KR20010083915A - 식물 병원성 진균에 대한 스트렙토마이세스 텐대로부터의항진균성 단백질의 이용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아스코마이세테스 과로부터의 식물 병원성 진균에 대한 스트렙토마이세스 텐대로부터의 약 10 kDa의 분자량을 갖는 항진균성 단백질(AFP)의 용도에 관한 것이다.

Description

식물 병원성 진균에 대한 스트렙토마이세스 텐대로부터의 항진균성 단백질의 이용 {Utilization of an antifungal protein from Streptomyces tendae against plant pathogenic fungi}
본 발명은 아스코마이세테스(Ascomycetes) 과의 식물 병원성 진균에 대한 스트렙토마이세스 텐대(Streptomyces tendae)로부터의 약 10 kDa의 분자량을 갖는 항진균성 단백질(AFP)의 용도에 관한 것이다.
항진균성 단백질은 오랫동안 기술되어져 왔으며, 이러한 단백질 중 일부는 식물의 경우에서는 PR 단백질(식물 발병-관련 단백질)[Bol, J.F. & Linthorst, H.J.M. (1990), Annu. Rev. Phytopathol., 28, 113]로도 불려지고 있다. 이러한 단백질은 스트레스 조건하, 예를 들면 바이러스성 또는 진균성 감염의 경우에 식물에 의해 형성되어 "유발된 내성"[Lindhorst, H.J.M., (1991) Cri. Rev. Plant Sci., 10(2), 123]이라고 불리는 식물의 활성 방어 메카니즘을 유도한다. 이러한 단백질 중 일부는 예를 들면, 키티나제 활성 또는 β-1,3-글루카나제 활성을 갖는다.
항진균 활성을 갖는 단백질은 또한 미생물로부터 이미 검출되어져 왔으며, 이러한 단백질 중 일부도 또한 키티나제 활성 또는 β-1,3-글루카나제 활성을 나타낸다. 반대로, 다른 단백질들은 진균 세포벽과의 상호작용을 통해 작용한다.
예를 들면, 진균 종들인 패실로마이세스 바리오티(Paecilomyces varriotii), 비소클라미스 니베아(Byssoclamis nivea), 펜실리움 푸베룰룸(Pencillium puberulum) 및 유페니실리움 테룸(Eupenicillium terrum)에 대해 활성적인 약 10 kDa의 크기를 갖는 항진균성 단백질(AFP)이 스트렙토마이세스 텐대로부터 분리되어져 왔다. 그러나, 활성은 이러한 종들에 대해서만 제한적이었다. 예를 들면, 패실로마이세스 카르네우스(Paecilomyces carneus), 패실로마이세스 릴라세누스 (Paecilomyces lilacenus), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum) 또는 페니실리움 클라비포르메(Penicillium claviforme) 같은 다른 종들은 억제되지 않는다. 또한, AFP의 사용은, 언급된 진균 종들은 식물 병원체가 아니기 때문에 상업적으로 정당화되지 않고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 식물 병원성 진균에 대해 활성인 항진균성 단백질을 찾아내는 것이다.
놀랍게도, 본원에 이르러, 스트렙토마이세스 텐대(Streptomyces tendae)로부터의 AFP가 아스코마이세테스 과로부터의 식물 병원성 진균에 대해 활성적임을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 주제는 아스코마이세테스 과로부터의 식물 병원성 진균, 특히 보트리티스 시네라(Botrytis cinera)에 대한 스트렙토마이세스 텐대로부터의 약 10 kDa의 분자량을 갖는 항진균성 단백질(AFP)의 용도에 관한 것이다.
언급된 항진균성 단백질은 전형적인 아미노-말단 시그날 서열을 함유하며, 즉, 친수성 N-말단 다음에 소수성 트랜스막 영역이 있으며, 이는 세포외 분비를 야기한다. 또한, 두 가지 형태, 즉, 약 9860 Da의 분자량을 갖는 보다 짧은 형태와 10300 Da의 분자량을 갖는 보다 긴 형태가 공지되어 있다.
AFP는 스트렙토마이세스 텐대에 의해 배양 배지내로 분비되기 때문에, 숙련자에게 공지된 방법에 따라 예를 들면, 스트렙토마이세스 텐대 배양 여액으로부터 직접적으로 분리할 수 있다. 대안으로, AFP는 유전공학적으로 제조할 수 있으며, 분리된 유전자는 바람직하게는 소위 다수 복사체 벡터, 예를 들면 plJ702[Hopwood, D.A. et al (1985) Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. Norwich, U.K.]내로 클로닝시키고 이러한 작제물을 사용하여 적합한 균주, 예를 들면 비-니코마이신-생산 균주 스트렙토마이세스 텐대 NP9를 형질전환시킬 수 있다. AFP-암호화 핵산의 예는 서열 1에 나타낸다. 이러한 바람직한 형질전환체를 예를 들면, 영양액 200㎖에서 7일 동안 성장시키는 경우, AFP 약 6㎎이 수득되며, 이는 ℓ당 AFP 30㎎에 상응한다. 따라서, 바람직하게 조절된 발효를 통해 유전공학에 의해 AFP를 생산하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 용도에 있어서, AFP는 바람직하게는 부가적인 보조제 하나 이상과 함께 예를 들면, 제형의 형태로 직접적으로 적용될 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 예를 들면, 진균의 공격을 받거나 진균 공격에 의해 위험에 빠진 식물에 기술된 제형을 분무한다. 제형의 AFP 농도는 일반적으로 약 10㎍/㎖ 내지 약 500㎎/㎖이다. 적합한 보조제는 예를 들면, 프로테아제 억제제, 글리세롤 같은 안정화제, 슈크로오즈, 염, 용매 또는 농작물 보호 분야에서 일반적으로 공지된 물질이다.
AFP를 스스로 생산할 수 있는 소위 형질전환된 식물은 진균 감염에 대한 보호를 제공하는 또 다른 가능한 방법이다.
따라서, 또 다른 양태는 형질전환된 식물에서 형성된 AFP에 대한 본 발명에 따른 용도이다. 형질전환된 식물은 바람직하게는, 유전공학적으로 조작된 옥수수, 목화, 감자, 바나나, 애기장대(arabidopsis), 카사바(casava), 담배, 유지종자 유채(canola), 감자, 사탕무, 곡류(예를 들면, 밀, 보리 또는 귀리), 딸기, 야채(예를 들면, 양배추), 콩(legume)(예를 들면, 완두(pea) 또는 잠두(bean)), 토마토, 양상추 또는 멜론이다.
형질전환된 식물을 생산하기 위해서는, AFP를 암호화하는 핵산, 예를 들면, 순수한 DNA, 바이러스성 DNA 또는 RNA 형태, 또는 플라스미드 DNA 형태의 AFP를 암호화하는 핵산을 식물 세포내로 도입한다. AFP-암호화 핵산의 예는 서열 1에 나타낸다. 그러나, 본 발명은 또한, 유전자 암호의 축퇴성으로 인해 서열 1의 핵산 서열과는 상이하지만 동일한 AFP 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함한다. 또한, 본 발명은 아스코마이세테스 과의 식물 병원성 진균, 특히 보트리티스 시네라에 대해 활성인 AFP 단백질을 암호화하는 서열 1의 핵산의 돌연변이체 또는 변이체를 포함한다. 이들은 예를 들면, AFP 단백질과 다른 외래 단백질의 융합 단백질 또는 N-말단 결실된 메티오닌을 갖는 AFP 단백질을 포함한다. 변이체의 다른 예는 엄격한 조건에서 서열 1의 핵산과 하이브리드화하는 핵산이다. 엄격한 하이브리드화 조건은 예를 들면, 문헌[Sambrook, J. et al. in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Habour Laboratory Press, 1989]에의해 결정할 수 있다. 형질전환된 식물은 후속적으로 형질전환된 식물 세포로부터 재생된다. 바람직하게는, AFP-암호화 핵산을 재조합 아그로박테리아, 전기천공법, 미세입자를 사용한 충격법 및/또는 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 식물 세포내로 도입시킬 수 있다.
쌍자엽 식물 세포에서 재조합 아그로박테리움 투메패시언스 세균을 사용한 감염은 예를 들면, 문헌[Klee, H. et al. (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. 38, 467 또는 제EP-B2-0122791호]에 기술되어 있다. 단자엽 식물 세포에서 재조합 아그로박테리움 투메패시언스 세균을 사용한 감염은 예를 들면, 옥수수(Zea mays L.)와 관련하여 문헌[Ishida, Y. et al. (1996) Nature Biotech. 14, 745]에 기술되어 있다. 이러한 목적에 사용되는 아그로박테리아는, AFP-발현 유전자 및 적합한 경우, 적합한 프로모터, 예를 들면, 식물 페이스올린 프로모터(phaseolin promoter)[예를 들면, 제EP-B2-0122791호] 또는 바이러스성 35S 프로모터[예를 들면, Ishida, Y. et al. (1996), 상기]가 삽입된 T-DNA를 갖는다. T-DNA는 예를 들면, 재조합 아그로박테리아와 관심있는 식물의 미성숙 배아를 공배양시켜 식물 세포내로 전달시킬 수 있다[예를 들면, Ishida, Y. et al. (1996), 상기]. 형질전환된 식물 세포를 선택하기 위해서, 식물 세포에서 발현시키고자 하는 AFP 유전자로부터의 내성 유전자를 발현시킬 수 있는 T-DNA 작제물을 사용하는 것이 바람직하다. 적합한 내성 유전자는 예를 들면, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제[예를 들면, Ishida, Y. et al. (1996), 상기]를 암호화하는 유전자이다. 따라서, 성공적으로 형질전환된 식물 세포는 예를 들면, 상응하는 항생제 포스피노트리신에 의해 선택될 수 있다. 형질전환된 식물 세포로부터 식물을 재생하는 것은 일반적으로 공지되어 있다[예를 들면, Sagi et al. (1995), Nature Biotech, 13, 481-485, Ishida, Y. et al. (1996), 상기 또는 Schopke et al. (1996), Nature Biotech, 14, 731-735].
형질전환 방법으로서 아그로박테리움 투메패시언스를 사용하는 이외에, 다른 형질전환 방법이 공지되어 있으며, 예를 들면, 전기천공법, 미세입자를 사용한 충격법 또는 폴리에틸렌 글리콜 사용 방법이 적합하다[예를 들면, Potrykos, 1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol., 42, 205; Estruch, J.J. et al. (1997), Nature Biotech., 15, 137-141 or Dingermann, T. (1995) BIOforum, 18, 252]. 예를 들면, 카사바[Schopke et al. (1996), 상기] 또는 바나나[Sagi, et al. (1995), 상기]는 이미 DNA-코팅된 입자를 사용하여 식물 세포를 충격시켜 형질전환된 바 있다. 이러한 방법에서도, 발현시키고자 하는 AFP 유전자는 바람직하게는 형질전환된 식물 세포의 후속적인 선택을 가능하게 하는 내성 유전자를 갖는 적합한 벡터내로 클로닝된다. 재조합 벡터는 바람직하게는 텅스텐 입자에 피복되어 예를 들면, 배아 세포 현탁액을 충격시킨다[예를 들면, Sagi, et al. (1995), 상기]. 이렇게 처리한 세포 현탁액을 적합한 항생제, 예를 들면, 포스피노트리신을 사용하여 형질전환된 식물 세포를 후속적으로 선택하고, 형질전환된 식물은 예를 들면, 이미 상기된 바와 같이 이로부터 재생된다.
본 발명의 중요한 장점은 AFP가 아스코마이세테스 과로부터의 식물 병원성 진균, 특히 하나 이상의 농작물 보호제에 이미 내성이 생긴 보트리티스 시네라에 대해서 활성적이라는 것이다.
하기 실시예 및 도면은 본 발명을 어떠한 제한도 없이 보다 상세히 기술하고자 의도된다.
서열 기술
서열 1은 스트렙토마이세스 텐대로부터의 항진균성 (223) 단백질 (AFP)을 암호화하는 핵산 서열을 나타낸다.
실시예 1
시험 플레이트를 제조하기 위해서, 보트리티스 시네라 포자 현탁액 50㎕를 시험 아가(맥아 추출물 20g/ℓ, 글루코오스 10g/ℓ, 효모 추출물 2g/ℓ, 황산 암모늄 0.5, 아가 15g/ℓ, pH 6.0) 100㎖에 부가한다. 이중 25㎖를 페트리 디쉬에 붓는다. 최종 포자 농도는 105포자/㎖이다. 직경 0.5㎝의 멸균 항생제 시험 디스크(제조원: Schleicher und Schuell, Dassel, Frg)를 시험 플레이트에 적용한다. 이후, AFP 용액(에스. 텐대-형질전환체의 동결건조된 배양 여액 100㎎/㎖) 5, 10, 15 및 20㎕를 후속적으로 시험 디스크 상에 피펫팅하고 시험 플레이트를 30℃에서 4일 동안 배양한다. 억제 영역의 직경은 각각, AFP 용액 5㎕에 있어서 0.7㎝, 10㎕에 있어서, 1㎝, 15㎕에 있어서 1.3㎝ 및 20㎕에 있어서 1.9㎝이다.
실시예 2
시험 플레이트를 제조하기 위해서, 보트리티스 시네래 ZF 3629[BCM에 내성 (Benlat, BenomylTM, Hoechst Schering AgrEvo GmbH, Frankfurt, carbendazem)]의 포자 현탁액 50㎕를 시험 아가(맥아 추출물 20g/ℓ, 글루코오스 10g/ℓ, 효모 추출물 2g/ℓ, 황산암모늄 0.5, 아가 15g/ℓ, pH 6.0) 100㎖에 부가한다. 이중 25㎖를 페트리 디쉬에 붓는다. 최종 포자 농도는 105포자/㎖이다. 직경 0.5㎝의 멸균 항생제 시험 디스크(제조원: Schleicher und Schuell, Dassel, Frg)를 후속적으로 시험 플레이트에 적용한다. 이후, AFP 용액(에스. 텐대 형질전환체의 동결건조된 배양 여액 100㎎/㎖) 5, 10, 15 및 20㎕를 후속적으로 시험 플레이트 상에 피펫팅하고 시험 플레이트를 30℃에서 4일 동안 배양한다. 억제 영역의 직경은 AFP 용액 5㎕에 있어서 0.9㎝, 10㎕에 있어서 1.3㎝, 15㎕에 있어서 1.9㎝ 및 20㎕에 있어서 2.2㎝이다.
실시예 3
발효에 의한 개선된 생산
호스를 장착한 플라스크에서, 예비 배양 배지(슈크로오스 103g/ℓ, 트립신 처리된 간장액(Oxoid, Wesel) 20g, MgCl210g/ℓ 및 효모 추출물 10g/ℓ) 100㎖에 에스. 텐대 균주의 아가 절편을 접종한다. 배양물을 회전 진탕기에서 200rpm으로 28℃에서 5일 동안 성장시킨다.
생산 배지(슈크로오스 103g/ℓ, 트립신 처리된 간장액(Oxoid, Wesel), MgCl210g/ℓ, 효모 추출물 10g/ℓ 및 데스모펜 100㎕, pH 7.5) 10ℓ를 상기된 예비 배양물 100㎖로 접종한다.
사용된 발효기는 Biostat E(제조원: Braun Melsungen)이다. 발효는 28℃, 700rpm 및 공기 0.5vvm에서 4일 동안 수행한다. 이후, 발효를 종결시키고, 배양 상등액을 3000rpm 및 4℃에서 원심분리시켜 회수한다. 상기 배치를 후속적으로 동결 건조에 의해 건조시킨다. 직접적으로 분말을 사용하는 것이 가능하다. 동결건조물 15㎕(100㎎/㎖)를 억제 영역 시험에서 보트리티스 시네래에 대해 사용하는 경우, 억제 영역은 1.7㎝이며, 보트리티스 시네래 ZF 3629의 경우에는 2.3㎝의 억제 영역이 검출된다.

Claims (7)

  1. 아스코마이세테스(Ascomycetes) 과로부터의 식물 병원성 진균, 특히 보트리티스 시네라(Botrytis cinera)에 대한, 스트렙토마이세스 텐대(Streptomyces tendae)로부터의 약 10 kDa의 분자량을 갖는 항진균성 단백질(AFP)의 용도.
  2. 제1항에 있어서, AFP가 바람직하게는 보조제 하나 이상과 함께 제형의 형태로 사용됨을 특징으로 하는 용도.
  3. 제1항에 있어서, AFP가 형질전환된 식물에서 형성됨을 특징으로 하는 용도.
  4. 제3항에 있어서, 형질전환된 식물이 옥수수, 목화, 감자, 바나나, 애기장대(arabidopsis), 카사바(casava), 담배, 유지종자 유채(canola), 감자, 사탕무, 곡류, 딸기, 야채, 콩, 토마토, 양상추 또는 멜론으로부터 선택됨을 특징으로 하는 용도.
  5. 제4항에 있어서, 곡류가 밀, 보리 또는 귀리로부터 선택되고, 사용되는 야채가 양배추이거나, 콩이 완두 또는 잠두로부터 선택됨을 특징으로 하는 용도.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 형질전환된 식물이 서열 1에서청구되는 핵산을 포함함을 특징으로 하는 용도.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 언급된 식물 병원성 진균이 농작물 보호제 하나 이상에 내성임을 특징으로 하는 용도.
KR1020017004884A 1998-10-21 1999-10-05 식물 병원성 진균에 대한 스트렙토마이세스 텐대로부터의항진균성 단백질의 이용 KR20010083915A (ko)

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