CN1301341A - 用于分子遗传诊断的组织样品的采集和预处理的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种采集和预处理用于分子遗传诊断的组织/血液或其它有核或含DNA的细胞或细胞成分的样品的装置和方法。用于收集和预处理含DNA的细胞样品的本发明装置包括一个样品收集器和收集样品的装置,该装置采集到样品后插入样品收集器并紧紧密封。样品收集器有一个底座和侧壁,由一个可轻易穿透的盖密封,在收集器侧壁上远离底座处有用于固定采样器的装置;收集器内是防止DNA降解酶的物质。用于采集样品的工具的构成使其插入样品收集器时,被收集器内用于固定的装置固定到位,并将样品收集器分割成至少一个由样品收集器的底座和侧壁以及采样器前端所限定的样品间。
Description
本发明涉及一种采集和预处理样品的装置和方法,所述样品为用于分子遗传诊断的组织、血液或其它有核的或含DNA的细胞或细胞成分。本发明还涉及所述装置在动物群体分类中的应用。
大量组织或DNA样品的采集是多种研究和应用项目所必需的。在某些情况下,必须收集关于整个牧群(例如生物学动态的动物生产)或部分区域的或有特定特征的动物群体的信息。
这样,例如,由疯牛病(BSE)丑闻和与此相关的确保肉及肉制品来源于未受影响之农场的问题引发了在欧盟范围内对农场动物的强制鉴定,即所供应的动物在出生时或出生后不久均有耳标作为其身份标识。有特定编号可鉴别每只饲养动物。因此,通过检查该编号,就例如有可能在稍后在屠宰场判定动物来自哪个农场。
然而这些耳标不能防止伪造,并可通过人为操作而改变,从而逃避所用识别系统。消费者或中间商不能确保动物确实来自所标明的农场。
因此需要有一种简单且独立于生产者、加工者、销售者的信息分析方法。
众所周知,每一只动物都能通过检验特定DNA变体(“遗传指纹”)而分别鉴定。在法医学和育种动物的亲子关系鉴定中,已使用这些创新的分子遗传检验进行分析;通常由兽医收集血样作为动物样品并进行分析。然而,动物群体较大时,这样做劳动强度过大,而且从经济的角度看不太实际。
有了现代检测方法(PCR、测序等)的帮助,即使是对极少量组织样品,也可鉴定它们是否源自一个特定个体。该检验的实施相对较容易,可靠性高于99.9%。
然而,目前对这样大量的样品实施分离、定向收集、保存、分类和分析所花费的财力和劳力是巨大的。
本发明的一个功能就是提供一种装置,使对受试动物含DNA的样品的收集可用该装置轻易且经济地实施。
本发明的另一功能是提供一种方法,使组织或血液样品可用这种方法很容易地从进行分析研究的受试动物中收集。
该功能通过一种用于收集和预处理含DNA之细胞样品的装置实现,该装置包括一个样品收集器和采样器。收集到样品后,将采样器插入样品收集器中并紧密封口。样品收集器有底座、侧壁,用一个可轻易穿透的瓶盖封闭。在侧壁上远离底座的区域有用于固定插入的采样器的装置和阻止DNA降解酶的物质。采样器构成如下,当它插入样品收集器时,固定该采样器的装置(在样品收集器内提供)即将其套牢定位,采样器将样品收集器分割成至少一个由样品收集器的底座、侧壁和采样器前端所限定的样品间。
此外,使用本发明的装置,用采样器的前端收集合适的样品并插入样品收集器中,从而通过样品收集器的底座和侧壁以及采样器的前端形成一个限定的与环境隔绝的样品间,由此实现前述功能。
现在通过附图解释本发明,即:
图1表示一个样品收集器模型1的剖面图,在其底座2上有一个凸体8。采样器4在样品收集器1内,并紧紧密封。在采样器4中远离样品间6和6a的一侧是一个允许插杆插入的孔12。
图2表示带钉柱10a的钉盘10,孔扣盘11和带舌柄9的样品收集器1的剖面结构图。样品收集器1用采样器4密封,显示了应用耳标10、11并同时收集样品之后的状态。
图3表示耳标10、11的侧面图,其包括用适当的装置衔接之前的钉盘10和孔扣盘11,以及带舌柄9的样品收集器1。
图4为牛群DNA指纹鉴定图。
现在采用优选的模型并参照附图详细描述本发明。
本发明的装置包括一个样品收集器1和采样器4。
样品收集器1有一个底座2和侧壁3,并用一个易于穿透的盖(如胶片或薄膜)封口。样品收集器1可通过加膜而进一步划分,从而使2个或更多部件可在使用前在样品收集器1内相互隔离,而且仅当采样器4进入样品收集器1并相互接触及与样品接触时才打破隔离。样品收集器1可进一步用分割壁(如占整个底座2的直径长度的凸体8)再划分成至少2个舱,使收集样品时至少可以收集2个完全分开的样品。
在优选的模型中,样品收集器1至少可以容纳采样器4的前端。如果需要,它的底座2可以做成带锥形凸体8的形式;采样器4恰好与凸体8相吻合。结果,当采样器4进入样品收集器1时,样品经强烈挤压进入由样品收集器1的底座2、侧壁3以及采样器4的前端7所组成的样品间6、6a。
样品收集器1也可以带有一个诸如扁平固定物之类的把持装置9,例如一个带孔舌柄以适当加固。这样,当在耳标10、11上用钳子时,舌柄可以加固钳子。舌柄也适用于记载与耳标上相同的识别数字。标记可以手工做在所提供的槽上,或者舌柄可以预先作标记(如压印),或者在耳标10、11的平板部分做识别数字的同时可以给舌柄打印相同的数字。
如果需要(例如为了进一步手工处理样品),样品收集器1还可以做成以下形状,使与采样器4闭合后,样品收集器1上界定出样品间6的部分用螺纹与样品收集器1的主体相连,并因此很容易旋下,能轻易接触到样品。
在本装置的优选模型中,样品收集器1用采样器4封闭的方式将使所形成的样品间6、6a如果不破坏装置就无法打开。因此可确保无法未经注意就对所收集的样品进行操作。
在样品收集器1内是使组织样品的蛋白质成分失活并稳定DNA的物质。
这些使组织样品的蛋白质(酶、DNA酶等)失活并稳定DNA的物质可例如选自:
蛋白酶K(例如:使保存时稳定的冻干形式)和用于消化蛋白质的缓冲液(分别加入);
强碱;
分子筛(例如:E.Merck 0.2nm No.1.05704.0250,K 230045904 624,吸水性>20%),可强烈吸水并干燥(及保温)与之接触的组织样品并使之失活。为防止分子筛不必要地吸收空气中的水分,可使用如惰性氩气将其包裹并以薄膜封闭;其它有助于使蛋白质成分失活并稳定DNA的成分。所述物质可配制成使其长期保持活性,如最长至一年或更长,并在导入样品后至少几个月最多一年内保证DNA的完整性足以用于分析研究。
采样器4可采用任何形状,只要能收集到样品并导入样品收集器1,导入后采样器4密封住样品收集器1。这包括圆柱形、锥形等。
在本装置的优选模型中,采样器4包括两个部分,使用前它们相互连接(但为可分开),使用时相互分离。这可用例如一个带特殊断点的塑料窄桥实现。采样器4可以是实心的,或者其后侧可允许插入一根插杆,如一个带中心孔12的插杆,使用时钳子的不锈钢插杆可以插入孔中使其坚固。
采样器4具有多种功能。样品由其收集,例如简单地将其浸入体液如血液、淋巴或尿液中,或从受试动物刮取或抽取组织。
在一优选模型中,受试动物的耳朵用本发明装置刺破;采样器4的前端可以做成带锋利边缘的,这样穿刺耳朵就可抽取/挤压出少量组织样品。
在本装置的另一优选模型中,在用耳标压穿试验对象的耳朵时,为了收集样品,将采样器与另一合适的器具如耳标钳子同时使用,从而使耳标的应用与样品的收集可以在同一工作程序中完成。
用于标识的耳标通常包括两部分,带钉柱10的盘(钉盘)和孔扣盘11,孔扣盘和钉盘尺寸差不多或略小,只要其足以防止钉柱10a滑落到耳朵上即可。两部分都采用可与食物一起使用的组织相容性合成材料(如:聚氨酯——拜尔(Bayer)公司的Desmopan 795 U)或部分可用金属(如:不锈钢、黄铜、青铜等)。
为插入耳标10、11可以用商用耳标钳子。大部分可用作此用途的钳子在必要时都能通过加上一小块额外的部分而轻易改进,使得当耳标10、11插入后,样品收集器1仍挂在钳子上,从而容易收集。这个额外的部分可以是一个小球形柄,带样品收集器1的舌柄9上的洞可以挂于其上。在把耳标10、11插入耳朵上后,如果必要可以把耳标10、11猛地从钳子的把手上拔出,球形柄会将带样品收集器1的舌柄9牢固地卡在钳子上。接着舌柄可以容易地挂在球形柄上,这样样品收集器1可被收集。
采样器4在导入样品收集器1后紧紧地密封并用固定装置5固定到位,可以防止样品物质漏出或外部物质进入。
样品收集器1和采样器4可以用任何合适的材料制作,例如金属或玻璃纤维强化的合成材料。如果采样器4用合成材料制成,在插入耳朵时它可以被所用钳子的金属插杆加固。
采用本发明的装置可以在用耳标10、11做常规识别标记的同时从动物身上取样,不需额外的工作或花费。节省的效果很显著。
与传统的样品收集器相比,本发明装置的另一优点是样品收集器上的舌柄9具有平舌状外形,可用于标记/识别样品。通常要在几乎是圆柱形容器(例如Eppendorf管)的近乎圆形的表面上用手作标记,这需要可观的努力并且结果可能很难辨认。因而很难扫描数字或数据并自动收集。
当不得不从整体结构的一部分取样时,常常需要用一个工具(刀、尖勺、解剖刀等)取样,此时本发明的系统具有特殊优点。在使用可重复利用的工具时污染的危险很高,正如使用PCR(多聚酶链式反应)这样很灵敏的检测时即使单个细胞都可能导致污染并因此导致假阳性结果。使用本发明的装置,只有一次性使用的部分会与样品物质接触。
本发明装置也可用于如可靠而安全地收集和处理液体样品(血液、尿、唾液等)。在这种情况下液体可置于样品收集器1的开口处,或置于采样器4前端,然后用合适的装置如钳子将其压入样品收集器1。也可以干净、可信地收集来自表面(皮肤、粘膜)的样品,且用本发明装置,把采样器4的前端当成一把“锋利的勺子”,简短地在表面上划/擦,就能安全地鉴定。
本发明的实质性优点是样品收集器1可以在耳标(钉盘10、孔扣盘11)的同时作标记,因此在分发给动物使用者或所有者之前可准确无误地标记相同的编号n。做标记可以由打印机完成,用塑料耳标时可以涂上一种(黑色)高级混合色(mastermix),它与合成材料结合得很牢,常规使用时无法将其擦掉或清除。此外,相应部分可打印上相同的专用数字。
用本发明装置收集的样品然后被送到中心收集区并在那里分析。收集样品收集器1不需要特别考虑运输中的温度和所花时间。样品收集器1可以用普通邮件、加急邮件运输,或者将样品收集到实验室或储藏室,没有问题也没有危险。
在实验室取一等份试样,测试反应和分析可用自动控制系统自动完成。样品的识别数字被储存起来并进一步由读取装置(扫描器)处理。通过避免手工输入数据,错误部分可以忽略不计。
对用本发明装置收集的样品中的DNA进行处理或分析时,将样品收集器1放到传送带上,使扫描器可以记录样品的身份。然后从样品间6、6a的底部插入一个导管,注入液体以取样,然后取一份等份试样。插入点可以再次封上,使样品收集器得以保存。如果刚开始时样品间6、6a以合适的方式分配,则本发明的装置内还有更多样品可作分析。
DNA分离可以通过使用自动移液器(Beckman公司的Biomec 2000)自动完成,而DNA纯化采用硅胶颗粒(例如,BIO-RAD公司的InstaGeneMatrix)。这些样品的测试反应也可以自动预备。
在此描述的易于收集样品和自动分析的系统有以下优点:
产地的防伪证明,从加工到消费的各个阶段所有牛及其肉制品的标记,以及因此保证来源于没有BSE的地区。可控制并稳定的定向销售如正规农场或国家公园饲养的动物或有特别级身份的动物。检验并监控运输途径,以及所有牛的运输的时间和距离。对于牛在欧盟内以及国际出口中的有效边境管理和跟踪。在任何时间如拍卖、展览等能对所有经身份证实才售出的饲养牛群进行准确的身份验证。完整证明所有牛的出生地并检出错误或伪造的文件。绝对可信的法庭证据(也可由医疗检验人员检查胃内容物中已消化的牛肉)。对(质量控制)和流行病学控制的绝对可信的监控。检测包括宠物食品在内的所有(加工的)食物中混合的牛肉。检查进行随机检测的屠宰场的生产者是否使用了禁用的激素和生长刺激因子。为牛的其它产品如皮革、骨头、牛角、牛蹄、器官制品、血液等证明来源。对直接销售奶和奶制品的动物和库存地的证明和检测。对所有牛群和销售途径的准确登记。DNA多态性的详细分析、遗传距离的测量和遗传筛选计划所用的样品的可提供性。繁殖计划的优化。遗传距离的测量。动物育种的谱系和育种史的调查。作为标记物辅助筛选计划(MAS)的一部分的分析。特殊遗传缺陷的出现和频率的确切证据。从法庭的角度,此处描述的装置和方法另有优点,即无法在对样品收集器的必要处理不被人注意的前提下改变(更换、伪造)所收集的样品。
通过收集和编列目录,有可能进行样品的进一步分类、产地的检测、遗传缺陷的筛选、存栏数的分析、突变的检测以及食物的筛选、病原体的诊断、转基因的检定、食物加工操作的卫生监督,且花费不大。
有了此处描述的系统,可对消化前的所有动物及其所有制品的遗传信息进行检测。其通常的相关开支将多方面减少。
即使是来源于动物的精加工食物(香肠、加工过的肉、“Leberks”(加有香料和其他配料的经过细细碾碎的肉,需在烤箱中烘烤或以现烤形式提供)、炸小牛肉片等),也可有物质和个体特异性DNA。因此有可能检测出掺杂了其它肉成分的食物的污染。当然还可凭此方法毫无疑问地证实某一食物来自于所标明的具体动物-前提是在原产农场采集了相应的(第一)样品(图4)。
为此必须从每一新生动物采集用于DNA分型的耳朵组织样本,并送到分型中心。在那里用微卫星引物通过(自动)PCR制作DNA指纹,并对每一个动物的准确模式进行登记。
这些数据保存于中心档案中并可访问。例行检测所得指纹,即所传送的第二份样品经DNA分型后,与第一次分析的指纹相比较,即可找到相匹配的动物。这个结果通常可在一天内得到。在极端的情况下,如动物运输或边境检疫中,特快结果可在三小时内获得。针对每一已登记动物均可提取其动物编号即DNA指纹和所有其它数据。可对动物的所有者即由一个所有者售出或来自同一牧群的所有动物进行集中。经过若干年对所有新生牛的登记,动物的亲本的亲子关系和每个亲本的后代数目可以通过该文件查找。对农场动物的一个完整群体的个体分型是新颖的。每一个消费者、客人、交易者、经销商、屠夫、加工者、所有者或检验员可以核对动物或动物制品的身份进而核对产地(图4)。进行这种核对时,只需从诸如屠宰场、超市或甚至从已经加工好的肉(如餐馆里已上桌的炸小牛肉片)取第二份样品。
对动物活体,如检查动物是否以经过批准的方式(距离)运输时,也可进行类似的分型。有了足够高的测试频率,测试结果的确定程度可自动导致欺诈行为降至最低,因为害怕可信的、合法的铁证以及被查明的危险。
将来为了监控特定动物群体或牧群以便预防危险、控制流行病或检测动物体内的非法残留物(激素、生长刺激因子等)而可能做出的各种安排,可以立即着手使用已收集到的DNA数据。
如果一个国家坚持用此处描述的系统进行个体分型,就可以一直处于立即(即当天)对发生的问题(如某一动物怀疑为BSE、某一农场猪瘟爆发等)作出反应的状态,从而给消费者提供无比的保护和空前的监测可能性。
尤其可能,例如通过个体分型而彻底且毫无疑问地证实来自“另一”生产的动物及其制品确实来源于那儿。那意味着每位消费者通过送去样品(第二份样品),即使在肉类经过长途运输和销售以后也可安排检测肉类相关信息。
现用非限制性实施例更具体解释本发明。
实施例1
牛群中的个体分型
牛用传统的耳标标记。采样器附在钉盘的钉柱上,采样器的形状为前端圆锥形和圆柱形底座,底座上有一孔用于容纳钉盘的钉柱。
将钳子上与舌柄为一体的样品收集器置于为孔扣盘提供的位置,使得用一个合成膜密封的样品收集器的盖会对准孔扣盘的口。
在远离样品收集器的地方,舌柄有一个洞将其固定于钳子上。
挤压钉盘上与样品收集器相连的钉柱,使其穿过母牛的耳朵,可将所得耳朵样品压入样品收集器。然后通过样品收集器内壁上的凸体固定采样器,从而使所形成的样品间密封。
样品收集器内有一个分子筛(Merck,0.2nm Nr.1.05704.0250),可保护所收集样品中的DNA不会降解。
可以毫无问题对样品收集器中放置了半年的遗传物质进行已知基因的DNA指纹分析和PCR分析。
实施例2
筛选用于特殊品系育种的功能性突变体(如用于异体移植的1.3Gal/Gal3阴性猪)。
由于自然突变率,在单一个体的足够大的群体中,基因组中出现的每一个基因不仅包含各种静默突变,而且很可能还包含导致等位基因失活的突变。在大多数这类情况下,这更可能涉及隐性突变而非显性突变。根据Hardy-Weinberg定律,由突变所致基因型的这类改变大部分被杂合子个体所掩盖。
在筛选方法中,关键是在所供猪群中对适当位点用适当的分子遗传学分析找到一个(单个)带有突变的杂合子携带动物。然后可用这个动物建立一个纯合子阴性品系,它具有与基因敲除术所产生品系相同的所需且必需的基因缺陷。它绝不会比这差。
所述方法代表了干细胞系在与不含任何标记物的适当构建体重组后的一定筛选级别。区别如下:一个干细胞系的所有细胞具有相同的基因型,例外的是那些在单次突变事件后包含了一个改变或重组的细胞。在猪群的筛选中所有分析过的基因型均不相同。它们未经定向诱变但确实带有突变,其在进化和育种者的工作中积累(只要在杂合子状态它们就没有阴性选择的压力)。
已知1.3Gal/Gal3的表达有量的差异。突变分析旨在发现多样化群体中已经存在的突变,所以要分析育种动物。如果忽视新的突变,则生产型猪只能携带育种亲本已经表现的变异。用Typi-fix系统保存和收集组织样品是实践中成功实施或获得财政收益的关键因素。在进行分析以寻找突变携带者时,须假定检测可能有多达100,000种基因型将接受检测,以找到有1.3Gal/Gal3缺陷的潜在动物。对来自100,000头猪的个体样品进行收集成本较高,此时可选择本发明的系统。样品只需传送到实验室(通过邮件或样品收集),在那里进一步处理。
Claims (21)
1.用于收集和预处理含有DNA的细胞样品的装置,包括
一个样品收集器(1)和一个采样器(4),它在收集样品后进入样品收集器并将其密封,
样品收集器(1)有底座(2)和侧壁(3),并以一个可轻易穿透的盖封口,在收集器侧壁上远隔底座之处有用于固定采样器的装置(5);收集器内提供防止DNA降解酶的方式;
采样器(4)的构成方式使其插入样品收集器(1)时被收集器内的固定装置(5)固定到位,并将样品收集器分割成至少一个由样品收集器(1)的底座(2)、侧壁(3)和采样器前端(7)所限定的样品间(6,6a)。
2.根据权利要求1的装置,其中所述样品收集器的可轻易穿透的盖是一层薄膜或防水膜。
3.根据权利要求1或2的装置,其中所述防止DNA降解酶的方式是使用强碱、蛋白酶K或分子筛。
4.根据权利要求3的装置,其中所述蛋白酶K用膜与相应缓冲液分隔,在导入采样器时膜被破坏,从而蛋白酶K与缓冲液接触。
5.根据以上权利要求之一的装置,其中所述采样器(4)前端逐渐变细。
6.根据以上权利要求之一的装置,其中所述采样器(4)的前端至少有一处锋利的边缘。
7.根据以上权利要求之一的装置,其中所述样品收集器(1)的底座(2)有一个位于收集器内部的凸体(8),采样器(4)的前端(7)与该凸体相匹配,以使采样器(4)导入的样品物质在凸体(8)和采样器(4)之间压碎。
8.根据权利要求7的装置,其中所述凸体(8)与样品收集器(1)的侧壁(3)的连接方式使导入合适的采样器(4)时,样品收集器(1)分割为2个样品间(6,6a)。
9.根据权利要求7或8的装置,其中所述凸体(8)包括一个圆锥体形状。
10.根据权利要求7至9中任一项的装置,其中所述凸体(8)是将样品收集器(1)分成2个区域的壁。
11.根据以上权利要求之一的装置,其中所述样品收集器(1)固定在一个支持装置(9)上。
12.根据权利要求10的装置,其中所述支持装置(9)是舌柄。
13.根据以上权利要求之一的装置,其中所述采样器成型为在其后部允许插入插杆。
14.根据以上权利要求之一的装置,其中所述采样器(1)与耳标的钉盘(10)用可分开的方式相连。
15.根据以上权利要求之一的装置,其中所述样品收集器与耳标的孔扣盘(11)用可分开的方式相连。
16.根据权利要求14或15的装置,其中所述耳标(10,11)与样品收集器(1)具有相同的识别数字。
17.从动物收集含有DNA的细胞样品的方法,
用采样器(4)的前端(7)收集合适的样品并插入样品收集器(1)中,从而形成由样品收集器(1)的底座(2)、侧壁(3)和采样器(4)的前端(7)所限定的与环境隔离的密封样品间(6,6a)。
18.根据权利要求17的方法,其中所述合适装置的采样器(4)经挤压穿透动物的耳朵然后插入样品收集器(1)。
19.根据权利要求18的方法,同时给该动物打耳标。
20.对动物群体分型的方法,样品采用根据权利要求1至16的装置收集、在实验室分析研究并编列目录。
21.采用根据权利要求1至16中任一项的装置从动物收集含有DNA的细胞样品的应用。
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