CN1288438C - 模拟移动床色谱分离提纯银杏内酯b的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用模拟移动床色谱分离提纯银杏内酯B的方法。采用模拟移动床色谱和重结晶有机结合的方法，提高产品纯度和收率。本发明方法包括以下步骤：原料选择、萃取、模拟移动床纯化、重结晶和成品HPLC法检测。本发明与目前精提银杏内酯B的柱层析法比较，收率达64%、产量大，提纯所得银杏内酯B纯度大于90%。另外模拟移动床过程是连续过程，提高了生产的自动化水平和生产效率，并使生产环境得到极大的改善，真正实现了清洁生产。利用模拟移动床色谱、重结晶可实现精细分离规模化。
Description
技术领域 本发明涉及天然药物的分离提纯方法，特别是用模拟移动床色谱分离提纯银杏内酯B的方法。
背景技术 银杏内酯B作为血小板活化因子拮抗剂是由银杏叶浸提而来。银杏叶中含有银杏内酯B、A、C，银杏黄酮和其他杂质等多种组分。在银杏内酯B的生产过程中，最关键的步骤是分离提纯。实际上银杏内酯B产品必须经过多步分离才能得到纯度较高的产品。这些分离过程包括浸提、过滤、萃取、沉淀等粗提过程。在粗提物中仍有不少杂质。目前采用的精提方法是树脂柱层析，三氧化二铝柱层析法。树脂柱层析是药物与食品工业中常采用的精制手段，这种设备简单，设备一次投资低。这种方法的不足之处在于分离的效率较低，流动相和固定相的利用率较低，成本高，产量低。产品纯度和收率之间的矛盾在柱层析中得不到解决。要保持纯度，只有牺牲收率，这种低收率必将导致高成本。
利用模拟移动床色谱分离药物技术近年来得到了迅速的发展。美国的一些专利文献报道了模拟移动床色谱法用于手性药物如光学异构体、外消旋物质和对映体，以及石油化学品的分离。其中US5,518,625专利文献涉及了心得安，氨酰心安和3-氯-苯-1-丙醇的手性分离。在中国的专利申请有德国德雷斯顿药品工业有限公司用模拟移动床色谱分离法制取高纯环苞菌素，还有日本代科化学株式会社和日产化学工业株式会社用模拟移动床法分离甲羟戊酸内酯类化合物技术。本发明的申请人也就用模拟移动床法分离手性药物—卡波前列素甲酯、生物药物—替考拉宁申请了中国专利。但是，对于银杏内酯B的模拟移动床色谱分离方法仍未见公开报道。
发明内容 本发明提供了一种银杏内酯B的分离提纯方法—萃取、模拟移动床色谱和重结晶有机结合的方法，以提高产品纯度和收率。
本发明提供的银杏内酯B的分离提纯方法包括以下步骤：
一、取水煮法获得的银杏浸膏，总黄酮24％、总内酯6％。
二、每克银杏浸膏粉原料加入0.8-1.2L乙酸乙酯，在30-35℃下进行固液萃取8-10小时，过滤，滤液减压蒸干得银杏内酯粗提物。
三、模拟移动床纯化
(1)设备及条件选择
采用模拟移动床色谱(简称SMBC)系统，该系统由洗脱泵、进样泵、萃取泵、流量计、色谱柱、电磁阀、单向阀和可编程逻辑控制器及计算机组成。洗脱泵流量0-1000mL/min，压力0-10Mpa；进样泵流量0-30mL/min，压力0-8Mpa；萃取泵流量0-100mL/min，压力0-10MPa；工作温度20-25℃。
(2)色谱柱填料及流动相选择
填料为反相硅胶ODS，填料粒度30-40um，流动相(溶剂)为乙醇与水的混合物。
(3)分离步骤
a、样液的配制：以经过萃取所得银杏内酯粗提物为原料溶于乙醇中，沉降、0.45μm滤膜过滤，滤液浓度1-10g/mL。此过程去除部分不可逆吸附的杂质，从而防止大量杂质尤其是不可逆吸附杂质对模拟移动床色谱系统中色谱柱污染，提高色谱柱的使用寿命。
b、流动相的配制：V乙醇∶V水＝5∶5。
c、模拟移动床色谱参数：解吸段3根柱、精制段3根柱、吸附段2根柱。进样流速Uf＝8-12mL/min，洗脱泵流速Ud＝340-380mL/min，萃取液流速Ue＝230-250mL/min，残余液流速Ur＝118-142mL/min，切换时间ts＝14-18min。
d、浓缩：残余液用薄膜旋转蒸发器浓缩至无水，用乙醇洗出后在真空干燥箱轰干，成为恒重的混合物。
四、重结晶
(1)乙醇重结晶
所得恒重的混合物用0.8-1.5g/mL浓度乙醇溶解，冰箱冷冻放置。现象：过4-8分钟后有白色沉淀析出，白色沉淀析出后再加4-7倍乙醇体积的水，静置1.8-2.5小时过滤，沉淀用水淋洗，白色沉淀真空烘干至恒重，得银杏总内酯。
(2)甲醇重结晶
用甲醇溶解乙醇结晶所得银杏总内酯，1g银杏总内酯用30-40mL甲醇溶解，超声使其完全溶解，室温下滴加4-5mL水，静置一小时后逐渐降温至零下10-18℃，结晶4-6小时，过滤，水洗晶体。结晶两次。白色沉淀真空烘干至恒重，得银杏内酯B产品。
五、成品HPLC法检测
岛津SPD-10A VP紫外检测器，Diamandsil ODS 4.6mm×250mm分析柱，流动相V甲醇∶V水＝65∶35，检测波长220nm，流速1mL/min，检测灵敏度0.0800AUFS，进样量20μL，检测温度：室温。由银杏内酯B、A、C对照品来确定产品中的组分并由标准工作曲线法标定银杏内酯B的纯度为90-95％。
本发明与目前精提银杏内酯B的柱层析法比较，收率高，达64％、产量大，提纯所得银杏内酯B纯度大于90％。另外模拟移动床过程是连续过程，层析方法是间歇的，因此模拟移动床技术的引入提高了生产的自动化水平和生产效率，并使生产环境得到极大的改善，真正实现了清洁生产。萃取、模拟移动床色谱、重结晶都是规模化纯化工艺，三者的有机结合是本发明的突出特点，是规模化精细分离的保证。
具体实施方式
一、样液的预处理：取水煮法获得的银杏浸膏，总黄酮24％、总内酯6％。每克银杏浸膏粉原料加入0.8-1.2L乙酸乙酯，在30-35℃下进行固液萃取8-10小时，过滤，滤液减压蒸干得银杏内酯粗提物。
将经过萃取所得银杏内酯粗提物为原料溶于乙醇中，沉降、0.45um滤膜过滤，滤液浓度1-10g/mL。此过程去除部分不可逆吸附的杂质，从而防止大量杂质尤其是不可逆吸附杂质对模拟移动床色谱系统中色谱柱污染，提高色谱柱的使用寿命。
二、流动相的配制：V乙醇∶V水＝5∶5。
三、模拟移动床色谱参数：解吸段3根柱、精制段3根柱、吸附段2根柱。进样流速Uf＝10mL/min，洗脱泵流速Ud＝360mL/min，萃取液流速Ue＝240mL/min，残余液流速Ur＝120mL/min，切换时间ts＝16min，残余液为
SMBC产品。
四、浓缩：产品液和残余液分别用薄膜旋转蒸发器浓缩至无水，用乙醇洗出后在真空干燥箱烘干至恒重。
五、重结晶
(1)乙醇重结晶
所得恒重的混合物用0.8-1.5g/mL浓度乙醇溶解，冰箱冷冻放置。现象：过4-8分钟后有白色沉淀析出，白色沉淀析出后再加4-7倍乙醇体积的水，静置1.8-2.5小时过滤，沉淀用水淋洗，白色沉淀真空烘干至恒重，得银杏总内酯。
(2)甲醇重结晶
用甲醇溶解乙醇结晶所得银杏总内酯，1g银杏总内酯用30-40mL甲醇溶解，超声使其完全溶解，室温下滴加4-5mL水，静置一小时后逐渐降温至零下10-18℃，结晶4-6小时，过滤，水洗晶体。结晶两次。白色沉淀真空烘干至恒重，得银杏内酯B产品。
六、成品HPLC法检测
岛津SPD-10A VP紫外检测器，Diamandsil ODS 4.6mm×250mm分析柱，流动相V甲醇∶V水＝65∶35，检测波长220nm，流速1mL/min，检测灵敏度0.0800AUFS，进样量20μL，检测温度：室温。由银杏内酯B、A、C对照品来确定产品中的组分并由标准工作曲线法标定银杏内酯B的纯度为93％。
Claims (1)
1、一种模拟移动床色谱分离提纯银杏内酯B的方法，其特征在于该分离提纯方法包括以下步骤：
一、取水煮法获得的银杏浸膏，总黄酮24％、总内酯6％；
二、每克银杏浸膏粉原料加入0.8-1.2L乙酸乙酯，在30-35℃下进行固液萃取8-10小时，过滤，滤液减压蒸干得银杏内酯粗提物；
三、模拟移动床纯化
(1)设备及条件选择
采用模拟移动床色谱系统，该系统由洗脱泵、进样泵、萃取泵、流量计、色谱柱、电磁阀、单向阀和可编程逻辑控制器及计算机组成，洗脱泵流量0-1000mL/min，压力0-10Mpa；进样泵流量0-30mL/min，压力0-8Mpa；萃取泵流量0-100mL/min，压力0-10MPa；工作温度20-25℃；
(2)色谱柱填料及流动相选择
填料为反相硅胶ODS，填料粒度30-40um，流动相为乙醇与水的混合物；
(3)分离步骤
a、样液的配制：以经过萃取所得银杏内酯粗提物为原料溶于乙醇中，沉降、0.45μm滤膜过滤，滤液浓度1-10g/mL；
b、流动相的配制：V乙醇∶V水＝5∶5；
c、模拟移动床色谱参数：解吸段3根柱、精制段3根柱、吸附段2根柱，进样流速Uf＝8-12mL/min，洗脱泵流速Ud＝340-380mL/min，萃取液流速Ue＝230-250mL/min，残余液流速Ur＝118-142mL/min，切换时间ts＝14-18min；
d、浓缩：残余液用薄膜旋转蒸发器浓缩至无水，用乙醇洗出后在真空干燥箱轰干，成为恒重的混合物；
四、重结晶
(1)乙醇重结晶
所得恒重的混合物用0.8-1.5g/mL浓度乙醇溶解，冰箱冷冻放置，过4-8分钟后有白色沉淀析出，白色沉淀析出后再加4-7倍乙醇体积的水，静置1.8-2.5小时过滤，沉淀用水淋洗，白色沉淀真空烘干至恒重，得银杏总内酯；
(2)甲醇重结晶
用甲醇溶解乙醇结晶所得银杏总内酯，1g银杏总内酯用30-40mL甲醇溶解，超声使其完全溶解，室温下滴加4-5mL水，静置一小时后逐渐降温至零下10-18℃，结晶4-6小时，过滤，水洗晶体，结晶两次，白色沉淀真空烘干至恒重，得银杏内酯B产品；
五、成品HPLC法检测
岛津SPD-10AVP紫外检测器，Diamandsil ODS 4.6mm×250mm分析柱，流动相V甲醇∶V水＝65∶35，检测波长220nm，流速1mL/min，检测灵敏度0.0800AUFS，进样量20μL，检测温度：室温，由银杏内酯B、A、C对照品来确定产品中的组分并由标准工作曲线法标定银杏内酯B的纯度为90-95％。
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