CN1304405C - 丁香甙的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种丁香甙的提取方法，所述的提取方法包括：以瑞香科结香属植物结香Edgeworthia Chrysantha Lindl.的植物碎片为原料，以提取剂浸渍提取出含丁香甙的粗提物，所述提取剂可为热水或乙醇或甲醇；再将所述丁香甙的粗提物进行多次分离，制得丁香甙。这种方法制得丁香甙的收得率高，提取方法简便易行，成本较低。且原料资源充足，更好的是可用以结香植物造纸过程中产生的浸渍液来提取丁香甙，避免了资源的浪费，该方法提取分离所得丁香甙纯度高，有利于对丁香甙作进一步的药理、临床研究。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种植物药有效成分丁香甙(Syringin)的提取方法，尤其是一种从瑞香科结香属植物结香Edgeworthia Chrysantha Lindl.的植物碎片中提取丁香甙的方法。
(二)背景技术
丁香甙(Syringin)是刺五加口服液、刺五加注射液、刺五加片、五五利眠胶囊、增智颗粒剂等的主要有效成分以及这些中成药重要质量控制指标。其结构式如下：
经研究发现，丁香甙在制药领域有着巨大的价值和广泛的前景：Jae Youl等对丁香甙作了体内外的免疫调节试验，认为丁香甙是一种抗变应性的免疫调节剂；Emets等研究表明丁香甙可作为食品添加剂以改善身心健康，提高工作效率，并有抗抑郁、防糖尿病、滋补等作用；Dardymov等认为丁香甙是一种可抑制葡萄糖代谢抑制剂形成的抑制剂；Takasugi的研究认为类似丁香甙的一类化合物能帮助提高脑部血液循环，因脑损伤、脑中风、老年性痴呆会引起血液循环下降；Wakunaga制药公司研究表明丁香甙对小鼠在生理压抑条件下能提高其性能力；日本一研究院对小鼠试验表明丁香甙还是一种有效的溃疡抑制剂；Teshome等研究发现丁香甙等一类成分可治疗早老性痴呆；Hodge研究了丁香甙等化合物可作为肿瘤坏死过程中的免疫调节剂；Choljong-won的研究指出含有丁香甙的药物具有护肝作用；Yesilada的研究表明丁香甙对风湿性关节炎具有一定的抑制作用，丁香甙还有抗疲劳作用。
目前，丁香甙的植物来源是以下植物：木犀科植物欧丁香Syringavulgaris L.树皮(The Merck Index 9ed.8806，1976)，女贞Ligustrumlucidun Alt.树皮(中药志2：35，1959)，迎春花Jasminum nudiflorum Lindl.叶和枝(江苏新医学院，中药大辞典，2353，1977)，五加科植物刺五加Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith根(C.A.71：81693u，1969)，玄参科植物毛泡桐Paulownia tomentosa(Thunb.)Steud.树皮(药学杂志(日)79：1226，1959)，冬青科植物铁冬青Ilex rotunda Thunb.树皮(救泌应)(药学学报15(5)：303，1980)，瑞香科植物黄瑞香(祖师麻)Daphne giraldiiNitsche茎皮(中草药11(9)：389，1980)。但是从这些植物中提取丁香甙得率较低。
结香，别名黄瑞香、打结花，为瑞香科结香属。结香原产我国，分布于长江以南各省及河南、陕西及西南等地。其茎皮纤维可造纸和人造棉。此外，结香还有驱虫作用，其根、茎、花还可供药用，有舒筋活血、消肿止痛之功效。结香是我省浙南地区一重要经济作物，种植面积甚广，其花蕾、茎皮、根等在民间可治疗各种疾病。茎皮主要用作造纸原料，在前处理过程中产生了大量的结香茎皮热水浸渍液，但该热水浸渍液未加以进一步利用，而是作为废水排弃。
目前还未有过从结香中提取分离丁香甙的文献或专利报道。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种收得率高，成本低的提取丁香甙的方法，这种方法可更好的利用自然资源。
为此，本发明采用的技术方案如下：
一种丁香甙的提取方法，所述的提取方法包括：以瑞香科结香属植物结香Edgeworthia Chrysantha Lindl.的植物碎片为原料，以提取剂浸渍提取出含丁香甙的粗提物，所述提取剂可为热水或乙醇或甲醇；再将所述丁香甙的粗提物进行多次分离，制得丁香甙。
具体的所述提取方法按如下步骤进行：
a.提取：将结香植物碎片置于提取剂中浸渍提取，得含丁香甙的粗提物，将含丁香甙的粗提物浓缩成浸膏；所述提取剂体积用量可为每公斤所述结香植物碎片加提取剂2～9升，较经济的做法是每公斤所述结香植物碎片加提取剂3～5升。
b.分离：将所提取的浸膏用硅胶柱层析进行粗分离，用含甲醇0～10％的氯仿甲醇混合溶剂作为洗脱剂进行梯度提取洗脱，收集含甲醇7～9％的洗脱液，蒸馏得到含丁香甙混合物；重新上硅胶柱层析用含甲醇4～6％的氯仿甲醇混合溶剂作为洗脱剂分次分离纯化，得纯品丁香甙。
所述的分离具体按如下步骤进行：
(1)将所述浸膏，再用硅胶(100～200目)柱层析进行分离，以含甲醇0～10％的氯仿甲醇混合液进行梯度洗脱，收集含甲醇7～9％的洗脱液，蒸馏得到含丁香甙的黄白色粉末状混合物；该混合物主要含有两种甙类化合物和一未知化合物，其一是丁香甙，另外一种是结香甙C(Edgeworoside C)。
(2)将步骤(1)制得含丁香甙混合物重新上硅胶(200～300目)柱层析再一次分离，含甲醇5～6％的甲醇氯仿作为洗脱剂进行洗脱，蒸馏洗脱剂得丁香甙粗品；
(3)将步骤(2)制得丁香甙粗品进一步采用硅胶(300～400目)柱层析，4～5％甲醇氯仿为洗脱剂进行分离纯化，得到丁香甙纯品。由于结香甙C(Edgeworoside C)的结构与丁香甙比较接近，较难彻底分离，所以在最终产品中通常含微量的结香甙C。
进一步所述的丁香甙的提取方法，所述的浸渍提取是在提取剂的回流温度提取。即若用乙醇提取，则加热到乙醇的回流温度提取；若用热水提取，则最好用沸水煎煮提取。
所述的植物碎片为结香植物的如下部位之一或下述的任意组合：(1)结香植物的茎皮、(2)结香植物的根皮、(3)结香植物的树叶。
若植物碎片为干燥品可同样做为提取丁香甙的原料。
再进一步，所述的浸渍提取进行2～3次，每次0.5～3小时，为了提取完全，可分多次提取，提取后过滤收集滤液，滤渣再加入适量的提取剂回流提取。
所述提取方法的具体步骤如下：
a.提取：将结香茎皮切断、每公斤所述结香植物碎片加3～5升的75～100％乙醇，在回流温度下回流提取3次，每次时间分别为3h、2h、1h，然后将提取液浓缩成浸膏，并用石油醚(60～90℃)脱脂；
b.分离：
(1)将步骤a所得浸膏用100～200目硅胶柱层析，以甲醇含量为1～10％的氯仿甲醇混合液为洗脱液进行梯度洗脱，收集并蒸馏含甲醇7～9％的洗脱液得黄白色粉末；
(2)步骤(1)所得黄白色粉末再用200～300目硅胶柱层析，以甲醇含量为5～6％的氯仿甲醇混合液为洗脱剂进行洗脱，蒸馏得丁香甙粗品；
(3)步骤(2)所得粗品进一步用300～400目硅胶柱层析，再以甲醇含量为4～5％的氯仿甲醇混合液为洗脱液进行洗脱，得丁香甙纯品。
更进一步，所述提取方法的具体步骤如下：
a.提取：将结香植物树叶每公斤所述结香植物碎片加3～9升的热水，回流提取2次，每次时间分别为2h、1h，然后将提取液浓缩成浸膏，并用石油醚(60～90℃)脱脂；
b.分离：
(1)步骤a所得浸膏用100～200目硅胶柱层析，以甲醇含量为1～10％的氯仿甲醇混合液为洗脱液进行梯度洗脱，蒸馏含甲醇7～9％的洗脱液中得黄白色粉末；
(2)步骤(1)所得黄白色粉末再用200～300目硅胶柱层析，以甲醇含量为5～6％的氯仿甲醇混合液为洗脱剂进行洗脱，蒸馏得丁香甙粗品；
(3)步骤(2)所得粗品进一步用300～400目硅胶柱层析，再以甲醇含量为4～5％的氯仿甲醇混合液为洗脱液进行洗脱，得丁香甙纯品。
结香的茎皮通常用以来造纸，用以造纸时首先将结香茎皮中的纤维揉化，弃热水浸渍后再将茎皮进一步处理造纸，本发明可用结香茎皮造纸过程中弃去的结香茎皮热水浸渍液浓缩成浸膏，再进一步分离制得丁香甙。
本发明所述的丁香甙的提取方法丁香甙的提取方法的有益效果主要体现在：
1.从结香植物中提取得丁香甙的收得率高，提取方法简便易行，成本较低。
2.从结香的茎皮中提取分离丁香甙原料充足，使结香资源得到了充分利用，更使造纸过程中产生的茎皮水提取液得到了二次利用，避免了资源的浪费。
3.分离所得丁香甙纯度高，有利于对丁香甙作进一步的药理、临床研究。
(四)附图说明
图1、图2为本发明实施例1丁香甙制备过程中TLC跟踪检测结果示意图，
图3、图4为本发明实施例2丁香甙制备过程中TLC跟踪检测结果示意图。
图5、图6为本发明实施例5丁香甙制备过程中TLC跟踪检测结果示意图。
图1、图2、图3、图4、图5、图6均在UV365nm下观察，丁香甙显暗紫色荧光，其中Rf＝0.4为未知化合物；Rf＝0.35为结香甙C；Rf＝0.3为丁香甙。
图7为丁香甙对照品色谱图。
图8为结香茎皮粉末样品提取液色谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述：
实施例1：丁香甙的提取
结香茎皮切断，称取1.5kg，加4.5升75％甲醇回流提取3次，每次时间分别为3h、2h、1h，收集提取液合并后减压浓缩得浸膏180g，用石油醚(60～90℃)脱脂。取脱脂后的浸膏40g与100～200目硅胶拌样，硅胶G(100～200目，550g)柱Φ6cm×50cm层析，用甲醇氯仿为洗脱液梯度洗脱(含甲醇0～10％)。收集含甲醇7～9％的甲醇氯仿溶液洗脱部分，蒸馏得大量黄白相间固体粉末状3.0g(第一次分离)，该混合物用少量甲醇溶解后与200～300目硅胶拌样，硅胶G(200～300目，350g)柱Φ4cm×45cm层析，以含甲醇6％的甲醇氯仿溶液为洗脱剂洗脱，洗脱至暗紫色斑点消失。收集含有暗紫色斑点部分的组分0.4g(第二次分离)。TLC跟踪检测，方法如下：
GF254型薄层层析硅胶(青岛海洋化工厂生产)
展开剂：氯仿/甲醇＝17/3
总提取物第一次层析得到大量白色粉末状物质，取样溶于甲醇后TLC检测结果如图1。进行第二次分离得到产物，取样溶于甲醇后的TLC检测结果如图2。
再次用甲醇溶解与200～300目硅胶拌样，硅胶G(300～400目)柱Φ2cm×25cm层析，含甲醇5％的甲醇氯仿溶液洗脱，TLC跟踪检测收集暗紫色斑点组分得99％丁香甙0.25g。
实施例2：丁香甙的提取
结香茎皮切断、称取2.0kg，分别用10升、6升、4升95％乙醇回流提取3次，每次时间分别为2.5h、1.5h、0.5h，提取液合并后减压浓缩得浸膏210g，用石油醚(60～90℃)脱脂。取脱脂后的浸膏60g与100～200目硅胶拌样，硅胶G(100～200目，350g)柱Φ6cm×50cm层析，用甲醇氯仿为洗脱液梯度洗脱(含甲醇0～10％)。收集含甲醇7～9％的甲醇氯仿溶液洗脱部分，蒸馏得大量黄白相间固体粉末状约5g(第一次分离)，该混合物用甲醇溶解后与100～200目硅胶拌样，硅胶G(200～300目，300g)柱Φ4cm×45cm层析，以含甲醇5％的甲醇氯仿溶液为洗脱剂洗脱。按实施例1所述方法TLC跟踪检测，洗脱至暗紫色斑点消失。收集含有暗紫色斑点部分的组分0.4g(第二次分离)，再次用甲醇溶解与100～200目硅胶拌样，硅胶G(300～400目，350g)柱Φ2cm×25cm层析，含甲醇4的％甲醇氯仿溶液洗脱，TLC跟踪检测收集暗紫色斑点组分得98％丁香甙0.2g。
柱层析过程中的薄板层析(TLC)跟踪检测方法如下：
GF254型薄层层析硅胶(青岛海洋化工厂)
展开剂：氯仿/甲醇＝17/3
总提取物第一次层析得到大量黄白色粉末状物质，取样溶于甲醇后TLC检测结果如图3；进行第二次分离得到物质，取样溶于甲醇后的TLC检测结果如图4。
实施例3：丁香甙的提取
结香根皮切断、称取1.5kg，第一次用6升用80％乙醇回流提取3小时，过滤，收集滤液，滤渣再用3升80％乙醇回流提取2小时，提取液合并后减压浓缩得浸膏150g，石油醚(60～90℃)脱脂。取脱脂后的浸膏30g与100～200目硅胶拌样，硅胶G(100～200目，300g)柱Φ6cm×50cm层析，用甲醇氯仿为洗脱液梯度洗脱(含甲醇0～10％)。收集含甲醇7～9％的甲醇氯仿溶液洗脱部分蒸馏得大量黄白相间固体粉末状5.1g，该混合物用甲醇溶解后与100～200目硅胶拌样，硅胶G(200～300目，350g)柱Φ4cm×45cm层析，以含甲醇5％的甲醇氯仿溶液为洗脱剂洗脱。按实施例1所述方法TLC跟踪检测，洗脱至暗紫色斑点消失。收集含有暗紫色斑点部分的组分0.4g，再次用甲醇溶解与100～200目硅胶拌样，硅胶G(300～400目，250g)柱Φ2cm×25cm层析，含甲醇4％的甲醇氯仿溶液洗脱，TLC跟踪检测收集暗紫色斑点组分得99％丁香甙0.20g。
实施例4：丁香甙的提取
取造纸过程中废弃的结香茎皮热水浸渍液10kg浓缩成浸膏300g，用石油醚(60～90℃)脱脂。取脱脂后的浸膏50g与100～200目硅胶拌样，硅胶G(100～200目，300g)柱Φ6cm×50cm层析，用甲醇氯仿为洗脱液梯度洗脱(含甲醇0～10％)。收集含甲醇7～9％的甲醇氯仿溶液洗脱部分，蒸馏得大量黄白相间固体粉末状5.5g，该混合物用甲醇溶解后与100～200目硅胶拌样，硅胶G(200～300目，350g)柱Φ4cm×45cm层析，以含甲醇5％的甲醇氯仿溶液为洗脱剂洗脱。按实施例1所述方法TLC跟踪检测，洗脱至暗紫色斑点消失。收集含有暗紫色斑点部分的组分0.4g，再次用甲醇溶解与100～200目硅胶拌样，硅胶G(300～400目，250g)柱Φ2cm×25cm层析，含甲醇4％的甲醇氯仿溶液洗脱，TLC跟踪检测收集暗紫色斑点组分得99％丁香甙0.19g。
实施例5：丁香甙的提取
结香茎皮切断、称取2.5kg，分别用12升、6升热水回流提取2次，每次时间分别为3h、2h，提取液合并后减压浓缩得浸膏250g，石油醚(60～90℃)脱脂。取脱脂后的浸膏60g与100～200目硅胶拌样，硅胶G(100～200目，300g)柱Φ6cm×50cm层析，用甲醇氯仿为洗脱液梯度洗脱(含甲醇0～10％)。收集含甲醇7～9％的甲醇氯仿溶液洗脱部分蒸馏得大量黄白相间固体粉末状约8g(第一次分离)，该混合物用甲醇溶解后与100～200目硅胶拌样，硅胶G(200～300目，350g)柱Φ4cm×45cm层析，以含甲醇5％甲醇氯仿为洗脱剂洗脱。按实施例1所述方法TLC跟踪检测，洗脱至暗紫色斑点消失。收集含有暗紫色斑点部分的组分1.0g(第二次分离)，再次用甲醇溶解与100～200目硅胶拌样，硅胶G(300～400目，250g)柱Φ2cm×25cm层析，含甲醇4％的甲醇氯仿溶液洗脱，TLC跟踪检测收集暗紫色斑点组分得99％丁香甙0.55g。
柱层析过程种的薄板层析(TLC)跟踪检测方法如下：
GF254型薄层层析硅胶(青岛海洋化工厂)
展开剂：氯仿/甲醇＝17/3
总提取物第一次层析得到大量黄白色粉末状物质，取样溶于甲醇后TLC检测结果如图5。进行第二次分离得到物质，取样溶于甲醇后的TLC检测结果如图6。
实施例6：丁香甙的提取
称取结香植物树叶2.0kg，第一次用10升水煎煮2小时，过滤，收集滤液，滤渣用6升水煎煮1小时，过滤，收集滤液，合并两次滤液，然后将提取液浓缩成浸膏150g，并用石油醚(60～90℃)脱脂。取脱脂后的浸膏60g与100～200目硅胶拌样，硅胶G(100～200目，350g)柱Φ6cm×50cm层析，用甲醇氯仿为洗脱液梯度洗脱(含甲醇0～10％)。收集含甲醇7～9％的甲醇氯仿溶液洗脱部分，蒸馏得大量黄白相间固体粉末状4.8g(第一次分离)，该混合物用甲醇溶解后与100～200目硅胶拌样，硅胶G(200～300目，300g)柱Φ4cm×45cm层析，以含甲醇6％的甲醇氯仿溶液为洗脱剂洗脱。按实施例1所述方法TLC跟踪检测，洗脱至暗紫色斑点消失。收集含有暗紫色斑点部分的组分0.38g(第二次分离)，再次用甲醇溶解与100～200目硅胶拌样，硅胶G(300～400目，350g)柱Φ2cm×25cm层析，含甲醇5％的甲醇氯仿溶液洗脱，TLC跟踪检测收集暗紫色斑点组分得98％丁香甙0.15g。
实施例7：结香茎皮中丁香甙的含量测定
仪器：岛津高效液相色谱仪(配有LC-10AT vp输液泵，SPD-10A vp紫外检测器，CLASS-VP色谱数据处理系统)；Sartorius BP211D型十万分之一电子天平。
试药：丁香甙(Syringin)对照品(HPLC纯度99.5％，自制，经结构鉴定)。
药材：结香茎皮采于浙江工业大学校园内。
试剂：甲醇(色谱纯)；重蒸馏水。
色谱条件：色谱柱为Shim-Pack CLC ODS(M)C18(5μm，4.1mm×250mm)，流动相甲醇-水(3/7)，流速0.6ml/min，检测波长266nm。在上述色谱条件下，样品中丁香甙峰形良好且与其它杂质完全分开。
精密称取丁香甙对照品2.52mg，加甲醇定容为0.504mg/ml的丁香甙溶液，精密吸取1μl、2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl注入液相色谱。结果表明当丁香甙进样量为0.504μg～6.048μg，进样量(X，μg)与峰面积(Y)呈良好的线性关系。回归方程：Y＝3.968×106X+159498，r＝0.9999(n＝7)。取干燥结香茎皮粉末样品3.0克置圆底烧瓶中，75％甲醇回流提取3次(2h，2h，1h)，合并提取液，浓缩后置于100ml容量瓶中定容、混匀，微孔滤膜0.45μm过滤。精密吸取供试品溶液20微升，注入高效液相色谱仪，按外标法计算，测得结香茎皮中丁香甙含量1.55mg/g。供试品溶液中丁香甙保留时间t＝12.20min处有最大吸收峰(图7、图8)。
Claims (10)
1.一种丁香甙的提取方法，其特征在于所述的提取方法包括：以瑞香科结香属植物结香Edgeworthia Chrysantha Lindl.的植物碎片为原料，以提取剂浸渍提取出含丁香甙的粗提物，所述提取剂为热水或乙醇或甲醇；再将所述丁香甙的粗提物进行分离，制得丁香甙。
2.如权利要求1所述的丁香甙的提取方法，其特征在于所述提取方法按如下步骤进行：
a.提取：将结香植物碎片置于提取剂中浸渍提取，得含丁香甙的粗提物，将含丁香甙的粗提物浓缩成浸膏；
b.分离：将所提取的浸膏用硅胶柱层析进行粗分离，用含甲醇0～10％的氯仿甲醇混合溶剂作为洗脱剂进行梯度提取洗脱，收集含甲醇7～9％的洗脱液，蒸馏得到含丁香甙混合物；重新上硅胶柱层析用含甲醇4～6％氯仿甲醇混合溶剂作为洗脱剂分次分离纯化，得纯品丁香甙。
3.如权利要求2所述的丁香甙的提取方法，其特征在于所述提取剂用量为每公斤结香植物碎片加提取剂2～9升。
4.如权利要求3所述的丁香甙的提取方法，其特征在于所述的分离按如下步骤进行：
(1)将所述浸膏，再用100～200目硅胶柱层析进行分离，以含甲醇0～10％的氯仿甲醇混合液进行梯度洗脱，收集含甲醇7～9％的洗脱液，蒸馏得到含丁香甙混合物；
(2)将步骤(1)制得含丁香甙混合物重新上200～300目硅胶柱层析再一次分离，含甲醇5～6％的甲醇氯仿作为洗脱剂进行洗脱，蒸馏洗脱剂得丁香甙粗品；
(3)将步骤(2)制得丁香甙粗品进一步采用300～400目硅胶柱层析，4～5％甲醇氯仿为洗脱剂进行分离纯化，得到丁香甙纯品。
5.如权利要求1～4之一所述的丁香甙的提取方法，其特征在于所述的浸渍提取是在提取剂的回流温度提取。
6.如权利要求5所述的丁香甙的提取方法，其特征在于所述的植物碎片为结香植物的如下部位之一或下述的任意组合：
(1)结香植物的茎皮、(2)结香植物的根皮、(3)结香植物的树叶。
7.如权利要求5所述的丁香甙的提取方法，其特征在于所述的植物碎片为干燥品。
8.如权利要求6所述的丁香甙的提取方法，其特征在于所述的浸渍提取进行2～3次，每次0.5～3小时。
9.如权利要求8所述的丁香甙的提取方法，其特征在于所述提取方法的具体步骤如下：
a.提取：将结香茎皮切断、每公斤结香植物碎片加3～5升75～100％乙醇，在回流温度下回流提取3次，每次时间分别为3h、2h、1h，然后将提取液浓缩成浸膏，并用沸程60～90℃的石油醚脱脂；
b.分离：
(1)将步骤a所得浸膏用100～200目硅胶柱层析，以甲醇含量为1～10％的氯仿甲醇混合液为洗脱液进行梯度洗脱，收集并蒸馏含甲醇7～9％的洗脱液得黄白色粉末；
(2)步骤(1)所得黄白色粉末再用200～300目硅胶柱层析，以甲醇含量为5～6％的氯仿甲醇混合液为洗脱剂进行洗脱，蒸馏得丁香甙粗品；
(3)步骤(2)所得粗品进一步用300～400目硅胶柱层析，再以甲醇含量为4～5％的氯仿甲醇混合液为洗脱液进行洗脱，得丁香甙纯品。
10.如权利要求2所述的丁香甙的提取方法，其特征在于所述的结香植物碎片为结香茎皮，所述的提取步骤如下：
用结香植物茎皮造纸过程中弃去的结香茎皮热水浸渍液浓缩成浸膏。
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