CN105087403A - 马克思克鲁维酵母菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种马克思克鲁维酵母菌，其保藏号为CGMCC？No.10621，本发明还提供了所述马克思克鲁维酵母菌的应用。相比于ATCC8585、ATCC26548等现有克鲁维酵母，本发明马克思克鲁维酵母菌具有更高的分泌蛋白的能力和更高的生物量，可用于生产酶制剂，并且可以用来构建重组蛋白表达系统。

Description

马克思克鲁维酵母菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种酵母菌，尤其涉及一种具有高分泌性能和高生物量的马克思克鲁维酵母菌、及其应用。

背景技术

目前已知的酶制剂有100多种，常用的有30多种，广泛用于食品、发酵、制革、纺织、日用化工、医药等工业。在我国规定可用于食品工业的有15种。

工业酶制剂来源于生物，但因通常使用的不是酶的纯品，制品中的有关组分(如微生物的某些代谢产物，甚至是有害的物质)有可能在使用时随着食品而被带入，从而影响人体健康。美国、加拿大、欧盟、澳大利亚、新西兰、日本等国均规定酶制剂必须经过严格的安全性评价，批准后才能生产销售。因此，利用微生物生产酶制剂时，其生产方法和培养条件都应保证是在受控条件下发酵，以保证所用的微生物不致成为有毒物质和其他有害物质的来源。

酵母(或：酵母菌)是一类单细胞真核生物，具有生长旺盛、培养简单和其独有的一些特性，它已被发展成为表达外源基因的重组表达系统。酵母作为单细胞生物一方面在操作和生产上具有细菌表达系统的特点，另一方面又具有真核细胞对翻译后蛋白的加工及修饰过程。如：二硫键的正确形成、前体蛋白的水解加工、糖基化作用等。

利用酵母表达系统表达外源蛋白的宿主包括：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、乳酸克鲁维亚酵母(Kluyveromyceslactis)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)、西方许旺氏酵母(Schwanuiomycesoccidentalis)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)和巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)。

克鲁维酵母安全不产生内毒素，营养要求极其简单、生长旺盛、生物量大、生长温度适应范围广(25－46℃)等优点，是用于发酵工业的重要微生物。

发明内容

本申请提供了一种具有高分泌性能和高生物量的马克思克鲁维酵母菌。

本发明提供的马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus；K.marxianus)，保藏号为CGMCCNo.10621(在本发明下述内容中，也可以称为马克斯克鲁维酵母FIM-1、K.marxianusFIM-1或KluyveromycesmarxianusFIM-1)。

本发明所述的马克思克鲁维酵母菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期为2015年3月13日。

本发明马克思克鲁维酵母菌，株菌落为圆形，呈乳白色，边缘整齐；酵母菌呈椭圆形，大小约为4-8μm，出芽生殖，单个、两个或多个系成串粘连。

本发明马克思克鲁维酵母菌，发酵分泌内切菊粉酶，并且在以葡萄糖为碳源条件下菊粉酶产量大于葡萄糖、菊粉混合碳源条件下的产量。

本发明第二个方面是提供一种马克思克鲁维酵母菌发酵方法，包括：

提供马克思克鲁维酵母菌CGMCCNo.10621；

在氮源和碳源存在条件下进行发酵；

收集菊粉酶。

其中，在所述发酵生产菊粉酶方法中，所述碳源优选为至少包括葡萄糖。

其中，在所述发酵生产菊粉酶方法中，所述氮源优选为至少包括酵母提取物。

其中，在所述发酵生产菊粉酶方法中，发酵时间优选为48-96小时。

其中，在所述发酵生产菊粉酶方法中，发酵温度优选为25-38℃，更优选为28-37℃，更优选为30-36℃，更优选为33-35℃。

其中，在所述发酵生产菊粉酶方法中，菌株接种量优选为0.05％-5％，更优选为0.1％-4.5％，更优选为0.5％-4％，更优选为1％-3％，如1.5％、2％。

其中，所述方法可以是用于马克思克鲁维酵母菌的高生物量发酵。

其中，所述方法可以是用于生产菊粉酶。

本发明所提供的马克思克鲁维酵母菌，相比于ATCC8585、ATCC26548等现有克鲁维酵母，具有更高的分泌蛋白的能力和更高的生物量，可用于生产酶制剂，并且可以用来构建重组蛋白表达系统。

附图说明

图1为本发明马克思克鲁维酵母菌分泌蛋白能力，泳道1：K.marxianusFIM-1；泳道2：K.marxianusATCC26548；泳道3：K.lactisATCC8585；泳道M；蛋白Marker；泳道4-8为那曲酸奶分离的不同的K.marxianus酵母菌株；

图2为本发明马克思克鲁维酵母菌细胞形态；

图3为本发明马克思克鲁维酵母菌高生物量发酵结果；

图4为葡萄糖为碳源的条件下(A)、葡萄糖和菊粉混合物为碳源条件下(B)，K.marxianusFIM-1分泌的菊粉酶产量对比，通道1-7依次为发酵24、48、72、96、120、144、168小时条件下的菊粉酶产量；

图5为本发明马克思克鲁维酵母菌发酵罐发酵菊粉酶的产量变化曲线；

图6为本发明马克思克鲁维酵母菌发酵罐发酵菊粉酶的蛋白电泳分析，通道1-7依次为发酵10、23、27、32、36、48、57小时条件下的菊粉酶产量。

具体实施方式

样品采集和酵母分离：

2014年8月从西藏那曲地区采集不同的酸奶样本。

取酸奶样本1g，用50ml的无菌水稀释，然后用无菌水进行10倍、100倍、1000倍和10000倍稀释，取100μl稀释液涂布于酵母固体培养基YNB(无氨基酵母氮源；YeastNitrogenBasewithoutAminoAcids)+1％菊粉平板上，30℃培养3-4天后形成克隆。

筛选

将酸奶样本中分离到的酵母菌以及从ATCC购买两株克鲁维酵母菌株Kluyveromyceslactis(保藏号：ATCC8585)和K.marxianus(保藏号：ATCC26548)，在含1％酵母提取物(YeastExtract)和2％的葡萄糖液体培养基中，30℃发酵培养120h后离心收集发酵上清，然后采用蛋白质电泳技术-SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测各株酵母分泌蛋白的能力。

其中发现：一株酵母FIM-1具有高分泌蛋白能力(如图1所示)，分泌蛋白的大小约90kDa左右。

菌株鉴定

酵母菌FIM-1的菌种的鉴定采用了18srDNA方法。

通过18SrDNA通用引物NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)和NS8(TCCGCAGGTTCACCTACGGA)，以提取酵母菌FIM-1的基因组为模板，进行PCR扩增与测序，获得了18srDNA序列如SEQIDNO.1所示，与GenBank中的已知序列进行比对后，发现获得的酵母菌FIM-1的18srDNA序列与K.marxianusNBRC1777的序列相似度为100％。

细胞形态学观察发现，酵母菌FIM-1的株菌落为圆形，呈乳白色，边缘整齐，显微下观察发现该酵母菌呈椭圆形(如图2)，大小约为4-8μm，出芽生殖，单个、两个或多个系成串粘连，这些表现与马克斯克鲁维酵母的细胞形态基本一致，因此该酵母菌命名为K.marxianusFIM-1。

本发明所述的马克思克鲁维酵母菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年3月13日，保藏号为CGMCCNo.10621。

高生物量发酵

1、实验材料

1)设备：全自动控制发酵罐，型号BIOTECH-5GB-9400A，5Lx5个。

2)有机氮源：酵母粉(安琪酵母，货号：81000235)；无机氮源：硫酸铵(国药集团，货号：10002918)；碳源：葡萄糖(国药集团，货号：63005518)。

3)消泡剂：豆油。

2、实验方法：

1)初始培养基：酵母粉40g，葡萄糖50g，初始体积1L。灭菌：115℃，20min。

2)发酵过程控制：pH7.0，用30％氨水调节、和10％HCl调节；溶解氧设定30％DOT，依靠转速调节溶解氧。

3)培养基流加：开始流加培养基时间是6-10小时，残糖浓度约为5-15g/L。

4)发酵培养时间：48-72小时。

5)培养温度：28-35℃。

3、实验结果：

按照碳氮比C︰N＝20︰1-5：1的比例，补料流速采用20-35g/h葡萄糖的流速进行碳源和1-1.25g/h氮源补料，发酵周期为48-96小时，放罐时发酵液总体约为2.2-3.5L。发酵过程消耗葡萄糖总量为850-1110克，酵母浸出物消耗量约180-232克，酵母细胞生物量约78-117g/L(干重)，细胞产率为0.56-0.62，细胞最大生长速度为2.92-3.29g/L。其中以20g/L葡萄糖流速进行补料获得的细胞密度及细胞生物量最高，如图3所示，发酵36h时细胞生物量110.1g/L，发酵57h时细胞生物量达117.2g/L(干重)，发酵过程中的细胞产率为0.62。

K.marxianusFIM-1分泌蛋白的鉴定

对K.marxianusFIM-1分泌的蛋白进行了AKTA进行了纯化，纯化获得的蛋白以1％的菊粉为底物进行降解实验，采用DNS方法检测低聚寡糖产物的形成。反应体系为：150μl体系中含1％的菊苣菊粉(Sigma-I2255)、50mM醋酸缓冲液pH4.5和10μl的纯化后的酶液，60℃反应结束后加入150μlDNS溶液，沸水浴煮10分钟后检测OD570吸光值，结果发现随着反应时间的延长，OD570的值不断增加，说明翻译体系中有低聚寡糖的产生，同时也说明该蛋白能够降解高聚合度的菊粉，是一种内切菊粉酶。

K.marxianusFIM-1发酵周期产菊粉酶实验

K.marxianusFIM-1发酵周期产菊粉酶实验采用两种培养基配方，一种是以含2％酵母抽提物、2％葡萄糖和2％菊粉，另一种培养基是含2％酵母抽提物、4％葡萄糖，按1％的接种量接种，然后摇瓶发酵培养7天，每各24小时取一次样，发酵液上清分别通过菊粉-DNS法测定菊粉酶产量和SDS-PAGE电泳检测总蛋白产量。

菊粉酶的酶活性测定：100μl体系中含1％的菊苣菊粉(Sigma-I2255)、50mM醋酸缓冲液pH4.5和3μl的发酵上清液，60℃反应10min后，取10μ反应液加入140μl的无菌水中，然后加入150μlDNS溶液，沸水浴煮10分钟后检测OD570吸光值，以果糖作标准曲线进行酶活性的定量，1U酶活性单位定义为每分钟催化产生1μmol的底物。

电泳检测总蛋白和酶活定量分析发现：在以葡萄糖为碳源的条件下(图4中A)K.marxianusFIM-1分泌的菊粉酶产量明显高于以葡萄糖和菊粉混合物为碳源(图4中B)，说明K.marxianusFIM-1菊粉酶可以被葡萄糖诱导表达，这为以后基于该菌株构建重组蛋白表达系统提供了很好的培养条件。

SDS-PAGE电泳检测结果表明K.marxianusFIM-1在两种培养基中菊粉酶的蛋白含量在96-120小时达到峰值(图4中通道4和5)，以葡萄糖为碳源条件下菊粉酶的最高可达48.3U/ml；而在以葡萄糖和菊粉混合碳源的条件，酶活产量只有29.5U/ml，随后酶蛋白开始发生降解(如图4中通道6和7)。

随后在5L的发酵罐中进行了K.marxianusFIM-1发酵以及产酶分析，发酵过程采用碳氮比C︰N＝20︰1的比例，以20g/h葡萄糖的流速和1g/h酵母粉进行碳源和氮源补料，发酵周期为57小时，发酵过程中进行取样和菊粉酶产量分析结果如图5和图6所示，发酵57小时后，菊粉酶产量达313.6U/ml。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)，其特征在于，该马克思克鲁维酵母菌保藏号为CGMCCNo.10621。

2.一种马克思克鲁维酵母菌发酵方法，其特征在于，包括：

提供马克思克鲁维酵母菌CGMCCNo.10621；

在氮源和碳源存在条件下进行发酵；

收集菊粉酶。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述碳源至少包括葡萄糖。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氮源至少包括酵母提取物。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，C︰N优选(3-8)︰1。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵时间为48-96小时。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵温度为25-38℃。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，菌株接种量为0.05％-5％。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法用于马克思克鲁维酵母菌的高生物量发酵。

10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法用于生产菊粉酶。