CN1304416A

CN1304416A - 液体介质中天然胶原蛋白的灭菌方法、所获得的无菌天然胶原蛋白、含有所获得的无菌天然胶原蛋白的组合物和应用

Info

Publication number: CN1304416A
Application number: CN99807085A
Authority: CN
Inventors: 哈姆扎·曼索尔
Original assignee: Octapharma AG
Current assignee: Octapharma AG
Priority date: 1998-04-10
Filing date: 1999-04-09
Publication date: 2001-07-18
Also published as: WO1999052946A1; DE69904578T2; EP1068240A1; ID26038A; FR2777284B1; CA2327882A1; NO20005079L; ZA200005497B; NO20005079D0; YU61100A; IL138562A0; BR9909566A; ATE229982T1; FR2777284A1; JP2002511489A; PL343523A1; HUP0102575A2; AU3151499A; EE200000592A; KR20010042539A

Abstract

本发明涉及制备天然胶原蛋白的方法,包括在具有双层横向切刀的混合器中预处理所述胶原蛋白,并且随后将液体介质中的所述胶原蛋白除菌,其中所述混合器配有控制搅拌和剪切速度的系统和恒温器。本发明也涉及天然状态、特别是药用组合物和/或parapharmaceutical组合物和/或内科－外科组合物和/或眼科组合物和/或化妆品组合物中的无菌胶原蛋白,特别是主要为Ⅰ型的胶原蛋白及其应用。

Description

液体介质中天然胶原蛋白的灭菌方法、所获得的无菌天然胶原

蛋白、含有所获得的无菌天然胶原蛋白的组合物和应用

本发明涉及制备胶原蛋白的方法，包括所述胶原蛋白的灭菌步骤，涉及由此获得的无菌胶原蛋白，涉及所述组合物和应用，特别是药用组合物和/或parapharmaceutical组合物和/或内科-外科组合物和/或眼科组合物和/或化妆品组合物及其应用。

在诸如Collagen，第1、2、3卷，Marcel E.Nimni.,CRC Press Inc,1988和Methods in Enzymology，第144卷，1987和第82卷，Leon W.Gunningham(编辑)的文献中已经一般描述了胶原蛋白及其应用。

众所周知，胶原蛋白是一种在大多数人类和动物组织中存在的、并且特别是在皮肤、腱和胎盘中发现的具有三维结构的分子。

其各种已知的特性特别是增加水分、血液凝固和伤口愈合。

例如在文献US-A-4,515,637中所述的，为了保持其止血作用，一般希望在将胶原蛋白给予人体内之前，保持胶原蛋白的天然形式。

此外，由于其应用，特别是其医学和/或化妆品应用，胶原蛋白必须无任何污染(病毒、细菌、朊病毒等)。在现有技术中已经用各种方法考察了胶原蛋白的灭菌，数年来面对新的挑战(由于胶原蛋白的天然来源，传播AIDS、Creutzfeldt-Jakob病等的风险)。

固体形式的胶原蛋白的灭菌技术包括特别是按照文献FR-A-2,393,581应用环氧乙烷或例如在文献EP-A-0,224,453中描述的辐射(应用β或γ电离辐射)。后一文献描述了基于胶原蛋白的海绵型的化妆品应用和药物用途，该文献建议以干燥形式灭菌，因为根据该文献，对加入乳液或溶液中的可溶性天然胶原蛋白灭菌是不可能的。

文献EP-A-0,664,132描述了一种用于外科应用的胶粘组合物，所述组合物基于通过氧化切割改性的非交联胶原蛋白。该文献中描述的组合物的一个最佳实施方案包括通过氧化切割制备非交联类型Ⅰ胶原蛋白[lacuna]的无菌粉末，然后通过在搅拌下加热至60℃将该粉末溶于无菌超滤水中。该文献指出，由于进行受控加热，所述胶原蛋白丧失其螺旋结构并且转化为明胶。此外，该文献解释到，该文献中的代表现有技术水平的基于交联胶原蛋白的所述胶粘组合物不易于处理，造成应用和机械强度的问题。

文献EP-A-0,667,352描述了一种用于溶液中胶原蛋白的碱处理，以便消除可能的朊病毒。为了避免所述朊病毒的残留污染的所有风险，该文献更具体地指出了一种方法，包括通过酶消化或通过碱切割连接胶原蛋白链的共价键从而溶解组织提取的胶原蛋白，然后通过过滤去除组织碎片，并且将由此溶解的胶原蛋白经过碱处理。

文献FR-A-2,586,703指出透明的基于Ⅳ型胶原蛋白的生理凝胶或胶原蛋白溶液的制备。然而，该文献指出，由于Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型胶原蛋白在中性pH下几乎不溶，因此仅允许生产半透明的悬浮液，并且不进行胶原蛋白分子的化学改性不可能使用它们制备透明的生理凝胶，而这些可能使得它们具有抗原性和/或毒性。

该现有技术的内容和通过研究工作的研究已经使得本发明人展示迄今在制备无菌天然胶原蛋白、特别是Ⅰ型胶原蛋白方面仍存在以下困难和问题：

^*处理

-天然胶原蛋白的高粘度，这在进行过滤、特别是直接过滤常规的液体介质中的天然胶原蛋白方面造成技术限制。

^*变性

-在各种通常的灭菌处理期间天然胶原蛋白部分或总的热变性，这引起例如部分或全部丧失其结构和/或其有益特性，诸如吸收、机械强度和增加水分。

-通过辐射(电离辐射)或用环氧乙烷灭菌，这引起例如溶液中待与胶原蛋白一起混合的有益的活性成分(诸如抗生素)变质和/或引起基于天然胶原蛋白的常规凝胶分离为两相，使得它不适用于商业用途。

-通过持续的碱处理引起的变性。

^*毒性和/或污染(病毒、朊病毒)

-在通过该方法灭菌的制品中存在痕量残留的环氧乙烷/在起始的粗胶原蛋白中存在污染物。

^*不相容性

-例如中性pH下可溶的有益活性成分(诸如抗感染剂)和在酸性介质中可溶的胶原蛋白之间pH的不相容性。

^*格林制剂

-基于天然胶原蛋白的制剂的外观不能令人满意，它具有纤维性的不均一的外观。

-生物胶粘剂的常规制剂的外观，它不适用于计划的用途(诸如不是即可使用的制剂，例如它们需要的制备时间太长)。

因此，本发明的目标是克服上述困难，并解决上述问题，特别是液体介质中胶原蛋白的灭菌，而同时保持其天然形式，也克服了下文提出的其它问题。

因此，本发明的主题是用于制备天然形式的胶原蛋白的方法，包括在混合器中预处理胶原蛋白的步骤以及随后对液体介质中的胶原蛋白灭菌的步骤，其中所述混合器具有双层横向切刀(double transversecutter)，配有用于控制搅拌速度和剪切速率的系统和一个恒温器。

本发明的一个主题也是天然形式的无菌胶原蛋白(尤其是主要为Ⅰ型的胶原蛋白)以及人用和/或兽用的组合物，其中所述组合物包含所述无菌胶原蛋白作为唯一的活性成分，或者在所述组合物中所述无菌胶原蛋白与其它从药用、parapharmaceutical、内科-外科和/或眼科和/或化妆品的观点看是可接受的有利物质相组合。

本发明的一个主题也是按照本发明的胶原蛋白的用途，即用于生产计划用于人类或动物机体的药物治疗和/或parapharmaceutical治疗和/或内科-外科治疗和/或眼科治疗和/或化妆品处理的组合物。

阅读以下详细描述后，本发明的这些主题和其它主题对于本领域技术人员而言是显而易见的。

目前可利用的制备无菌胶原蛋白的方法造成以上已经提及的实现上的问题，并且实际上，所述方法迄今尚不能容许对单独或在存在其它活性成分的情况下的液体介质中的胶原蛋白，进行容易进行且特别有效地确保所获得的胶原蛋白的无菌性和天然性质并且因此保持其有益特性的直接灭菌。

因此，本发明已经达到此目的，本发明涉及制备胶原蛋白的方法，包括以下步骤：在灭菌之前在混合器中机械性预处理已溶解并纯化、可选地用胃蛋白酶处理过的非无菌天然胶原蛋白提取物；其中所述混合器诸如由法国J.F.I.Graulhet公司出售并改进的商标为DITO-SAMA 175(LA BOVIDA)的“切刀式混合器”，它配有温度控制系统。最令人惊讶和意外的是，该预处理步骤使得可以灭菌处于液体形式的胶原蛋白并且保持其天然形式。

由此制备的胶原蛋白最好是主要为Ⅰ型胶原蛋白。

由此制备的主要为Ⅰ型的胶原蛋白是无菌的的非活性形式，即具有未改变的二级结构和三级结构，并且保持所有的其有益特性，特别在灭菌之后。

按照本发明的胶原蛋白可用于非常多的用途，这在后面详细描述，特别是：

-人类医学应用和兽医学应用：

药学应用

parapharmaceutical应用

眼科学应用

内科-外科应用

-化妆品应用。

它可以独自使用，即没有任何其它活性成分，例如为无菌透明溶液形式，

-用于注射用制剂

-或者作为生物胶粘剂

和下面详细说明的其它形式。

它可以在组合物中联合使用

-于低pH下，作为其它活性成分的溶媒用于立即释放所述其它活性成分。这些其它活性成分最好选自凝血因子，例如凝血酶；抗感染剂，例如灭滴灵；抗生素，特别是大环内酯诸如庆大霉素、氟代喹诺酮诸如甲氟哌酸；抗炎药，例如酰基羧酸或oxicam衍生物、类固醇或非类固醇抗炎药；抗真菌剂和生长因子，特别是骨生长因子，诸如促生长素和表皮生长因子，诸如EGF。

然而，在某些特定的用途中，例如在眼科学或在掺入与酸性pH不相容的活性成分(诸如糖肽抗生素万古霉素)的情况下，为了刚才这两个实例，显然最好具有中性pH的胶原蛋白。

当使用胶原蛋白作为持续释放活性成分(诸如凝血因子)的载体，或者当寻求活性成份的活性和机械作用的组合时，使胶原蛋白处于中性pH是有利的。因此，也特别有利的是使用按照本发明的胶原蛋白。

-或在特定应用中，通过以分层固体形式在酸性pH下和中性pH下混合两种预先的组合，这将在下文中描述。

作为按照本发明的胶原蛋白的非常多介绍的实例，可以提及：

液体形式：凝胶特别是注射用凝胶、滴剂、泡沫剂、喷雾剂，

-假固体形式：薄膜、片材、膜、绷带或贴剂等。

-固体形式：粉剂、层状/分层海绵、薄膜、膜、线、缝线等。

也可以在药用组合物或化妆品组合物、特别是增湿组合物(moisturizing composition)中利用按照本发明的无菌胶原蛋白的酸性和可溶性特性。

也可以例如使用按照本发明的方法获得的低pH下的假固体形式的胶原蛋白，所述胶原蛋白单独使用或与其它活性成分(诸如维生素E或维生素C)联用，特别是作为表皮上的组织增湿剂或作为面膜中活性成分的载体。

这些介绍和其它介绍将在本发明说明书的其余部分说明。

在本发明正文中，

术语“天然胶原蛋白”是指：未经改变其原始结构、其多肽链保持完整(包括端肽)和分子的螺旋结构保持完整的胶原蛋白。

术语“无端肽胶原蛋白”是指：通过用非胶原蛋白酶的蛋白水解酶(诸如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，或甚至更好为胃蛋白酶)的酶解消化进行有限蛋白水解、导致去除其端肽的胶原蛋白。当然，如果它为天然形式，则其保留其三螺旋结构。

术语“无菌胶原蛋白”是指：按照世界卫生组织、欧洲药典和美国药典(USP 22)的标准为无菌的胶原蛋白，即在按照所涉及的管理机构认定标准进行微生物分析后证明是无菌的。

术语“液态胶原蛋白”是指：溶液中的胶原蛋白或悬浮液、分散体或凝胶形式的胶原蛋白。

术语“假固体胶原蛋白”是指：不流动的凝胶形式的胶原蛋白，并且所述凝胶形成含有超过75％水的致密均匀的物质。

术语“固体胶原蛋白”是指：含有不超过10％-20％水的胶原蛋白，可以为固体形式，例如粉状、薄膜、海绵、膜等形式。

短语“具有聚合能力的天然胶原蛋白”是指：按照本发明的方法的变体制备的胶原蛋白，它当于高于37℃的温度下为液体形式，或从固体形式中溶解后，具有流体性质。它转化为均一的物质，而在不高于约37℃的温度下为“假固体”形式。这种胶原蛋白在性质上当然可以是无端肽的。

短语“溶解和纯化的提取物”是指：低pH(从1.5至6.5，通常为3-6，甚至更好为4-5)下的非无菌胶原蛋白提取物，其中硫灰含量(sulfuric ash content)一般低于2％，而脂质含量一般低于1％，并且它包含12％-13.9％的羟脯氨酸和17-18.7％的总氮，它不含痕量色氨酸或低于95,000 Da的多肽链。

这种提取物可以得自干燥的新鲜石灰鞣革(诸如牛皮或兔皮)和/或特别是牛、山羊、猪、绵羊、马、兔、牡鹿、鸵鸟、鱼的结缔组织等，或得自干燥或新鲜的动物骨、角膜或甚至腱(例如鸵鸟Achilles的腱)，或者得自纯化的胶原纤维或粉末。它也可以从人类来源的胎盘中提取。

通过一系列处理制备可用于本发明范围的提取物，所述处理概括而言包括：

石灰处理/去除毛发/洗涤/脱灰/去除表皮和皮下组织/切碎/旋转干燥/于25℃下浸入1N NaOH中12小时/洗涤以完全消除NaOH/研磨/切成薄膜/在0.01％TritonX100浴中脱脂/可选地在K₂HPO₄浴中消除氨基葡聚糖/洗涤/旋转干燥/用纯水洗涤/旋转干燥/在10^-2M乙酸、一氯乙酸或柠檬酸中酸化/可选地稀释所述胶原蛋白提取物。

所述提取物可以为水溶液、悬浮液、分散体或凝胶或糊剂等形式。

本发明的方法可以应用于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白等。然而，下文纯粹作为非限制性说明，除非另有说明，否则术语“胶原蛋白提取物”和“胶原蛋白”是指胶原蛋白提取物或主要为Ⅰ型的胶原蛋白。

因此，在本发明范围内，胶原蛋白提取物主要由Ⅰ型胶原蛋白组成，即含有高于90％的Ⅰ型胶原蛋白。所述提取物也可以完全由Ⅰ型胶原蛋白组成，例如按照已知的透析、离心和用氯化钠示差沉淀的技术继续消除Ⅲ型胶原蛋白。

Ⅰ型胶原蛋白为285,000道尔顿的高分子量聚合物，以两个相同的称为α1(Ⅰ)₂的多肽链和称为称为α₂(Ⅰ)₂的多肽链的三螺旋缔合构成。它属于丝状胶原蛋白家族(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型)。

胶原蛋白有一个变性峰，该峰取决于其来源、产生其的提取方法及其交联或非交联形式。在非交联形式中，变性峰在35-45℃。

通过在所述链经电泳迁移后对聚丙烯酰胺凝胶进行测光密度术测量，主要为Ⅰ型的胶原蛋白的α₂(Ⅰ)₁/α₁(Ⅰ)₂比率为0.48-0.52。

通过使其交替通过高于或等于pH13的缓冲液和pH低于或等于2.5的缓冲液进行化学处理，可以进行该提取物的病毒灭活和可选地存在胃蛋白酶的病毒灭活。一般进行本身已知的处理，诸如浸于4％氢氧化钙与3％硫化钠混合的浴中，然后浸于0.5％偏亚硫酸氢钠与2％氯化铵混合的浴中。

如例如文献FR 2,586,703中提出的，通过钠处理使得pH回至6.8-7.4，进行可选的中和胃蛋白酶。

同样的，也可以以已知方式，如WHO(WHO/COS/VHP/92.104)和欧洲共同体1991年12月11日的指导中描述的方式，消除导致牛海绵状脑病并被称为“朊病毒”的可能因子。因此，这种消除可以包括用1N氢氧化钠溶液于25℃处理1小时至48小时，或者用次氯酸钠于25℃处理至少1小时。

因此，按照第一个方面，本发明的主题更准确地为从已溶解和纯化的非无菌天然、可选地无端肽的胶原蛋白的提取物制备胶原蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在具有双层横向切刀的混合器中混合并剪切所述提取物1分钟至60分钟，通常为15分钟至40分钟，最好为10分钟至20分钟，搅拌速度为100rpm至10,000rpm，一般为500rpm至7000rpm，最好为1000rpm至5000rpm，而同时控制温度；然后将所述提取物灭菌，结果获得天然形式的无菌胶原蛋白。

由此获得的胶原蛋白可以为液体、凝胶、假固体或固体形式。

最好是，按照第一个实现变体并且当所述提取物通常不进行胃蛋白酶处理时(为了简化，下文的“变体1”是指不用胃蛋白酶处理的本发明方法的实施方案，除非另有说明)，通常受控的温度一般不超过40-50℃，或甚至在交联剂存在下不超过60-80℃(按照该变体的替代方法的另一实施方案，该实施方案将在下文中详细描述)。

按照本发明方法的第一变体，由于所述提取物不经胃蛋白酶处理，因此其温度逐渐从室温增加，直至在所述混合器中达到40℃至50℃，同时将初始搅拌速度从500rpm分段增至至高5000-7000rpm，在粘度增加的各阶段，进行提取物的稀释。所述胶原蛋白由此保持选定的高粘度，同时降低其浓度。有利的是，所述高粘度为17,000-20,000cps。例如，当所述最高温度为42℃至44℃时，让所述提取物在所述灭菌步骤之前静置。

我们在灭菌后观察到，由此制备的胶原蛋白保留其天然形式并获得改进的特性，特别是弹性和机械强度。它具有胶粘和聚合能力。

所述混合器中的所述提取物最好以每段3℃至5℃从室温分段升至至少40-50℃，同时也以每段500-1000rpm分段提高搅拌速度，以达到1500rpm至7000rpm的速度，最好为5000rpm。

实际上重要的是分段提高温度，由于温度的突然提高瞬时使胶原蛋白变性，而不足以提高其弹性特性。将该温度升至至少40℃，因为低于此温度，随后的过滤难以进行或甚至不可能进行。

同样重要的是分段提高搅拌速度，以更好地控制选定的高粘度，而同时降低胶原蛋白的浓度，正如已经提及的。

提取物中胶原蛋白的浓度为0.001％-15％，一般为0.1-10％，最好为3-6％。

然而如上所述，所述混合器中的温度可以达到更高的值，在诸如戊二醛和氨基酸(azyl acid)(诸如肼)的交联剂或与胶原蛋白相容的任何其它交联剂存在下，它可以高达80℃。当存在这些交联剂时，对于这些交联剂在提取物中的终浓度，在戊二醛的情况下，为0.00075％-0.1％，最好为0.0075％-0.01％，在肼的情况下为0.1-2％，最好为0.5-1.5％。由此“交联的”胶原蛋白因此具有较高的设定温度，可以约为40-50℃，其体内吸收时间比非交联胶原蛋白长，并且可以长达8周至12周。

根据依照本发明方法该变体、包括获得粘性液体形式的无菌天然胶原蛋白的一个特定实施方案，进行以下程序：

-制备约10-15％的足够高浓度的非无菌天然胶原蛋白，由兔皮或鸵鸟Achilles腱中提取。

-然后在已经提及的具有双层横向切刀的混合器中，将非无菌天然胶原蛋白的提取物于500-1000rpm的温和速度和约20℃的室温下经过搅拌和剪切。

-分段增加旋转速度和剪切速率，这有大大提高提取物粘度的效应。该粘度值可以为7000cps至20,000cps。从1500cps，提取物实际上具有弹性外观，这使得其难以在混合器中搅拌和剪切。

-在粘度提高的每个阶段，通过加入注射用水(WFI)或10^-2M柠檬酸而稀释提取物，并且分段提高混合器中的搅拌速度和温度，直至获得约20,000cps的非常高的粘度。

-重复该操作数次，最好重复4-5次，直至温度达到35℃，速度为3000-5000rpm，而胶原蛋白的浓度达到约3-6％。

-将产物在所述35℃的温度和所述3000-5000rpm的速度下保持数分钟，最好为3-5分钟。

-在非交联胶原蛋白的情况下，提高混合器中的温度，直至达到40-50℃，最好为40-45℃。在该温度下，最令人惊讶地观察到提取物的液化，粘度降低至约40-100cps。

-立即于40-50℃的受控操作温度下，将如刚刚所述制备的胶原蛋白提取物通过孔隙率为0.45μ-0.22μ的膜充分过滤。

-然后使其经过灭菌，最好通过通过孔隙率为0.22μ的膜(诸如Millipore公司销售的Millidisck膜)，于40-50℃的受控操作温度下进行绝对过滤(absolute filtration)而除菌。选择40-50℃温度下的过滤时间，以不超过1小时，更好为10-20分钟。也可以最好通过加入过乙酸进行灭菌，所述过乙酸特别是由Air Liquide公司生产的，名为Soproper，过乙酸在充分过滤的提取物的终浓度为所述胶原蛋白的0.5％-50％(干重)，最好为5％-15％(干重)。通过以每1g过乙酸加入2-20g硫代硫酸钠，最好加入4g-12g/g硫代硫酸钠的比例，进行所述灭菌剂的中和。用过乙酸灭菌所需的接触时间于室温下为1小时至24小时，最好为2小时至4小时。

按照本发明方法的该第一变体的、包括获得假固体凝胶形式的天然胶原蛋白的另一具体实施方案，由于胶原蛋白的浓度为0.5％-10％，因此也最好通过以2.5Mrad(β或γ电离辐射)的剂量辐射而直接将其灭菌。意外地观察到，所述假固体凝胶保持致密和均质，并因此与常规凝胶不同，没有分离为两相，并且它保持其物化特性和其聚合能力。最好可以将用该方法灭菌的这种假固体凝胶液化，以便与对电离辐射敏感的其它活性成分(诸如凝血因子、抗生素、抗真菌剂等)混合，以用于生产液体或固体组合物，特别是通过以下实例引述的制剂：海绵、粉剂、薄膜、膜、贴剂等。

当将这种灭菌方法用于按照该方法的这种第一变体获得的胶原蛋白固体制剂，并且所述制剂独自或与抗电离辐射并且选自本发明文献中引述的治疗药类别的活性成分联合时，没有发生该形式胶原蛋白的物化性质或聚合能力和胶粘能力的改变。

按照该变体1，按照发明的方法也可以包括一种中和步骤。所述中和步骤可以在灭菌步骤之前或之后进行。该中和步骤可以用例如氢氧化钠进行，以将pH调至6.8-8.2，最好为7.0-7.4。最令人惊讶的是，注意到粘性液体形式的胶原蛋白于40-50℃的温度下的这种中和，不引起胶原蛋白的任何沉淀。提取物保持澄清或半透明的粘性液体形式，并在与低pH下的胶原蛋白的相同条件下快速凝固。它是非常有利的，因为胶原蛋白在中性pH下沉淀，阻止了某些制剂(诸如基于胶原蛋白的凝胶，或胶原蛋白与万古霉素的组合)的生产。

用已经提及的常规技术对本发明胶原蛋白分子的分析，证实了由此中和的所述胶原蛋白的一级结构、二级结构和三级结构的完整型。

按照变体1获得的胶原蛋白的特征为：

注意到最令人惊讶的是，按照本发明方法的第一变体灭菌的胶原蛋白保留其天然形式。

在40-50℃的温度下，它为粘性半透明液体。

其粘度的变化范围一般为20cps至300cps，优选为30-200cps，甚至更好为40-100cps。

其pH一般为1.5-6.5，优选为2-5，甚至更好为3-4。

其浓度一般为0.001-15％，优选为0.1-10％，甚至更好为3-6％。

它在低于或等于38℃的温度下凝固非常快。它为假固体形式，这种形式具有显著的止血胶粘剂的胶粘特性。在约38℃的温度下，其凝固时间在高于或等于5％的浓度下少于1分钟，在3％-4％的浓度下为1-2分钟，而在低于2％的浓度下约为3分钟。

获得的天然无菌胶原蛋白也具有以下的其它重要特征或特性：

-主要为(即含有90％或90％以上)Ⅰ型的胶原蛋白，即α₂(Ⅰ)₁/α₁(Ⅰ)₂比率为0.48-0.52

-含水量：高于80％

-外观：在高于约38℃的温度下为液体，并且接触时有粘性；在低于约38℃的温度下为假固体致密并且均匀胶凝的物质。

-总氮：17.0％-18.7％

-羟脯氨酸：12％-13.9％

-无色氨酸、氨基葡聚糖和分子量＜95,000道尔顿的多肽

-液体＜1％

-硫灰量＜2％

-变性峰：38℃-45℃，通过差示自动记录测温法(DSC)测量。

-胶粘能力

-聚合能力

-在室温下保持

-即可使用。

因此，本发明的一个主题也是具有上述特征的这种胶原蛋白。

按照本发明方法的这种第一变体获得的基于胶原蛋白的制剂和用途：

如上所述，酸性或中性pH下的按照本发明的胶原蛋白具有聚合能力和显著的胶粘特性。后者与其止血特性和吸收特性结合，赋予其可吸收止血胶粘剂的特性。

本发明的胶原蛋白可以优选分装到2-5ml的注射器或管形瓶中，所述注射器或管形瓶最好由玻璃制成，并且保持在允许其聚合或凝固的0-38℃的温度下，甚至更好为室温下。

按照本发明的这种可吸收止血胶粘剂的另一有利形式是干粉或干海绵形式。这种形式在使用前不需要预先制备。

为了获得这种形式，使以粘性形式获得的本发明的胶原蛋白例如经过冻干。

将本发明液体形式的胶原蛋白在无菌条件下均匀地分装到容器中(冻干盘)，产生冻干物，其厚度为1-20mm，最好为2-10mm，甚至更好为3-5mm。获得的冻干物为乳白色并具有略有弹性的薄膜形成外观。其含水量为1％-25％，最好为5％-15％。所述冻干物可以经过研磨以产生选定的小粒度的粉剂。

对于粉剂的制备，在冻干前其胶原蛋白为约3-6％或更高，以确保更好地喷雾。

将研磨后的粉末分装到具有双层盖的无菌聚乙烯管形瓶或使得能够保持无菌性并有利于在出血表面喷雾的另一容器中。

在海绵的情况下，胶原蛋白的浓度应该相对低，最好为1-2％。

可以将薄膜形成海绵在冻干后单独包装到双层袋或泡罩中，经热封封闭。根据用途，它们的形状例如为正方形、三角形或圆形，边长或直径为1cm-30cm。

上述两种干燥形式的作用类似于已经描述的液体形式的作用。然而，薄膜形成海绵也施加机械作用，这在出血和郁滞时放血的情况下，特别是腹部出血和郁滞时放血时是必须的。

这种胶粘剂无论其形式如何，特别是粘性液体、假固体、薄膜形成海绵或粉剂，均可以与活性成分联合，所述活性成分特别是药用活性成分，诸如参与加快止血的凝血因子(诸如凝血酶、血纤蛋白原、因子Ⅻ等)或者抗生素，特别是在骨外科的情况下。

当这种胶粘剂含有凝血因子时，它可能最好与稳定剂结合，所述稳定剂诸如多元醇(例如甘油或聚亚烷基二醇，其中所述亚烷基具有1-4个碳原子，诸如特别是聚乙二醇或聚丙二醇)或单糖、双糖或多糖(诸如葡萄糖或蔗糖)。

关于由按照本发明方法的变体1的粘性液体形式的胶原蛋白获得的其它制剂，可以提及：

假固体贴剂，作为活性成分的载体用于上皮外局部使用，或者作为特别适用于三度烧伤患者的结瘢喷雾剂、以及用于化妆品用途的增湿面膜。

所述贴剂可以掺入一种或多种抗生素、消炎药、防腐剂、抗细胞剂、抗真菌剂和抗霉菌剂和其它生理上和药学上的活性物质，特别是水杨酸或烟碱。这些活性成分在高于40℃的温度下加入，直至获得均化。将混合物脱气并在压力下用一种系统(例如计量泵)驱动，分装为密封包装物(例如泡罩或聚乙烯薄膜等)。将液体冷却至室温后，通过热封将包括物密封。

贴剂中所用的胶原蛋白浓度范围为1-8％，最好为2-5％。

当存在抗生素时，以每mg胶原蛋白的mg数计，所述抗生素的浓度如下：

庆大霉素：0.01-2mg/mg，甚至更好为0.1-0.7mg/mg，最好为0.15mg/mg至0.5mg/mg。

万古霉素：0.01-2mg/mg，甚至更好为0.1-0.7mg/mg，最好为0.15mg/mg至0.5mg/mg。

甲氟哌酸：0.01-2mg/mg，甚至更好为0.05-0.5mg/mg，最好为0.075mg/mg至0.25mg/mg。

贴剂的厚度范围为1-5mm或更厚。然而，贴剂的厚度最好为1.5-2.5mm。

根据设想的用途调整长度和宽度。

按照本发明获得贴剂有假固体形式，为挠性、强的高度水合的(含水量高于80％)，并具有半透明外观。

它易于应用于内部或外部组织表面，无论所述组织表面是受损害的还是健康的。在应用于外部上皮的情况下，贴剂可以固定到不渗透性低致敏性胶粘剂上，使其粘附并保持在组织表面上。

通过将所述胶原蛋白单独或与活性成分(诸如维生素(C、E等))、表面活性剂(诸如洁尔灭)或增湿剂(诸如甘油)联合注入例如缓慢移动所传送带上，使得有可能获得均匀厚度的均匀的薄膜。冷却后，将其切为合适大小的假固体形式，并包装到气密袋(例如由具有内部聚乙烯衬里的铝制成)中。

可用于制备这种面膜的胶原蛋白浓度一般为0.2-3％，甚至更好为0.5-2％，最好为1-1.5％。

形状和大小没有限制。面膜通常具有A4型纸张的形状和大小(21×29.7cm)。厚度一般为0.5-3mm，最好为1-1.5mm。

面膜有假固体形式，它的挠性非常强，触感柔软，为半透明的，并且高度水合(含水量高于97％)。它非常容易应用于皮肤。可以向其中加入一种或多种染料和与胶原蛋白相容的其它活性成分。

喷雾剂含有与对于贴剂所述的浓度和组合相同的所述胶原蛋白和所述活性成分。最好将其包装到5-25ml的单剂量管形瓶或喷雾器中，所述管形瓶和喷雾器最好由玻璃或聚乙烯制成。

使用之前，通过在水浴中或在温箱中加热2-3分钟，使于室温下为聚合形式的胶原蛋白在其原始包装中液化。在胶原蛋白凝固前，立即以一定距离将其喷雾到组织表面上。

如此喷雾的胶原蛋白粘附至组织表面并在该表面上非常快速地聚合，因此形成止血和结瘢的均一薄膜。这种喷雾剂在目的是结瘢作用和/或持续释放活性物质(诸如抗生素、防腐剂、抗霉菌剂、消炎药等)时特别适用。

这种从一定距离喷雾的装置的优点是避免操作者与受损害组织表面接触，由此避免了任何可能的局部感染的风险。

由于按照本发明的胶原蛋白的特殊性质而特别有利，并且成为可能的这种喷雾剂的用途之一尤其涉其三度烧伤的患者，对于所述患者而言保证无菌和快速护理是必需的。

同由按照本发明方法变体1的粘性液体形式的胶原蛋白获得的其它制剂一样，也可以提及：薄膜或膜，通过注入到例如聚乙烯带上，然后在鼓风的温箱中风干或真空干燥而获得。操作温度为10℃至35℃，最好为20℃至25℃。

为了获得例如厚度低于1mm、最好为25μm-250μm的薄膜，胶原蛋白溶液通常使用的浓度范围为2-5％，最好为2.5-3.5％。干燥时间的范围可以为1小时至120小时。最好是，干燥时间为约24小时。具体地说，观察到用相对缓慢干燥和相对低的空气流速获得最佳结果。

如此获得的薄膜或膜的含水量为1-15％，最好为5-10％。将其在无菌条件下或者手工或者自动切割，并包装到密封的不可渗透的包装中。

以类似于上述其它形式的方法，所述薄膜或膜可以含有活性成分，诸如抗生素、防腐剂或消炎药等。它们可以由酸性(低pH)或中性胶原蛋白生产。

将其用于外部或内部目的，以结瘢和/或释放活性成分(例如一种药用活性成分)。因为它们与出血湿表面接触时具有弹性，所以它们可以有利地形成粘附至受损害组织区域的被膜(envelope)。

在眼科应用方面，它们最好可以由pH6.8-7.2的胶原蛋白生产。在这种情况下，所述薄膜或膜可以采用例如储液圆筒(reservoir cylinder)或透明的隐形镜片的形式，以将活性成分持续地局部传递至眼。当需要使用这种液体形式的胶原蛋白形式(滴剂/洗眼药)时，所述胶原蛋白保存于胶囊或其它单剂量包装中，这在使用之前必须再加热。

在眼科应用的情况下，中性pH的胶原蛋白浓度，对于膜或镜片而言为1％-2.5％，最好为0.5％-2％，而对于中性pH滴眼药而言，胶原蛋白的浓度为0.1％-1.5％，最好为0.2％-0.5％。

本发明的一个主题因此也是上述的组合物，对此仅作为说明，已经引述了某些可能的药用形式。

按照本发明方法的第二变体，所述提取物在温度控制的所述混合器中机械处理之前，如下文所述用合适的酶(除胶原蛋白酶外)有限蛋白水解，所述酶诸如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或胃蛋白酶，最好是胃蛋白酶。一般而言，所述提取物中胶原蛋白的浓度为0.1％-2％，甚至更好为0.2％-1％，最优选为0.3％-0.5％。

然后如下处理所述胃蛋白酶处理的提取物(纯化、溶解的)：

-通过各种孔隙率的膜分级进行澄清过滤，例如通过孔隙率为100-50μ的膜，然后通过20μ、1μ直至0.45微米的膜。

-然后进行一个新的纯化步骤，即用碱土金属盐(例如用氯化钾或氯化钠，最好为氯化钠)差示沉淀，然后可选地对K₂HPO₄和Na₂HPO₄磷酸缓冲液透析，最后离心以回收沉淀的胶原蛋白。

-通过在纯水中温和搅拌，将如此获得的沉淀均化，胶原蛋白的浓度为1％-30％，然后洗涤2-3次，然后再悬浮于纯水中，于0℃至20℃的温度下，最好是在0℃至10℃的温度下，温和搅拌48小时。

-将该悬浮液离心或经旋转干燥倾析。将胶原蛋白收集于pH为2-5最好为2.5-3.5的低pH的10^-2M柠檬酸溶液中，其体积作为选定的胶原蛋白终浓度的函数计算。

-不经搅拌，让所述沉淀于0℃至10℃的低温下在这种酸性溶液中静置2小时至48小时，最好12小时至24小时。胶原蛋白沉淀溶涨，失去其白色以变为半透明。

-将沉淀转移至具有双层横向切刀的混合器中，诸如已经提及的DITO-SAMA切割器/混合器，然后将搅拌速度和剪切速率逐渐增加，以使搅拌速度达到优选为1000-5000rpm，甚至更好为2000-3000rm，同时控制温度的增加以使其不超过35℃，最好为25℃，直至获得完全溶解。所获得的溶液为清亮的。

再者，从最好主要由Ⅰ型组成的胶原蛋白提取物制备所述胶原蛋白。

按照该变体2，如此获得和纯化的天然胶原蛋白溶液随后最好可以在操作温度下通过孔隙率为0.22μ的膜绝对过滤而除菌，所述操作温度按照该变体最好为20-25℃的温度，或者通过在与以上所述的相同条件下加入过乙酸而灭菌，或者通过对预干燥形式进行电离辐射(2.5Mrad)而灭菌，所述预干燥形式可选地的溶于无菌液体介质中，以与对电离辐射敏感的、选自本发明文献中提及的治疗药物类别的活性成分无菌制剂混合。

在于室温下进行灭菌步骤之后，最好进行可选地的中和步骤。于室温下，观察到从中和的第二小时起沉淀物开始形成。因此，特别有利的是将所述胶原蛋白保持在0℃至8℃的温度下，并在中和后的前两个小时、最好是前1小时、甚至更好在30分钟内，制备胶原蛋白和在低pH(pH1-6.5)下不相容的其它活性成分的组合或混合物，然后开始具体进行可选的冷冻、冻干或风干或真空干燥的步骤。

按照变体2获得的胶原蛋白的特征为：

如此获得的无端肽胶原蛋白是无菌的天然形式。它是粘度为2cps至40cps的低粘度的清亮溶液形式，如果需要为酸性或中性pH。

如此生产的胶原蛋白的其它特征如下：

-含有90％或90％以上Ⅰ型胶原蛋白的胶原蛋白，即α₂(Ⅰ)₁/α₁(Ⅰ)₂比率为0.48-0.52

-变性峰：38℃-45℃，通过差示自动记录测温法(DSC)测量。

-总氮：17.0％-18.7％

-羟脯氨酸：12％-13.9％

-无色氨酸、氨基葡聚糖和分子量＜95,000道尔顿的多肽

-脂质＜1％

-硫灰量＜2％

因此，本发明的一个主题也是这种无菌无端肽天然胶原蛋白。

基于按照变体2获得的胶原蛋白的制剂和用途。作为实例可以提及：

-不经改性而使用酸性pH的液体形式，作为组织增湿剂或在制剂中以例如0.1％-3％的浓度与化妆品活性成分联合；在结瘢治疗制剂中例如在皮肤学活性成分(诸如消炎药、局部防腐剂(antiseptics)、抗细菌剂、抗真菌剂、水杨酸等)存在下联合使用。这些制剂为外用的乳膏、凝胶、泡沫剂或软膏剂，所述胶原蛋白以1％-3％的浓度掺入其中。它们也可以为外用的液体或喷雾剂形式，胶原蛋白的浓度为0.1％-1％。提及的活性成分以已知的治疗剂量使用。

-在中性pH下以膏状或凝胶形式结合磷酸盐和强碱盐(例如氯化钠)使用，则胶原蛋白的浓度例如为2％-7％，例如在皮肤抑制诸如皱纹或细纹的校正方面，或者用于诸如在尿失禁的情况下加强平滑肌，或最后用于生产组织代用品诸如心脏瓣膜或骨代用品，则所述胶原蛋白特别是与羟基磷灰石或珊瑚联用。

-在中性或酸性pH下用于泡沫剂，所述泡沫剂含有低浓度胶原蛋白，特别可用于外科和显微外科，用于修复损伤的组织和用于确保维持组织间和实质间隙，并避免损伤或病灶组织之间解剖病理学粘连(最好在实质外科、心血管外科、胸外科、整形外科或ENT外科中)。这种泡沫剂可以掺入活性成分，特别是抗生素、防腐剂和消炎药，其浓度与按照变体1的制剂中提及的浓度相同。这种泡沫剂将在以下更详细地描述。

使用按照变体2的这种无菌胶原蛋白，特别是借助冻干进行干燥，也可能制备可吸收的止血海绵，由于其止血作用和作为一种或多种活性成分(诸如特别是抗感染剂和/或凝血因子)的局部载体，因此它们特别有利。

由按照变体2的酸性pH胶原蛋白获得的这种海绵非常有益，因为它们一旦与液体介质接触后则可立即溶解，这使得可以立即释放一种或多种活性成分。由按照变体2的中性pH胶原蛋白获得的这种海绵，其外观为微丝状的，使得可以持续释放并同时对它们粘附的出血表面施加有益的机械作用，

酸性或中性pH的、浓度为0.1％-3％(优选为0.2％-2％，甚至更好为0.5％-1％)的胶原蛋白可以用于制备这种海绵。

当存在庆大霉素、甲氟哌酸和万古霉素时，这些抗生素以已经提及的变体1制剂的浓度使用。

也可以存在其它活性成分，诸如浓度(以每mg胶原蛋白的国际单位计)为0.1IU/mg-20IU/mg(优选0.5IU/mg-10IU/mg，甚至更好为1IU/mG-5IU/mg)的凝血酶和比例为0.1mg/mg-20mg/mg(优选0.1mg/mg-10mg/mg，甚至更好为0.5-5mg/mg)的血纤蛋白原。也可以联合其它活性剂，诸如其它血液衍生物，特别是凝血酶原、因子Ⅹa、因子Ⅸa、因子ⅩⅢ和凝血的内在机制和外在机制的任何其它激活剂或激活剂前体、可选地联合其它生理上和药学上的活性物质，诸如血纤溶酶原的激活剂和抑制剂、或例如抗纤溶药物。也可以联合其它物质，例如调节胶原蛋白吸收的特定的酶或者交联剂。

在不锈钢、玻璃或聚乙烯制成的容器中，于5℃至35℃的温度下，优选10℃至30℃，甚至更好于15℃至20℃下，制备按照本发明的胶原蛋白和上述活性成分的混合物。

正如所述的，当所述胶原蛋白为中性pH时，它应该在中和后2小时内使用。然后将混合物分装到冻干容器中，使得可以获得厚1-20mm、优选3-15mm、甚至更好为5-8mm的多层。这些制剂因此可以按照以下操作参数作为单层冻干：冷冻温度为-5℃至-60℃，吸收温度为20℃至50℃，一般为25℃至40℃，最好为30℃至35℃。

如此获得的海绵制剂是白色的，具有均匀、针织绒毛状外观。它们的含水量为1％-25％。

按照本发明的海绵可以不经改性而使用，或者可以通过对其分别施加压力就地(在冻干机的室内)层压，或在无菌条件下使其通过轧制机于冻干机外层压。这一操作使得可能提高这种类型海绵的强度。

所述制剂可以有利地以一层或多层冻干。在这种情况下，各层之间的粘附优选在-11℃至-20℃、最好-11℃到-13℃的选定温度的冷冻期期间发生。则获得层压物，其中例如两个下层可以含有例如与凝血酶和血纤蛋白原混合的酸性pH的胶原蛋白(使得可以释放这些制品并形成生物胶粘剂)，并且其中上层例如由中性pH的胶原蛋白组成(使得可以如已经提及的对出血表面施加机械作用)。上述形式使其可以非常有利地作为生物胶粘剂的载体，而不象其它已知的胶粘剂一样预先制备。有利的是，中性pH的层含有抗生素，这使得它们持续释放，这在骨感染的情况下特别有利。各层的顺序以及层数的选择不重要，这在本领域技术人员的技术范围内，本领域技术人员会根据设想的用途调节层顺序和层数。

在按照本发明的这些组合物中，也可以包括稳定剂，诸如多元醇、聚亚烷基二醇或多糖，或者为氨基酸或与胶原蛋白相容的其它活性剂诸如消炎药，或者为已经提及的交联剂，以在此有利地增加其吸收时间。也可以联合具有机械作用并使得可以进行缝合的其它可吸收药物，诸如纤维素或氧化纤维素组织或vicryl^(由Ethnor公司出售)。

此外，可能联合其它活性成分、再按照本发明方法的变体2获得的酸性或中性pH的胶原蛋白，在冻干或干燥后可以生产止血粉剂。则所用的胶原蛋白的浓度为1％-3％。

本发明的一个主题因此也是上述组合物，关于这些组合物，已经描述了代表按照变体2获得的非聚合胶原蛋白制剂的可能的药学形式。

下文给出本发明某些主题的非限制性实施例并参考附图，在附图中：

-图1和图2为聚丙烯酰胺凝胶电泳图，分别显示在本发明的机械处理和热处理之前和之后的Ⅰ型胶原蛋白多肽链的分离(变体1)。

-图3和图4为所述胶原蛋白热变性图，分别表明在本发明的机械处理和热处理之前(变体1)和之后的所述胶原蛋白的天然(未变性)性质。

实施例

实施例1：制备具有聚合能力的胶原蛋白的方法(变体1：非胃蛋白酶处理的提取物)

将如上由鸵鸟Achilles腱制备的10％的胶原蛋白提取物转移到已经提及的具有双层横向切刀的混合器中。然后于室温(20℃)下以1500rpm的速度和速率搅拌和剪切7分钟。注意到粘度增至15,000cps。提取物变为灰白色并具有弹性外观。然后进行连续稀释以获得6％的胶原蛋白浓度。每次稀释后，以3-4分钟的间隔温度逐渐增加4℃，搅拌速度逐渐增加500rpm。当达到3500rpm的搅拌速度和35-36℃时，保持这些条件约3分钟，然后停止搅拌，让提取物在35-36℃的相同温度下静置30分钟。然后进行新的稀释(5倍)，在3-4分钟内提高速度以达到5000rpm，提高温度以达到42℃。则胶原蛋白为糊状，其粘度为17,000-20,000cps。提高温度以达到44℃。然后将这些条件保持30秒至1分钟；糊状胶原蛋白快速液化，外观变为流体，其粘度降至30-50cps。

将液化的提取物立即转移至已经预先热灭菌的加压过滤装置中，该装置配有水循环的双层封套，使得可将温度保持在42-45℃。然后使提取物通过两个无菌滤膜充分过滤，第一个滤膜的孔隙率为0.45μ，第二个滤膜的孔隙率为0.22μ。将滤液收集在配有双层封套的保压容器中，维持温度为42-45℃。然后将滤液通过孔隙率为0.22μ的膜绝对过滤。

通过按照欧洲药典进行细菌测试，证明获得的胶原蛋白为无菌的。

此外，在如此获得的胶原蛋白的机械处理和热处理之前、期间和之后进行的分析表明，所述胶原蛋白的氨基酸组成未改变。此外，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳没有检测到分子量低于95,000 Da的多肽(诸如1和图2)。也注意到α₂(Ⅰ)₁/α₁(Ⅰ)₂比率为0.49，即胶原蛋白含有高于95％的Ⅰ型胶原蛋白。

通过用Perkin-Elmer公司的Delta系列DSC-7型采用差示自动记录测温法(DSC)在40-50℃下热处理和机械处理期间进行的温度记录分析，证实对应于胶原蛋白分子三螺旋结构丧失的胶原蛋白变性峰消失。然而，这种消失仅为暂时的，因为在冷却胶原蛋白提取物及其凝固后，注意到所述变性峰再出现(图3和图4)。这证明按照本发明的热处理和机械处理期间胶原蛋白的三螺旋结构的丧失在性质上是可逆的。

该组结果证明，二级结构和三级结构得到维持，因此如此制备的胶原蛋白为天然形式。

如此获得的胶原蛋白的其它主要特征和性质如下：

-含水量：95％

-外观：在高于约38℃的温度下为粘性液体，并且接触时有粘性；在低于约38℃的温度下为假固体的致密并且均匀胶凝的物质。

-粘度：液体形式为45cps

-总氮：17.9％

-羟脯氨酸：12.8％

-无色氨酸、氨基葡聚糖和分子量＜95,000道尔顿的多肽链

-pH为5.5

-脂质＜1％

-硫灰量＜2％

将按刚刚所述方法制备的无菌胶原蛋白保持在42-45℃有限的时间，以便不用改性而快速分装到合适的容器或包装中，诸如管形瓶、注射器、泡罩等，或在与其它活性成分(诸如凝血因子)混合后分装，其中所述其它活性成分如果需要已预先灭菌。

如此生产的胶原蛋白当单独使用时，形成具有出色止血特性的胶粘剂，一般用于实质外科、心血管外科、胸外科、矫形外科、ENT外科、泌尿外科、肝外科、内脏外科和妇产科手术、以及移植和骨髓外科；用于显微外科和需要可能联合其它成分的这种医药形式作用的任何其它医学领域。

将所述胶原蛋白保持于室温下，所述胶原蛋白凝固。

这将其明显区别于目前市场可可得到的其它所谓的生物胶粘剂，诸如奥地利Immuno-AG公司的Tissucol^或法国Laboratoires desFractionnements et des Biotechnologies的Biocolle^，其干燥形式必需贮藏于约4℃的低温。

基于按照本发明的胶原蛋白的胶粘剂在使用之前应该重建为液体形式。为此，仅仅加热2-3分钟是足够的，例如在温箱或在40-45℃的水浴中加热，然后缓慢人工搅拌。

因此，与上述已知的胶粘剂相比，基于按照本发明的胶原蛋白的胶粘剂除其有益特性外，其制备时间约缩短10倍。

当存在凝血因子时，在将其加入胶原蛋白中之前，以以下方式预先制备所述凝血因子。

将分别相当于2IU/mg和1IU/mg胶原蛋白的量的凝血酶或血纤蛋白原粉末分别用40mM氯化钙溶液和(即1ml胶原蛋白50IU凝血酶)注射用水(WFI)溶解。然后分别通过孔隙率为0.22μ的纯净滤膜过滤。

然后将所述凝血酶或血纤蛋白原加至如上所述已经预先中和(pH7.0)的无菌胶原蛋白中。将混合物均化并分装。

例如用计量泵加压分装到合适的容器中，例如在生物胶粘剂制剂的情况下，特别是分装到玻璃管形瓶或注射器中；例如在贴剂、薄膜或增湿面膜的情况下，分装到热封的泡罩或袋中，或者分装到冻干器的盘中，以如上所述获得粉剂或海绵等。

实施例2：含有胶原蛋白+凝血酶的无菌液体生物胶粘剂

采用无菌液体形式的实施例1中获得的制品，在玻璃管形瓶中制备含2ml 5％胶原蛋白和相当于200IU量的凝血酶的组合物。

在其用于出血表面时，其凝固并粘附至所述组织表面，使得损伤或切口闭合，它用作接触止血剂，使得停止出血。

实施例3：含有无菌胶原蛋白+血纤蛋白原的粉剂

采用实施例1中获得的制品，在将与血纤蛋白原混合的胶原蛋白冻干和研磨为无菌分装形式后，将每瓶含700IU血纤蛋白原的360mg胶原蛋白分装到无菌聚乙烯管形瓶中。

这种粉剂当通过喷雾到出血表面而应用，特别是在显微外科用于难以接近的区域中时，使得可以通过其对凝血的内在途径和外在途径的止血作用而止血，并粘附至出血表面。

实施例4：含无菌胶原蛋白+凝血酶的海绵

以35ml无菌液体胶原蛋白开始，所述胶原蛋白的浓度为1％，如实施例1中获得，然后进行中和，将其分装到盘或5×7cm的泡罩中。然后进行冻干，然后将盘或泡罩在无菌条件下封闭，然后将这些盘或泡罩包装到双层无菌袋中。

如此生产的海绵使得可以覆盖35cm²的面积，相当于掺入700IU凝血酶的350mg胶原蛋白的量。

这种海绵具有快速止血作用，它将胶原蛋白与凝血酶对凝血机制的作用结合在一起，粘附至出血表面，使得施加相当大的机械作用。其薄膜形成方面使得可以覆盖大的出血区域。

实施例5：含有胶原蛋白(假固体)+灭滴灵的贴剂

于42-45℃下，将液体形式、预先除菌过滤的抗感染剂灭滴灵以0.05 mg/mg干胶原蛋白的比例加入2％实施例1中获得并如上所述进行中和的液体形式的胶原蛋白中。

冷却后，使厚1mm的清亮均质的假固体凝胶形式的胶原蛋白通过用2.5 Mrad的β射线(Laboratoires Caric Orsay，法国)辐射进行灭菌。

意外地注意到，与经过相同的辐射灭菌处理的常规凝胶不同，由按照本发明的胶原蛋白制备的凝胶“不破坏(break)”，即不分离为两相。

这种贴剂当应用于受感染伤口时，具有局部的保护性作用，由于存在灭滴灵并释放灭滴灵而用作消毒剂。

实施例6：具有聚合能力的无端肽胶原蛋白(变体1)

采用来源于新鲜鸵鸟Achilles腱的纯化胶原蛋白的10％提取物，进行以下步骤：

-通过加入pH2.510^-2M柠檬酸溶液稀释胶原蛋白，直至获得1％的胶原蛋白浓度，

-加入胃蛋白酶；1/10重量/重量的干胶原蛋白，

-让其于室温(20℃)下作用7小时，

-第7天时，用氢氧化钠(30％)中和胶原蛋白，以获得pH7.2。胶原蛋白沉淀下来，通过用旋转干燥器/倾析器装置诸如Rousselet公司出售的RC40的所述装置离心，除去保留在溶液中的非胶原蛋白蛋白和胃蛋白酶残留物，

-在软化水中洗涤所述沉淀，然后旋转干燥，水重量相当于10倍的沉淀重量，然后获得潮湿纤维形式的胶原蛋白沉淀，

-在相同条件下重复这一操作3次，由此获得含水量为70％的胶原蛋白纤维，

-将沉淀溶于pH2.5的10^-2M柠檬酸中，

-将混合器均化直至发生完全溶解，获得浓度为10％的清亮的胶原蛋白提取物，其粘度为6000cps，

-将提取物转移到已经提及的具有双层横向切刀的混合器中，按照实施例1所述连续进行所述程序，直至获得约5％的胶原蛋白。

这种无菌无端肽的、具有聚合能力的天然胶原蛋白在眼科应用中特别有益，如上所述，可以为镜片、挠性膜或滴剂/洗眼药形式。此外，不存在具潜在免疫原性的端肽使其尤其具有吸引力。

实施例7：胶原蛋白泡沫剂(变体2)

由按照已经描述的变体2处理的含水量为70％的胶原蛋白湿纤维沉淀，制备泡沫剂。将沉淀均化并在+4℃温和搅拌下在纯水中保持48小时。离心后，将沉淀溶解于10^-2M柠檬酸溶液(pH2.5)中，胶原蛋白的浓度为2.5％。于4℃静置24小时后，将沉淀转移到具有双层横向切刀的混合器中。逐渐提高搅拌速度、剪切速率和温度，达到2000rpm和25℃的温度。然后于25℃的操作温度下使提取物通过孔隙率为0.22μ的纯净膜。

以为1.5g/l的浓度将洁尔灭加入如此获得的2.5％无菌胶原蛋白中。将混合物于室温下搅拌，从500rpm增进至2500rpm提取物变稠并且变为白色，由此获得按照本发明的泡沫剂。

将泡沫剂分装到10ml或更大的可选地配有导管的计量泵中，这允许给予到在显微外科中通常难以接近的区域。

如此保存的这种泡沫剂在于室温下贮藏时可稳定至少24个月。在存在热敏感活性成分的情况下，最好将这样产生的泡沫剂的贮藏温度保持在于4-10℃。

这种泡沫剂特别有利地用于实质外科和胸外科。特别是可用于保持组织间间隙和实质间隙，使得能够避免受伤害组织之间的解剖病理学粘连。

实施例8：层状或单层止血海绵(变体2)

按照实施例7所述，由按照变体2获得的胶原蛋白生产海绵，通过孔隙率为0.22μ的膜进行绝对过滤而除菌。

为了获得也包含例如凝血因子的单层海绵，进行以下程序：

-将预先已经与无菌凝血酶(700IU)或无菌血纤蛋白原(350IU)混合并且中和的、浓度为1％的35ml液体胶原蛋白分装到5×7cm的泡罩中。

-将每种上述胶原蛋白组合物(冷冻温度和吸收温度分别为-25℃和35℃)分别进行常规的冻干。

如此获得的含中性pH胶原蛋白的海绵具有略有纤维的绒毛状外观，在血纤蛋白原和凝血酶的情况下分别为白色和乳白色。

这种海绵具有与胶原蛋白对凝血机制外在作用和内在作用有关的止血作用，并通过凝血因子(即凝血酶和血纤蛋白原)的止血作用的进一步增强。

而且，按变体2获得的中性pH胶原蛋白由于其不溶性，对出血组织表面施加单独使用冻干形式的凝血因子时不能施加的机械作用。

另外，如上所述，在这种按照本发明的形式中，所述凝血因子的活性完全保留，这与常规制剂(诸如Tachocomb，Hafslund Nycomed，在文献EP-A-59 265中描述)不同，其中所述常规制剂通过电离辐射妙计，并因此部分变性。

为了获得层状海绵，进行以下程序：

-将预先与凝血酶(700IU)和1ml 40mM氯化钙混合、浓度为0.5％的18ml pH5的液体胶原蛋白分装到5×7cm的泡罩中，然而

-于-10℃下进行温和冷冻，然后将预先已经与血纤蛋白原(350IU)、浓度为0.5％的18ml pH5的液体胶原蛋白加入该第一层中，然后

-在相同条件下再次温和冷冻，最后一层为1％的液体胶原蛋白，此时所述胶原蛋白为中性pH，将其加入如此获得的第二层，最后，

-按单层海绵实例中所述进行冻干。

由此，获得具有以下显著特性的三层的层状海绵：

^*一旦应用后，酸性pH的胶原蛋白立即溶解，由此释放所述凝血因子，在出血表面上形成止血胶粘剂，

^*中性pH的外层也施加机械作用，因此增强所述止血胶粘剂的作用，如果出血面积大，则更是如此。

此外，按照本发明的这种海绵的优点是，使用之前不需要制备。

一般而言，这种类型的止血形式特别适用于实质外科、心血管外科、胸外科、整形外科、矫形外科、ENT外科、泌尿外科、肝外科、内脏外科和妇产科手术、移植和骨髓手术以及显微外科，并且一般适用于需要这种止血作用的任何领域。

实施例9：海绵+庆大霉素

进行以下程序：

-将6升1.4％按照本发明方法变体2获得的胶原蛋白溶液引入无菌容器中，并通过加入氢氧化钠中和，然后

-在中和后1小时内将1142g/l盐酸万古霉素溶液加入保持在室温下的胶原蛋白溶液中，然后

-将溶液均化，然后借助计量泵，以70ml/10cm容器边长的比例，将产生的混合物通过孔隙率为0.22μ的滤膜转移到冻干容器中，接着

-开始冷冻至-25℃的循环，然后是高达35℃的升华循环和解吸附循环，

-通过在冻干器内为获得层压海绵而向各层施加自动压力，最后获得厚7mm并含有比例为8.4mg胶原蛋白/cm²和4.2mg盐酸万古霉素/cm²的无菌海绵，或厚1-2mm的海绵，接着

-将泡罩热封，并包装到无菌聚乙烯双层袋中。

获得掺入庆大霉素、甲氟哌酸或其它抗生素或抗感染剂代替万古霉素的按照本发明的同样的海绵。

这些海绵局部地逐渐释放其活性成分，在治疗许多病变、特别是骨、内脏、创伤和外科病变方面、特别是在预防或治疗可能的微生物污染方面特别有用。

含有按照本发明的胶原蛋白的这些海绵，除其出色的耐受型和生物可降解性外，具有如上所述掺入过滤除菌的万古霉素的很大优势，它因此保持其所有活性，这与常规制剂不同，在常规制剂中，这种抗生素通过电离辐射灭菌后部分变性。

Claims

1．由溶解和纯化的、可选地胃蛋白酶处理的非无菌胶原蛋白提取物制备胶原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

-(ⅰ)在具有双层横向切刀的混合物中搅拌并剪切所述提取物，同时分段提高搅拌速率使其不超过10,000rpm，并将温度以2℃至10℃，最好为3℃至5℃分段提高，以便将初始的室温提高至高为受控的最大温度，最好低于50℃，然后

-(ⅱ)在液体介质中将所述提取物灭菌，其结果是获得无菌的天然形式的胶原蛋白。

2．在权利要求1中要求保护的方法，所述溶解和纯化的提取物不经胃蛋白酶处理，其特征在于，在步骤(ⅰ)中，在每个所述阶段进行所述提取物的稀释，此时所述提取物的粘度达到选定的15,000-20,000cps的高数值，而当所述最大温度为42-44℃时，让所述提取物刚好在步骤(ⅱ)之前静置。

3．在权利要求1和2的任一项中要求保护的方法，其特征在于，在步骤(ⅱ)之前，所述提取物在所述受控最大温度下通过孔隙率为0.45μ-0.22μ的膜充分过滤。

4．在权利要求1中要求保护的方法，所述溶解和纯化的提取物经胃蛋白酶处理，其特征在于，在步骤(ⅰ)中，所述最大温度达到35℃，最好达到25℃，而所述搅拌速度为1000-5000rpm，最好为2500rpm，

-分段通过至高为0.45μ的各种选定孔隙率的膜进行澄清过滤，然后

-用氯化钠进行所述滤液的差示沉淀

5．在权利要求3或4的任一项中要求保护的方法，其特征在于，在步骤(ⅱ)中，通过孔隙率为0.22μ的膜进行绝对过滤，或通过加入过乙酸将所述提取物灭菌。

6．在任一前述权利要求中要求保护的方法，其特征在于，所述方法包括在步骤(ⅱ)之前或之后的所述提取物的中和步骤。

7．在任一前述权利要求中要求保护的方法，其特征在于，所述胶原蛋白为丝状类型，最好为主要为Ⅰ型的胶原蛋白。

8．在任一前述权利要求中要求保护的方法，其特征在于，所述胶原蛋白提取物得自皮肤(dermides)、结缔组织或动物的腱，特别是得自兔皮和鸵鸟Achilles的腱。

9．天然的Ⅰ型胶原蛋白，其可以用权利要求5-8的任一项中要求保护的方法获得，其特征在于，它具有以下特征或特性：

-α₂(Ⅰ)₁/α₁(Ⅰ)₂比率为0.48-0.52

-根据欧洲药典的标准为无菌的

-总氮：17.0％-18.7％

-羟脯氨酸：12％-13.9％

-无色氨酸、氨基葡聚糖和分子量＜95,000道尔顿的多肽

-脂质＜1％

-硫灰量＜2％。

10．药用组合物和/或parapharmaceutical组合物和/或内科-外科组合物和/或眼科组合物和/或化妆品组合物，包含单独的或联合至少一种其它活性成分的在权利要求9中要求保护的胶原蛋白。

11．在前一权利要求中要求保护的组合物，其特征在于，所述其它活性成分选自凝血因子如凝血酶、抗感染剂特别是灭滴灵、抗生素特别是大环内酯如庆大霉素、糖肽如万古霉素、氟代喹诺酮如甲氟哌酸、酰基羧酸衍生物或oxicam衍生物类固醇和非类固醇消炎药、生长因子特别是骨生长因子如促生长素和表皮生长因子如EGF(表皮生长因子)、表面活性剂、增湿剂、稳定剂和维生素。

12．在权利要求10和11的任一项中要求保护的组合物的药用形式，其特征在于，其选自凝胶特别是注射用凝胶和假固体凝胶、泡沫剂、洗眼药、单层或层状海绵、粉剂、板或带、面膜、喷雾剂、薄膜、膜、片材和线，特别是用于缝合的线。

13．在权利要求9中要求保护的胶原蛋白的用途，即用于制备计划用于人类或动物机体的药物治疗和/或parapharmaceutical治疗和/或内科-外科治疗和/或眼科治疗和/或化妆品处理的组合物。