MXPA01004057A

MXPA01004057A - Uso de una proteina antifungal de streptomyces tendae contra hongos patogenos de plantas.

Info

Publication number: MXPA01004057A
Application number: MXPA01004057A
Authority: MX
Inventors: Neumann Thomas
Original assignee: Aventis Res & Tech Gmbh & Co
Priority date: 1998-10-21
Filing date: 1999-10-05
Publication date: 2003-03-10
Also published as: ATE217757T1; DE19848517A1; CA2347706A1; AU6467999A; JP2002527456A; IL142597A0; KR20010083915A; EP1123004A1; DE59901521D1; AU748455B2; WO2000022932A1; CN1324214A; ZA200103234B; NZ511213A; ID29012A; EP1123004B1

Abstract

La invencion se refiere al uso de una proteina antifungal (AFP) que tiene un peso molecular de aproximadamente 10 kDA de Streptomyces tendae contra un hongo patogeno de planta de la familia Ascomycetes.

Description

USO DE UNA PROTEINA ANTIFUNGAL DE STREPTOMYCES TENDAE CONTRA HONGOS PATÓGENOS DE PLANTAS MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere al uso de una proteína antifungal (AFP) que tiene un peso molecular de aproximadamente 10 kDa de Streptomyces tendae contra hongos patógenos de plantas de la familia Ascomycetes. Las proteínas antifungales se han descrito desde hace algún tiempo, algunas de estas proteínas se han determinado como proteínas PR (proteínas relacionadas a la patogénesis de plantas) en el caso de .as plantas (Bol, J.F. & Linthorst, H.J.M. (1990), Annu. Rev. Phytopathol, 28, 113). Estas proteínas son formadas por plantas bajo condiciones de estrés, por ejemplo en el caso de infección viral o fungal, ¡nduciendo un mecanismo activo de defensa de la planta el cual se denomina "resistencia inducida" (Lindhorst, H.J.M. , (1991) Cr¡. Rev. Plant Sci., 10(2), 123). Algunas de estas proteínas tienen, por ejemplo, actividad de quitinasa o actividad de ß-1 ,3-glucanasa. Las proteínas con una actividad antifungal también se han detectado de microorganismos; algunas de estas proteínas también muestran actividad de quitinasa o actividad de ß-1 ,3-glucanasa. Por el contrario, otras proteínas actúan a través de una interacción de la pared celular del hongo.

Por ejemplo, una proteína antifungal (AFP) que tiene un tamaño aproximado de 10 kDa la cual es activa contra las especies fúngales Paecilomyces varriotii, Byssoclamis nivea, Penicillium puberulum y Eupenicillium terrum se ha aislado de Streptomyces tendae. Sin embargo, la acción se restringió a estas especies. Otras especies tales como, por ejemplo, Paecilomyces carneus, Paecilomyces lilacenus, Penicillium chrysogenum o Penicillium claviforme no son inhibidas. Además, el uso de AFP no está justificado comercialmente puesto que las especies fúngales mencionadas no son patógenas de plantas. El objetivo de la presente invención fue por lo tanto encontrar una proteína antifungal la cual fuera activa contra hongos patógenos de plantas. Sorprendentemente, en la actualidad se ha encontrado que AFP de Streptomyces tendae es activa contra hongos patógenos de plantas de la familia Ascomycetes. El asunto objetivo de la presente invención es por lo tanto el uso de una proteína antifungal (AFP) con un peso molecular aproximado de 10 kDa de Streptomyces tendae contra hongos patógenos de plantas de la familia Ascomycetes, en particular contra Botrytis ciñera. La proteína antifungal mencionada contiene una secuencia señal amino terminal típica, es decir un N-terminal hidrófilo seguido por una región transmembranal hidrofóbica, la cual causa la secreción extracelular. Además, se conocen dos formas, denominadas forma corta con un peso molecular de aproximadamente 9 860 Da y una forma larga con un peso molecular de aproximadamente 10 300 Da. Puesto que la AFP es secretada por Streptomyces tendae dentro del medio de cultivo, se puede aislar por ejemplo directamente del filtrado del cultivo de Streptomyces tendae, siguiendo los métodos conocidos por el experto en la técnica. Como alternativa, AFP puede producirse por ingeniería genética, aislando el gen a ser clonado preferiblemente dentro de un vector denominado vector de multicopia, por ejemplo p1J02 (Hopwood, D.A. et al, (1985) Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. Norwich, U.K.) y usando esta construcción para transformar una cepa adecuada, por ejemplo la cepa no productora de nicomicina NP9. Un ejemplo de un ácido nucleico que codifica AFP se muestra en SEQ ID No. 1. Cuando este transformante preferido se mantiene en cultivo, por ejemplo, durante 7 días en 200 ml de solución nutriente, se obtienen aproximadamente 6 mg de AFP, lo cual corresponde a 30 mg de AFP/1. La producción de AFP por ingeniería genética a través de una fermentación controlada preferiblemente, por lo tanto se prefiere especialmente. Para el uso de acuerdo con la invención, AFP puede aplicarse directamente por ejemplo en la forma de una formulación junto con preferiblemente al menos un auxiliar adicional. A este fin, por ejemplo, las plantas atacadas por hongos o dañadas por ataque de hongos son asperjadas con la formulación descrita. La concentración de AFP de la fórmula generalmente es de aproximadamente 10 µg/ml a aproximadamente 500 mg/ml. Los auxiliares adecuados son, por ejemplo, inhibidores de proteasa, estabilizadores tales como glicerol, sacarosa, sales, solventes o sustancias generalmente conocidas del campo de protección de cosechas. Las llamadas plantas transgénicas, las cuales son capaces de producir AFP por sí mismas, son otra posibilidad para proveer protección contra la infección fungal. Otra modalidad es por lo tanto el uso de acuerdo con está invención de AFP, el AFP siendo formado en una planta transgénica. La planta transgénica es, preferiblemente, maíz genéticamente modificado, algodón, papa, banana, Arabidopsis, casava, tabaco, aceite de semilla de colza (cañóla), patata, remolacha azucarera, cereales tales como, por ejemplo, trigo, centeno o avena, fresas, verduras tales como, por ejemplo, calabaza, leguminosas tales como, por ejemplo, chicharros o frijoles, tomate, lechuga o melón. Para generar una planta transgénica, un ácido nucleico que codifica AFP, por ejemplo en la forma de ADN desnudo, ADN viral o ARN, o en la forma de ADN plasmídico, se introduce en una célula vegetal. Un ejemplo de un ácido nucleico que codifica AFP se muestra en SEQ ID No. 1. Sin embargo, la presente invención también abarca a aquellos ácidos nucleicos los cuales difieren de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No. 1 atribuida a la degeneración del código genético, pero la cual codifica para la misma secuencia de aminoácidos de AFP. Además, la invención abarca aquellos mutantes o variantes del ácido nucleico de SEQ ID No. 1 los cuales codifican una proteína AFP la cual es activa contra hongos patógenos de plantas de la familia Ascomycetes en particular contra Botrytis ciñera. Estos incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión de la proteína AFP con otras proteínas extrañas o una proteína AFP con una metionina N-terminalmente deletada. Otros ejemplos de variantes son ácidos nucleicos los cuales hibridan en condiciones severas con el ácido nucleico de SEQ ID No. 1. Las condiciones de hibridación severas pueden estar determinadas por ejemplo en Sambrook, J. et al, en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Las plantas transgénicas se regeneran subsecuentemente de las células vegetales transformadas. Preferiblemente, un ácido nucleico que codifica AFP puede introducirse dentro de la célula vegetal por medio de agrobacteria recombinante, por electroporación, por bombardeo por micropartículas y/o por medio de polietilenglicol. La infección con la bacteria recombinante Agrobacterium tumefaciens en células vegetales de dicotiledóneas se describe, por ejemplo, Klee, H. et al. (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. 38, 467 o EP-b2-0122791 ). La infección con bacteria recombinante Agrobacteríum tumefaciens en células vegetales de monocotiledóneas se describe, por ejemplo en Ishida, Y. et al, (1993) Nature Biotech. 14, 745 con referencia al maíz (Zea mays L.). La agrobacteria usada para este propósito tiene un ADN-T dentro del cual el gen expresa AFP y, si es apropiado, un promotor adecuado, por ejemplo un promotor de faseolina vegetal (ver, por ejemplo, EP-B2-0122791) o un promotor viral 35S (ver, por ejemplo Ishida, Y. et al, (1996), anteriormente mencionado) que se han insertado. El ADN-T puede transferirse dentro de células vegetales por ejemplo cocultivo de agrobacteria recombinante junto con embriones inmaduros de la planta en cuestión (ver, por ejemplo, Ishida, Y. et al, (1996) anteriormente mencionado). Para seleccionar las células vegetales transformadas, se prefiere usar una construcción de ADN-T la cual es capaz de expresar, en la célula vegetal, un gen de resistencia del gen AFP a ser expresado. Un gen de resistencia adecuado, es por ejemplo, el gen que codifica para fosfonotricina acetiltransferasa (ver, por ejemplo, Ishida, Y. et al. (1996), anteriormente mencionado). Así, las células vegetales exitosamente transformadas pueden seleccionarse por ejemplo por medio del antibiótico fosfonotricina correspondiente. Generalmente se conoce la regeneración de una planta a partir de células vegetales transformadas (ver, por ejemplo, Sagi et al, (1995), Nature Biotech, 13, 481-485, Ishida, Y. et al, (1996), anteriormente mencionado, o Schópke et al, (1996), Nature Biotech, 14, 731-735). Además del uso de Agrobacterium tumefaciens como medio de transformación, otros métodos de transformación se conocen y son adecuados, tales como, por ejemplo, electroporación, bombardeo con micropartículas o el uso de polietilenglicol (ver, por ejemplo, Potrykos, (1991 ) Annu. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol., 42, 205; Estruch, J.J. et al, (1997), Nature Biotech, 15, 137-141 o Dingermann, T. (1995) BlOforum, 18, 252). Por ejemplo, la casava (Schopke et al. (1996), anteriormente mencionado) o el plátano (Sagi, et al, (1995), anteriormente mencionado) han sido transformados por células vegetales bombardeadas con partículas cubiertas con ADN. En este método, también el gen AFP a ser expresado se clona dentro de un vector adecuado el cual preferiblemente tiene un gen de resistencia que permite la selección subsecuente de las células vegetales transformadas. El vector recombinante se aplica preferiblemente a las partículas de tungsteno con las cuales, por ejemplo, las suspensiones de células embriogénicas se bombardean (ver, por ejemplo, Sagi, et al, (1995), anteriormente mencionado). Las suspensiones celulares así tratadas se seleccionan subsecuentemente para células vegetales transformadas usando un antibiótico adecuado, por ejemplo fosfinotricina, y se genera de la misma una planta transgénica, por ejemplo como se describió anteriormente. Una ventaja considerable de la presente invención es que AFP es activa contra hongos patógenos de la familia Ascomycetes, en particular contra Botrytis ciñera, la cual ha desarrollado una resistencia en particular a uno o más agentes protectores de cosechas. Los ejemplos que siguen y la secuencia se pretende que describan la invención en mayor detalle sin imponer ninguna limitación: Descripción de la secuencia La SEQ ID No.1 muestra una secuencia de ácido nucleico para una proteína antifungal (223) (AFP) de Streptomyces tendae.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Para preparar las placas de ensayo, 50 µl de una suspensión de esporas de Botrytis ciñera se añadieron a 100 ml de agar de ensayo (20 g/l extracto de maltosa, 10 g/l glucosa, 2 g/l extracto de levadura, 0.5 sulfato de amonio, 15 g/l agar, pH 6.0). 25 ml de éstos se añadieron dentro de cajas de Petri. La concentración de esporas final fue de 108 esporas/ml. Se aplicaron subsecuentemente discos de ensayo estériles y con antibióticos (Schleicher und Schuell, Dassel, Frg) de 0.5 cm de diámetro a una placa de ensayo. Entonces, se pipetearon 5, 10, 15 y 20 µl de la solución AFP (100 mg/ml cultivo liofilizado filtrado de S. Tendae transformadas) subsecuentemente sobre los discos de ensayo y la placa de ensayo se incubó durante cuatro días a 30°C. El diámetro de la zona de inhibición fue de 0.7 cm para 5 µl de solución de AFP, de 1 cm de diámetro para 10 µl, de 1.3 cm para 15 µl de solución y de 1.9 cm para 20 µl.

EJEMPLO 2 Para preparar las placas de ensayo, se añadieron 50 µl de una suspensión de esporas de Botrytis cinerae ZF 3629 (resistentes a BCM (Benlat, Benomyl™, Hoechst Schering Agrevo GmbH, Frankfurt, carbendazem)) a 100 ml de agar de ensayo (20 g/l extracto de maltosa, 10 g/l glucosa, 2 g/l extracto de levadura, 0.5 sulfato de amonio, 15 g/l agar, pH 6.0). 25 ml de éstos se añadieron dentro de cajas de Petri. La concentración final de esporas fue de 105 esporas/ml. Se aplicaron subsecuentemente discos de ensayo estériles y con antibióticos (Schleicher und Schuell, Dassel, Frg) de 0.5 cm de diámetro a una palca de ensayo. Entonces, se pipetearon 5, 10, 15 y 20 µl de la solución AFP (100 mg/ml cultivo filtrado liofilizado de S. Tendae transformada) subsecuentemente sobre ios discos de ensayo y la placa de ensayo se incubó durante cuatro días a 30°C. El diámetro de la zona de inhibición fue de 0.9 cm para 5 µl de solución de AFP, de 1.3 de diámetro para 10 µl, tí? 1.9 cm para 15 µl de solución y de 2.2 cm para 20 µl.

EJEMPLO 3 Producción mejorada por fermentación En un frasco equipado con una manguera, se inocularon 100 ml del medio de precultivo ( 103 g/l sacarosa, 20 g caldo de soya tríptica (Oxoid, wesel), 10 g/l MgCI2 y 10 g/l extracto de levaduras) con una sección de agar de la cepa S. tendae. El cultivo se dejó crecer durante 5 días a 28°C a 200 rpm en un agitador orbital. Se inocularon 10 L del medio de producción (103 g/l sacarosa, 20 g caldo de soya tríptica (Oxoid, wesel), 10g/l MgCI2, 10 g/l extracto de levadura, 100 µl desmofen, pH 7.5) con 100 ml del precultivo mencionado anteriormente. El fermentador empleado fue un Biostat E (Braun, Melsungen). La fermentación se llevó a cabo durante cuatro días a 28°C, 700 rpm y 0.5 vvm de aire. Después de esto, la fermentación se detuvo, y el sobrenadante de cultivo se colectó por centrifugación a 3000 rpm y 4°C. El lote se secó subsecuentemente por liofilización. Fue posible emplear el polvo directamente. Si 15 µl del liofilizado (100 mg/ml) se empleaban contra Botrytis cinerae en un ensayo de zona de inhibición, se detectaba una zona de inhibición de 1.7 cm, contra Botrytis cinerae ZF 3629, en donde se detectó una ona de inhibición de 2.3 cm.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Aventis Research & technologies GmbH & Co KG <120> Utilización de una proteína antifungal de Streptomyces tendae contra hongos patógenos de plantas. <130> 98F122 <140> Aún sin archivo de referencia <141> Aún sin fecha de solicitud <150> DE-19848517.4 <151 > 1998-10-21 <160> 1 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 387 <212> ADN <213> Streptomyces tendae <220> CDS <223> Codifica una proteína antifungal <400> 1 acgaagcrtt ccgtgcgccg cgcrcggt gtcgcaacag tcgccgccgc cgcac.ggcc 60 gccacgg gg rgcccgccgc ggcggccacc acrrc-.ccca ccacggcc c cgccarcggc 120 ccgaccacca ac gtacgga c gtaacgag aacagc^acc tcgaaaccca caacaacgag 180 ggccgcgaca crctgrgc r; cgccaacgcc ggaacgacgc ccgtcgccac ctacgggg g 240 aac-gggtcg agcccggaaa caacgccgec accctgcagc cccagcggaa zczgs.g*gaz 300 ccgaggc gg aaacca cac cc ccagaag cggggctcg ggaacccggg ccaca ccac 360 gagatccr" ccaccaggac ccaccga 387

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de una proteína antifungal (AFP) que tiene un peso molecular de aproximadamente 10 kDA de Streptomyces tendae contra hongos patógenos de plantas de la familia Ascomycetes, en particular contra Botrytis ciñera.

2.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde AFP se usa en forma de una formulación preferiblemente junto con al menos un auxiliar.

3.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde AFP se forma en una planta transgénica.

4.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde la planta transgénica se selecciona de entre maíz, algodón, papa, plátano, Arabidopsis, casava, tabaco, aceite de semilla de colza (cañóla), remolacha azucarera, cereales, fresas, verduras, leguminosas, tomate, lechuga o melón.

5.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 4, en donde los cereales se seleccionan de entre trigo, cebada o avena, la verdura usada es calabaza o las leguminosas se seleccionan de entre chicharros o frijoles.

6.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en donde la planta transgénica comprende un ácido nucleico como el que se reclama en SEQ ID No. 1 , siendo SEQ ID No. 1 parte de la reivindicación.

7.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el hongo patógeno de plantas enunciado es resistente a uno o más agentes protectores de cosechas.