CN1270602C

CN1270602C - 一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法

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Publication number: CN1270602C
Application number: CN 200410041038
Authority: CN
Inventors: 陈发棣; 蒋甲福; 房伟民; 赵宏波; 管志勇
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2004-06-21
Filing date: 2004-06-21
Publication date: 2006-08-23
Anticipated expiration: 2024-06-21
Also published as: CN1593110A

Abstract

本发明涉及一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法，属于生物技术领域，包括：筛选出愈伤组织分化能力较强的基因型菊花品种‘七月红’长嫩茎段；在培养基MS+2.0mg·L-12，4-D+0.2mg·L^-16-BA上诱导获得浅绿色、颗粒细小(1毫米左右)、外观湿润、质地松软的愈伤组织，转移液体培养基中进行悬浮培养40天后，采用固液双层培养约4周后转到MS分化培养基1个月后获得1cm左右高度的再生植株幼苗并驯化移栽。本发明首次建立了小菊细胞悬浮培养与植株再生体系，为小菊的细胞及基因工程提供了培养技术。

Description

一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法

一、技术领域

本发明一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法，属于生物技术领域，专用于组织培养获得再生植株。

二、技术背景

菊花(Dendranthema Xgrandiflora Ramat.)是我国十大名花和世界四大切花之一，是盆栽、切花和园林美化的重要花卉种类，在花卉生产中占有十分重要的地位。杂交和诱变是目前菊花育种的主要手段。但是，杂交和诱变育种带有一定的盲目性，缺乏遇见性和可控性，而且工作量很大；诱变育种局限于个体或组织水平，其后代往往产生大量嵌合体，这对优良性状的纯化鉴定和稳定遗传带来很大的困难。

以单细胞或小细胞团作为对象进行菊花细胞、基因工程等研究具有很大的优势，因为单细胞或小细胞团受周围细胞和微环境的影响较小，且可以得到单细胞起源、遗传上稳定的同质体再生植株。在细胞水平进行诱变育种和遗传转化时，可从大群培养细胞中较快地筛选出所需的突变细胞或转化细胞，再生植株一般为纯合突变体，通过生化或分子生物学手段对突变株或转化植株进行选择，能大大缩短育种年限。利用生物技术改良菊花的观赏性状、抗性已引起广泛重视。能否成功地将这一方法应用于菊花育种与生产，关键是要建立菊花组织、细胞培养的再生体系。菊花茎尖、茎段、叶片、花瓣、花托、花萼、雌雄蕊、花蕾再生植株都已有成功报道。但关于菊花悬浮细胞培养的研究，尚未有报道。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法，建立小菊细胞悬浮培养再生体系，成功获得植株并移栽成活，用于小菊组织培养获得再生植株，同时为小菊的细胞、基因工程提供获得再生植株的技术。

技术方案

本发明是一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法，包括：

1)愈伤组织的诱导

1.1基因型的选择取不同品种的顶端幼嫩叶片，用75％酒精灭菌30s，再用0.1％升汞灭菌10min，无菌水冲洗5次，切成约0.5×0.5cm²小块，接到MS+2.0mg·L^-12，4-D+0.2mg·L^-16-BA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 6.2的培养基上；30天后，将诱导的愈伤组织转接到MS+2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 6.2的分化培养基上，30d后选出平均每块愈伤组织分化芽数大于5个的品种；

1.2愈伤组织的获得以选择品种的无菌苗为试材，取植株中上部0.2-0.5cm长嫩茎段作外植体，接种到以MS、B₅作基本培养基，添加0.2mmg·L^-16-BA和浓度为1.00mg·L^-12，4-D的诱导愈伤组织培养基上，30d后统计愈伤组织的诱导率为100％，获得诱导的愈伤组织为浅绿色、颗粒大小为0.05-0.15cm、外观湿润、质地松软的愈伤组织；

2)悬浮系的建立和植株再生

2.1悬浮培养

取2～3g上述诱导出的浅绿色、颗粒大小为0.05-0.15cmm、外观湿润、质地松软的愈伤组织放入MS+0.2mg·L^-1KT+0.2mg·L^-1NAA+0.2mg·L^-12，4-D液体培养基中进行悬浮培养3天，将培养的悬浮液用高温高压灭菌过的300目的尼龙网过滤，收集过滤液进行继代培养，继代时，把培养物摇匀，分装到无菌三角瓶中，再加入同等体积的新鲜培养基，培养条件为：摇床转速100转/分钟，25±1℃，1000lux弱光下培养，共培养30-50d；

2.2植株再生

将上述培养的悬浮液用300目尼龙网过滤，收集过滤液转移到MS+0.2mg·L^-1 KT+0.2mg·L^-12，4-D+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 6.2的固体培养基上，每瓶装有25～30ml固体培养基的100ml三角瓶中加1ml过滤液，在25±1℃，1000lux弱光下培养，4周后获得0.2-0.4cm大小的愈伤组织；

把获得的愈伤组织转移到分化培养基MS+2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1 NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂上，在25±1℃，3000lux下培养，每天12小时黑暗，一个月后获得0.8-1.5cm高度的再生植株。

上述方法中最好将将获得的愈伤组织转到MS/B₅+2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+琼脂0.7g·L^-1，以MS为基本培养基的添加30g·L^-1蔗糖，B₅加20g·L^-1蔗糖，pH值6.2，高温高压灭菌前的分化培养基；30d后统计分化情况，每块愈伤组织分化芽数达0.5-1.0个，确定以上获得的愈伤组织可以于下一步悬浮培养。悬浮培养初期，每隔3天继代换液1次，继代2次，以后可每隔7～10d继代换液1次。

有益效果本发明提供的一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：

①本研究以小菊为材料，建立悬浮细胞培养与植株再生体系，为小菊的细胞、基因工程等的深入研究奠定了基础。比较不同基因型在分化培养基上的分化率，筛选出分化能力最强的基因型为‘七月红’，每块愈伤组织30d天可诱导出9个芽，，筛选出茎段最易诱导出愈伤组织，同时再生能力较理想，愈伤组织的诱导率为100％，平均每块愈伤组织分化芽数0.7个；

②本发明悬浮培养的单个细胞在3～5d内即可见到细胞分裂，约6d即可形成小细胞团，培养过程中，整个生长曲线为上升的半抛物线型，可分为延迟期(2d)、对数生长期(6～9d)，减慢期(2d)等阶段；试验表明，悬浮细胞在7种培养基上，植板率有明显差异，本发明选择培养基即MS+0.2mg·L^-1KT+0.2mg·L^-12，4-D培养基上悬浮细胞的植板率最大，为9.2×10^-4；悬浮细胞再生愈伤组织时，都需要添加生长素和细胞分裂素，本发明2，4-D效果较好，植板率也相应提高到30×10^-4；

③本发明进行短期的低温预处理，可以提高悬浮细胞的植板率，4℃处理2h，植板率增加0.3×10^-4，并采取悬浮培养初期，每隔3天继代换液1次，继代2次，以后可每隔7～10d继代换液1次，共继代4次，植板率为9.5×10^-4。

④本发明成功获得1cm左右高度的再生植株(图5)。再生植株驯化至根长度达0.5-1cm时移栽成活(图6)。本发明建立了小菊细胞悬浮培养再生体系，成功获得植株并移栽成活，可用于小菊组织培养获得再生植株，同时为小菊的细胞、基因工程提供获得再生植株的技术。

四、附图说明

图1‘七月红’细胞悬浮培养(×100)

→：不规则细长细胞：

椭圆形细胞：

细胞团

图2‘七月红’细胞悬浮培养的细胞团(×200)

图3悬浮细胞培养所得的愈伤

图4悬浮细胞培养所得愈伤的变化

图5悬浮培养所得的愈伤分化出芽

图6悬浮培养再生植株生根

五、具体实施方案

本发明所提供的菊花悬浮细胞培养和植株再生的方法，其实施方案如下：

1愈伤组织的诱导

1.1基因型的选择取不同品种的顶端幼嫩叶片，用75％酒精灭菌30s，再用0.1％升汞灭菌10min，无菌水冲洗5次，切成约0.5×0.5cm²小块，接到MS+2.0mg·L^-12，4-D+0.2mg·L^-16-BA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 6.2的培养基上。30天后，将诱导的愈伤组织转接到MS+2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 6.2的分化培养基上，30d后选出平均每块愈伤组织分化芽数大于5个的品种。结果表明，‘七月红’叶片在15d后就开始形成愈伤组织(速度最快)，且愈伤组织在转到分化培养基上分化率最高，每块愈伤组织可诱导出9个芽。

1.2愈伤组织的获得以‘七月红’品种的无菌苗为试材，取植株中上部的叶片切成三部分：叶片上部、叶片下部、叶柄及约0.3cm长嫩茎段作外植体，分别接种到以MS、B₅作基本培养基，添加0.2mg·L^-16-BA和不同浓度2，4-D(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0mg·L^-1)的诱导愈伤组织培养基，每瓶接种5个外植体，每个处理重复3次；30天后获得诱导的愈伤组织；

将愈伤组织转到MS/B₅+2mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+琼脂0.7g·L^-1，以MS为基本培养基的添加30g·L^-1蔗糖，B6加20g·L^-1蔗糖，pH值6.2(高温高压灭菌前)的分化培养基。30d后统计分化情况，筛选出适于诱导悬浮培养用愈伤组织[浅绿色、颗粒细小(愈伤组织表面形成0.1cm左右大小的细小颗粒)、外观湿润、质地松软的愈伤组织]的外植体。

结果表明，最适合的外植体为幼嫩茎段，最适合的培养基为MS+0.2mg·L^-16-BA+1.0mg·L^-12，4-D+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 6.2。其愈伤组织的诱导率为100％，平均每块愈伤组织分化芽数0.7个。

2悬浮系的建立和植株再生

2.1悬浮培养取2～3g上述诱导出的浅绿色、颗粒细小(愈伤组织表面形成0.1cm左右大小的细小颗粒)、外观湿润、质地松软的愈伤组织放入MS+0.2mg·L^-1KT+0.2mg·L^-1NAA+0.2mg·L^-12，4-D液体培养基中进行悬浮培养，3d后，培养的悬浮液用高温高压灭菌过的300目的尼龙网过滤，收集过滤液进行继代培养。继代时，把培养物摇匀，分装到无菌三角瓶中，再加入同等体积的新鲜培养基，培养条件为：摇床转速100转/分钟，25±1℃，1000lux弱光下培养。

悬浮培养初期，每隔3天继代换液1次，继代2次，以后可每隔7～10d继代换液1次，共培养40d左右。

2.2植株再生将上述培养40d后的悬浮液用300目尼龙网过滤，收集过滤液转移到MS+0.2mg·L^-1KT+0.2mg·L^-12，4-D+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 6.2的固体培养基上，每瓶装有25～30ml固体培养基的100ml三角瓶中加1ml过滤液，在25±1℃，1000lux弱光下培养。四周后获得0.3cm左右大小的愈伤组织。

把获得的愈伤组织转移到分化培养基MS+2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂上，在25±1℃，3000lux下培养(每天12小时黑暗)，一个月后获得1cm左右高度的再生植株(图5)。

再生植株在MS+0.5mg·L^-1NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂培养基(pH 6.2)上诱导生根，培养条件为25±1℃，弱光(约1000lux)。20d后，当根长度达0.5-1cm时驯化移栽成活(图6)。

上述悬浮培养的单个细胞在3～5d内即可见到细胞分裂，约6d即可形成小细胞团，培养过程中，整个生长曲线为上升的半抛物线型，可分为延迟期(2d)、对数生长期(6～9d)，减慢期(2d)等阶段；试验表明，悬浮细胞在7种培养基上，植板率有明显差异，本发明选择培养基即MS+0.2mg·L^-1KT+0.2mg·L^-12，4-D培养基上悬浮细胞的植板率最大，为9.2×10^-4；悬浮细胞再生愈伤组织时，都需要添加生长素和细胞分裂素，本发明2，4-D效果较好，植板率也相应提高到30×10^-4；

高温(38℃)条件下，无论来自何种愈伤组织所得的悬浮细胞，其植板率都会下降，38℃处理6h、48h，其植板率分别下降7.3×10^-4、9.0×10^-4；本发明进行短期的低温预处理，可以提高悬浮细胞的植板率，4℃处理2h，植板率增加0.3×10^-4，但处理时间超过4h时植板率开始降低，随着继代次数的增加，植板率下降，继代6次后，植板率降低1.9×10^-4，继代9次时，植板率降为1.9×10^-4，继代次数达到12次时植板率降为0。采用悬浮培养初期，每隔3天继代换液1次，继代2次，以后可每隔7～10d继代换液1次，共继代4次，植板率为9.5×10^-4。

Claims

1、一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法，包括：

1)愈伤组织的诱导

1.1 基因型的选择取不同品种的顶端幼嫩叶片，用75％酒精灭菌30s，再用0.1％升汞灭菌10min，无菌水冲洗5次，切成0.5×0.5cm²小块，接到MS+2.0mg·L^-1 2，4-D+0.2mg·L^-16-BA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH6.2的培养基上；30天后，将诱导的愈伤组织转接到MS+2.0mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1 NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH6.2的分化培养基上，30d后选出平均每块愈伤组织分化芽数大于5个的品种；

1.2 愈伤组织的获得以选择品种的无菌苗为试材，取植株中上部0.2-0.5cm长嫩茎段作外植体，接种到以MS或B₅作基本培养基，添加0.2mg·L^-1 6-BA和浓度为1.0mg·L^-1 2，4-D的诱导愈伤组织培养基上，30天后获得诱导的愈伤组织；

将愈伤组织转到MS/B₅+2mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1 NAA+琼脂0.7g·L^-1，以MS为基本培养基的添加30g·L^-1蔗糖，B₅加20g·L^-1蔗糖，pH值6.2的分化培养基，30d后统计愈伤组织的诱导率为100％，获得诱导的愈伤组织为浅绿色、颗粒大小为0.05-0.15cm、外观湿润、质地松软的愈伤组织；

2)悬浮系的建立和植株再生

2.1悬浮培养

取2～3g上述诱导出的浅绿色、颗粒大小为0.05-0.15cm、外观湿润、质地松软的愈伤组织放入MS+0.2mg·L^-1 KT+0.2mg·L^-1 NAA+0.2mg·L^-1 2，4-D液体培养基中进行悬浮培养3天，将培养的悬浮液用灭菌过的300目的尼龙网过滤，收集过滤液进行继代培养，继代时，把培养物摇匀，分装到无菌三角瓶中，再加入同等体积的新鲜培养基，培养条件为：摇床转速100转/分钟，25±1℃，1000lux弱光下培养，共培养30-50d；

2.2 植株再生

将上述培养的悬浮液用300目尼龙网过滤，收集过滤液转移到MS+0.2mg·L^-1 KT+0.2mg·L^-1 2，4-D+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH6.2的固体培养基上，每瓶装有25～30ml固体培养基的100ml三角瓶中加1ml过滤液，在25±1℃，1000lux弱光下培养，4周后获得0.2-0.4cm大小的愈伤组织；

把获得的愈伤组织转移到分化培养基MS+2.0mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1 NAA+30g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂上，在25±1℃，3000lux下培养，每天12小时黑暗，一个月后获得0.8-1.5cm高度的再生植株。

2、根据权利要求1所述的一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法，其特征在于：将获得的愈伤组织转到MS/B₅+2mg·L^-1 6-BA+0.1mg·L^-1NAA+琼脂0.7g·L¹，以MS为基本培养基的添加30g·L^-1蔗糖，B₅加20g·L^-1蔗糖，pH值6.2的分化培养基；30d后统计分化情况，每块愈伤组织分化芽数达0.5-1.0个，以上获得的愈伤组织用于下一步悬浮培养。

3、根据权利要求1或2所述的一种菊花悬浮细胞培养获得再生植株的方法，其特征在于：悬浮培养初期，每隔3天继代换液1次，继代2次，以后每隔7～10d继代换液1次。