CN1265807C - 含有胡麻苷的黄酮类提取物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种来自中药原料药的黄酮类提取物,其中含有胡麻苷,本发明还涉及这类提取物在治疗脑缺血和脑缺氧中的应用。本发明尤其提供了来自甘青青兰原料药中的黄酮类提取物,和该提取物的提取方法。本发明还提供了利用该提取物的药物组合物的应用。本发明的提取方法简单实用,提纯效果良好,组合物疗效确切,在治疗脑血管病和脑卒中方面具有全新的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种来自中药原料药的黄酮类提取物,尤其涉及来自甘青青兰原料药的含有胡麻苷的黄酮类提取物;本发明还涉及这类提取物在治疗脑缺血和脑缺氧疾病中的应用以及含有该提取物的药物组合物。
背景技术
藏药甘青青兰为唇形科植物甘青青兰(唐古特青兰)Dracocephalumtanguticum Maxim的干燥地上部分,藏名译音为:知羊高、知羊故。分布甘肃西南部、青海东部、四川西部和西藏东南部等地区,生于海拔1900-4600m的高山灌丛林地、松林边缘、砾石草坡、干燥河谷两岸。本品具有清热祛湿,疏风解表,舒肝和胃,清肝热、胃热,止血,愈疮,干黄水的功能,用于头晕,肝炎、胃炎、肝热病、胃热病,黄水病,便血,关节炎,痈疮等疾病的治疗。有关甘青青兰的化学成分,研究报道的很少。
在含有黄酮类化合物的文献中,有关甘青青兰的报道为其主要含挥发油成分、黄酮类化合物和微量元素等。据1993年版《中药大辞典》中报道,甘青青兰中含的有效成分包括黄酮、挥发油、氨基酸和甾体化合物等。张晓峰等从唐古特青兰分离到5个黄酮类化合物,经化学和光谱分析鉴定为:茵芋甙,大波斯菊甙,胡麻素,胡麻甙,胡麻甙-6″-乙酸酯,但未能明确测定其黄酮类提取物中胡麻苷的含量及其生物活性;其他的药理功效尚未见报道。
发明内容
本发明人在对甘青青兰中的黄酮类提取物进行研究中发现,所得到的含有胡麻苷的黄酮类提取物对脑缺血和脑缺氧有治疗效力,因而完成了本发明的内容。
本发明提供的中药黄酮类提取物,尤其是中药甘青青兰中提取的含有胡麻苷的黄酮类提取物,与现有的药物相比无毒副作用。
本发明提供了一种来自中药中藏药原料药甘青青兰的黄酮类提取物,其中至少含有胡麻苷成分,该提取物中胡麻苷的含量以重量百分数计至少不低于5%,优选10%,但不超过95%,该提取物可用于脑缺血和脑缺氧的治疗。
本发明尤其提供了来自藏药甘青青兰的上述黄酮类提取物,进而提出了甘青青兰有效成分的新的医药用途。
本发明还提供了来自甘青青兰原料药的上述提取物的提取方法,应用大孔吸附树脂和碱提酸沉的提取方法,可以得到有效成分尤其是胡麻苷含量较高的提取物。
在对上述黄酮类提取物的研究中,本发明还提供了以该提取物为有效成分的药物组合物,其可用于脑缺血和脑缺氧的治疗。
根据本发明提供的黄酮类提取物,其中至少含有胡麻苷,每克含有总黄酮成分的提取物中的胡麻苷以不少于50毫克。尤其是,每克提取物中含有胡麻苷不少于100毫克。
本发明提取物可以来自任何含有所述胡麻苷成分的原料药,优选来自藏药甘青青兰原料药中的黄酮类有效成分。
通过对成分及药物效果的试验摸索,本发明尤其提供了应用经过筛选的大孔吸附树脂和碱提酸沉的提取方法得到的甘青青兰提取物,具有比较高的黄酮类有效成分(即胡麻苷)含量,并且保持了天然原料的成分。
通过药效学研究,证明本发明的上述提取物(或称黄酮类有效部位)可用于脑缺血和脑缺氧的治疗。所以本发明还提供了用于治疗脑缺血和脑缺氧的药物组合物,其包括了治疗有效量的上述中药黄酮类提取物及药剂学中可接受的药物辅料。
本发明所称“黄酮类”是指以黄酮为母核的具有不同取代基的化合物。
根据前面所述,本发明的提取物来自中药甘青青兰,除含有胡麻苷外,还可以包括任何黄酮类有效部位,例如其有效成分还包括但不限于:茵芋甙,大波斯菊甙,胡麻素,胡麻甙-6″-乙酸酯等中的一种或数种。根据本发明的优选方案,该提取物来自甘青青兰原料药中黄酮类有效成分。
本发明的提取物可以是通过任何可行的方法得到,优选地可以是采用大孔吸附树脂、聚酰胺吸附和碱提酸沉(例如调PH值)精制得到,使产物具有比较高的纯度和收率。
本发明可采用原料生药,也可采用饮片。根据本发明优选的方法,采用甘青青兰饮片或未加工的甘青青兰生药为原料,如果是未加工的甘青青兰生药,可进行清洗、晾晒和切片等加工作为前期处理,提取方法如下:
甘青青兰药材粉碎,有机溶媒(例如乙醇)提取,回收溶剂,浓缩沉淀,上大孔吸附树脂,用有机溶媒(例如醇,优选乙醇、甲醇)梯度洗脱,收集10%~100%浓度洗脱下来的成分,优选20%~90%浓度洗脱下来的成分,更优选30%~70%浓度洗脱下来的成分,上聚酰胺柱,以醇—水梯度洗脱,得到的组分接着上Toyopearl HW-40(4*40cm)、Sephadex LH-20(3*40cm)、MCI gel(3*40cm)柱,以醇-水为洗脱溶剂,分离得到化合物胡麻苷。
结构鉴定
胡麻苷(Pedaliin)
淡黄色粉末(MeOH),mp:251~253℃。UV(λmaxMeOH):274,347nm。
ESI/MS(m/z):
1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)δppm:13.10(1H,s,5-OH),10.04(1H,s,4`-OH),9.40(1H,s,3`-OH),7.47(1H,d,J=8.5Hz,6`-H),7.46(1H,s,2`-H),6.91(1H,d,J=8.5Hz,5`-H),6.89(1H,s,8-H),6.88(1H,s,3-H),5.06(1H,d,J=6.9Hz),4.31(1H,brs),3.92(3H,s,-OCH3),3.60(1H,d,J=11.0Hz),4.20~3.00(suger)。
13C-NMR(DMSO-d6,125MHz)δppm:182.11(C-4),164.19(C-2),158.51(C-7),152.57(C-9),151.70(C-5),149.78(C-4`),145.76(C-3`),128.13(C-6),121.47(C-1`),119.03(C-6`),115.94(C-5`),113.52(C-2`),104.88(C-10),102.70(C-3),102.01(C-1``),91.52(C-8),77.26(C-5``),76.55(C-3``),74.14(C-2``),69.93(C-4``),60.89(C-6``),56.53(-OCH3)。与文献对照基本一致,故确定该化合物为胡麻苷,见附图1-4。
除以上所述,实施本发明方法的过程中所涉及的其它操作,例如提取液的挥发,可以采用加温挥发,也可以直接常温自然挥发或其它可行的方法,分取和挥干过程的具体操作属于本领域的基本技能,而涉及到的中药饮片加工、粉碎、过筛和萃取等,均可采用本领域常规操作或其它可行的操作,本发明没有特别限定。得到的提取物可以通过任何常规的检测分析方法得知其是否符合要求,如薄层色谱法、紫外分光光度法以及其他如《中国药典》2000年版一部附录所收载的分析方法,以上属于本领域常规操作,本发明亦没有特别限定。
从甘青青兰药材中分离精制的总黄酮及其主要成分胡麻苷,药效学试验表明其具有抗缺氧保护神经细胞的作用,因此作为甘青青兰的有效部位和有效成分之一。本文建立的HPLC法用来测定甘青青兰药材和有效部位中胡麻苷的含量,分离效果好,方法快速准确,重现性好。
1.仪器与试药
仪器:Waters2695高效液相色谱仪,Waters2695联盟系统,Waters2696二极管矩阵检测器,Mellennium32色谱工作站;(美国Waters公司),KQ-250超声波清洗器。
试剂:甲醇为色谱纯,磷酸等为分析纯。
对照品:胡麻苷为自行提取精制,并经UV、IR、1H-NMR、13C-NMR鉴定结构,高效液相法测定纯度大于98%。
药材:药材为购于青海省西宁市,经北京中医药大学李家实教授鉴定为为唇形科植物甘青青兰Dracocephalum tanguticum Maxim的干燥地上部分。
2.方法与结果
2.1色谱条件色谱柱:Symmetry Shield Rp18(4.6×250mm,5μm),流动相:甲醇-0.025mol/L磷酸(45∶55);柱温30℃;流速0.7mL/min;检测波长:347nm。在以上色谱条件下,样品液相色谱图中,胡麻苷与其它组分的色谱峰分离度良好。见附图5~15。
柱效与分离度计算:n=5.54×(tR/Wh/2)/2=8105
R=2*(tR2-tR1)/(W1+W2)=7.5
2.2供试品溶液的制备选用50%甲醇做溶剂,采取超声波提取做为样品制备的方法,试验中主要考察了最佳超声提取时间,试验结果表明提取时间为40min时,提取比较完全。因此,确定提取时间为40min。
表1超声提取时间考察
时间(min) | 峰面积 |
20304050 | 77645287833030758893040321 |
取本品粉末(通过60目)约0.5g,精密称定,置50mL具塞锥形瓶中,加50%甲醇25ml,称重,超声提取40min,取出,放冷,再称定重量用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.3对照品溶液的制备 精密称取胡麻苷对照品适量,加50%甲醇制成每1mL含0.198mg的溶液,作为对照品溶液。
2.4线性范围试验 精密量取胡麻苷对照品溶液1.0,3.0,5.0,7.0,10.0μl注入液相色谱仪中,按上述色谱条件测定色谱峰面积,以对照品的进样量X(μg)对峰面积的积分值Y进行线性回归,结果表明,胡麻苷进样量在0.198~1.98μg范围内线性关系良好,线性回归方程为:
Y=4391035X-379568 相关系数:r=0.9998
表2线性范围考察结果
对照品(μg) | 0.198 | 0.594 | 0.990 | 1.386 | 1.980 |
色谱峰面积 | 548595 | 2198567 | 3869423 | 5764074 | 8326548 |
2.5稳定性试验 精密吸取同一供试液,按0、2、4、6、8h时间间隔,分别测定峰面积,试验结果表明,供试品溶液制备后8h内测定,色谱峰面积无明显变化,RSD小于2%,表明在此时间内供试品化学性质稳定。
表3稳定性试验测定结果
时间(小时) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | X | RSD(%) |
色谱峰面积 | 3060963 | 2988732 | 3054321 | 3110320 | 3030457 | 3048959 | 1.46 |
2.6精密度试验 取胡麻苷对照品溶液,同法连续测定5次,测定对照品对应的色谱峰峰面积,计算其RSD为0.24%。
表4精密度试验测定结果
次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | X | RSD(%) |
色谱峰面积 | 3869423 | 3844732 | 3851721 | 3838449 | 3874331 | 3855731 | 0.40 |
2.7重复性试验 取5份有效部位样品,平行操作,测定胡麻苷的含量,计算其RSD为4.60%。
表5重复性试验测定结果
序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | X | RSD(%) |
胡麻苷(%) | 0.44 | 0.42 | 0.41 | 0.39 | 0.43 | 0.418 | 4.60 |
2.8加样回收率试验 取本品已知准确含量(0.44%)的样品(产地:青海)粗粉0.25g,精密称定,置50mL量瓶中。精密加入胡麻苷对照品溶液(10mL),按样品【含量测定】项下方法操作,计算其回收率,平均值为98.0%,RSD为2.27%。
表6回收率试验测定结果
样品称量(g) | 样品含量(mg) | 对照品加入量(mg) | 峰面积 | 实测总量(mg) | 回收率(%) | 均值(%) | RSD(%) |
0.25810.25320.25680.26010.2522 | 1.1361.1141.1301.1441.120 | 1.1881.1881.1881.1881.188 | 790032774123768833781254784355 | 2.3222.2752.2592.2962.305 | 99.8097.7095.1096.90100.60 | 98.0 |
2.9样品测定 取本品粉未(通过60目)约0.5g,有效部位取0.1g,精密称定,置50mL具塞锥形瓶中,药材加入50%甲醇25mL,有效部位加50ml,超声提取40min,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与有效部位供试品溶液5μl,药材10μl注入液相色谱仪测定,计算即得,结果见表7。
表7甘青青兰药材及其部位中胡麻苷含量测定结果(50%甲醇溶剂提取,n=3)
编号 | 样品名称及其批号 | 胡麻苷(%) |
12345678 | 药材20010901药材20011001药材20011015药材20010201药材20010202有效部位20021101有效部位20030401有效部位20030501 | 0.440.420.420.420.4911.2610.0713.41 |
3.讨论
3.1胡麻苷为甘青青兰中主要的黄酮苷类成分且其具有抗缺氧保护神经细胞作用,因此以胡麻苷为指标对甘青青兰药材的质量进行评价具有重要的意义。同时不同批次甘青青兰药材中黄酮苷类成分含量较接近,本品按干燥品计算,含胡麻苷(C22H22O12)不得少于0.40%。
3.2以胡麻苷为指标考察了有效部位总黄酮的质量,通过考察三批中试样品,结果表明,有效部位的总黄酮的变化差异较大,因此以胡麻苷为指标控制有效部位的质量,本品按干燥品计算,含胡麻苷(C22H22O12)不得少于11.24%。
总之,本发明人在对甘青青兰的研究中意外地发现,上述黄酮类有效部位对脑缺血和脑缺氧的治疗有效,进一步药效试验证实了甘青青兰黄酮类有效部位在治疗脑缺血和脑缺氧疾病中的用途,尤其可用于治疗脑缺血。本发明人发现了该黄酮类提取物在制备治疗脑缺血疾病的药物中的用途。
在上述研究基础上,本发明还提供了可用于治疗脑缺血和脑缺氧的药物组合物,包括治疗有效量的中药黄酮类提取物及药剂学中可接受的药物辅剂,其中黄酮类提取物以胡麻苷计在组合物中重量比至少不低于5%,优选不低于10%,更优选15%以上,不超过95%。
上述药物组合物包括药学可接受的任何剂型,如注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂和口服液等,上述药物辅剂也包括药学可接受的任何辅料,以及各剂型的制备工艺均为本领域常规操作,在此不加赘述。
根据本发明的药物组合物,该黄酮类有效部位还可与其它中药成分复配达到更好的治疗效果,所述中药成分可以是例如葛根、人参、银杏、三七、灯盏花、丹参等原料药中的有效成分,其可来自任何提取方法。
附图说明:
图1胡麻苷化学结构式(Pedaliin)
图2胡麻苷UV图谱(Pedaliin-UV spectra)
图3胡麻苷1H-NMR图谱(Pedaliin--1H-NMR spectra)
图4胡麻苷13C-NMR图谱(Pedaliin--13C-NMR spectra)
图5甘青青兰药材(批号:20010901)HPLC色谱图
图6甘青青兰药材(批号:20011001)HPLC色谱图
图7甘青青兰药材(批号:20011015)HPLC色谱图
图8甘青青兰有效部位(批号:20021101)HPLC色谱图
图9甘青青兰有效部位(批号:20030401)HPLC色谱图
图10甘青青兰有效部位(批号:20030501)HPLC色谱图
图11胡麻苷对照品HPLC色谱图
图12甘青青兰药材HPLC指纹图谱(批号:20010901)
图13甘青青兰药材HPLC指纹图谱(批号:20011001)
图14甘青青兰药材HPLC指纹图谱(批号:20011015)
图15甘青青兰药材(三批)HPLC叠加指纹图谱
图16甘青青兰有效部位HPLC指纹图谱(批号:20021101)
图17甘青青兰有效部位HPLC指纹图谱(批号:20030401)
图18甘青青兰有效部位HPLC指纹图谱(批号:20030501)
图19甘青青兰有效部位(三批)HPLC叠加指纹图谱。
具体实施方式
关于本发明的具体实施和治疗效果,将结合优选实施例及附图进行详细阐述,需要说明的是:本发明所采用的术语“黄酮类提取物”、“黄酮类有效部位”及“总有效部位”的含义是相同的。
甘青青兰黄酮类有效成分胡麻苷的提取(一)
药材2.5kg粉碎成粗粉,加70%乙醇提取三次(8倍量、2小时;6倍量、1小时;6倍量、1小时)合并提取液,回收乙醇至无醇味(4000ml),沉淀析出,滤过,得A部分173g。
取提取液(4000ml)中2200ml上大孔吸附树脂Dianion HP-20柱(5*55cm)吸附充分,以H2O(B部分)、10%EtOH(C部分)、30%EtOH(D部分)、50%EtOH(E部分)、90%EtOH(F部分)分别进行洗脱,得B部分89.123g、C部分17.052g、D部分28.617g、E部分16.126g、F部分8.014g
D部分(25g)拌样上聚酰胺柱(5*50cm),以乙醇-水梯度洗脱,得到D1-D5不同的部位,每个部位反复上Toyopearl HW-40(4*40cm)、Sephadex LH-20(3*40cm)、MCI gel(3*40cm)柱,以甲醇-水,乙醇-水为洗脱溶剂,分离得到化合物DT-D-1、DT-D-4、DT-D-5、DT-D-6,其中DT-D-1即为胡麻苷。
甘青青兰黄酮类有效部位的提取(二)
1.大孔吸附树脂的处理
1.1预处理:取AB-8型大孔吸附树脂,用丙酮加热回流洗脱,洗脱至洗脱液蒸干后无残留物。
1.2装柱:以乙醇湿法装柱,继续用乙醇冲柱,不时检查流出液,至与水混合不呈白色混浊为止(乙醇液∶水=1∶5)。然后以大量的蒸馏水洗去乙醇,备用。
1.3再生:树脂使用一次后,一般用95%的乙醇洗脱至无色时,树脂柱即已再生,然后以大量水洗去乙醇,即可进行下一次的分离。经反复使用后,吸附树脂颜色变深,吸附效果下降时,可用0.1%~0.5%NaOH和HCl进行酸碱交替处理或浸泡适当的时间,至树脂接近原颜色为宜,继续用水洗至中性即可再用。
2.药材的提取:取药材甘青青兰,粉碎成粗粉,用50%乙醇回流提取3次(8倍量,2小时;6倍量,1小时;6倍量,1小时),滤过,合并滤液,低温减压回收乙醇至无醇味,以水调节至每毫升药液相当于1.59g生药。
2.1洗脱溶媒的定性选择:取提取液加到已处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱(3*15cm)上,依次用蒸馏水、10%、30%、50%、70%、90%乙醇梯度洗脱,分段收集,减压回收乙醇加以浓缩,聚酰胺薄层色谱及其HPLC色谱定性检查胡麻苷和黄酮类成分。结果显示10%、70%、90%中含有黄酮较少,同时结合药效学实验结果,30%、50%乙醇洗脱的药效结果较好,因此确定提取液在AB-8型大孔吸附树脂吸附后,水和10%乙醇洗脱除去水溶性杂质,50%乙醇洗脱富集青兰中黄酮类成分。
2.2 50%乙醇洗脱量的确定:取样品溶液20ml上柱,静置后,先用蒸馏水、10%乙醇洗脱至无色,再用50%乙醇洗脱,每50ml为一份,每份稍加浓缩,薄层色谱法定性检测胡麻苷,结果显示第16份时检测不出胡麻苷,故确定洗脱溶媒用量为900mL。
2.3富集程度考察:取样品液20ml,按上述条件上柱洗脱,收集水洗脱液浓缩干燥至恒重,收集50%乙醇洗脱液,减压回收乙醇,并减压干燥至恒重。另取提取液20ml减压干燥至恒重,分别测定总固物的含量。并按含量测定法测定上柱前和上柱后的含量,结果见表8。
总固体物(g) | 胡麻苷量(mg) | 胡麻苷含量(%) | |
上柱前上柱后水洗脱物胡麻苷保留率(%) | 6.281.194.09- | 156.35120.654.0277.17 | 2.4910.130.10- |
结果表明,以AB-8型大孔吸附树脂为吸附剂,上样与洗脱前后的总固型物和胡麻苷的含量为指标,AB-8型大孔吸附树脂可以有效的去除杂质,使胡麻苷为主要成分的黄酮类成分的含量大幅度提高,而且的保留率接近,说明AB-8型大孔吸附树脂可用于青兰中有效部位黄酮类成分的富集。
以胡麻苷为指标评价AB-8型大孔吸附树脂富集青兰中有效部位黄酮类成分的上样量,结果表明大孔吸附树脂100mL最大吸附量为20ml青兰药液为佳。
甘青青兰有效部位HPLC指纹图谱(三)(见附图16-19)
1.仪器与试剂
Waters2695联盟系统(2996二极管矩阵检测器,Mellennium32色谱工作站,柱温箱,自动进样,氦气脱气,美国Waters公司),Symmetry ShieldRp185μm(4.6mm×25cm)色谱分析柱。KQ-250型超声清洗器。
所用甲醇为色谱纯,水为重蒸水,磷酸为分析纯。
对照品胡麻苷为本实验室自制,经HPLC检查纯度大于99%。
2.实验样品的制备
药材经粉碎机粉碎后过40目筛,取各批药材粉末0.5g,精密称定,置于50mL具塞锥形瓶中,加25ml 50%甲醇,超声提取30min,用微孔滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。
取有效部位DT 0.1g,精密称定,置于50mL容量瓶中,加适量50%甲醇,超声溶解30min,放冷后,50%甲醇定容,用微孔滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。
3.色谱条件
色谱柱:Symmetry Shield Rp18(5μm 4.6mm×250mm)
流动相:甲醇(A)-0.025mol/L磷酸(B)梯度,
0min:40(A):60(B)
60min:50(A):50(A)
检测波长:347nm
柱温:30℃
流速:0.5mL/min
进样量:10μl
药理学实验研究
甘青青兰提取物总黄酮和胡麻苷对大鼠大脑中动脉血栓模型的离体实验
一.实验材料
1.动物:SD大鼠,雄性,体重350±20g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,合格证号:SCXK 11-00-0008。
2.药物:
受试药物:胡麻苷、总黄酮,均为本实验室提供。
(2)阳性对照药:海得琴(甲磺酸双氢麦角毒碱片),片剂,规格:1mg/片,人日用量为3~6mg,临用时以0.5%cmc配制。由瑞士山德士药厂与国营天津华津制药厂合作生产,批号971166。适应症:主要用于与老年化有关的精神退化的症状和体征,急慢性脑血管病后的功能、智力减退的症状。
(3)其他药品与试剂:
FeCl3·6H2O(A·R):北京市朝阳区通惠化工厂生产,用1mol/L盐酸配制成50%溶液。红四氮唑:化学纯,由中国医药(集团)上海化学试剂公司提供。批号H20010305。余均为市售分析纯。
3.仪器设备:
(1)XTL-I型连续变倍体视显微镜,由北京电子光学设备厂生产。
(2)AEG-200型电子分析天平,日本岛津产。
小型三用水箱,北京市医用设备厂生产。
Df-206型电热鼓风干燥箱,北京京通设备厂生产。
LG-R-80A型自动冲洗血液粘度仪和LG-B-190型红细胞变形/聚集测试仪,均由北京世帝科学仪器公司提供。
二.方法与结果
1.大鼠大脑中动脉血栓模型的制备及分组给药
方法来源:刘小光、徐理钠。一种能评价溶栓药和抗栓药的大鼠大脑中动脉血栓模型。药理学报,1995;30:662
实验用大鼠,以水合氯醛0.35g/kg腹腔注射麻醉,按Tamura等的方法,稍加改进。大鼠右侧卧位固定,在眼外眦和外耳道连线中点作一长1.5cm的弧形切口,暴露颞骨,用牙科钻在颧骨与颞鳞骨接合处向鼻侧1mm处作一直径2.5mm的骨窗,暴露大脑中动脉,将吸有10μl 50%FeCl3液的小片滤纸敷在大脑中动脉上,手术在体视显微镜下进行。待30min后大脑中动脉变黑,取下滤纸,用生理盐水冲洗局部组织,逐层缝合。假手术组不敷FeCl3,余同模型组。实验分为5组:假手术组、模型组、以上2组均给予等量蒸馏水。阳性对照药海得琴0.6mg/kg组、胡麻苷组、总黄酮组。术前灌胃给药7天。
3.对模型大鼠缺血性脑损伤的影响
3.1对神经症状的影响:在术后不同时间(6h、24h、32h、48),对动物神经症状进行评分,评分标准参考【Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M等.Rat middlecerebral artery occlusion:evaluation of the mode and development of aneurologic examination.Stroke,1986,17:472】具体如下:(1)大鼠被提尾悬空时,两前肢对称伸向地面,记0分,如不平行,手术对侧前肢出现肩屈曲、肘屈曲、肩内旋或既有腕肘屈曲又有内旋者,根据损伤程度不同分别记为1-3分;(2)置大鼠于平滑地面上,分别推双肩向对侧移动,手感左右推动阻力相等,记0分,如向手术对侧推动时阻力下降者,依程度不同记为1-3分;(3)将动物两前肢置一金属网上,用力向后拉,观察两前肢的肌张力,对等且有力者记0分,手术对侧前肢肌张力下降者,依程度不同记1-3分;(4)提鼠尾离开地面,动物有不停的向手术对侧转圈者,记1分。
据以上标准,满分10分,分数越高,动物行为障碍越严重。结果组间比较,进行t检验。结果见表9。
3.2对脑梗塞范围的影响:实验方法参考【Lundy EF,Solik BS,Frank RS et al.Morphometric evaluation of brain infarcts in rats and gerbils.J Pharmacol Method,1986;16:201】动物经末次神经症状评分后,断头取脑,除掉嗅球、小脑和低位脑干,将其余部分冠状切成厚度相同的7片,置5ml染色液中(含4%红四氮唑1.5ml,1mol/L KH2PO4 0.1ml及双蒸水3.4ml),37℃避光温孵30min,正常组织染成红色,梗塞组织为白色,将白色组织仔细分离并称重,以梗塞组织重量占总脑重量的百分比作为脑梗塞范围,结果如表10所示。
3.3对血液流变学的影响动物处死前,经腹主动脉取血0.8ml,抗凝,用血液粘度仪进行检测,以高切(200S-1)、中切(30S-1)和低切(5S-1)时血液粘度表示全血粘度;另取抗凝血以2000转离心8min,其上清液即为血浆,取0.8ml血浆用血液粘度仪测试100S-1时的血浆粘度。结果组间比较,进行t检验,如表11、表12所示。
表9总黄酮、胡麻苷对24小时大脑中动脉血栓模型神经症状评分的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 例数 | 神经症状评分 | |
6h | 24h | |||
假手术组模型组海得琴组总黄酮组胡麻苷组 | --0.615020 | 121281010 | 0±0**6.67±1.034.00±0.50**4.60±0.92**4.40±1.28** | 0±0**5.83±1.073.75±0.66**4.10±1.14*3.60±0.80** |
注:
X±SD;各组与模型组相比较:*P<0.05;**P<0.01
表10总黄酮、胡麻苷对大脑中动脉血栓模型脑梗塞范围的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 例数 | 脑梗塞范围(%) |
24h | |||
假手术组模型组海得琴组总黄酮组胡麻苷组 | --0.615020 | 121281010 | 0±0**4.12±1.292.11±1.46*2.35±1.19**2.61±1.10* |
注:
X±SD;与模型组相比,*P<0.05;**P<0.01
表11总黄酮、胡麻苷对24h大脑中动脉血栓模型血液粘度的影响
组别 | 剂量mg/kg | 例数 | 全血粘度 | 血浆粘度100S-1 | ||
高切(200S-1) | 中切(30S-1) | 低切(1S-1) | ||||
正常组模型组海得琴组总黄酮组胡麻苷组 | --0.65020 | 1212101010 | 4.89±0.45*5.37±0.404.93±0.38*5.26±0.355.37±0.62 | 7.06±1.127.93±1.047.16±1.208.28±0.948.83±1.26 | 26.27±5.51**34.69±4.0329.55±3.95*25.20±5.65**30.17±5.75 | 1.25±011*1.40±0.141.18±0.14**1.16±0.06**1.18±0.10** |
注:
X±SD;各组与模型组相比,*P<0.05;**P<0.01,
表12总黄酮、胡麻苷对24h大脑中动脉血栓模型血液流变学的影响
组别 | 剂量(mg/kg) | 例数 | 血小板聚集率(%) | |
ADP | 胶原 | |||
正常组模型组海得琴组总黄酮组胡麻苷组 | --0.615020 | 1212888 | 55.33±8.53*67.08±7.6431.00±12.22**64.30±8.9464.90±4.08 | 59.4±16.463.67±12.9323.11±11.86**50.30±11.0555.80±7.90 |
注:
X±SD;各组均与模型组相比,*P<0.05;**P<0.01;
[总结]:
(1)大脑中动脉血栓模型可以比较客观地模拟临床脑梗塞多发生在大脑中动脉这一事实,易控制局部条件,对全身影响小,复制成功率高,且与临床脑血栓形成的病理过程相似,血栓部位固定,于24h出现偏瘫样症状,TTC染色可见明显的脑梗塞灶。
(2)总黄酮、胡麻苷能改善大鼠的神经症状,降低缺血大鼠脑梗塞范围,此种结果提示药物有改善脑缺血的作用。
(3)大鼠形成大脑中动脉血栓后,可引起血小板聚集率升高,全血粘度(高切200S-1、中切30S-1和低切5S-1)及血浆粘度(100S-1)增加,说明在脑缺血的发生过程中,血液流变学呈粘、浓、凝、聚状态的变化。
总黄酮、胡麻苷均能降低血小板聚集率。能降低全血粘度和血浆粘度。提示对血液流变学的改善作用是其抗脑缺血作用的机制之一。
药物组合物
实施例1:注射剂
含有胡麻苷的黄酮类提取物 10g
苯甲醇 10g
注射用水 加至1000ml
共制成注射剂1000ml。
实施例2:片剂
含有胡麻苷的黄酮类提取物 10g
淀粉 50g
糖粉 20g
糊精 20g
常规压片,压制1000片,每片0.1g。
实施例3:胶囊剂
含有胡麻苷的黄酮类提取物 10g
糊精 20g
糖粉 20g
淀粉 100g
共制成1000粒。
实施例4:颗粒剂
含有胡麻苷的黄酮类提取物 10g
糊精 100g
糖粉 200g
淀粉 690g
常规方法制成颗粒剂1000g,装袋,每袋10g。
以上描述了本发明优选实施方式,然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
Claims (8)
1、甘青青兰的黄酮类提取物,其特征在于至少含有胡麻苷,每克该黄酮类提取物中含有胡麻苷不少于50毫克。
2、如权利要求1所述的黄酮类提取物,其中,每克提取物中含有胡麻苷不少于100毫克。
3、如权利要求1或2所述的黄酮类提取物的制备方法,其中依次为醇水提取、上大孔吸附树脂,20%~100%醇洗脱,吸附除杂、浓缩、干燥。
4、如权利要求3所述的黄酮类提取物的制备方法,其中用30%~70%的乙醇洗脱。
5、如权利要求1或2所述的黄酮类提取物在制备治疗脑缺血和脑缺氧疾病的药物中的应用。
6、一种药物组合物,包括治疗有效量的权利要求1或2的黄酮类提取物和及药剂学中可接受的药物辅剂。
7、如权利要求6的药物组合物,其中黄酮类提取物的重量比例至少不低于5%。
8、如权利要求6或7所述的药物组合物,其中黄酮类提取物的重量比例为5%~95%。
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