CN1287015C - 基于丝的纤维 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从各种可能的来源制备丝或类似丝的蛋白质，并将其喷丝以产生用于生物医药和其它应用的再生丝纤维的新方法。将丝预溶解以形成无定形粉，随后重新溶解于二氯乙酸和氯仿或二氯甲烷的混合物中，从而形成用于喷丝的均匀的丝纤蛋白溶液。通过控制喷丝和拉伸条件，以及通过适当的化学改性，可以形成具有各种机械和生物性质的纤维。此类纤维可以具有被延长或被缩短的在人体中的生物稳定性，并且适用于可植入的装置(例如可吸收人工韧带和工程基质、药物释放植入物和许多其它用途)。

Description

基于丝的纤维
本发明涉及包含由丝连续长丝再生制得的聚合物的新型可生物吸收材料及其获得方法。这一从天然丝或丝废弃物或其它类似丝的材料作为连续长丝而再生的材料可以被用来开发用于临床的组织工程韧带和腱。由此，该材料可以被用作用于组织工程产品的支架和用于纺织或非纺织可生物吸收植入物(例如疝气贴剂、缝合线、韧带固位装置和血管移植物)。再生丝聚合物也可以被用作由材料基质缓慢降解而实现的药物控制释放的载体。
“丝”是由多种动物产生的挤出连续双长丝的概括描述。这些长丝是基于蛋白质的。后者代表了大多数的天然丝，而有些(源于醋栗叶蜂Nemetus ribesii)是胶原质，但大部分由丝蛋白构成。
自汉朝开始，就以通过蚕Bombyx mori的养殖而将丝用作纺织原料了。被公认为商品丝的是从蚕在其蜕变成蚕蛾过程中产生的保护性茧得到的长丝产品。在蚕蜕变为成年蚕蛾的过程中，以约30％粘性丝胶蛋白质包裹的“粘性”连续双长丝被蚕“吐丝”形成作为保护物围绕在其自身周围的长丝加强的茧。为了用于纺织品的最终用途，通过在蚕蛾从其茧中将脱离之前将其窒息而终止将这一蜕变过程，这样做保持了长丝的连续性。在热水中将茧的外层软化后，在退缠操作中将源于几个(约7个)茧的两束丝蛋白双长丝同时捻/缠。最终的“连续”长丝纱长约2km，直径15-25微米(并有7根长丝)。
剩余物(为形成/产生基础连续规则双长丝而从茧外表面刷下的丝、不能使用的内部最后部分、断裂/损坏的茧部分)不适合用于长丝纱中，被称作“废丝”。近年来，这种材料被切断成短的长度，用做纺织品的“绢丝”纺织纱的生产的基材。
由于其受人欢迎的机械性质和生物兼容性，多年来丝长丝纤维已被用于医用缝合线。丝纤维是由分子大量取向的丝蛋白构成的。由于酶对纤维结构的无定形部分中易受影响并可接近的位点的攻击，作为缝合线的天然丝在体内随时间将会损失长度。
美国专利第4818291号描述了适合手术中使用的含丝纤蛋白和人纤维蛋白原的混合物的新型粘合剂。该发明描述了含5至90重量％丝纤蛋白的混合物及其作为在医疗应用中提供对表面的良好粘合的粘合剂的使用。将丝纤蛋白溶解于随后通过渗析除去的盐的饱和水溶液中。随后将剩下的丝蛋白悬浮液与人纤维蛋白原混合从而产生粘合剂。这种方法的缺点是在悬浮液生成过程中将发生蛋白降解。得到的粘合剂通常具有一些与所要求的相比较差的物理性质。
美国专利第5252285号描述了也包括将丝纤蛋白溶于盐的水溶液的用于喷丝形成丝纤维的方法。将盐从溶液中除去，随后通过流延或蒸发除去水，从而形成基本为无定形物的丝薄膜。然后将该材料溶于六氟异丙醇以形成“溶液”，随后将溶液喷丝并拉制成再生丝纤维。当这种溶剂如所描述的使用时，减少了丝蛋白降解的问题。由于与其使用相联系的成本和环境影响，环境方面的考虑使得不使用例如六氟异丙醇的有机溶剂的趋势正变得越来越明显。
目前可以得到的可生物吸收材料不适用于要求拉伸强度和硬度可与不可吸收聚合物(如聚酯)的拉伸强度和硬度相比的装置。植入人体后，这些材料不能将其机械效用保持3-6个月以上。
这种有限的寿命对于必须在1-2年中(在此期间在康复过程中天然或组织工程细胞向内生长从而得到完全修复的结构)保持其大部分强度的载荷承受结构骨架(例如韧带和腱)是一个严重的缺点。
因此，存在着对在延长的时间内提供控制的可生物吸收性但也至少一年内在保持足够程度的强度和机械完整性的材料的需求。同时，该材料必须与生理学介质相兼容并为身体所容纳。为避免使用后手术除去的需要，材料应最终降解。
本发明的目的之一是获得被身体缓慢吸收而同时维持足够的机械强度的综合性能，从而使该材料可以被用作承受载荷的可生物吸收纤维。由此，该材料应在医疗领域中得到应用(例如组织工程韧带和腱、可生物吸收固定系统和可吸收载荷承受缝合线)。
本发明的另一个目的在于将废丝材料转化为有用的医用材料。本发明的另一个目的在于产生由丝或丝废弃物衍生得到的、在生理学环境中具有各种机械性质和寿命的纤维。以较低的成本生产材料也是本发明的目的之一。
本发明的另一个目的在于提供将由非天然蚕提供的丝类蛋白质喷丝方法。例如，本发明的方法可以被用于由经基因修饰的生物体(例如经基因修饰的蚕)得到的丝。该方法也可用于合成丝蛋白(例如用标准基因工程方法产生的丝蛋白)。丝蛋白质的来源可以包括经基因修饰的植物(例如番茄或烟草植株)、动物(例如经基因修饰的泌乳的绵羊、山羊或牛)或微生物(例如经基因修饰的酵母或细菌)。
本发明的再一个目的是提供无定形载体基质从而实现药物的控制释放。再生丝可以被用作不同物理形式(包括喷丝/挤出的产物)的载体。
本发明实现了以上目标并避免了许多与已有技术方法相联系的问题。特别地，通过在生产纤维时小心控制加工参数，本发明能够改变在生理学介质中的纤维的机械性质和增加其寿命。
按照本发明的一个方面，本发明提供了一种形成丝纤维的方法，该方法包括以下步骤：
(1)选择溶剂并将丝溶解以形成丝纤蛋白溶液，
(1)将丝纤蛋白溶液过滤，
(2)将经过滤的溶液喷丝至凝固浴中以产生挤出纤维，和
(3)将挤出纤维拉伸。
溶剂优选二氯乙酸和氯仿和/或二氯甲烷的混合物。凝固浴优选含醇。
节肢动物包括野生和养殖的蚕(例如桑蚕Bombyx、柞蚕或anaphe silk)和蜘蛛(不论是否经过基因修饰的)，而产品可以通过传统生产、从节肢动物的丝腺直接收获或以其它方法获得。
在一个实现方案中，丝是源于虫的，例如源于蜘蛛或蛾。丝更优选源于蛾，包括Bombyx，柞蚕或anaphe silk。源于不同地理位置和不同的蚕蛾和蜘蛛的丝可能具有不同的化学组成和分子量；所有这些丝都可以用于本发明的方法，产生具有不同性质的产品。
在另一个实现方案中，丝是源于经基因修饰的生物体的。
在一个实现方案中，该方法包括以下步骤：
(1)任选地对丝材料进行脱胶和提纯处理，
(2)将丝切断至小于1毫米的长度，
(3)将切断的丝溶解于适当的溶剂中并以无定形形式沉淀丝蛋白，
(4)将切断的丝重新溶解于包含二氯乙酸和氯仿和/或二氯甲烷的混合物的溶剂中，形成均匀的丝纤蛋白溶液，
(5)对丝纤蛋白溶液进行过滤和除气处理，
(6)将经过滤的溶液干喷湿纺或湿纺至醇凝固浴中以产生粘性的挤出纤维，
(7)除去含氯溶剂，
(8)将挤出纤维拉伸。
随后将经拉伸的纤维洗涤并干燥。可以将无定形丝蛋白作为起始原料用于上述方法中，而且这样做可以避免使用上述步骤1-3的必要。
作为起始原料而用于溶解的丝可以是任何类型的丝，包括：天然丝、废丝和作为无定形薄膜预准备的丝。我们发现，作为无定形薄膜准备的丝的溶解速度远比丝纤蛋白纤维快，由此缩短了降解可能发生的时间。这一方法将降解减至最小并由此获得了具有更高性能的产品。
将用于本发明的丝用割机(cutting mill)或类似的设备切断，这是本发明的一个重要方面。由此，本发明的另一个方面是使用割机或类似的设备将生丝切断至小于1毫米的长度。我们已经发现如常规使用锤磨机(hammer mill)对最终丝纤维是有害的，因为锤磨机破坏了蚕丝纤维的分子完整性。
方法的概述
在一个实现方案中，该方法包括以下步骤：
(1)对丝材料进行脱胶处理以除去丝胶(非必要步骤)；
(2)提纯步骤(非必要步骤)；
(3)将丝蛋白转化为适当的物理和/或形态学形式；
(4)选择溶剂体系并将丝溶解以形成均匀的丝纤蛋白溶液，在溶解过程中优选发生最少的降解；
(5)将丝纤蛋白溶液过滤；
(6)除气；
(7)将经过滤的溶液干喷湿纺或湿纺至选定的液体凝固浴中以产生粘性的挤出纤维；
(8)老化步骤(非必要步骤)；
(9)将挤出纤维拉伸；
(10)最终两步洗涤；
(11)干燥。
在丝从其天然的生丝状态到用于挤出/喷丝的粘性液体的初步加工过程中，将会发生丝的一些降解。氧化是丝损坏的主要原因，各生产阶段中惰性气氛(例如氮)的使用减小了这一影响的程度。
本发明的方法包括通过首先清洁原料、除去丝胶、切断至极短(即小于1毫米)的长度和随后将其溶于适当的溶剂体系从而将组织聚合物物质分离至组份分子片段而形成丝纤蛋白溶液。将溶液过滤和除气，然后将其喷丝和拉伸。最后对纤维进行净化和干燥处理。由此，通过将天然丝形态学物质拆卸成其组份分子以及将其通过喷丝/拉伸操作重新组装形成被身体缓慢吸收的长丝而制成本发明的再生丝聚合物。纤维降解和因此损失拉伸强度的速度可以比天然丝低。
在另一个实现方案中，任选地通过引入分子间交联、向丝蛋白接枝或对怀疑在使用中会发生降解的位点处或附近的可接近体积内的残留氨基酸进行化学改性而对丝材料进行改性。这些改性可以在最初丝原料溶解前或在再生纤维上实现(即在本方法实施前或后实现)。
对本发明的方法生产的再生丝材料进行化学改性(在喷丝前或后)的目的可以是为特定医疗或其它目的而改变纤维的机械和生物性质。由此，例如，可以改变强度和生物降解速度。这一改性可以使用以下一种或几种方法实现：
(1)使用环氧化物、酸酐酰基化、醛或乙二醇二缩水甘油醚进行交联；
(2)使用聚羟基甲基丙烯酸乙酯向蛋白质接枝；
(3)使用各种气体的气体等离子体处理并随后进行与改性剂的反应；
(4)在对纤维进行喷丝或拉伸前，通过对丝残留氨基酸进行改性增加无定型体积。
丝纤维可用于医疗中。符合本发明的具有加强了的物理和生物学性质的再生丝纤维适用于需要高强度纺织材料的多种应用，特别适用于任何以下应用：
(1)作为具有定制的在人体中存留的时间的可生物吸收可手术植入材料；或
(2)作为具有定制的强度或模数的可生物吸收可手术植入材料；或
(3)作为适用于药物释放应用的可生物吸收可手术植入材料；或
(4)作为包括某种程度的生物可降解性的纺织材料。
加工步骤
可以通过在不连续步骤中逐步操作或作为连续操作实现再生长丝的生产过程。
挤出
溶解于溶剂体系的丝的浓度和上述溶剂的组成也影响纤维产品，并且二者都可以改变以优化纤维在具体最终用途的生理介质中的强度和/或寿命。
优选不高于40℃的最高温度下制备用于纤维生产的基本最初挤出步骤的丝纤蛋白溶液，上述温度不高于室温更好，并且优选在尽可能的最低温度下储存/使用上述溶液。当温度接近和高于50℃时降解的速度增加。
在喷丝前进行除气和过滤是有必要的。除气通过离心实现。
初生长丝在凝固浴中时间的维持和上述浴的温度是重要的。我们发现，室温和更低的温度使纤维的强度更高，但需要更长的驻留时间。上述浴的温度优选不高于50℃。
使用于“干喷”湿纺系统中的气隙为1.0cm或2.0cm。已经考察了其它气隙长度并发现较大的气隙的使用使得更大的喷头拉伸环境的使用成为可能。
挤出速度也可以在常规参数内变化，我们发现每分钟14.5米的速度是特别适用的。
在另一个实现方案中，凝固浴温度和组成可以各自独立地改变以影响最终纤维的性质。在凝固浴中的浸渍时间可以影响最终纤维的性质。
拉伸
在另一个实现方案中，可以选择拉伸比以影响得到的再生纤维的强度和其它性质。在较高的拉伸比下得到的纤维强度较高。经如此凝固浴处理的长丝的拉伸浴温度是重要的。如果将拉伸温度升至170℃或更高，则产生更加取向化的长丝，而这种长丝的强度更高且更不容易降解。但是，较低的温度使拉伸过程本身中发生的降解降至最低。但是，最优的温度将取决于原料的性质和拉伸浴的性质。为了调整纤维的性质，可以改变浴的长度以代替拉伸速度的改变或将浴的长度和拉伸速度一起改变。
化学改性
旨在为再生丝提供不同稳定性的改性包括为了取得交联而进行的二羧酸酐的使用，或通过聚合物接枝对丝蛋白残留氨基酸进行改性。这些处理可以在经提纯的丝的溶解或对再生丝长丝的最终拉伸之前进行。
使用适当气氛的等离子体放电最终处理为产生特定化学官能团提供了有用的工具。这使得丝长丝表面上的旨在获得在体内的更长寿命而不损失机械性能的具体化学改性更加容易。
作为合成丝的类似物，产生作为均聚物或共聚物的特定合成聚氨基酸也是可能的。这种方法可以产生更具结晶性的因此也是强度更好和更稳定的产品。此类化学组合物也避免了酶和生物降解最可能发生的残留氨基酸位点的存在，因此具有增加了的在活的生物体内的稳定性。
较大的极性和非极性残留基团位于纤维的30％较不规则体积内，而生物和化学活动被有效地限制在上述体积内。可以设想使用其它化学“处理”可以“封闭”这些处于对化学/酶降解最敏感的位置附近的丝蛋白位点和/或使希望取得的链交联。生产后的交联会阻止接近。后者当然会增加产品的生物稳定性。也可以通过增加纤维直径(减小比表面积)降低生物降解速度。相反地，增加比表面积(更细的单根长丝)使降解更快。这种现象的一种应用是对混入的药物的释放速度的调整。
最终处理
在本发明的另一方面，可以得到比天然丝纤维在体内在同样生理条件下具有更长的寿命的再生丝纤维。
作为最终处理步骤，可以用由光聚合原位形成的非常薄(仅一或两个分子厚)的聚合物膜对丝进行涂层。这样做提供了针对基体丝降解的屏障并可同时由此类聚合物形成可能结合创伤康复“加速剂”的位点，或直接作为具有上述加速剂特性或性质的结合聚合物。此类位点也可以通过等离子体处理产生/形成。
本发明的方法的几个方面是具有开创性的，特别是：
1.将丝纤维切断至超短长度使得减少降解的条件下进行的溶解变得容易。或者，使用旋转蒸发法形成的无定形丝薄膜的溶解。
2.最初的丝原料的溶解所使用的溶剂的选择是该工艺的成功实施所必需的。更具体地，确保了纤维产品的质量并且与使用盐的水溶液时所观察的现象相比限制了降解的有机溶剂体系的选择。
3.加工参数(例如纺丝参数)的选择可以影响纤维的性质；
4.通过改变再生纤维的直径，可以改变活的生物体内的降解速度和纤维的机械性能，从而适应具体应用；
5.以(旨在降低生物吸收速度的)交联为形式的丝纤蛋白化学改性的使用产生了纤维性能方面的创造性的优点，这包括在生理介质中的加强了的拉伸强度和延长了的寿命；
6.此外，与标准丝相比，在有限但受控制的降解或加强无定形体积(通过引入大型残留氨基酸或使用特定的喷丝条件)后的丝蛋白的使用给出了用于其它应用的降解和吸收更快的材料；
7.在活的生物体内具有多种降解速度的丝材料为其作为控制药物释放载体基质的使用做了准备；
8.此外，本发明的聚合物可以用于需要可生物降解聚合物的非医疗应用中。
实施例
实施例1
将丝纤蛋白溶于有机溶剂从而得到丝纤蛋白溶液。使用65∶35v∶v比例的二氯乙酸与二氯甲烷或氯仿作为溶剂。将前一体系用于“干喷湿纺”而后一体系用于100％湿纺。相比而言，在两个纺丝系统中前者都产生了强度更高和更具生物稳定性的最终产品。使用12％w/vol的丝溶液。
室温凝固浴为甲醇或乙醇。乙醇比甲醇更适宜，因为这样减少了已单独挤出并正在凝固的长丝粘连在一起的情况。
也对拉伸比水平进行了研究并发现4.5至1的拉伸比适用于干喷湿纺凝固长丝。
“喷丝”比(起始长丝收集速度与实际挤出速度的比)是另一个影响产品性质的参数。在一个方案中，以凝固长丝的形式得到起始长丝并在实施最后拉伸阶段从而形成最终的纤维之前在一个单独的操作中在流动的水中洗涤24小时。在另一个例子中，在一个单独的步骤中将纤维挤出和拉伸。使用一个包括以上成份的完整连续操作是有益的。
实施例2
由商业化中国丝绸生产商处作为长丝成份或作为废纱得到Bomyxmori“丝废弃物”。不仅必须除去存在的20％以上丝胶，还必须除去任何染色物和其它外来杂质/外来物质。在本文中脱胶大多通过用100℃下的0.4％肥皂液处理2小时、随后依次用碳酸钠溶液、沸水洗涤和最后用20℃下的蒸馏水洗涤实现。
另一个方法是使用蛋白酶处理已达到相同的目的(表1)。
              表1.用于胶内的丝的基于酶的脱胶方法
  阶段   操作   条件
1   钠亚硫酸氢盐和磷酸氢盐(0.4g/l)中的0.8％木瓜酶(0.8g/l)   纤维/液体比＝1∶20，60分钟，70℃
  2   用1g/l碳酸钠洗涤   100℃，30分钟
  3   大量水洗涤   室温，24小时
  4   重复蒸馏水洗涤   70℃
  5   三次蒸馏水洗涤   室温
从“废丝”再生丝蛋白连续长丝已经在已有技术中得到了描述。本发明的程序中的一个可能的不同在于其可能能够省去纺丝前的丝蛋白溶液初步透析。
二氯乙酸(DCA)是聚N-羧酸酐的溶剂。使用基于DCA的溶剂(65％DCA+35％二氯甲烷和65％DCA+35％氯仿)的尝试不仅实现了容易进行的丝蛋白溶解，而且还实现了它们分别向乙醇中的湿纺和干喷湿纺，以及非常有前途的长丝的生成而没有将预透析包括在处理过程中的潜在需求。表2显示了溶剂喷丝程序的细节。
将约10％w/v丝蛋白溶于选定的溶剂中并维持在15℃数小时，同时以200-500rpm的速度搅拌以确保完全溶解和均匀性。
使用氮的正压将每一溶液通过3个不锈钢精细滤网的组件，随后通过10分钟离心除气。这样做避免了喷丝过程中的断裂。在喷丝头中再实施额外的过滤。使用带有5个150微米直径的孔的喷丝头。实施湿纺或干喷湿纺至1.2米长的乙醇凝固浴中。
            表2.丝蛋白喷丝系统和方法
  A.湿纺(S1)   B.干喷湿纺(S2)
  65％二氯乙酸   65％二氯乙酸
  35％氯仿   35％二氯甲烷
  12％w/v丝蛋白浓度   11％w/v丝蛋白浓度
  17.91米/分挤出速度   13.875米/分挤出速度-气隙1cm
  3.45∶1拉伸比   4.5∶1拉伸比
  6.0特产品   3.85特产品
在这些例子中，没有进行“线内”喷丝/拉伸。在拉伸前，将源于乙醇凝固浴的湿长丝的丝束(rope)松弛地支持在一个单独的拉伸单元上(通过80cm长乙醇浴)一段时间(例如24小时)。最后将经拉伸的纤维缠在不锈钢筒管上。所使用的拉伸比为3∶1至4∶5。
通过将最终的经拉伸丝蛋白的筒管在乙醇中浸泡10-12小时实施最终提纯。随后，为了确保所有溶剂和凝固剂的完全去除，将纤维在流动的自来水中彻底洗涤。在蒸馏水中进行最终洗涤后在室温下自然干燥。
为了观察机械性质，使用20mm计量长度的长丝(在65％RH、20℃下进行调湿)对最终长丝进行了测试。测试使用Instron 1122在50mm/min.十字头速度(250％伸长率)进行。表3中显示了两个在两个喷丝条件之一下得到的长丝性质的对比例子。
表3.再生长丝产品性质[参照“标准”丝蛋白：38cN/tex强度，23.4％伸长率和“废丝”：26.3cN/tex强度，9.5％伸长率]
  A.湿纺(S1) B.干喷湿纺(S2)
  6.0特产品20.8cN/tex强度14.8％断裂伸长率 3.85特产品30.6cN/tex强度18.2％断裂伸长率双折射(Δn)×103＝53.1
湿纺(S1)和干喷湿纺(S2)得到的样品的X-射线衍射数据显示出的β-叠片规则结构(β-pleated sheet order)的大量存在但与天然丝相比其取向程度下降了。在至少4∶1的拉伸比下β-构象是显著的。
通过真空导数热重量分析法(DTG)进行的丝蛋白的对比观察显示出了被测试的长丝中氧化降解的存在。两种喷丝过程所得到的再生纤维样品的DTG曲线显示出已经发生了一些氧化降解。
对再生长丝丝蛋白的改性进行了研究了。与天然丝形成鲜明对比，再生长丝显示出了显著提高了的生物降解速度，这是降低了的总规整性水平和使这些被认为酶活动发生的丝蛋白链位点更容易接近的后果。因此，与符合具体机械性质需求相类似地，为了以受控的方式加强或降低稳定性的水平而设计了改性。
可以将通过两种改性途径用于再生丝长丝。
(a)化学改性从而封闭被认为是特别易受酶降解影响的残留氨基酸并潜在地改变机械性能，而在具有生物活性的位点处或靠近上述位点处或作为薄涂层的“接枝”聚合提供阻碍生物活性试剂接近的纯粹物理性的障碍；和
(b)丝蛋白分子链间的交联可以直接加强机械性能并可能封闭易受可能降解的影响的位点。
交联
(i)环氧化物
原则上与环氧化物进行酯化的对象是HIS、LYS、ARG和TYR。使用了两种环氧化物：1，2-环氧-3-苯氧基丙烷和乙二醇二缩水甘油醚(EGDGE)。
(ii)与酸酐酰基化
使用了戊二酸酐和琥珀酸酐。在二元酸酐的使用中，跨官能团位点的交联形成的产生是可能的。酸酐处理也降低了光致泛黄。衣康酸酐也具有类似的可能性。
(iii)醛
通过用戊二醛处理对丝蛋白进行改性，这可能改变生物稳定性和机械性质。
(iv)双官能度二氟氯嘧啶衍生的交联剂
此类试剂能够与丝蛋白中敏感的位点反应，并引入降低可接近性的交联。
聚合物“接枝”
可以在长丝表面上形成一层薄聚合物膜(几个分子厚)，该膜可以是在使用或不使用等离子体处理的情况下交联到表面上的或使用紫外灯将膜交联而不使用与丝的化学连接。
实施使用聚甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)的“接枝”。实验细节在表4中报告。
                          表4.再生丝长丝的丝蛋白改性
  样品   处理试剂   引发剂/催化剂   条件   功能
E1 HEMA 过硫酸铵   丝∶液体＝1∶50(g∶ml)，25℃，4.5h   接枝改性
E4   EGDGE(乙二醇二缩水甘油醚) 0.1M NaOH   S∶L＝1∶100(g∶ml)(含水异丙醇，360ml/l)，25℃，4.5h   改性/交联
E6 丁二酸酐   S∶L＝1∶100(dmf*)(g∶ml)，65℃，3.5h(使用10％w/v酸酐)。还有65℃下45m至3h的时间 改性/交联
E7 戊二酸酐   S∶L＝1∶100(dmf*)(g∶ml)，65℃，3.5hr(使用10％w/v酸酐)。还有65℃下45m至3h的时间 改性/交联
E8 戊二醛   在pH 7.1的缓冲液(10w/v醛)存在下S∶L＝1∶20(g∶ml)，50℃，1h   改性/交联
*dmf-二甲基甲酰胺
在2cm长度上在250％十字头速度下测定再生丝蛋白长丝的机械性质。表5中显示了仅一些对比数据以确定每一单独处理引起的强度和断裂伸长率的相对变化；没有考虑所获得的“处理”或改性的程度的不同。
改性所引起的改变是复杂的，可能包括化学、形态学和组织学成分。
表5.丝蛋白长丝：尝试进行改性后的机械性质改变
  样品   ％强度改变   ％伸长率改变
  未处理的再生丝   0.0   0.0
  E1处理   -6.9   +31.1
  E4处理   -16.8   +14.0
  E6处理   +5.5   +34.7
  E7处理   -0.5   +19.2
生物降解
需要进行在模拟生理学环境中在37℃(体温)下的实际的研究从而测试本发明的目的是否实现。使用加速的测试条件(例如＞37℃)被认为是不适宜的。如果有多于一种降解过程发生(这是可能的)，从最优的37℃偏离的温度将对行为产生被歪曲的影响。
具体的酶的选择取决于重现在将使用所构成基底的性能的位置普遍存在的特定环境的需要，例如在结缔组织中的亮氨酸氨肽酶和酯酶、在牙齿环境中的α-淀粉酶和在适用于药物释放的位点可以发现的酶。
尽管如此，为了确认改性对生物降解速度的影响，实施了简单的概括性的在活的生物体内用单独的蛋白水解酶木瓜酶和α-胰凝乳蛋白酶进行的生物降解试验。
旨在监测在活生物体内的测试中的生物降解的观察的结果是机械性质、质量损失和分子组成方面的变化。在此以机械性质和质量损失作为生物降解的监测指标。
此处在蛋白水解酶的最优pH下和37℃下使用蛋白水解酶，但其使用的浓度比更确定的试验中将大量使用的浓度大若干数量级。为了维持酶活性并同时避免通过生物降解产物发生的任何作为结果的二级作用，在被限制在10日中的测试过程中，此环境每24小时即被更换。
α-胰凝乳蛋白酶(pH 7.8)有效地打断了与PHE、TYR、LEU和TRP相邻的肽键。与此形成对比的是，木瓜酶(pH 5-7.5)打断了与HIS和LYS相邻的肽键。表6显示了在这种酶环境中的降解条件和质量损失和强度下降上的典型观察结果。将对经改性后的丝上的酶活性与暴露于仅缓冲液后的丝上的酶活性对比。经10天培养后，将酶作用物充分洗涤、干燥并随后称重从而计算质量损失。如前所述使用Isntron 1122在20mm计量长度上对调湿后的样品进行机械测试。
              表6.改性丝蛋白长丝的生物降解
[条件：37℃，在20ml 10日测试中的木瓜酶/α-胰凝乳蛋白酶，50mg
              样品，酶浴每24小时进行补充]
  样品长丝   酶浴   质量损失(％)   强度损失(％)
未改性的“再生”丝   木瓜酶   7.25   14.3
  α-胰凝乳蛋白酶   6.17   18.2
  经琥珀酸酐处理后的再生丝(E6)   木瓜酶   3.81   9.76
  α-胰凝乳蛋白酶   1.05   5.99
  经戊二酸酐处理后的再生丝(E7)   木瓜酶   6.80   3.39
  α-胰凝乳蛋白酶   0.95   2.01
  经戊二醛处理后的再生丝(E8)   木瓜酶   2.83   3.47
  α-胰凝乳蛋白酶   2.16   1.04
  经EGDGE处理后的再生丝(E9)   木瓜酶   2.93   5.08
  α-胰凝乳蛋白酶   0.00   2.65
  经HEMA处理后的再生丝(E1)   木瓜酶   3.19   3.95
  α-胰凝乳蛋白酶   0.37   2.79
总结
过去，已知的天然长丝生物稳定性妨碍了确实具有生物相容性的丝纤蛋白作为缝合材料的使用。现在，“废丝”可以以相对低的成本容易地得到，而本发明成功地将这些长度和直径易变的材料或商品化的长丝状丝转化为具有增加了的生物稳定性和加强了的机械性能的再生连续长丝产品。
已经表明，再生丝蛋白的化学改性或“接枝”加强了生物稳定性而不显著损失机械性能。可以通过基本生产条件和随后进行的处理对产品进行控制从而提供多种生物稳定性的产品。

Claims (10)

1.从一种或多种节肢动物的产物形成丝纤维的方法，该方法包括以下步骤：
(1)提供一种溶剂，该溶剂为二氯乙酸和氯仿和/或二氯甲烷的混合物，并将丝纤蛋白溶解以形成丝纤蛋白溶液，
(2)将丝纤蛋白溶液过滤，
(3)将过滤后的溶液向温度不高于50℃的凝固浴中喷丝以生成挤出纤维，和
(4)将挤出的纤维拉伸。
2.根据权利要求1的方法，其中凝固浴含醇。
3.根据权利要求1的方法，其中丝是来源于虫的。
4.根据权利要求2的方法，其中丝是来源于虫的。
5.根据以上权利要求中的任意项的方法，其中丝纤蛋白得自天然丝、废丝、在丝蛋白被吐丝形成茧之前直接从虫获得的丝蛋白、从基因修饰后的生物体得到的丝或作为无定形膜而预准备的丝的一种或多种。
6.根据权利要求1至4中任意项的方法，其中包括以下步骤：
(1)任选地将丝材料脱胶和提纯；
(2)将丝切断至小于1毫米的长度；
(3)将切断的丝溶解于适用的溶剂中并以无定形物的形式将丝蛋白沉淀；
(4)将丝重新溶解于包含二氯乙酸和氯仿和/或二氯甲烷的混合物的溶剂中，从而形成均匀的丝纤蛋白溶液；
(5)对丝纤蛋白溶液进行过滤和除气处理；
(6)将经过滤的溶液干喷湿纺或湿纺至醇凝固浴中以产生一致的挤出纤维；
(7)除去含氯溶剂；和
(8)将挤出的纤维拉伸。
7.根据权利要求1至4中任意项的方法，其中包含以下步骤：
(1)任选地将丝材料脱胶以除去丝胶；
(2)任选的提纯步骤；
(3)将丝蛋白切断至小于1毫米的长度；
(4)选择溶剂体系并将丝溶解以形成均匀的丝纤蛋白溶液；
(5)将丝纤蛋白溶液过滤；
(6)除气；
(7)将经过滤的溶液干喷湿纺或湿纺至选定的液体凝固浴中以产生一致的挤出纤维。
8.根据权利要求1至4中任意项的方法，其中在实施方法前或实施方法后对丝进行化学改性。
9.根据权利要求8的方法，其中化学改性是以下的一项或多项：
(1)使用环氧化物、酸酐酰基化、醛或乙二醇二缩水甘油醚进行交联；
(2)使用聚甲基丙烯酸羟乙酯向蛋白质接枝；
(3)使用各种气体的气体等离子处理并随后进行与改性剂的反应；
(4)在喷丝或拉伸纤维前，通过对丝残留氨基酸的改性增加无定型体积。
10.按权利要求1至9中任意项的方法生产的丝纤维。
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