CN1274365C - 用于血管形成治疗的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供：(1)用于血管形成治疗的药物组合物，它包含至少一种选自下组的物质作为活性成分：具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质，以及产生这些物质的物质；和编码血管形成因子的基因；(2)增强编码血管形成因子的基因的血管形成作用的制剂，它包含至少一种选自下组的物质作为活性成分：具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质，以及产生这些物质的物质；(3)一种血管形成制剂，它包含前列腺环素合酶基因作为活性成分；(4)用于血管形成治疗的药物组合物，它包含ets-1基因和另一种编码血管形成因子的基因作为活性成分；(5)一种制剂，它包含ets-1基因作为活性成分，用于增强另一种编码血管形成因子的基因的血管形成作用；和(6)一种血管形成制剂，它包含ets-1基因作为活性成分。

Description

用于血管形成治疗的药物组合物
技术领域
本发明涉及一种新的用于血管形成治疗的药物组合物。更具体地，本发明涉及下述新的用于血管形成治疗的药物组合物，它包含编码血管形成因子的基因和至少一种选自下组的物质作为活性成分：具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质，以及产生这些物质的物质。。此外，本发明还涉及前列腺环素合酶基因和ets-1基因在诸如血管形成治疗中的新用途。
背景技术
新血管的发育和血管形成最初都伴有原血管的内皮细胞的活化。那种除了在体内刺激上述血管形成以外，还具有针对内皮细胞的体外致细胞分裂功能的生长因子称为“血管形成因子(血管形成生长因子)”。
血管形成因子首次用于治疗是由Folkman等(N.Engl.J.Med.285，1182-1186(1971))报道的。后续研究证实，重组血管形成因子，如成纤维细胞生长因子(FGF)家族(Science 257，1401-1403(1992)；Nature 362，844-846(1993))，内皮生长因子(EGF)(J.Surg.Res.54，575-583(1993))和血管表皮生长因子(VEGF)的应用能促进和/或加速心肌和后肢缺血动物模型中侧支血管的发育(Circulation 90，II-228-II-234(1994))。本发明人还发现，肝细胞生长因子(HGF)象VEGF一样，具有内皮特异性生长因子的功能(J.Hypertens.14，1067-1072(1996))。
用血管形成因子治疗血管病的策略(如上述)被称为“血管形成治疗”。近期关于血管形成治疗的最活跃研究是关于使用上述血管形成因子的基因治疗缺血性疾病和动脉疾病的进展。
例如，本发明人阐明了HGF能有效对抗闭塞性动脉硬化症(ASO)(Circulation Vol.100，No.18，No.1672(1999)；Japanese Circulation Journal Vol.64(Suppl.I)，478，No.P079(2000))。另外还揭示，HGF基因能有效针对心肌梗塞中的缺血性再灌注损伤(Circulation Vol.96，No.8，No.3459(1997)；Ann.Thorac.Surg.，67，1726-1731(1999)；Gene Therapy，7：417-427(2000))。
已证实VEGF基因对猪的心肌缺血模型(Human Gene Therapy 10，2953(1999))和兔的后肢缺血模型(Circulation 96(suppl II)：II-382-388(1997))有效。此外，还报道了VEGF对ASO患者(Circulation 97，1114-1123(1998))和心绞痛患者(Ann.Thorac.Surg.68，830-837(1999))有效。目前在美国，有多个小组在进行ASO患者和心绞痛患者的VEGF基因治疗的临床试验，如Isner等。
关于bFGF基因，已有报道说，由于将bFGF基因引入到一种肌营养不良模型小鼠mdx的肌肉内，导致血管数增加(Gene Therapy 6(7)，1210-1221(1999))。
前列腺环素(前列腺素I2；PGI2)是前列腺素的一种，它是一种半寿期为5-10分钟的不稳定的脂质介质(Arch.Gynecol.Obstet.243，187-190(1988))。它通过提高由G蛋白偶联型受体介导的cAMP水平而具有较强的血管扩张作用和抑制血小板凝集的作用(N.Engl.J.Med.17，1142-1147(1979))。目前，血管扩张剂，如PGI2，PGE1(前列腺素E1)以及它们的衍生物(类似物)都广泛用于治疗各种血管病。特别是，期望通过动脉内注射和静脉内注射PGE1而对末稍血循环疾病(如ASO和TAO(闭塞性血栓性脉管炎)发挥诸如血管扩张和抑制血小板凝集的功能。这样的注射已经成为一种成熟的治疗方法。此外，鉴于PGI2具有较强作用又很快失活，开发了各种衍生物(iloprost，beraprost钠等)。这些衍生物被用于治疗末稍血管闭塞性疾病和慢性动脉闭塞症(Prostaglandins，Leukotrienes and Essential Fatty Acids.54，327-333(1996)；药学杂志，117，509-521(1997))。PGE1和PGI2还被用于由胶原病引起的末稍血循环障碍，Raynaud’s现象，体外循环的维持(Minerva Med.89，405-409(1998))，心衰(Am.Heart J.134，44-54(1997))等等。
如上所述，已知诸如PGI2等具有血管扩张作用和抑制血小板凝集的作用的物质能有效于各种血管病。但从未有人将这些物质与上述使用HGF基因进行的血管形成治疗联合使用，更没有人阐明这样的联合将获得什么样的效果。
而且，已知诸如HGF、VEGF、bFGF和EGF等血管形成因子能增强ets-1(幼红细胞增多病病毒癌基因同系物1，一种转录调节因子)的表达，并通过ets-1激活参与血管形成的各种类型的因子(J.Cell.Physiol.，169，522-531(1996)；“HGF的分子医学(Molecular Medicine of HGF)”，MedicalReview，179-185(1998))。但是，从未有人将ets-1基因用于血管形成治疗，对它的作用完全不了解。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于血管形成治疗的新的药用组合物。更具体地是提供一种用于血管形成治疗的新的药用组合物，它包含编码血管形成因子的基因和至少一种选自下组的物质作为活性成分：具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质，以及产生这些物质的物质。本发明还涉及前列腺环素合酶基因和ets-1基因在诸如血管形成治疗中的新用途。
本发明人研究了PGI2合成酶基因(PGI2合成酶，本文称为“PGIS”)与HGF基因联合用于血管形成治疗的效果。迄今为止，尚未发现任何药物与编码血管形成因子的基因联合用于血管形成治疗中能表现出令人满意的效应。而且，迄今也没有人阐述与其它基因联合使用的效应。
用小鼠后肢缺血性ASO模型检测的结果是，HGF基因或VEGF基因与PGIS基因的联合使用显示出相对于这些基因单独使用而言意外显著的对小鼠后肢血流的改善作用。另外还首次发现，PGIS基因加强了HGF基因或VEGF基因的血管形成作用，而且即使是单独使用也能表现出血管形成作用。
上述结果表明，诸如PGI2等具有血管扩张作用或血小板凝集抑制作用的物质或产生它们的物质(如PGIS基因)在使用血管形成因子进行的血管形成治疗中十分有效。
此外，本发明人检测了编码转录调节因子ets-1(处在信号传递途径中HGF和VEGF的下游)的基因在血管形成治疗中的应用。结果首次发现单独给与ets-1基因这种转录调节因子也具有血管形成作用。ets-1与HGF基因的联合使用显示出比单独给与这两种基因更显著的血管形成作用。
基于以上发现完成了本发明。
更具体地，本发明的技术方案是：
(1)一种用于血管形成治疗的药物组合物，它包含编码血管形成因子的基因和至少一种选自下组的物质作为活性成分：具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质，以及产生这些物质的物质；
(2)一种用于血管形成治疗的药物组合物，其特征在于将编码血管形成因子的基因与至少一种选自下组的物质联合使用：具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质，以及产生这些物质的物质；
(3)一种用于血管形成治疗的药物组合物，它包含至少一种选自下组的物质作为活性成分：具有血管扩张作用和血小板凝集抑制作用的物质，以及产生这些物质的物质；还包括编码血管形成因子的基因；
(4)一种用于血管形成治疗的药物组合物，其特征在于将编码血管形成因子的基因与至少一种选自下组的物质联合使用：具有血管扩张作用和血小板凝集抑制作用的物质，以及产生这些物质的物质；
(5)(1)-(4)任一项所述的用于血管形成治疗的药物组合物，其中所述血管形成因子是HGF和/或VEGF；
(6)(1)-(5)任一项所述的用于血管形成治疗的药物组合物，其中所述具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质以及能产生它们的物质都是涉及cAMP增多的物质；
(7)(1)-(6)任一项所述的用于血管形成治疗的药物组合物，其中所述能产生具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用之物质的物质为基因；
(8)(7)所述的用于血管形成治疗的药物组合物，其中所述基因为前列腺环素合酶基因；
(9)一种用于血管形成治疗的药物组合物，其包含HGF基因和前列腺环素合酶基因作为活性成分；
(10)一种用于血管形成治疗的药物组合物，其特征在于将HGF基因和前列腺环素合酶基因联合使用；
(11)一种用于血管形成治疗的药物组合物，其包含VEGF基因和前列腺环素合酶基因作为活性成分；
(12)一种用于血管形成治疗的药物组合物，其特征在于将VEGF基因和前列腺环素合酶基因联合使用；
(13)(1)-(12)任一项所述的用于血管形成治疗的药物组合物，其中所述组合物用于治疗或预防缺血性疾病或动脉疾病；
(14)(13)的用于血管形成治疗的药物组合物，其中所述缺血性疾病或动脉疾病选自闭塞性动脉硬化，心肌梗塞，心绞痛，心肌病，和脑血管疾病；
(15)(1)-(14)任一项所述的用于血管形成治疗的药物组合物，其中所述基因以裸露DNA的形式引入；
(16)一种用于增强编码血管形成因子的基因的血管形成作用的制剂，它包含至少一种选自下组的物质作为活性成分：具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质，以及产生这些物质的物质；
(17)一种用于增强编码血管形成因子的基因的血管形成作用的制剂，它包含至少一种选自下组的物质作为活性成分：具有血管扩张作用和血小板凝集抑制作用的物质，以及产生这些物质的物质；
(18)(16)或(17)的增强血管形成作用的制剂，其中所述血管形成因子是HGF和/或VEGF；
(19)(16)-(18)任一项所述的增强血管形成作用的药物组合物，其中所述具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质以及能产生它们的物质都是涉及cAMP增多的物质；
(20)(16)-(19)任一项所述增强血管形成作用的制剂，其包含前列腺环素合酶基因作为活性成分；
(21)一种用于增强HGF基因的血管形成作用的制剂，其包含前列腺环素合酶基因作为活性成分；
(22)(16)-(21)任一项所述增强血管形成作用的制剂，用于治疗或预防缺血性疾病或动脉疾病；
(23)一种血管形成制剂，其包含前列腺环素合酶基因作为活性成分；
(24)(23)的血管形成制剂，其用于治疗或预防缺血性疾病或动脉疾病；
(25)一种用于血管形成治疗的药物组合物，其包含ets-1基因和另一种编码血管形成因子的基因作为活性成分；
(26)一种用于血管形成治疗的药物组合物，其特征在于联合使用ets-1基因和另一种编码血管形成因子的基因；
(27)(25)或(26)的用于血管形成治疗的药物组合物，其中所述血管形成因子是HGF和/或VEGF；
(28)一种用于血管形成治疗的药物组合物，其包含HGF基因和ets-1基因作为活性成分；
(29)一种用于血管形成治疗的药物组合物，其特征在于联合使用HGF基因和ets-1基因；
(30)(25)-(29)任一项所述用于血管形成治疗的组合物，其中所述组合物用于治疗或预防缺血性疾病或动脉疾病；
(31)一种含有ets-1基因作为活性成分的制剂，它增强另一种编码血管形成因子的基因的血管形成作用；
(32)(31)的增强血管形成作用的制剂，其中所述血管形成因子是HGF和/或VEGF；
(33)一种用于增强HGF基因的血管形成作用的制剂，其包含ets-1基因作为活性成分；
(34)(31)-(33)任一项所述增强血管形成作用的制剂，其中该制剂用于治疗或预防缺血性疾病或动脉疾病；
(35)一种血管形成制剂，其包含ets-1基因作为活性成分；
(36)(35)的血管形成制剂，用于治疗或预防缺血性疾病或动脉疾病。
本发明提供了用于血管形成治疗的药物组合物，它包含至少一种选自下组的物质作为活性成分：具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质，以及产生这些物质的物质；还包括编码血管形成因子的基因。
本文中用于血管形成治疗的“编码血管形成因子的基因”是指编码能诱导新血管形成的蛋白、多肽或其部分的基因。具体例如，编码以下蛋白的基因：HGF，VEGF，VEGF-2，酸性FGF(aFGF)，碱性FGF(bFGF)，FGF-4，EGF，TGF-α，TGF-β，血小板衍生的表皮细胞生长因子(PD-ECGF)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，胰岛素样生长因子，血管形成蛋白(angiopoietin)-1等。此外，调节基因表达的HIF-1(如VEGF)，以及编码转录因子的基因(如ets家族的成员，包括ets-1)也都是所述基因的例子。优选所述基因是HGF基因和VEGF基因；更优选HGF基因。这些基因的序列注册在公用数据库中，本领域技术人员利用这些数据库能轻易地克隆上述基因。
下文中，用HGF基因和VEGF基因举例说明本发明。
本发明中，术语“HGF基因”是指编码HGF(HGF蛋白)的基因。插入表达质粒中以备表达的HGF基因也可以简称为“HGF基因”。特别是，所述基因包括HGF的cDNA，参见Nature，342，440(1989)，Examined PublishedJapanese Patent Application No.2777678，Biochem.Biophys.Res.Commun.，163，967(1989)所述的那些，它们被插入适当表达载体(非-病毒载体，病毒载体)中，如下所述。编码HGF cDNA的核苷酸序列可参见上述文献。此外，它也登记在诸如Genbank等数据库中。因此可以根据上述序列信息，采用适当DNA片段作为PCR引物，对来自肝脏或白细胞的mRNA进行RT-PCR反应而克隆出HGF cDNA。本领域技术人员基于参考文献，如MolecularCloning 2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，可以很容易地进行这种克隆。
本发明的HGF基因不限于如上所述。只要所述基因所表达的蛋白基本上具有与HGF相同的血管形成作用，这种基因就可以用作本发明的HGF基因。尤其是，本发明的HGF基因包括：1)与上述cDNA在严格条件下杂交的DNA；2)编码具有下述氨基酸序列的蛋白的DNA，所述序列由上述cDNA编码，但其中一或多个(优选数个)氨基酸被取代、缺失、和/或添加等，只要它们编码的蛋白具有血管形成作用。上述1)和2)所述DNA可以通过定点诱变法、PCR法、常规杂交法等轻易获得。特别是，这些方法可根据上述参考文献，如Molecular Cloning 2nd edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)来进行。
本文中术语“VEGF基因”是指编码VEGF蛋白的基因。插入表达载体以备表达的VEGF基因也简称为“VEGF基因”。具体例子如插入适当表达载体(非-病毒载体，病毒载体)中的VEGF cDNA，如下所述。人的VEGF基因由于已报道的转录期间选择性剪接而存在4种亚型(VEGF121，VEGF165，VEGF189，和VEGF206)(Science，219，983(1983)；J.Clin.Invest.，84，1470(1989)；Biochem.Biophys.Res.Commun.，161，851(1989))。这些VEGF基因中任一种都可以用于本发明。但是，VEGF165基因是所有VEGF基因中生物活性最强的，因此更为优选。此外，与上述HGF情况类似，这些VEGF的修饰的基因，只要它们编码具有血管形成作用的蛋白，就都包括在本发明的VEGF基因中。
与HGF基因类似，VEGF基因也可以由本领域技术人员根据文献(如Science，246，1306(1989))中描述的序列和数据库中登记的序列信息而轻易地克隆；对它们的修饰也很容易进行。
可以通过体外测定WO 97/07824所述的血管内皮细胞的增生作用，来测定上述HGF基因，VEGF基因，编码它们的修饰形式的基因是否具有血管形成作用。或者，可以体内测定下文实施例的小鼠后肢缺血模型中血流的改善来测定这些基因的血管形成作用。
上述编码血管形成因子的基因可以单独或联合用于本发明的血管形成治疗中。
根据以下实施例所述，是本发明首次发现，前列腺环素合酶基因(PGIS基因)在血管形成治疗中与HGF基因联合使用可产生意外显著的效果。尤其是，本发明首次证实，联合使用HGF基因和PGIS基因获得了超出它们单独应用所得效应的叠加的协同效应。
由PGIS合成的PGI2具有如上所述的血管扩张作用，增强血管透性的作用，以及血小板凝集抑制作用。因此，上述协同效应可能是由于HGF基因和PGIS基因的联合使用提供了一种使HGF能在缺血部位轻易发挥作用的环境，即一种由于PGI2具有的血管扩张作用和血小板凝集抑制作用等作用而使HGF引起血管形成的环境。结果导致上述意外效应。
因此认为，具有血管扩张和/或血小板凝集抑制作用的物质，或者产生它们的物质引起了与联合使用PGIS基因等效的效应。因此，本发明提供了一种用于血管形成治疗的药用组合物，它包含至少一种选自下组的物质作为活性成分：具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质，以及产生这些物质的物质；还包括编码血管形成因子的基因。
特别是，同时具有血管扩张作用和血小板凝集抑制作用的物质，以及产生这些物质的物质优选用于本发明的血管形成治疗中。
本文中术语“具有血管扩张作用的物质”包括所有已知具有血管扩张作用的物质(市售血管扩张制剂等)，它可以是任何物质，包括基因、蛋白、以及低分子量化合物。具体可以是以下物质。
常用的血管扩张剂(所谓降压药)包括：Ca拮抗剂，ACE抑制剂，α1阻断剂，ANP(心房利尿钠肽)，钾离子通道开启剂，肼等。
特别是，用于ASO的血管扩张剂包括：前列腺素制剂如PGI2，PGE1及其衍生物(iloprost，beraprost钠，lipoPGE1等)；此外，增加NO供体或胞内cGMP浓度的药物，如亚硝酸化合物包括硝化甘油；增加胞内cAMP的药物，如磷酸二酯酶抑制剂。
优选的制剂是增加cAMP的药物或前列腺素制剂，更优选PGI2，PGE1及其衍生物(类似物)，更进一步优选PGI2。
“具有血小板凝集抑制作用的物质”包括所有已知具有血小板凝集抑制作用的物质(市售抗血小板制剂等)，并且可以是任何物质，如基因、蛋白、低分子量化合物。特别是，这类物质的实例如上述前列腺素制剂，如PGI2，PGE1及其衍生物(iloprost，beraprost sodium，lipoPGE1等)，以及花生四烯酸代谢抑制剂，腺苷环化酶激活剂，磷酸二酯酶III抑制剂，5-HT2受体拮抗剂，花生四烯酸代谢抑制剂或磷酸二酯酶V抑制剂。
优选的物质是那些增加cAMP的药物，或前列腺素制剂。更优选PGI2，PGE1，和它们的稳定衍生物(类似物)，更进一步优选PGI2衍生物。
以上术语“产生具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质的物质”是指，合成、产生、或诱导上述具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质的物质。特别是，它们指能合成、产生、或诱导上述增加前列腺素或cAMP的物质。
这些物质可以是基因、蛋白、和低分子量化合物。但在，例如，合成血管扩张物质的合酶的情况中，优选所述物质为基因形式。所述基因的具体实例包括：PGIS基因，环加氧酶-1(COX-1)基因，环加氧酶-2(COX-2)基因(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(16)，7384-7388(1992))，NO合酶(内皮型和诱导型)基因，细胞色素P450基因，ANP(心房利尿钠肽)基因，BNP(脑利尿钠肽)基因，CNP(C-型利尿钠肽)基因等。优选的基因包括PGIS基因，COX-1基因，和COX-2基因，更优选PGIS基因。所有这些基因的序列都已经登记在公用数据库中，本领域技术人员可以很容易地利用这些登记的基因克隆出所述基因。
一个利用了PGIS基因的实例如下。
本文中，术语“PGIS基因”是指编码PGIS蛋白的基因。为了表达的目的而插入表达质粒中的PGIS基因也简称为“PGIS基因”。具体实例是，如BBRC 200(3)，1728-1734(1994)，和WO 95/30013所述的插入到适当表达载体(非病毒载体，病毒载体)中的PGIS cDNA，见下文。此外，与上述HGF基因和VEGF基因相似，修饰的PGIS基因，只要能编码具有PGIS作用的蛋白，就包括在本发明的PGIS基因目录中。
与HGF基因和VEGF基因一样，本领域技术人员也可以根据上述文献所述的序列，或者根据数据库中登记的序列信息，很容易地克隆出PGIS基因。还可以很容易地对PGIS基因进行修饰。可测定由所述基因编码的蛋白是否具有所需PGIS活性，例如，用6-酮前列腺素F1α酶免疫分析试剂盒(Cayman，目录号#515211)进行免疫分析，或者通过薄层层析(TLC)检测前列腺环素合酶的代谢物。另外，还可以通过测定血管形成因子与另一种血管形成因子对以下实施例中小鼠后肢缺血模型的作用，来测定该血管形成因子对血管形成作用的增强作用。
上述具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质，或能产生它们的物质，单独或与这些物质中的某一些联合，可用于以血管形成因子基因进行的血管形成治疗中。
以下是本发明用于血管形成治疗的药用组合物的引入方法，引入形式，以及引入量的说明。
1)具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质，或产生它的物质(基因)，以及编码血管形成因子的基因，的应用
为了联合使用编码血管形成因子的基因和诸如上述PGIS基因，即联合使用两种或更多种基因，需要采用这些基因的适于进行基因治疗的制剂形式。联合使用的例子包括HGF基因与PGIS基因联合，或VEGF基因与PGIS基因联合。
被患者施用基因治疗制剂的方式可分为两类，其一利用非病毒载体，另一利用病毒载体。其制备方法和给药方法详见实验手册(实验医学(Experimental Medicine)增刊，“基因治疗的一般技术(Fundamental Techniquesfor Gene Therapy)”，羊土社，1996；实验医学(Experimental Medicine)增刊，“基因导入与表达分析的实验方法(Experimental Methods for Gene Transfer &Expression Analysis)”，羊土社，1997；“基因治疗研究和开发手册”，i(日本基因治疗学会)编，NTS，1999)。详述如下：
A.非病毒载体的应用
利用重组表达载体，引入了目标基因的常规基因表达载体，通过以下方法可以将目标基因引入细胞和组织中。
用于将基因转染至细胞中的方法的实例包括：磷酸钙共沉淀法，利用毛细玻璃管直接注入DNA的方法等。
将基因转染至组织中的方法的实例包括：通过内包型脂质体进行的基因转染方法，通过静电型脂质体进行的基因转染方法，HVJ(日本血凝素病毒)-脂质体法，改良的HVJ-脂质体法(HVJ-AVE脂质体法)，受体介导基因转染的方法，通过粒子枪将载体(金属粒子)与DNA分子一起引入细胞的方法，直接引入裸露DNA的方法，通过带正电的聚合物引入的方法，等等。可以用这些方法中的任何一种将重组表达载体引入细胞。在这些方法中，直接引入裸露DNA的方法是最简便的，因此从这种角度说是最优选的引入方法。或者，HVJ-脂质体法也是优选的转染形式，因为与传统的脂质体法相比，它能以极高的活性与细胞膜融合。优选将Z毒株(得自ATCC)作为HVJ，但原则上也可以使用其它HVJ毒株(例如ATCC VR-907，ATCC VR-105等)。
本发明中可以使用任何表达载体，只要它能体内表达所需的基因，这样的载体包括，例如，pCAGGS(Gene，108，193-200(1991))，pBK-CMV，pcDNA3.1，pZeoSV(Invitrogen，Stratagene)。
可以将上述两种或更多基因，以两种或更多重组表达载体的混合物的形式同时，或以一定时间间隔分别转染至机体中，所述混合物可通过将所达基因引入不同表达载体而制备。另一种方法是，引入单一表达载体，其中所述两种或更多基因已插入一种表达载体中。此外，有了上述脂质体制剂，就可以将两种或更多种重组表达载体包括在一种脂质体中而实施转染，或通过将每种重组表达载体包括在各自的脂质体中而实施转染。
B.病毒载体的应用
病毒载体的实例包括重组腺病毒，逆转录病毒等。更具体地，可以通过将基因引入DNA病毒或RNA病毒，并用该重组病毒感染细胞，而将基因引入细胞，所述病毒如无毒力的逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒，痘苗病毒，痘病毒，脊髓灰质炎病毒，仙台病毒，SV40，以及免疫缺陷病毒(HIV)。
在上述病毒载体中，已知腺病毒的感染效力远高于其它病毒载体。因此，从这个角度说，优选使用腺病毒载体系统。
与上述非病毒载体相似，也可以通过制备分别引入了两种或更多基因的重组表达载体，而将上述这些腺病毒载体以混合物的形式同时引入，或者间隔一定时间分别引入。或者，可以引入单一重组表达载体，其中已将两种或更多基因引入一种表达载体中。
此外，可以一并使用上述非病毒载体以及病毒载体将两种或更多种基因引入活体中。
引入本发明用于基因治疗的制剂的方法包括：(i)将所述基因治疗制剂直接引入机体中的体内方法；和(ii)收获来自人体的特定类型的细胞，在机体外将所述基因治疗制剂引入所述细胞，然后将修饰的细胞引入机体的回体(ex vivo)方法(日经Science，April 1994，20-45；月刊药事36(1)，23-48，1994；实验医学(Experimental Medicine)增刊，12(15)，1994；“基因治疗研究和开发手册”，(日本基因治疗学会)编，NTS，1999)。本发明优选上述体内方法。
通过体内方法给药时，根据所治疗的疾病，靶器官等等来选择合适的给药途径。例如，静脉给药，动脉给药，皮下给药，皮内给药，肌肉内给药等，或者直接在病变部位局部给药。
可以通过不同的制备形式来适应上述每种给药方式所适合的不同剂型(例如，液体制剂等)。例如，可以采用常规方法制备含有基因作为活性成分的注射剂，例如，将适当溶剂(缓冲液，如PBS，生理盐水，已灭菌的水等)溶解；必要时通过滤器过滤除菌，然后装入无菌容器中。可根据该注射剂的要求添加常规载体等。或者，脂质体，如HVJ-脂质体可以是脂质体制剂的形式，如悬浮剂，冻结剂，或离心浓缩的冻结剂。
此外，为了便于病灶周围存在所述基因，可以制备控释制剂(微型丸剂等)并埋植在病灶附近。也可以用渗透泵连续和逐步给药。
上述两种或更多种重组表达载体可以采用不同剂型，或者可以是含有混合制剂的一种剂型。
制剂中所述基因的含量可根据所治疗的疾病，患者年龄和体重等进行适当调整；但通常优选每种基因每隔数日或数月给药0.0001-100mg，或优选0.001-10mg一次。
2)具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质，和产生它的物质(低分子量化合物，蛋白等)，以及编码血管形成因子的基因，的应用
编码血管形成因子的基因和低分子量化合物，蛋白，肽等联合使用时，所述编码血管形成因子的基因应该采用上述基因治疗制剂的形式。另一方面，低分子量化合物等物质都是以常规药用组合物的形式口服或胃肠外给药。代表性的组合包括，HGF基因与PGI2衍生物的组合，VEGF基因与PGI2衍生物的组合等。
含有上述低分子量化合物，蛋白等物质作为活性成分的药用组合物的例子如下所述。
上述已经作为血管扩张剂或血小板凝集抑制剂(抗血小板剂)产品销售的低分子量化合物或蛋白的给药方法，剂量等，可以根据它们所声明的优点来设定。但通常的给药形式和方法可以是如下所述。
口服给药可以使用本领域常规的给药形式。胃肠外给药的形式可以是诸如局部给药制剂(经皮剂等)，直肠给药制剂，注射剂和鼻内用药制剂。
口服制剂或直肠给药制剂的例子包括，胶囊，片剂，丸剂，粉剂，滴剂，栓剂，液体制剂等。注射剂的例子包括，无菌溶液，悬浮液，乳液等；具体有，水，水-聚乙二醇溶液，缓冲液，0.4％生理盐水等。局部给药制剂包括，例如，乳膏，软膏剂，洗剂，经皮剂，等等。
可以用本领域常规方法将上述剂型与可药用填充剂和添加剂一起配制。可药用填充剂和添加剂包括载体，结合剂，香味剂，缓冲剂，增稠剂，着色剂，稳定剂，乳化剂，分散剂，悬浮剂，防腐剂，pH调节剂，渗透压调节剂，润滑剂等。可药用载体包括，例如，碳酸镁，乳糖，果胶，淀粉，甲基纤维素等。
可以根据所治疗的疾病，靶器官等等选用适当途径来给药上述药用组合物。例如，静脉内、动脉内、皮下、皮内、肌肉内等，或者直接在病灶部位局部给药。此外，也可以口服或使用栓剂。
给药剂量和频率根据患者症状、年龄、体重，给药形式等而不同；但每日成人剂量通常是约0.0001-500mg，优选约0.001-100mg，可以一次给足，或分多次给与。
含有上述低分子量化合物和蛋白作为活性成分的药用组合物可以与含有编码血管形成因子的基因的基因治疗制剂同时给药，或者间隔一定时间给药。
本发明用于血管形成治疗的药用组合物适用于需要血管形成治疗的所有疾病。具体例如缺血性疾病或动脉疾病。更具体地，心脏疾病的例子包括缺血性心脏病、心肌梗塞、急性心肌梗塞、心肌病、心绞痛、不稳定的心绞痛、冠状动脉硬化、心衰等；四肢缺血性疾病的实例包括闭塞性动脉硬化(ASO)，伯格(Berger)病、血管损伤、动脉栓塞、动脉血栓、器官动脉闭塞、动脉瘤等。其它实例有脑血管疾病，具体例子包括，脑血管闭塞、脑梗塞、脑血栓、脑栓塞、脑卒中、脑出血、脑底异常血管网病、脑血管性痴呆、阿尔茨海默型痴呆(Alzheimer type dementia)、脑出血后遗症、和脑梗死后遗症。本发明的药用组合物尤其对闭塞性动脉硬化有效。
此外，本发明还提供了用于增强编码血管形成因子的基因所致的血管形成效应的制剂，它包含至少一种选自下组的物质作为其活性成分：具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质，和产生它们的物质。如上所述，作为本发明用于血管形成治疗的药用组合物的活性成分的物质，具有增强编码血管形成因子的基因的血管形成作用的效应。因此，如上所述，它可以用作血管形成治疗的药用组合物的成分之一，它还可单独用作增效剂以增强编码血管形成因子的基因的血管形成作用。本发明的增效剂可有效用于编码血管形成因子的基因的作用不足的情况中。本发明的增效剂可以仅包含一种成分(物质)，或包含多种成分(物质)的组合。
具体地，本发明增效剂的活性成分包括上述PGIS基因或COX基因。其它例子还有PGI2，PGE1，它们的衍生物，等等；优选PGIS基因。所述血管形成因子可以是HGF或VEGF。
本发明增效剂的给药方法，给药形式，适用症等等特点都与上述血管形成治疗药用组合物的特点相同。
此外，本发明提供了包含PGIS基因作为活性成分的血管形成制剂。即，这是第一次表明，单独给药PGIS基因可导致血管形成效应。这是尚未为人所知的一种新效应，它归因于发现PGIS基因可用作血管形成制剂。本发明的血管形成制剂可用于上述需要血管形成的所有疾病(缺血性疾病，和动脉疾病)。而且，给药方法，给药形式等都相同于上述用于血管形成治疗的药用组合物。
此外，也是由本发明第一次表明，ets-1基因可用作血管形成治疗的基因治疗剂。也就是说，如下文实施例所证实的那样，单独给与ets-1基因可观察到血管形成效应，将ets-1基因与HGF基因联合使用，与它们任一个单独给药相比，可以增强血管形成。
本文中，ets-1是一种转录调节因子，其表达通常因HGF，VEGF，bFGF，和EGF等血管形成因子的作用而增强。已知这些血管形成因子可通过ets-1来活化与血管形成有关的各种因子(J.Cell.Physiol.，169，522-531(1996)；“HGF的分子医学(Molecular Medicine of HGF)”，Medical Review，179-185(1998)))。因此，通过将ets-1基因与除了HGF基因以外的其它血管形成因子(如VEGF基因)联合使用，可以获得与HGF基因联合使用相同的效应。
因此，本发明提供了新的用于血管形成治疗的药用组合物，其中单独应用了ets-1基因或将该基因与其它血管形成因子联合使用。具体地，有以下三种实例：
(1)一种用于血管形成治疗的药用组合物，其包含ets-1基因和另一种编码血管形成因子的基因作为活性成分；
(2)一种制剂，其包含ets-1基因作为增强由另一种编码血管形成因子的基因所致的血管形成作用的活性成分；和
(3)一种血管形成制剂，其包含ets-1基因作为活性成分。
本文中，术语“ets-1 gene”是指编码ets-1(ets-1蛋白)的基因。被掺入表达质粒中以便表达的ets-1基因也可以简称为“ets-1基因”。具体实例有，GenBank登录号为J04101的人ets-1 cDNA，由Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85(21)，7862-7866(1988)所述的掺入适当的基因治疗表达载体(非病毒载体，病毒载体)，如上述的那些。可以用类似于上述对HGF基因和VEGF基因的方法克隆ets-1基因。此外，本发明的ets-1基因不限于天然类型，只要是能表达基本上与ets-1相同效应的蛋白，这样的基因就包括在内。
与上述HGF基因和PGIS基因类似，可以将这种ets-1基因配制成基因治疗制剂。而且，引入活体的方法和引入量，剂型等都与HGF基因和PGIS基因的情况相同。
如上述(1)所述，为了联合使用ets-1基因与其它编码血管形成因子的基因(除ets-1以外)，可以将这两种或更多种基因如下配制。使用非病毒载体时，将基因插入不同表达载体中，构建出不同的重组表达载体，用这些载体以混合物的形式同时转染活体，或以一定时间间隔分别转染活体。另一种方法是，将所述两种或更多种基因掺入一种表达载体中，然后引入这种单一表达载体。如果给药形式是脂质体制剂，可通过将上述不同的表达载体包含在一个脂质体中，或者通过将这些不同的重组表达载体分别包容至不同脂质体中，而引入上述不同的重组表达载体。
另一方面，使用病毒载体时，可以将重组表达载体(其中已将两种或更多种基因掺入不同表达载体中)可以以混合物的形式同时引入，或者以一定时间间隔，用类似于上述对非病毒载体的方法引入。或者，可以引入单个重组表达载体，其中已将两种或更多种基因掺入一种表达载体中。
或者，可以用上述非病毒载体和病毒载体来将两种或更多种基因引入活体中。
与ets-1基因联合使用的血管形成因子的基因可以是任何基因，只要它编码出能诱导新血管形成的蛋白或多肽，或其一部分，如上所述。优选HGF基因和VEGF基因，更优选HGF基因。
此外，如上述(2)所述，本发明的ets-1可以单独用作增强编码血管形成因子的基因(如HGF和VEGF)的血管形成作用的增效剂。这种包含ets-1基因作为活性成分的增效剂可用于编码血管形成因子的基因的作用不足的情况中。特别是，它可有效用作增强HGF基因的作用的增效剂。此外，本发明的ets-1基因可以单独用作上述(3)所述的血管形成制剂。当以此种方式单独使用ets-1基因时，可以应用与上述基因治疗制剂相同的给药方法和给药形式。
上述使用ets-1基因的血管形成治疗可应用于，例如，疾病，特别是缺血性疾病或动脉疾病，更尤其心脏病，如缺血性心脏病心肌梗塞，急性心肌梗塞，心肌病，心绞痛，不稳定的心绞痛，冠状动脉硬化症，心衰和四肢缺血性疾病，如闭塞性动脉硬化(ASO)、伯格病、血管损伤、动脉栓塞、动脉血栓、器官动脉闭塞、动脉瘤。其它实例有脑血管疾病等。具体地，脑血管疾病的实例包括：脑血管闭塞、脑梗塞、脑血栓、脑栓塞、脑卒中、脑出血、脑底异常血管网病、脑血管性痴呆、阿尔茨海默氏痴呆、脑出血后遗症、和脑梗塞后遗症。这些疾病中，本发明含有ets-1基因作为活性成分的药用组合物都可以有效应用，特别对闭塞性动脉硬化有效。
附图说明
图1是给小鼠后肢缺血性ASO模型给药各种基因(对照，HGF基因，PGIS基因，HGF基因+PGIS基因)后，用激光多普勒成像仪(Laser DopplerImager)测量后肢血流的结果，它显示了左-右比率随时间的变化。
图2是给小鼠后肢缺血性ASO模型给药各种基因(对照，HGF基因，PGIS基因，HGF基因+PGIS基因)后，用激光多普勒成像仪测量后肢血流的结果，它显示了左-右比率与给药所述基因之前相比，随时间变化的增长率。
图3是给小鼠后肢缺血性ASO模型给药各种基因(对照，HGF基因，PGIS基因，HGF基因+PGIS基因)后，缺血性后肢肌肉中毛细血管数的检查结果。
图4是给大鼠后肢缺血性ASO模型给药各种基因(对照，HGF基因，ets-1基因，HGF基因+ets-1基因)后，用激光多普勒成像仪测量后肢血流的结果，它显示了右-左后肢血流比率的增长率。
图5是给大鼠后肢缺血性ASO模型给药各种基因(对照，HGF基因，ets-1基因，HGF基因+ets-1基因)后，缺血性后肢肌肉中毛细血管的密度。
图6是给大鼠后肢缺血性ASO模型给药各种基因(对照，HGF基因，ets-1基因，HGF基因+ets-1基因)后，缺血性后肢肌肉中的大鼠HGF浓度。
图7是给大鼠后肢缺血性ASO模型给药ets-1基因后，缺血性后肢肌肉中的大鼠HGF浓度。
图8是给小鼠后肢缺血性ASO模型给药PGIS基因，VEGF基因，或VEGF基因+PGIS基因后，缺血性后肢肌肉中的人VEGF浓度。
图9是形成小鼠后肢缺血性ASO模型的手术10天后，通过LDI测定的未处理的右后肢(正常)和左后肢(ASO)的血流比率。
图10是给小鼠后肢缺血性ASO模型给药PGIS基因，VEGF基因，或VEGF基因+PGIS基因的2周后，通过LDI测定的缺血性后肢肌肉中血流量的增长比。
图11是给小鼠后肢缺血性ASO模型给药PGIS基因，VEGF基因，或VEGF基因+PGIS基因的4周后，通过LDI测定的缺血性后肢肌肉中血流量的增长比。
图12是给小鼠后肢缺血性ASO模型给药PGIS基因和HGF基因，VEGF基因，或VEGF基因和PGIS基因的4周后，通过碱性磷酸酶染色的缺血性后肢肌肉的冰冻切片照片。
图13是给小鼠后肢缺血性ASO模型给药PGIS基因，VEGF基因，或VEGF基因+PGIS基因的4周后，毛细血管的密度。
实施本发明的最佳模式
下文中，本发明将通过实施例进行描述，但这并不意味着仅限于这些
实施例。
[实施例1]
对小鼠后肢缺血性ASO模型给药HGF基因或PGIS基因的效应
(1)材料
人HGF cDNA(特开平5-111383号公报记载)用常规方法克隆，并插入含有巨细胞病毒(CMV)启动子的表达质粒pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中，作为人HGF基因来使用。
人PGIS cDNA(B.B.R.C.，Vol.200，No.3，p1728-1734(1994))用常规方法克隆，并插入含有CMV增强子和β-肌动蛋白启动子的表达质粒pCAGGS(Gene 108，193-200(1991))中，用作人PGIS基因。
(2)方法
使用C57BL/6J小鼠(8周龄，雄性)。对小鼠实施麻醉，方法是腹膜内注射200μl 10-倍稀释的戊巴比妥，必要时再吸入乙醚。然后，结扎左后肢动静脉以制作小鼠后肢缺血性ASO模型。10天后，用激光多普勒成像仪(LDI，Moor Instruments Ltd.，MLDI5070)评价双侧后肢的血流，计算左-右比率。然后，将500μg以上(1)所述每种基因以裸露质粒的形式给药至左后肢肌肉中。共设立4个组：即，未给药的对照组；HGF基因单独给药组；PGIS基因单独给药组；以及HGF基因和PGIS基因联合给药组。给药这些基因的2周和4周后，用LDI评价血流，计算所述比率。此外，4周后，摘出左后肢肌肉，制备冰冻切片，通过碱性磷酸酶染色来测定毛细血管密度。用Fisher的PLSD方法检验显著性差异。
(3)结果
左-右后肢血流比率随时间的改变通过LDI测定，示于图1。此外，相对于基因给药之前LDI比率的增长率示于图2。PGIS基因给药2周后，血流改善，但给药4周后，几乎与对照组相同。HGF基因给药的2周和4周后，血流都得到改善。意外的是，PGIS基因和HGF基因的联合使用相较于单独给与这些基因，血流得到显著改善(2周后：对照为100％，HGF基因给药为132％，PGIS基因给药为125％，HGF基因+PGIS基因联合给药为177％，P＜0.01；4周后：对照为100％，HGF基因给药为150％，PGIS基因给药为104％，HGF基因+PGIS基因联合给药为166％，P＜0.01)。
基因给药4周后，肌肉中的毛细血管密度见图3。毛细血管密度由于给药PGIS基因或HGF基因而增加。而且，通过联合使用PGIS基因和HGF基因，毛细血管密度相较于单独给药显著增加。
[实施例2]
对大鼠后肢缺血性ASO模型给药HGF基因和ets-1基因的效应
(1)材料
使用携有人HGF基因的表达质粒，与实施例1一样。人ets-1cDNA(GenBank登录号J04101，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85(21)，7862-7866(1988))通过常规方法克隆，并插入市售表达载体中，用作人ets-1基因。
(2)方法
使用Sprauge Dawley大鼠(12周龄，雄性)。摘出一侧股动脉，以制作大鼠后肢缺血性ASO模型。1周后，将100μg的每种基因用HVJ-脂质体法给药至左后肢肌肉。共设立4个组：仅给药载体的对照组；HGF基因单独给药组；ets-1基因单独给药组；以及HGF基因和ets-1基因联合给药组。给药前和给药4周后，用LDI评价两后肢中的血流，计算左-右血流比率的增长率。此外，摘出左后肢肌肉，制备冰冻切片，通过碱性磷酸酶染色来测定肌肉中的毛细血管密度。为了研究基因给药对内源性HGF的影响，用ELISA试剂盒(Institute of Immunology)测定缺血的后肢中，大鼠HGF的肌肉内浓度。
(3)结果
通过单独给与ets-1基因，增强了肌肉组织中的ets-1结合活性。此外，通过单独给与ets-1基因，用LDI所测的后肢血流比率的增长率提高(图4)，肌肉中的毛细血管密度增加(图5)，这些结果表明，单独给药ets-1基因对血管形成的效应，以及对ASO模型的有效性。此外，在ets-1基因单独给药组中，缺血后肢中的肌肉内HGF浓度增加(图6和图7)，据认为这是ets-1基因给药发生效应的机制之一。
在ets-1基因和HGF基因联合给药组中，LDI血流比率的增长率相较于ets-1基因或HGF基因单独给药组显著增加(图4)。联合给药还使肌肉内毛细血管密度显著增加(图5)。可见，所述基因的联合转染比单独应用更促进血管形成。因此，这些基因的联合比单独基因转染能更有效对抗ASO。
根据对大鼠缺血后肢肌肉中内源性HGF浓度的测定，大鼠HGF浓度在HGF基因和ets-1联合给药组高于在HGF基因单独给药组(图6)。这提示HGF具有通过活化ets-1而进行的自我循环型(auto-loop type)调节机制，因为与ets-1基因联合给药比HGF基因单独给药更促进内源性HGF的表达。
[实施例3]
对小鼠后肢缺血性ASO模型给药VEGF基因和PGIS基因的效应
(1)材料
人VEGF165 cDNA(九洲大学第II外科米满教授惠赠)用常规方法克隆，插入带有CMV增强子和β-肌动蛋白启动子的表达质粒pCAGGS(Gene 108，193-200(1991))中的EcoRI位点，作为人VEGF基因来用。
人PGIS cDNA(B.B.R.C.，Vol.200，No.3，p1728-1734(1994))用常规方法克隆，插入带有CMV增强子和β-肌动蛋白启动子的表达质粒pCAGGS(Gene 108，193-200(1991))中，作为PGIS基因来用。
(2)方法
1.使用C57BL/6J小鼠(8周龄，雄性)。对小鼠实施麻醉，方法是腹膜内注射200μl 10-倍稀释的戊巴比妥，必要时再吸入乙醚。然后，结扎左后肢动静脉以制作小鼠后肢缺血性ASO模型。评价后，将1mg以上(1)所述每种基因以裸露质粒的形式给药至左后肢肌肉中。共设立4个组：未给药的对照组；VEGF基因单独给药组；PGIS基因单独给药组；以及VEGF基因和PGIS基因联合给药组。每组4只动物。将每种质粒给药至左胫骨肌，之后的第5天，用AN’ALYZA免疫分析系统人VEGF试剂盒(GENZYME)测定缺血的后肢中，人VEGF蛋白的肌肉内浓度(图8)。
2.通过与上述类似的方法制作小鼠后肢缺血性ASO模型。10天后，用激光多普勒成像仪(LDI，Moor Instruments Ltd.，MLDI5070)评价双侧后肢的血流，计算左-右比率(图9：右腿(正常)，左后肢(ASO))。结果证实，以正常血流为100％时，左后肢中的血流量减少了近30％。评估后，将500μg以上(1)所述每种基因以裸露质粒的形式给药至左后肢肌肉中。共设立4个组：未给药的对照组；VEGF基因单独给药组；PGIS基因单独给药组；以及VEGF基因和PGIS基因联合给药组。给药这些基因的2周和4周后，用LDI评价血流，并计算增长率。此外，4周后，摘出左后肢肌肉，制备冰冻切片，通过碱性磷酸酶染色来测定毛细血管密度(图12)。用Fisher的PLSD方法检验显著性差异。
(3)结果
1.如图8所示，对照组和PGIS基因给药组中未检测到人VEGF蛋白的肌肉内浓度，VEGF基因和PGIS基因联合给药组所检测到的上述浓度比VEGF基因单独给药组的高。
2.2周后通过LDI测得的左后肢血流的增长率见图10，4周后的结果见图11。无论是VEGF基因单独给药，还是VEGF基因和PGIS基因联合给药，2周后的血流未见改善。但4周后，VEGF基因单独给药以及VEGF基因和PGIS基因联合给药相较于对照组，血流都得到改善。意外的是，PGIS基因和VEGF基因的联合使用相较于单独给与这些基因，血流得到显著改善(2周后：对照为100％，PGIS基因给药为105％，VEGF基因给药为117％，VEGF基因+PGIS基因联合给药为115％；4周后：对照为100％，PGIS基因给药为103％，VEGF基因给药为130％，VEGF基因+PGIS基因联合给药为169％，P＜0.01)。
基因给药4周后，肌肉中的毛细血管密度见图13。毛细血管密度由于VEGF基因给药而增加。而且，通过联合使用PGIS基因和VEGF基因，毛细血管密度相较于单独给药显著增加。(对照为100％，PGIS基因给药为175％，VEGF基因给药为221％，VEGF基因+PGIS基因联合给药为338％，P＜0.0001)。
工业实用性
本发明提供了一种新的用于血管形成治疗的高效药用组合物，它包含至少一种选自下组的物质作为活性成分：具有血管扩张作用和/或血小板凝集抑制作用的物质，以及产生这些物质的物质；还包括编码血管形成因子的基因。此外，对于前列腺环素合酶基因和ets-1基因等基因，以前不知道它们可用于血管形成治疗，而本发明新发现它们可用于血管形成治疗。本发明还提供了包含这些基因作为活性成分的用于血管形成治疗的药用组合物。

Claims (9)

1.一种用于血管形成治疗的药物组合物，它包含编码HGF和/或VEGF的基因和前列腺环素合酶基因作为活性成分。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述基因以裸露DNA的形式引入。
3.权利要求1或2的药物组合物在制备用于治疗或预防闭塞性动脉硬化的药物中的用途。
4.一种用于血管形成治疗的药物组合物，其包含编码HGF和/或VEGF的基因和前列腺环素合酶基因，其中所述编码HGF和/或VEGF的基因是单独的制剂，所述前列腺环素合酶基因也是单独的制剂。
5.权利要求4的药物组合物，其中所述基因以裸露DNA的形式引入。
6.权利要求4或5的药物组合物在制备用于治疗或预防闭塞性动脉硬化的药物中的用途。
7.一种血管形成制剂，包含前列腺环素合酶基因作为活性成分。
8.权利要求7的制剂的用途，用于制备增强HGF和/或VEGF编码基因的血管形成作用的药物。
9.权利要求7的血管形成制剂在制备用于治疗或预防闭塞性动脉硬化的药物中的用途。
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