CN1304560C - 采用循环脉冲－暂停补料方式的发酵法 - Google Patents

采用循环脉冲－暂停补料方式的发酵法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生产有价值的化合物的方法，包括如下步骤：a) 在发酵培养基中发酵丝状细菌或真菌(例如链霉属菌株或曲霉属菌株)，在发酵期间采用循环脉冲定量给料/暂停的方式在所述发酵培养基中加入糖类，其中所述脉冲定量给料的时间短于暂停时间；和b)从发酵培养液中回收有价值的化合物。

Description

采用循环脉冲-暂停补料方式的发酵法
根据国家科学基金(National Science Foundation)授予的GrantNo.9906586，美国政府也享有对本发明的权利。
                         技术领域
本发明涉及在发酵过程中降低培养液粘度的方法。
                         背景技术
丝状微生物是商业微生物学中的一种有力工具，因为其可被用于很多不同治疗药物(例如青霉素和头孢菌素)、商业化合物(例如柠檬酸)和商品酶(例如蛋白酶和淀粉酶)的商业生产中。
数十年来，丝状微生物的发酵所呈现出的独特的工程学挑战是众所周知的。特别地，丝状微生物的丝状形态通常会导致高粘度，而该高粘度则使对培养液的搅拌、泵送和供氧变的很困难。
尽管已经做了大量研究，但关于在商业规模系统内转变形态以降低培养液粘度的研究进展相对较少。事实上，最通常的降低培养液粘度的方法是在培养液中加水将其稀释或增加搅动以便将丝变成片段。但这些方法都不具有稳定的效果。
                         发明概述
发明人发现培养液粘度可以通过在发酵期间调整碳补料方式从而以一种有益的方式进行转变，因此我们要求：
一种生产有价值的化合物的方法，包括如下步骤：
a)在发酵培养基中发酵丝状细菌或真菌，在所述发酵培养基中于发酵期间用循环脉冲定量给料/暂停(cyclic pulse dosing/pause)的方式加入糖类，其中所述脉冲定量给料的时间短于暂停时间；和
b)从发酵培养液中回收有价值的化合物。
                         附图说明
参考附图对本发明作进一步的说明，其中
图1显示了获自链霉菌的3个补料分批发酵过程(参见实施例2)的酶活性，干细胞重和培养液粘度(以标准化形式)。不同发酵过程间的唯一差别为其中之一延长了暂停时间。
                         发明详述
发明人已经揭示了在补料分批发酵过程中对细胞进行循环补料可以作为降低培养液粘度的方法。在发酵过程中，葡萄糖可持续地，或以300秒一个循环的方式补料，在每个循环中或以30秒或以50秒来使用进料泵。在所有发酵过程中，使用总量相同的葡萄糖对培养基进行补料(参见实施例1)。
数据显示，脉冲补料在时间图上对全部干细胞重、氧质量传递速率、或在每一发酵过程中全部添加碱(此为细胞代谢能力的指征变量)都不产生显著影响。另外，脉冲补料对全部胞外蛋白浓度或胞外蛋白的表观分布也没有可测量的影响。
相反的，脉冲补料对形态学有显著的影响。采用脉冲补料方式的细胞比用持续补料方式的细胞小。这导致了脉冲补料的发酵过程中的粘度低于持续补料的发酵过程中的粘度。
有价值的化合物
根据本发明的有价值的化合物可以是抗生素如青霉素或头孢霉素或红霉素或商品化合物如柠檬酸。有价值的化合物还可以是治疗性蛋白质如胰岛素或酶(例如水解酶、转移酶、裂解酶、异构酶或连接酶，特别是糖类水解酶(carbohydrolase)、纤维素酶、氧化还原酶、蛋白酶、脂肪酶或糖酶)。
微生物菌株
根据本发明的微生物菌株可以获自任何种类的丝状细菌或真菌。
例如，在优选实施方式中，有价值的化合物可以获自链霉属菌株，例如，变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉素(Streptomycesmurinus)或获自放线菌。
在另一优选实施方式中，有价值的化合物可以获自丝状真菌，如顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Crytococcus)、Filibasidium属、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉(Humicola)、Magnaporthe属、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix属、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、Talaromyces属、Thermoascus属、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium属、或木霉属(Trichoderma)的菌种，特别地，有价值的化合物可以获自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarumroseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides、Fusarium venenatum、Humicola insolens、Humicolalanuginosa、米黑毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei、或绿色木霉(Trichoderma viride)等菌种。
公众可从许多培养物保藏机构获得上述菌种，比如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物与细胞培养物保藏股份有限公司(DeutscheSammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh DSM)、荷兰真菌菌种保藏中心(CBS)、和农业研究部专利培养物保藏中心，美国北方研究中心(NRRL)。
为实现本发明的目的，此处使用的与给定来源相关联的术语“获自”意指有价值的化合物通过上述来源而得以生产或通过用来自上述来源的基因插入的细胞而得以生产。
发酵
微生物菌株可用现有技术中任意的公知技术进行发酵。发酵培养基可以是包含氮源和/或碳源复合物的复合培养基，如大豆粉、棉籽粉、谷物浸液、酵母提取物、酪蛋白水解产物、糖浆等等。发酵培养基也可以是化学配制的培养基，例如，采用WO98/37179中公开的配制方法。
发酵可采用补料分批的方式、重复补料分批的方式或持续的发酵步骤。
在补料分批的步骤中，可以于发酵开始前在培养基中不加入或加入部分包含一个或多个结构和/或催化单元的多种化合物，也可以将包含一个或多个结构和/或催化单元的多种化合物的全部或剩余部分，分别在发酵过程中补料。在发酵过程中，用于补料的选用多种化合物可以一起或彼此分离地进行补料。
在重复补料分批的发酵或持续发酵的过程中，在发酵期间，全部起始培养基被额外补料。可以将结构单元料(structural element feed(s))一起或分别对起始培养基进行补料。在重复补料分批的发酵方式中，包含生物质的一部分发酵培养液以规律的时间间隔取出，而在持续发酵过程中，则持续性取出部分发酵培养液。因此发酵过程中要根据取出发酵培养液的量而补充部分新鲜培养基。
在本发明的优选实施方式中，发酵采用补料分批方式或重复补料分批(repeated fed-batch)方式。
糖类
根据Morrison和Boyd：Organic Chemistry，1056页，第4版：“Carbohydrates are polyhydroxy aldehydes，polyhydroxy ketones，orcompounds that can be hydrolysed to them.A carbohydrates that cannotbe hydrolysed to simpler compounds is called a monosaccharide.Acarbohydrates that can be hydrolysed to two monosaccharide moleculesis called a disaccharide.A carbohydrates that can be hydrolysed tomany monosaccharides is called a polysaccharide.”中所定义的任何糖类都可根据本发明而被采用。
糖类可优选自葡萄糖、蔗糖、葡萄糖糖浆、果糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、寡糖、限制糊精、糊精、水解谷物糊精、淀粉、环糊精、maltulose、甘露糖、和半乳糖，特别优选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、水解糊精(hydrolyseddextrin)。
根据本发明，糖类的加入量一般为0.01g糖/kg培养液/小时-10g糖/kg培养液/小时，特别为0.1g糖类/kg培养液/小时-5g糖类/kg培养液/小时，在最优选的实施方式中为0.5g糖类/kg培养液/小时-2g糖类/kg培养液/小时。
循环脉冲定量给料/暂停
根据本发明，发酵期间糖类的加入方式为循环脉冲补料/暂停(cyclicpulse dosing/pause)。通过“脉冲”补料糖类和“暂停”补料糖类，则出现“可控的”饥饿状态，从而降低了粘度。根据脉冲/暂停次数(times)的比率而在暂停期间增加糖类的补料量，从而保持整体平均给料速率。
在优选的实施方式中，糖类脉冲定量给料持续时间为10秒-1000秒，特别的为1秒-500秒，优选为5秒-100秒。
在优选的实施方式中，暂停持续时间为60秒-1800秒(1分钟-30分钟)，优选为300秒-1800秒(5分钟-30分钟)。
根据本发明，脉冲定量给料时间短于暂停时间，例如脉冲定量给料时间持续30秒，而暂停时间持续，如300秒。
回收有价值的化合物
本发明的另一个方面为发酵培养液的下游处理步骤。在发酵过程结束后，可使用适用于兴趣化合物的标准技术从发酵培养液中回收有价值的化合物。根据有用产物的性质和细胞内定位而使用相关的下游处理技术。首先从发酵液体中分离有价值的化合物，采用例如，离心或过滤。在有价值的化合物于内部累积或于微生物细胞相连的某些情况下要从生物质中回收有价值的化合物。另外，当微生物细胞分泌有价值的化合物时，从发酵液体中将其回收是众所周知的。
下面用实施例进一步说明本发明，但并不应理解为其对本发明作出限制。
实施例1
材料和方法
菌株和生长条件
在所有试验中均使用Aspergillus oryzae(获自IFO 4177菌株，发酵研究所，Osaka，日本)。
冻干孢子用0.1％Tween 80溶液做成悬液且加入甘油至终浓度为30％(w/v)以便保藏。孢子悬液保存于-70℃。接种时，冰冻孢子在新鲜琼脂糖斜面(酵母提取物4.0g/l，右旋糖单水化物5.0g/l，磷酸二氢钾1.0g/l，硫酸镁0.5g/l，琼脂10g/l)上萌发孢子，在孢子形成后接种于种子发酵罐(20L)内。
在种子形成培养基中，使用8L复合生长培养基为下述组合物：葡萄糖20.0g/l，(NH4)2SO4 2.5g/l，酵母提取物10.0g/l，KH2PO4 1.5g/l，NaCl1.0g/l，MgSO4.7H2O 1.0g/l，CaCl2.2H2O 0.10g/l。灭菌后，加入1.0ml滤过灭菌痕量无机盐溶液(ZnSO4.7H2O 5.7g/l，CuSO4.5H2O 1.0g/l，NiCl2.6H2O0.2g/l，FeSO4.7H2O 5.5g/l，MnSO4.H2O 3.4g/l)。然后使用KOH或H3PO4将培养基的pH调整至3.3。在种子形成发酵期间，温度要保持在30℃，空气流率控制在1.0VVM，浆速控制在750rpm，且通过加入NH3将pH保持在3.3。种子形成培养物长至细胞的氧利用率达到0.3mmol/(升×分钟)的任意值时，5％(v/v)的种子形成培养物被用于接种试验发酵。
发酵条件
发酵罐的额定容积为20升而使用的工作容积为13升。生长培养基包含：葡萄糖5.0g/l，(NH4)2SO4 2.5g/l，KH2PO4 3.75g/l，NaCl 2.5g/l，MgSO4.7H2O2.5g/l，CaCl2.2H2O 0.25g/l。灭菌后，加入17.5ml滤过灭菌痕量无机盐溶液(如上述)。在所有步骤中，均通过使用NH3将pH保持在6.0，温度保持在30℃，空气流率控制在1.0VVM，而搅拌速度控制在750rpm。在对照发酵组中，在初始批次模式期间溶解氧水平升高10％后，将葡萄糖溶液(65％w/v)以10g葡萄糖每小时的速度持续补料。其它发酵组用本文所述方式进行补料。经规律时间间隔取样，然后使用干细胞质量的双份测量法分析生物质。形态学和流变学特性的测定如下述。
形态学
真菌单元影像，包括培养液自由分散菌丝和凝集团都被用来分析以便对形态定量。将1ml培养液与相同体积的定影液(Paul GC和Thomas CR(1998)Characterization of Mycelial Morphology Using Image Analysis.Adv.Biochem.Eng.60：1-59)混合以配制用于影像分析的样品，并保存在4℃以备随后的分析。在影像分析时，混合样品用20％蔗糖溶液稀释至终浓度为0.2g/l以便消除由于细胞重叠而形成的伪象。使用安置在载物台倒置相差显微镜(inverted stage phase contrast microscope，IMT-2，Olympus)上的CCD影像相机(Sony)捕捉影像，并用安装在Macintosh计算机(Quadra950)上的框架抓取卡(G-3，Scion)将其数字化。使用下载自互联网网址http：//rsb/info.nih.gov/nih-image/的软件：NIH Image V1.6来分析影像。采用平均投影面积(average projected area)将凝集团和自由分散菌丝一同进行测定。由于菌丝具有几乎恒定的菌丝长度，故投影区域为体积的近似值，故其可被用于定量生物质。对每一样品而言，至少采用100真菌单元的影像进行分析以便确定该样品的平均投射区域。
流变学分析
所有流变学测试均使用采用了“叶片和杯(vane and cup)”几何学的回转粘度计(rotational viscometer DVII+，Brookfield)来实施。所使用的叶片和杯的系统、其校准方法以及流变学分析步骤已经公开于Marten，MR，Wenger，KS和Khan，SA(1997).Rheology，Mixing Time，andRegime Analysis for a Production-Scale Aspergillus oryzaeFermentation.Bioreactor and Bioprocess Fluid Dynamics.A.W.Nienow.Ednburgh，BHR Group，Cranfield，UK：295-313。Herschel-Bulkley方程(τ＝τy+Kγ n)用于描述所有批次的流变学特性，表观粘度(η)用(τavg/γavg)进行计算，其中采用跟据Marten，MR，Wenger，KS和Khan，SA(1997).Rheology，Mixing Time，and Regime Analysis for aProduction-Scale Aspergillus oryzae Fermentation.Bioreactor andBioprocess Fluid Dynamics.A.W.Nienow.Ednburgh，BHRGroup，Cranfield，UK：295-313的所定义的平均切变压力(ave rage shearstress)和切变率(shear rate)。
统计数据分析
统计比较采用变量分析(AVOVA)。有意义水平(α)定义为0.05。因此，小于0.05的P值或显著性概率(P)被认为是组间显著性差异的指征(95％可信度)。均值的耐受度报道为均值的标准误差。
凝胶电泳
采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(12％均一性，Bio-Rad)来确定胞外培养基中分泌蛋白的分布。
用β-巯基乙醇在Laemmli缓冲液中配制样品，然后在加入相同体积前加热。采用低距分子量标准蛋白质(Bio-Rad)来确定蛋白的分子量。采用扫描(GS-800，Bio-Rad)凝胶然后通过计算轨迹量(比如用其峰下面积定量条带)来分析(Quantity One software，Bio-Rad)条带的方法来定量蛋白条带，。
结果
采用下述方法来计算9个补料批次发酵的一系列发酵过程的三个不同的“脉冲片段(pulse fraction PF)”值：
脉冲片段(PF)＝(补料-泵“开”时间)/(全部循环时间)。
在所有发酵的全部循环时间为300秒。作为对照组的三个补料批次的发酵过程以PF＝1.0实施，且葡萄糖的稳定补料速率为10g/小时。第二组的三个发酵过程以PF＝0.5实施，且葡萄糖的补料速率为20g/小时，第三组的三个发酵过程以PF＝0.1实施，且葡萄糖的补料速率为100g/小时。通过这种安排，不管PF值是多少，在每5分钟的循环里，总量相同的葡萄糖被加入到全部的发酵过程中。全部发酵的初始葡萄糖浓度均为5g/l，在溶解氧升高10％后开始补料。使用在线检测来确定氧摄取率(OUR)，二氧化碳释放率(CER)，加入的全部碱量；取样后做离线的真菌形态学，培养液的流变学以及生物质浓度的分析。
真菌生物质(作为干细胞重测量)在全部发酵期间几乎是线性增加至终浓度约17g/l。回归分析显示在三个不同PF值的发酵过程中的生物质图之间不存在显著性差异(95％可信度)。
对于全部批次而言，为控制pH而加入的全部碱几乎为线性升高的，而且对于三个PF值来说，没有可辨的差别。因此，在补料批次期间的脉冲补料操作对这些能指示细胞代谢能力的变量没有明显的影响。
全部胞外蛋白浓度(作为相同九个发酵过程期间的时间函数)显示了初始蛋白浓度为大约1g/l，这归于来自接种物的残留蛋白，其在发酵的补料期间降低了。在初始葡萄糖被消耗掉后，补料开始而且低残留葡萄糖水平使得分泌蛋白表达。这引发了全部蛋白浓度明显的线性增加，并持续至每一批次结束。回归分析显示在三个不同PF值的发酵的蛋白浓度图之间不存在显著性差异(95％可信度)。
在发酵的补料批次期间，胞外蛋白浓度(g胞外蛋白每g干细胞质量)所示均值对应于PF值1.0，0.5和0.1分别为0.11±0.003，0.11±0.005和0.10±0.005，在这些PF值之间没有显著性差异。因此，脉冲补料对全部胞外蛋白浓度图没有明显的影响。
除全部胞外蛋白以外，我们还使用了SDS-PAGE以便了解这些蛋白作为时间函数的表观分布。确定了六个这些蛋白的相对浓度，而回归分析显示在不同PF值的发酵过程的蛋白表观分布之间不存在显著性差异。因此，脉冲补料并没有改变该系统中胞外蛋白的表达方式或表观分布。
虽然脉冲补料对代谢变量或胞外蛋白表达没有明显的影响，但其对真菌形态具有显著影响。特别是真菌单元的平均尺寸。我们使用了平均投射面积(A)来测定真菌单元的尺寸，其能将自由分散的菌丝和凝集团(此处所述的任一发酵中都未发现片状物)一起考虑。平均投射面积已经分为三个不同的时期。在第一个时期或每个发酵的补料阶段(t＜18小时)，A作为时间的函数升高。在第二个时期(18＜t＜50小时)，初始葡萄糖衰竭，补料开始，而A开始降低。这会持续至第三时期(50＜t＜110小时)，这时A保持一个大约稳定的值。回归分析显示在开始的两个时期间A图之间不存在显著性差异。相反的，在50小时和每一批次结束之间，时间平均的A在PF＝1.0和0.5的发酵之间(P＝2.2×10-4)，以及在PF＝1.0和0.1的发酵之间(P＝7.4×10-5)具有显著性差异。
因此，脉冲补料对真菌形态有可测量的和显著的影响。在脉冲补料发酵过程中的真菌单元要小于用持续葡萄糖流补料的发酵过程中的真菌单元。
这些发酵过程中的形态学行为显示了其对培养液粘度具有可测量的影响。我们发现与形态学分析相类似的，培养液粘度情况可被分为三个不同的时期。在第一个时期(t＜18小时)，粘度作为时间的函数升高，在第二个时期(18＜t＜50小时)，粘度保持相对稳定，在第三时期(50＜t＜110小时)，粘度再次升高。
在第一个时期或每个发酵过程的分批阶段，培养液生物质和A都升高，结果粘度同样升高。在第二个时期，生物质继续升高，但A降低。显然这两个现象相互抵消，结果粘度保持相对稳定。在第三时期，生物质升高而A保持稳定，这导致了粘度的第二次升高。对开始两个时期(t＜50小时)的时间平均的粘度的统计学分析显示在以三个不同PF值操作的发酵过程之间不存在显著性差异。但是，在第三个时期，(t＞50小时)脉冲补料发酵过程的粘度要显著低于对照组中的粘度。我们发现在这一时期，时间平均的粘度值为0.47±0.073，0.23±0.022和0.17±0.019，分别对应于以PF值1.0，0.5和0.1所实施的发酵过程，在以PF值1.0和0.5之间(P＝1.8×10-5)，以及在PF＝1.0和0.1的发酵过程之间(P＝2.4×10-6)具有显著性差异。
简单的补料策略，特别是其中脉冲定量给料时间短于暂停时间的，可应用于生产较小的真菌丝，其可导致发酵培养液粘度的显著降低。
实施例2
链霉菌发酵
关于培养液粘度有益降低的第二个试验来自产生天然胞内蛋白的丝状微生物鼠灰链霉素(Streptomyces murinus)。延长暂停时间可轻度增加生产能力，而能显著降低培养液粘度。
方法
三个相同试验尺寸的发酵罐从相同种子发芽罐中获取种子且同时以250公斤的起始重量运行相同的时间。种子形成培养基为普通发酵成分，包括葡萄糖，谷物浸液，磷酸钾和硫酸铵。主罐培养基为相同制备的，同样包括磷酸钠，硫酸镁和一些痕量金属。在主罐内生长的起始阶段，葡萄糖补料开始，其速率在余下的发酵过程中保持恒定。即，该发酵为这种生物的典型发酵方式。
测定每单位重量培养液的酶活性，通过使用遵守ISO-9001的校验方法测定每单位体积的培养培养液的干细胞重。使用采用了6cm锥体和平板几何学的 Carrimed压力控制的流变仪测定粘度。所述流变仪在指导下可施用10s-1&100s-1切变率，稳定的压力状态用于计算表观粘度。
结果
图1显示了来自三个补料批次发酵过程的结果(以标准化的形式)。在这些发酵过程之间的唯一差别为三个过程的最后一个具有延长的暂停时间：脉冲定量给料时间尽可能的快(＜10秒)而暂停时间为7分钟。
每单位质量的活性数据显示了对来自脉冲-暂停补料方式的酶活性的影响为较小而正向的，对每单位体积细胞干重没影响。粘度数据显示了根据脉冲-暂停补料方式的培养液粘度具有显著而高有益的降低。
结论
脉冲-暂停定量给料方式导致生产能力小幅度增加以及粘度显著性降低。这对大规模混合性能形成主要影响，其将导致能生成高生物质浓度而因此具有高产出率的大规模发酵成为可能。

Claims (8)

1.一种生产有价值的化合物的方法，包括如下步骤：
a)在发酵培养基中发酵丝状细菌或真菌，在发酵期间采用循环式脉冲定量给料/暂停的方式加入糖类，其中所述脉冲定量给料时间短于暂停时间；其中所述脉冲补料持续时间为从1秒-500秒，暂停持续时间为从60秒-1800秒；和其中所述发酵获得的培养基的粘度低于持续补料的发酵培养基的粘度，和
b)从发酵液中回收有价值的化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述有价值的化合物为抗生素或蛋白质。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述蛋白质为酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述酶为水解酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、氧化还原酶、或糖酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述丝状细菌为链霉属菌株。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述丝状真菌为曲霉属菌株。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖类选自，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或水解糊精。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖类的加入量为从0.01g糖类/kg培养液/小时-10g糖类/kg培养液/小时。
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