CN1248916A - FXR、PPARα和LXRα激活剂恢复屏障功能、促进表皮分化和抑制增生的用途 - Google Patents

FXR、PPARα和LXRα激活剂恢复屏障功能、促进表皮分化和抑制增生的用途 Download PDF

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K·汉利
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Abstract

通过外用化合物如金合欢醇X受体的激活剂、过氧化物酶体增生体－激活的α受体的激活剂和LXRα受体的氧固醇激活剂,可治疗或预防表皮屏障破坏或功能紊乱的皮肤和粘膜疾病。这些化合物还可有效地治疗表皮分化和增生疾病。

Description

FXR、PPARα和LXRα激活剂恢复屏 障功能、促进表皮分化和抑制增生的用途
                   相关申请交叉文献
本申请是美国待批优先权申请No.08/788,973(1997年1月24日提交)的部分续展申请，原申请被纳入本文作参考。
                           政府权利
本发明至少部分受到美国联邦政府(国立卫生研究院补助金号HD29706)的资助。因此，政府享有本发明的某些权利。
本发明领域涉及皮肤用外用制剂，对患有表现出屏障功能破坏的皮肤或粘膜疾病或失调的个体的治疗方法，以及涉及表皮分化和增生疾病的那些治疗方法。
                           发明背景
哺乳动物表皮的一个功能是形成屏障以防止过量水分经过皮肤损失进入环境。该屏障由无核、角质化的表皮最外层形成，统称为角质层。各种皮肤和粘膜疾病和病征产生了局部或全面的表皮屏障紊乱。这些紊乱不仅对皮肤病变的形态有显著作用，而且还激活了某些皮肤病，如牛皮癣中的Koebner现象和湿疹性疾病中的发炎。也已知道，屏障的完整性是调节表皮DNA合成的主要因素。因此，维持正常的表皮屏障是抑制表皮过度增生的一种生理方式。参与或引起表皮屏障破坏或功能紊乱的病征例子是：
胎龄少于33周的早产婴儿体内的体液和电解质异常、低温、和通过皮肤的感染；
粘膜发炎，如唇炎、唇裂、鼻过敏和外阴阴道炎；
湿疹性皮炎，如特应性皮炎和皮脂溢性皮炎、变应性或刺激性接触性皮炎、湿疹开裂、光过敏性皮炎、光毒性皮炎、植物光化性皮炎、辐射性皮炎和停滞性皮炎；
皮肤或粘膜创伤、烧伤、大泡性疾病或局部缺血引起的溃疡和糜烂；
几种形式的鱼鳞癣；
大泡型表皮松懈；
牛皮癣；
肥大性疤痕和瘢痕疙瘩；
体内老化和光老化的皮肤变化；
皮肤机械剪切引起的摩擦性水疱；和
表面使用皮质醇引起的皮肤萎缩。
功能性屏障所需的表皮关键组成是细胞间、层状角质层脂类双层。角质层脂类的合成相当自主，不受循环或饮食的影响。相反，合成应答由渗透性屏障功能来调节。调节通过三种关键脂类各自的速率限制酶的活性、磷酸化(活化)状态、质量、mRNA的改变来实现，这三种酶是丝氨酸棕榈酰转移酶(用于合成神经酰胺)、HMGCoA还原酶(用于合成胆固醇)以及乙酰CoA羧化酶和脂肪酸合成酶(用于合成脂肪酸)。屏障功能变化的其它结果是胞外脂类加工的关键酶受到调节。一种这样的酶是β-葡糖脑苷脂酶，它催化前体糖基神经酰胺转变成神经酰胺。
尽管渗透性屏障需求调节脂类合成，但是关于屏障发育(barrier development)和体内平衡的内源调节剂还不知道。最近，来自本发明者实验室的研究揭示了核受体超家族的几种激活剂和配体(如糖皮质激素、甲状腺激素和雌激素)促进啮齿类动物胎仔皮肤中出现成熟的屏障。Hanley，K.，等，″表皮屏障个体发育：在无血清培养基中成熟和通过糖皮质激素和甲状腺激素而非选定生长因子来促进″，J.Invest.Dermatol.106：404-411(1996)；Hanley，K.，等，″胎鼠中表皮屏障形成中性别差异的激素基础。受雌激素促进和受雄激素延迟″，J.Invest.Dermatol.97：2576-2584(1996)。相反，该家族的其它成员(如1，25-二羟基维生素D3 9-顺式-视黄酸和全反式视黄酸)却没有效果。
                            发明概述
现已发现，通过在表面施加以下三类核受体任一类的某些激活剂可加速形成成熟的、完全分化的角质层和功能性表皮渗透性屏障，这三类核受体是类金合欢醇(farnesoid)X-激活的受体(FXR)、过氧化物酶体增生体(proliferator)-激活的受体α(PPARα)和肝为基础的受体(称为LXRα)。这三类受体是核受体，是转录因子的核受体超家族的一部分。这三类受体在超家族的亚组中，亚组中所有受体共有的特征是它们只有在和类视黄醇X受体(RXR)形成异二聚体时才会起作用。然而，该亚组中其它许多成员没有促进成熟角质层形成或屏障发育的激活剂，它们包括维生素D受体(VDR)、所有反式-视黄酸受体(RARα，β，δ)和9-顺式视黄酸受体(RXR)。因此，FXR、PPARα和LXRα激活剂实现这一结果的能力是该亚组成员中独特的。
FXR激活剂促进屏障发育的能力特别令人惊奇，因为结构与金合欢醇(主要的FXR激活剂)类似但本身并非FXR激活剂的化合物不会促进屏障发育，尽管它们具有相似的结构。PPARα受体的能力也令人惊奇，因为还存在在结构和功能上相似的其它PPAR受体(及其各自分开的激活剂)，但是只有PPARα受体的激活剂能促进屏障发育。本发现还令人惊奇的一方面是伴随PPARα激活的屏障发育促进与必需和非必需脂肪酸间的差别没有关系，而是与某些共同的结构特征有关。本发现还令人惊奇的一方面涉及氧固醇，其并非LXRα激活剂，但是结构与LXRα激活剂非常接近。并非LXRα激活剂的氧固醇不能产生本发明的有利结果，尽管在结构上相似。另外，作为本发明对象的许多激活剂以前也不知道可用作外用表皮药物。
这三类激活剂新发现的活性使得它们可用于治疗患屏障功能缺失或紊乱的哺乳动物皮肤。本发明特别可用来治疗早产婴儿，尤其是胎龄少于33周的那些婴儿。本发明还可用来改善表皮分化和增生。用途包括黑色素瘤和非黑色素瘤皮肤癌和皮肤初癌、表皮分化和增生疾病，如伴随或不伴随屏障功能异常的牛皮癣、变应性皮炎和各类鱼鳞癣；良性肿瘤，如疣、湿疣和皮脂溢性角化病。
本发明的其它特征和优点可从下列描述中明显看出。
                          附图简述
图1的条形图显示了6种化合物的经表皮失水(TEWL)试验的结果，其中两种在本发明的范围内。
图2的条形图显示了另5种化合物的TEWL试验结果，其中三种在本发明的范围内。
图3的条形图显示了另7种化合物的TEWL试验的结果，其中一种在本发明的范围内。
图4a是本发明范围内2种化合物的TEWL对活性组分浓度的曲线。
图4b是本发明范围内第3种化合物的TEWL对活性组分浓度的曲线。
图4c是本发明范围内第4种和第5种化合物的TEWL对活性组分浓度的曲线。
图5a的条形图显示了本发明范围内两种化合物在亚最适浓度下单独或组合时的TEWL测试结果。
图5b的条形图显示了图5a的相同两种化合物单独或组合时的TEWL测试结果，只是化合物处于最适浓度。
图6a的条形图显示了用氯贝特处理过的细胞培养物中的外皮蛋白(involucrin)mRNA水平。图6b的条形图显示了用氯贝特处理过的细胞培养物中转谷氨酰胺酶mRNA的水平。
图7a的条形图进一步显示了用氯贝特处理过的细胞培养物中的外皮蛋白mRNA水平。图7b的条形图进一步显示了氯贝特处理过的细胞培养物中的转谷氨酰胺酶mRNA的水平。图7a和7b的培养基中的钙离子水平高于图6a和6b。
图8的条形图显示了用不同剂量的氯贝特处理过的细胞培养物中外皮蛋白和转谷氨酰胺酶mRNA的水平。
图9a的条形图显示了用不同剂量的氯贝特处理过的细胞培养物中的外皮蛋白水平。图9b的条形图进一步显示了从钙含量较高的培养基获得的类似的数据。
图10的条形图显示了用不同剂量的金合欢醇处理过的细胞培养物中的外皮蛋白水平。
图11的条形图显示了用不同剂量的幼激素III型处理过的细胞培养物中的外皮蛋白水平。
图12的条形图显示了用不同剂量的金合欢醇和幼激素III型处理过的细胞培养物中角质化包膜形成速度的增加水平。
图13的条形图显示了用不同剂量的金合欢醇和幼激素III型处理过的细胞培养物中DNA含量的降低程度。
图14a的条形图显示了用两种LXRα激活剂以及两种相关化合物(作为对照)处理过的细胞培养物中的外皮蛋白和转谷氨酰胺酶的mRNA水平。图14b的条形图显示了类似的数据，并与另一相关化合物作了比较。
图15的条形图显示了外皮蛋白和转谷氨酰胺酶mRNA水平与LXRα激活剂剂量的相互关系。
图16的条形图显示了类似于图14a和14b的结果，只是采用钙含量较高的细胞培养物。
图17a的条形图显示了用两种LXRα激活剂处理过的细胞培养物以及一种用胆固醇处理过的细胞培养物(用作对照)中的外皮蛋白和转谷氨酰胺酶蛋白水平。图17b的条形图显示了在高钙浓度下转谷氨酰胺酶蛋白水平与一种LXRα激活剂剂量间的关系。图17c的条形图显示了在高钙浓度下用两种LXRα激活剂处理过的和用胆固醇处理过的细胞培养物中的外皮蛋白蛋白水平。
图18a的条形图显示了经两种LXRα激活剂处理过的低钙细胞培养物以及用胆固醇处理过的低钙细胞培养物(作为对照)中的角质化包膜形成。图18b的条形图显示了在高钙细胞培养物中的类似结果。
图19的条形图显示了用两种LXRα激活剂处理过的和用胆固醇(作为对照)处理过的低钙细胞培养物中的DNA合成速度。
                    发明及较佳实施例详述
类金合欢醇X-激活的受体(FXR)、过氧化物酶体增生体-激活的受体α(PPARα)以及受体LXRα是约150种蛋白的超家族中的成员，它们应答激素激活剂或配体而与其靶基因中启动子的顺式作用元件结合并调节基因表达。这些受体中有许多受体的激活剂是已知的，而其它称为“孤儿受体(orphan receptor)”的受体的激活剂却是未知的。这些受体中有一些以二聚体形式与其靶基因结合，二聚体由相同受体的两分子组成(均二聚体)，而其它受体结合的二聚体形式由两种不同受体的一个分子组成(异二聚体)。后者中突出的特点是核受体需要与类视黄醇X受体异二聚化，如Yu，V.C.，等所报道的″RXBβ：一种增强视黄酸、甲状腺激素和维生素D受体与其同源响应元件结合的共同调节剂，″Cell 67：1251-1266(1991)。该组成员包括维生素D受体、甲状腺激素受体(T3R)、视黄酸受体(RAR)、类金合欢醇X-激活的受体(FXR)、过氧化物酶体增生体-激活的受体(PPAR)和LXRα。
Forman及其共同工作人员Forman，B.B.在″金合欢醇代谢激活的核受体的鉴定″Cell 81：687-693(1995)中首次报道了类金合欢醇X-激活的受体(FXR)。该受体是相对分子量(Mr)约为54,000的蛋白，它是由胞内代谢产物调控的脊椎动物转录因子。受体由某些类金合欢醇激活，即金合欢醇本身和从其衍生出来的化合物，和/或结构与金合欢醇相似的化合物。这些类金合欢醇包括金合欢醇、金合欢醛、乙酸金合欢酯、金合欢酸、香叶基香叶醇和幼激素III型。金合欢醇的化学名为3，7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯醇，幼激素III型的化学名为7-甲基-9-(3，3-二甲基环氧乙烷基)-3-甲基-2，6-壬二烯酸甲基酯。不激活FXR的类金合欢醇和代谢产物是香叶醇、鲨烯、美索平(methoprene)、甲瓦龙酸、氧化鲨烯、二氧化鲨烯、羊毛甾醇、24，25-环氧胆固醇、孕烯醇酮(pregnenalone)、脱氢表雄酮、胆汁酸和25-羟基胆固醇。特别感兴趣的FXR激活剂是金合欢醇(后面称为反式，反式-金合欢醇)、金合欢醛、甲基金合欢基醚、乙基金合欢基醚、金合欢酸甲酯、金合欢酸乙酯、7-甲基-9-(3，3-二甲基环氧乙烷基)-3-甲基-2，6-壬二烯酸甲酯和7-甲基-9-(3，3-二甲基环氧乙烷基)-3-甲基-2，6-壬二烯酸乙酯。其中较佳的是金合欢醇、金合欢醛、甲基金合欢基醚、金合欢酸甲酯和7-甲基-9-(3，3-二甲基环氧乙烷基)-3-甲基-2，6-壬二烯酸甲酯。特别佳的是金合欢醇和7-甲基-9-(3，3-二甲基环氧乙烷基)-3-甲基-2，6-壬二烯酸甲酯(幼激素III型)。
过氧化物酶体增生体-激活的受体(PPAR)在Schoonjans，K.的综述文章″过氧化物酶体增生体-激活的受体(PPAR)在介导氯贝特类和脂肪酸对基因表达影响中的作用″J.Lipid Res.37：907-925(1996)中有所描述。已经鉴定出PPAR的三种亚型，它们被命名为α、β(或δ)和γ。已经从非洲爪蟾属、人、小鼠和大鼠中克隆出α亚型；从非洲爪蟾属、人和小鼠中克隆出β(或δ)亚型；从非洲爪蟾属、人和仓鼠中克隆出γ亚型。PPAR的模件(modular)结构由6个功能区域组成。一个区域作为DNA结合区域，它含有约66个氨基酸，用两个锌原子来稳定，每个锌原子与四个不变半胱氨酸残基结合。PPARα激活剂中包括氯贝特类(fibrates)、和非短链脂肪酸(＞C10)、长链不饱和单脂肪酸和二羧酸、特别是十二烷二酸。还包括氯贝特类的低级烷基(较佳的是甲基)酯和脂肪酸的低级烷基(较佳的是甲基)酯。氯贝特类包括：
氯贝特(安妥明)：2-(4-氯苯氧基)-2-甲基丙酸乙酯
非诺贝特：2-(4-(4-氯苯甲酰基)苯氧基)-2-甲基丙酸异丙酯
环丙贝特：2-(4-(2，2-二氯环丙基)苯氧基)异丁酸
吉非贝齐：2-(2，4-二甲基苯氧基丙基)-2-甲基丙酸
苯扎贝特：2-(4-(4-氯苯甲酰基氨基乙基)苯氧基)-2-甲基丙酸
在脂肪酸中，有取代的脂肪酸是特别强效的激活剂。特别感兴趣的PPARα激活剂是亚油酸、油酸、5，8，11，14-二十碳四炔酸、(4-氯-6-(2，3-二甲代苯氨基)-2-嘧啶基)硫代乙酸和氯贝特。包括这些和其它PPARα激活剂例子的清单如下：
2，4-二氯苯氧基乙酸
2，4，5-三氯苯氧基乙酸
2-甲基-4-氯苯氧基乙酸
2-苯氧基-2-甲基丙酸乙酯
2-(4-溴苯氧基)-2-甲基丙酸乙酯
2-(4-碘苯氧基)-2-甲基丙酸乙酯
2-(2-氯苯氧基)-2-甲基丙酸乙酯
2-(3-氯苯氧基)-2-甲基丙酸乙酯
2-(4-氯苯氧基)-2-甲基丙酸乙酯
2-(4-(4-氯苯基)苯氧基)-2-甲基丙酸乙酯
2-(4-(4-氯苯甲酰基)苯氧基)-2-甲基丙酸异丙酯
2-(4-(2，2-二氯环丙基)苯氧基)-2-甲基丙酸
2-(4-(4-氯苯甲酰基氨基乙基)苯氧基)-2-甲基丙酸
2-(2，3-二甲基-4-(1，2，3，4-四氢萘-1-基)苯氧基)乙酸
2-(2-甲基-3-乙基-4-(4-氯苄基)苯氧基)乙酸
(4-氯-6-(2，3-二甲代苯氨基)-2-嘧啶基)硫代乙酸
2-((4-氯-6-(2，3-二甲代苯氨基)-2-嘧啶基)硫代乙酰氨基)乙醇
全氟-正-癸酸
己二酸二-(2-乙基己基)酯
磷酸二-(2-乙基己基)酯
癸二酸二-(2-乙基己基)酯
双-(羧甲基硫代)-1，10-癸烷
4-(4-氯苯氧基)丁酸乙酯
2-(2-硝基-5-(2-氯-4-三氟甲基苯氧基)苯甲酰氧基)丙酸乙酯
2-(4-(4-氯苯甲酰基))苯氧基-2-(2-甲基丙酰氨基)乙基磺酸
十四烷基氧乙酸
十四烷基氧丙酸
全氟丁酸
全氟辛酸
十四烷基硫代乙酸
十四烷基丙酸
邻苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯
邻苯二甲酸单-(2-乙基己基)酯
2-乙基己酸
2-丙基己酸
Willy，P.J.，等在″LXR，一种确定突出的类视黄醇响应途径的核受体″Gene&Development 9：1033-1045(Cold Spring Harbor Laboratory Press)中首先描述的LXRα受体，它被命名为LXRα是因为它最初从肝脏中分离出来及其肝-富含表达方式的缘故。LXRα激活剂类都是氧固醇的亚型，包括7α-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、27-羟基胆固醇、4β-羟基胆固醇、24-羟基胆固醇、20(S)-羟基胆固醇、22(R)-羟基胆固醇和20，22-二羟基胆固醇。结构相似但并非LXRα激活剂的化合物包括胆固醇本身以及一些氧固醇(7，25-二羟基胆固醇、17α-羟基胆固醇和22(S)羟基胆固醇(22(R)羟基胆固醇的对映体))。用来取代胆固醇的编号惯例如下：
本说明书中所用术语“激活剂”是指在进行局部施用时能激活指定受体的任何分子物质，不论是物质本身与受体结合，还是物质的代谢物与受体结合。因此，激活剂可以是受体的配体，或可以是代谢变成受体配体的激活剂，即在组织中形成的、为实际配体的代谢物。
在实施本发明时，激活剂可作为药学上可接受进行局部给药的制剂的活性组分来进行给药。这些制剂可能含有或不含载体，但是最好采用载体。较佳的载体是非脂类载体，尤其是能与水混溶的液体或液体混合物。例子是甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、丙二醇和丁二醇，以及这些化合物的两种或多种的混合物。
载体中活性组分的浓度通常约为10-1000μM，但是对于某些活性组分来说，浓度可在该范围外。在含有金合欢醇作为活性组分的制剂中，较佳的浓度约为10-100μM。在含有幼激素III型作为活性组分的制剂中，较佳的浓度约为10-200μM。在含有氯贝特作为活性组分的制剂中，较佳的浓度约为100-1000μM。在含有油酸作为活性组分的制剂中，较佳的浓度约为100-1000μM。在含有亚油酸作为活性组分的制剂中，较佳的浓度约为5-50μM。
本发明含有FXR或PPARα激活剂的外用制剂可为皮肤和/或粘膜提供有益的效果。激活剂可以配制成洗液、溶液、凝胶、乳膏、软膏、油膏、喷雾剂或可进行表面施药的其它任何形式。制剂还可含有一种或多种促进制剂在受影响区域分散、但没有生物活性的试剂。这些试剂的例子是表面活性剂、致湿剂、润湿剂、乳化剂或推进剂。
本文所指可有效增强屏障发育的量是指在随时间重复施药时能显著缓解破坏性或功能紊乱性表皮渗透性屏障症状的量。在任何给定的情况下，最适量对于本领域技术人员来说均是显而易见的，或可通过常规试验来确定。
可通过实施本发明来治疗的皮肤病的例子是：
胎龄少于33周的早产婴儿的皮肤；
特应性皮炎和皮脂溢性皮炎；
粘膜发炎，如唇炎、唇裂、鼻过敏和外阴阴道炎；
变应性或刺激性接触引起的湿疹性皮炎、湿疹开裂、辐射性皮炎和停滞性皮炎；
由于化学性或热烧伤、大泡性疾病或血管损害或局部缺血引起的溃疡和糜烂，包括静脉、动脉、栓塞性或糖尿病溃疡；
伴随或不伴随屏障功能异常的鱼鳞癣；
大泡型表皮松懈；
牛皮癣；
肥大性疤痕和瘢痕疙瘩；
体内老化和/或皮肤日射病(dermatoheliosus)；
机械摩擦性水疱；
皮质醇萎缩；和
黑色素瘤和非黑色素瘤皮肤癌，包括木质素黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、光化性角化病和病毒诱导的瘤形成(疣和尖端湿疣)。
最优的方法和给药频率对于本领域技术人员来说是显而易见的，或可通过常规试验来确定。在大多数情况下，在受影响区域或打算实现所需效果的区域上外用一薄层就可获得有效的结果。根据待处理的病征、病情阶段或程度以及不论施用目的是治疗还是预防，采用每2-3天一次至每天四次或更多的施药频率可获得有效的结果。
本发明通常用于治疗陆生哺乳动物的皮肤，这些动物包括，例如，人、家庭宠物、牲畜和其它农场动物。
为了便于描述，提供了下列实施例，这些实施例并非限定了本发明。这些实施例以及整个说明书中提到的所有文献均出于法律目的纳入本文作参考。
实施例1至11的材料和方法
A.器官培养模型和屏障功能测定
从Simonsen(Gilory，California，USA)获得定时(timed)怀孕的Sprague-Dawley大鼠(塞入日为第0天)，在第17天早产胎儿。在培养不同时间后测定胎儿大鼠体侧割下的全厚度皮肤的经表皮失水(TEWL)。将皮肤分离块真皮朝下放在培养基M-99(无血清)中的胶原膜插入物(孔径为3μ)上，浸没、用凡士林密封侧边和真皮表面，这样便只经表皮面上失水。在环境温度(24±3℃)和湿度(40±5℃)下，在6小时内用Cahn天平(灵敏度为0.001mg)每小时对分离块称重。TEWL水平记录成每平方毫米表皮每小时的失水毫克数。
这些实施例中所用的化合物如下：金合欢醇                              幼激素III型                          
Figure A9880290100142
亚油酸                               
Figure A9880290100143
油酸                                 
Figure A9880290100144
氯贝特                               
Figure A9880290100145
WY14,643(匹立尼酸)                    5，8，11，14-二十碳四炔酸(ETYA)      
Figure A9880290100147
托利他腙(troglitazone)                视黄酸                                 
Figure A9880290100151
9-顺式视黄酸                            1，25-二羟基维生素D                    
Figure A9880290100153
前列腺素J2                             
Figure A9880290100154
橙花叔醇                               
Figure A9880290100155
香叶基香叶醇                           
Figure A9880290100156
顺式，反式-金合欢醇                     胆固醇                                
Figure A9880290100161
25-羟基胆固醇                         
Figure A9880290100162
22(R)-羟基胆固醇                       22(S)-羟基胆固醇                      
Figure A9880290100164
鲨烯                                   甲羟戊酸                              
Figure A9880290100166
前列腺素J2购自Cayman Chemical Company(Ann Arbor，Michigan，USA)。托利他腙购自Parke-Davis Laboraories(Detroit，Michigan，USA)。化合物(4-氯-6-(2，3-二甲代苯氨基)-2-嘧啶基)硫代乙酸(也称为pirinixic acid和WY 14,643)购自WyethLaboratories(Philadelphia，Pennsylvania，USA)。化合物顺式-金合欢醇、橙花叔醇和香叶基香叶醇购自University of California，Los Angeles，California，USA。其它所有化合物购自Sigma Chemical Company(St.Louis，Missouri，USA)。
在必须含有0.5％(重量/体积)牛血清白蛋白(BSA)的培养基中加入脂肪酸和氯贝特(p-氯苯氧基异丁酸)。在乙醇中加入类异戊二烯和氧固醇(≤0.1％)，幼激素III型以二甲基亚砜(DMSO)溶液(≤0.1％)形式加入。在合适的载体(≤0.1％DMSO或乙醇，和/或≤0.5％BSA)存在下培养对照移出物。
B.光学和电子显微镜检查
将光学显微镜检查用样品固定在改进的Karnovsky溶液中，用塑料包埋，用甲苯胺对0.5μm切片染色。将电子显微镜检查用样品切成1mm3小片，固定在改进的Karnovsky固定剂中并加工。用乙酸双氧铀和柠檬酸铅对切片染色，然后固定在四氧化钌中，用Zeiss 10A电子显微镜检查。
C.酶测定试验的组织制备
在10mM乙二胺四乙酸(EDTA)的无钙镁磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)(pH7.4)中37℃培养30-40分钟后，从真皮中分离出表皮。然后将组织切碎，在冰上匀化(用Polytron匀化器匀化三次，每次15秒，然后超声破碎两次，每次以35％功率破碎10秒)，匀化在含0.1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)和0.1％Triton X-100(用于β-葡糖脑苷脂酶)的PBS中，或在含0.15M蔗糖和2mM EDTA(用于类固醇硫酸酯酶)的10mM Tris(pH7.5)中进行。在10000×g下4℃离心15分钟后，测定上清液中的β-葡糖脑苷脂酶活性。用10000×g离心(4℃，10分钟)、然后以100000×g4℃超离心60分钟获得微粒体级分，测定级分中的类固醇硫酸酯酶活性。用常规技术测定蛋白含量。
D.β-葡糖脑苷脂酶和类固醇硫酸酯酶活性
用合成的底物4-甲基-繖形基β-D-葡糖苷(4-MUG)测定β-葡糖脑苷脂酶活性。测定试验在37℃、含5mM牛磺胆酸钠和0.5mM 4-MUG的柠檬酸-磷酸缓冲液(pH5.6)中进行60分钟，最终测定体积为100μl，蛋白浓度为1-2毫克/毫升。用2毫升碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH10.5)终止反应。然后测定360λ(激发)和450λ(发射)下的荧光，并和4-甲基繖形酮(4-MU)标准曲线比较。
类固醇硫酸酯酶活性这样测得，将100μg微粒体蛋白培养在含5.6mM葡萄糖(pH7.4)和15μM(3H)二氢表雄酮硫酸酯(DHEAS)(15μCi)的0.1M Tris中，最终体积为1.1毫升。用苯萃取产物(3H)DHEA，用闪烁分光光度计对等份计数。
E.数据分析
用一位t-测试进行数据分析。
                         实施例1
本实施例的试验证明并非所有的RXR激活剂异二聚体均能促进屏障发育。采用了三种特定受体—类视黄醇受体、维生素D受体和过氧化物酶体增生体-激活的受体γ(PPARγ)—的激活剂，结果证明为阴性。
以前的研究已经表明，胎龄17天的大鼠的全厚度皮肤在培养2天后在颗粒细胞中表现出层状体，在角质层间隙分泌出层状物，但是象在子宫内的19天大鼠一样，表皮缺乏成熟的层状膜结构和有能力的屏障。Hanley，K.，等，″表皮屏障个体发育：在无血清培养基中成熟和通过糖皮质激素和甲状腺激素而非选定生长因子来促进″，J.Invest.Dermatol.106：404-411(1996)。与此对比，屏障功能等价于成熟表皮中所见功能的角质层通常通过培养形成不迟于4天，对应于在子宫内的第21天。Hanley等.(1996)。
在各种不同激活剂或载体存在下培养胎龄17天的大鼠皮肤移出物，在两天后测定经表皮失水。它们采用的激活剂和浓度如下：
9-顺式-视黄酸：类视黄醇X受体(RXR)的激活剂；浓度为1μM
所有反式视黄酸：视黄酸受体(RAR)的激活剂；浓度为1μM
1，25-二羟维生素D3：维生素D受体的激活剂；浓度为1μM
前列腺素J2：PPARγ的激活剂；浓度为10μM
经表皮失水(TEWL)的结果以条形图形式显示在图1上方四个条中，它们与对照(图中最下方的条)比较的结果表明这四种激活剂均没有减少TEWL从而促进屏障发育的显著效果。
在进一步的测试中(结果未显示在图1中)，测试前三种激活剂在1nM-1μM浓度范围内对屏障发育速度的影响。在该范围内任何测试浓度下均未见效果。
这些数据表明，类视黄醇受体、维生素D受体和PPARγ的激活剂不能促进胎儿屏障发育。
                           实施例2
本实施例报道的实验证明了PPARα的激活剂促进了屏障发育，而其它PPAR亚型的激活剂却不能。
PPARα激活剂的一个例子是亚油酸，图1显示了移出物在300μM亚油酸中培育2天后的TEWL值。与实施例1中讨论的四种无效的激活剂以及对照组相反，亚油酸显著地减少了TEWL(p＜0.005，n＝8)(均显示在图1中)。
目前已知的三种PPAR亚型是PPARα、PPARδ和PPARγ。这些亚型在药理上是不同的，并且独特地由不同试剂激活。Yu，V.C.等，″RXRβ：一种增强视黄酸、甲状腺激素和维生素D受体与其同源响应元件结合的共同调节剂，″Cell67：1251-1266(1991)。为了确定屏障发育的促进是否是PPARα特异性提供的，测试了下列各种PPAR激活剂：
油酸：PPARα的激活剂，怀疑它也是PPARδ的激活剂，测试浓度为300μM
ETYA：PPARα的激活剂，怀疑它也是PPARδ的激活剂，测试浓度为100μM
WY14,643：仅仅是PPARα的激活剂，测试浓度为100μM
氯贝特：仅仅是PPARα的激活剂，测试浓度为300μM
托利他腙：仅仅是PPARγ的激活剂，测试浓度为10μM
与该研究有关的是前列腺素J2(它只是PPARγ的激活剂)的测试结果，它显示在图1中。
上面列出的5种激活剂的结果显示在图2的条形图中，图2还包括两个对照。包括只能激活PPARα的那些激活剂在内的所有PPARα激活剂均表现出明显的正效应，而PPARγ激活剂托利他腙没有效果(象图1所示PPARγ激活剂前列腺素J2一样)。这些结果表明，PPARα的激活剂促进屏障发育，而仅仅激活PPARγ的激活剂不能促进屏障发育。
                          实施例3
本实施例报道的实验证明金合欢醇X-激活的受体(FXR)的激活剂促进了屏障发育，而结构与金合欢醇、金合欢醇代谢物、金合欢醇代谢前体或金合欢醇代谢前体的其它代谢物相似的其它化合物不会促进屏障发育。
再次参看图1，金合欢醇被包括在条形图中，它显示了在50μM金合欢醇中培养2天的TEWL值。与实施例1中讨论的四种无效激活剂和对照相反，金合欢醇显著的减少了TEWL(p＜0.005，n＝8)，程度与亚油酸类似。
为了确定金合欢醇对屏障发育的作用是否是由FXR介导的，测试描述方式与金合欢醇相关或已知可激活FXR的其它一些化合物的TEWL。金合欢醇通过多步代谢合成从乙酰辅酶A产生，一个关键的中间产物是甲羟戊酸。作为途径的一部分，甲羟戊酸在一个速率限制步骤中被转变成异戊烯焦磷酸，而异戊烯焦磷酸则通过一系列反应转变成金合欢基焦磷酸。后者直接转变成金合欢醇，但是也能根据不同的途径合成化合物如胆固醇、辅酶Q、多萜醇、类胡萝卜素、维生素D、胆汁酸和类固醇激素。而金合欢醇途径则又形成类金合欢醇代谢物，如金合欢醛、金合欢酸、金合欢酸甲酯和幼激素III型。
因此该组实验包括对甲羟戊酸(200μM)、幼激素III型(100μM)、25-羟基胆固醇(50μM)以及橙花叔醇(100μM)、香叶基香叶醇(50μM)、顺式-金合欢醇(50μM)和鲨烯(50μM)进行测试，因为后四种化合物和金合欢醇之间结构相似。
这些测试的结果显示在图3的条形图中，结果表明100μM的幼激素III型显著地促进了屏障形成(p＜0.005，n＝6)。相反，甲羟戊酸(200μM)、25-羟基胆固醇(50μM)、鲨烯(50μM)、香叶基香叶醇(50μM)、顺式-金合欢醇(50μM)和橙花叔醇(100μM)显著影响屏障功能。这些结果表明，金合欢醇和幼激素III型促进屏障功能是由FXR介导的。
                            实施例4
本实施例报道的实验研究了前述实施例中测试的各种PPARα和FXR激活剂的剂量响应。用氯贝特、油酸、亚油酸、金合欢醇和幼激素III进行如上所述的TEWL测试，每一种均有一定的浓度范围。结果显示在图4a(氯贝特和油酸)、4b(亚油酸)和4c(金合欢醇和幼激素III型)中。对于氯贝特和油酸，浓度约500μM时对屏障发育有最大效应，最大效应半值在约250μM处。对于亚油酸，最大效应在约30μM处，最大效应半值在约12.5μM处。金合欢醇显示出最大效应在约50μM处，最大效应半值在约20μM处。幼激素III型显示出最大效应在约250μM处，最大效应半值在约75μM处。
                         实施例5
进行一系列实验以确定RXR和FXR的激活剂或RXR和PPARα的激活剂是否会以协同或叠加方式产生大于单用FXR或PPARα时的激活程度。
在9-顺式-视黄酸中培育移出物，9-顺式-视黄酸首先与氯贝特组合，再与金合欢醇组合，然后再与两者组合，然后测定TEWL。9-顺式-视黄酸的测试浓度为1μM，而氯贝特和金合欢醇均在上述实施例4中测得的次优浓度(即氯贝特100μM，金合欢醇10μM)下进行测试。未发现组合对功能或表皮形态成熟有影响。
然后，进行实验以测定PPARα激活剂和FXR激活剂的组合是否产生了协同或叠加的结果。第一组实验采用这两种激活剂的次优浓度(氯贝特100μM，金合欢醇10μM)。结果显示在图5a的条形图中，并与对照(没有激活剂存在)比较。标记为“Clo”的条显示的氯贝特TEWL值与图4a中相同浓度下的数据点相同，而图5a中标记为“Farn”的条显示的金合欢醇TEWL值与图4c中相同浓度下的数据点相同。两种激活剂组合的TEWL值用图5a中标记为“Clo+Farn”的条表示，它显示屏障发育得到显著地促进，这表明氯贝特和金合欢醇有叠加效果。
在第二组实验中(结果显示在图5b中)，采用图4a和4c测得的金合欢醇和氯贝特的最大浓度。在图5b中，氯贝特的TEWL值用标记为“Clo”的条表示，它与图4a中最大有效浓度时的数值相同，而金合欢醇的TEWL值用标记为“Farn”的条表示，它与图4c这最大有效浓度下的数值相同。两种激活剂在其最大有效浓度下的组合的TEWL值用图5中标记为“Clo+Farn”的条表示，它表明与单用两种激活剂的数值相比，屏障发育没有得到进一步的促进。
氯贝特和金合欢醇在次优剂量下有叠加效果表明了相似的朝向屏障发育的激活途径。通过组合最大有效浓度下的两种激活剂没有增效作用可进一步说明这一点。9-顺式-视黄酸和氯贝特或金合欢醇之间没有增效作用表明或是朝向屏障发育的途径与RXR无关，或是存在了足够的内源RXR激活剂。
                          实施例6
本实施例试图测定在光学显微镜和电子显微镜水平下PPARα和FXR激活剂的效应与表皮成熟之间的关系。
用光学显微镜检测培养在各种培养基中的移出物。培养用培养基包括对照培养基(不含激活剂)和单独含300μM氯贝特、100μM幼激素III型、300μM油酸、30μM亚油酸、50μM金合欢醇、各种浓度的9-顺式-视黄酸、全反式-视黄酸和1，25-二羟基维生素D3的各种培养基。
对照移出物的表皮的光学显微检查结果表明这些移出物既没有明显的颗粒层，又没有明显的角质层。相反，在含有氯贝特的培养基、含有幼激素III型的培养基、含有油酸的培养基、含有亚油酸的培养基以及含有金合欢醇的培养基中培养48小时的移出物均具有多层颗粒层和角质层。培养在含视黄酸(9-顺式和所有反式)培养基中的移出物和培养在含1，25-二羟基维生素D3的培养基中的移出物没有显示出明显的角质层，且在形态上不能和对照区分开来。
对移出物外侧表皮的超结构成熟进行观察，该移出物已在各种培养基中培育过，然后固定在四氧化钌中。采用与上文所述相同的培养基，不包括含视黄酸和含1，25-二羟基维生素D3的培养基。用所有含FXR和PPARα激活剂的培养基处理过的移出物均显示出有成熟层状膜单元结构的多层排列填充在角质层细胞外区域中。在对照、维生素D3、全反式-视黄酸、9-顺式-视黄酸培养物中，单层角质层中的细胞外层均没有组织形成成熟的层状膜单元结构。
这些结果表明，屏障的功能性发育的刺激与促进表皮分层和分化以及角质层中更迅速地出现成熟层状单元结构相伴随。
                         实施例7
本实施例研究了PPARα和FXR激活剂对某些酶表达的影响，这些酶的活性在形成屏障时有所增加。在本领域中已经知道，在大鼠子宫内和在体外，表皮β-葡糖脑苷脂酶活性在角质层和屏障发育时有所增加，抑制该酶会阻止正常的屏障形成，且该酶是屏障体内平衡(成年人体内屏障功能)所需的。也已知道，促进表皮屏障形成的激素增加了胎儿皮肤移出物中的β-葡糖脑苷脂酶活性。也已知道，在屏障形成时，类固醇硫酸酯酶活性有所增加，并且也是受促进屏障形成激素的刺激。因此，选择β-葡糖脑苷脂酶和类固醇硫酸酯酶作为本项研究的酶。
使17天胎龄大鼠的皮肤移出物在单独含氯贝特(300μM)和幼激素III型(100μM)的培养基以及对照培养基中培育24至48小时。测定酶活性，结果在表I中表示成5次测定的平均值±SEM(平均值的标准误差)。与同一期间的对照相比，p值均≤0.005。
                             表I
                            酶活性
                                         活性
                    β-葡糖脑苷脂酶               类固醇硫酸酯酶
                    (nmol/min/mg)                 (pmol/h/mg)24小时培育：
载体                 1.35±0.22                    5.99±0.80氯贝特                 2.97±0.30                    13.90±1.10幼激素III型              2.89±0.20                    12.55±1.2548小时培育：
载体                 3.02±0.45                    8.75±0.91氯贝特                 5.35±0.89                    22.51±2.60幼激素III型              5.20±0.62                    18.23±2.35
该表中的数据表明，在24和48小时后经处理的移出物中β-葡糖脑苷脂酶活性比对照中的活性高约2倍，而类固醇硫酸酯酶活性在24小时后比对照增加了1.6倍，在48小时后增加了2.5倍。这些数据表明，伴随合格的屏障形成，氯贝特和幼激素III型促进了两种脂类代谢酶的活性。
                           实施例8
本实施例描述了PPARα激活剂诱导角质细胞分化，该分化是成熟的表皮屏障发育过程的一部分。以外皮蛋白和转谷氨酰胺酶(及其mRNA)作为分化的指示剂进行测定，这两种蛋白是角质层细胞角部位(corneosites)外骨骼的组分。测试的PPARα激活剂是氯贝特。
将人角质细胞培育在含0.03mM Ca++(低得不能诱导分化的水平)的培养基中。培养基中还包括400μM的氯贝特或10μM和20μM的ETYA，而没有氯贝特和ETYA的另一细胞培养基作为对照。在48小时内以不同间隔(在0、6、12、24和48小时时)用Northern印迹分析测定外皮蛋白和转谷氨酰胺酶mRNA的产生情况。外皮蛋白的结果显示在图6a中，而转谷氨酰胺酶的结果显示在图6b中。在每一种情况中，较浅的条代表对照细胞，较深的条代表培养在含氯贝特培养基中的细胞。mRNA的产生程度用0小时时对照组的百分数表示。图中数据表明，经氯贝特处理过的细胞表现出从第6小时起外皮蛋白水平显著提高，从第12小时起转谷氨酰胺酶水平显著提高。ETYA也获得了类似的结果。
然后重复实验，只是培养基中钙浓度为1.2mMCa++，该浓度高得足以由其自身来诱导分化。外皮蛋白的结果显示在图7a中，转谷氨酰胺酶的结果显示在图7b中。同样，在这些图中，较浅的条代表对照细胞，较深的条代表培养在含氯贝特培养基中的细胞，mRNA产生的程度表示成第0小时时对照的百分数。在对照细胞中，外皮蛋白mRNA水平在24小时时增加到最大值，然后在48小时内下降，而转谷氨酰胺酶在前24小时上升，然后保持水平或以较小的速度增加。经氯贝特处理过的细胞表现出在所有时间点外皮蛋白和转谷氨酰胺酶的mRNA水平比对照均有所增加。ETYA获得了类似的结果。
用含有不同浓度(0(仅含载体)-400μM)氯贝特和0.03mM或1.2mMCa++的培养基进行一系列24小时的培育，测定两种mRNA水平与氯贝特剂量间的相互关系。图8中显示了外皮蛋白和转谷氨酰胺酶mRNA水平的结果，其中mRNA的产生水平表示成第0小时各自测定值的百分数。图中显示出每种蛋白的mRNA水平随着该范围内剂量的增加而增加。
用Western印迹法测定培养基中外皮蛋白本身的水平。在含有浓度范围为0(仅含载体)-400μM的氯贝特以及0.03mM和1.2mM钙离子的培养基中进行各种培育。在0.03mM钙离子下测试的结果显示在图9a中，在1.2mM钙离子下测试的结果显示在图9b中。在这些图中，蛋白含量表示成培育相同时间但没有氯贝特的培养基各自测定值的百分数。在两种钙含量下，发现蛋白含量均随着氯贝特浓度在该范围内的增加而显著增加。这些数据结合起来证明了PPARα激活剂对于表皮分化的蛋白标志物的表达有很大影响。
                          实施例9
本实施例证明了FXR激活剂可使角质细胞分化增加。这是表皮分化关键蛋白标志物表达水平提高的一个指征。采用的激活剂是金合欢醇和幼激素III型。
按照实施例8的步骤进行，测定在含不同浓度(0(仅含载体)-15μM)金合欢醇和幼激素III型以及0.03mM和1.2mM钙离子的培养基中培育24小时的细胞的外皮蛋白水平。金合欢醇的结果显示在图10中，幼激素III型的结果显示在图11中(在0.03mM Ca++下)。图中显示出外皮蛋白含量随着金合欢醇浓度在该范围内的增加而大量增加，对于幼激素III型来说也是如此。这些数据表明FXR激活剂提高了表皮分化关键蛋白标志物的表达水平。
                          实施例10
本实施例描述了氯贝特、金合欢醇和幼激素III型对于角质化包膜形成速度的影响(通过将35S掺入不溶于洗涤剂和还原剂的蛋白中来测得)。
在含0.07μMCa++的KGM中将正常的人角质细胞培养至80％铺满。在80％铺满时，将细胞转移到含0.03μMCa++或1.2μMCa++的KGM中，加入不同浓度(0-400μM)的氯贝特。使细胞在添加了35S-甲硫氨酸/半胱氨酸的这些溶液中培育48小时。在测定角质化包膜前2小时(第46小时)加入5μM离子霉素。用磷酸盐缓冲液生理盐水(PBS)清洗细胞，溶解在2％十二烷基硫酸钠中，取等份置于含4％十二烷基硫酸钠/40mM二硫苏糖醇的沸水中30分钟。用0.1％十二烷基硫酸钠/0.1％二硫苏糖醇洗涤不溶于十二烷基硫酸钠的颗粒物，用闪烁计数测定掺入不溶于洗涤剂的角质化包膜中的放射活性。为了在35S标记期间测定合成的总蛋白，在沸腾前使等份细胞裂解液在冰上用10％三氯乙酸沉淀30分钟，用5％三氯乙酸清洗，用闪烁计数定量测定。角质化包膜的百分数计算成百分数cpm/总蛋白cpm×100。
结果显示在表II中，其中结果表示成代表有0.03mM Ca++的对照值的百分数，其中每一项代表两个独立实验的平均值±SEM。对于0.03mM Ca++和200与400μM氯贝特时的数据，以及1.2mM Ca++和400μM组的数据，p值与相应的仅含载体的对照相比，小于0.01。
                        表II
               氯贝特诱导角质化包膜的形成培养基中的钙含量      培养基中的氯贝特含量      角质化包膜的形成
                                               (对照的％)0.03mM                        0                     100.0％±13.90.03mM                        50μM                 121.4％±15.70.03mM                        200μM                321.3％±30.40.03mM                        400μM                386.8％±28.71.2mM                         0                     488.0％±34.11.2mM                         50μM                 458.9％±39.81.2mM                         200μM                529.3％±17.41.2mM                         400μM                581.9％±28.7
表II中的数据表明氯贝特在高钙和低钙培养基中均促进了角质化包膜的形成。
用10μM金合欢醇和15μM幼激素III型单独在低钙浓度(0.03mM)的不同培养基中进行类似的测试。48小时后的结果显示在图12中，结果表明金合欢醇和幼激素III型均使角质化包膜形成的速度显著增加。
                            实施例11
本实施例描述了氯贝特、金合欢醇和幼激素II型对角质细胞生长的影响，结果证明了PPARα和FXR激活剂均能抑制细胞生长和增生。
用不同浓度(范围为0(仅含载体)-400μM)的氯贝特在低钙(0.03mM)和高钙(1.2mM)下处理预先铺满的角质细胞48小时。收获经处理过的角质细胞并超声破碎，所得匀化物用1μL/mL双苯并咪唑于暗处培育2小时。在荧光分光光度计上读取样品来定量测定DNA含量。结果显示在表III中。表中每个值为三份样品的平均值。
                       表III
             氯贝特对角质细胞生长的影响
             氯贝特诱导角质化包膜的形成氯贝特(μM)      48小时后的DNA含量           显著程度
                   (μg/碟)0                      15.5±0.9                --50                     14.9±1.5                不显著200                    12.9±1.1                p＜0.1400                    11.0±1.3                p＜0.01
用10μM金合欢醇和15μM幼激素III型在0.03mM Ca++下培育48小时进行类似的测试。结果显示在图13中。表II和图13组合起来表明PPARα和FXR激活剂能抑制细胞生长。
实施例12至17描述了在本发明所述用途中LXRα的氧固醇激活剂的活性。
实施例12至17的材料和方法
A.细胞培养
用常规技术从新生儿包皮中分离出人表皮，将角质细胞培养在无血清角质细胞生长培养基(“KGM”；Clonetics，San Diego，California USA)中。用载体(含测试化合物)或单独载体(＜0.1％乙醇)处理细胞24小时或48小时。测试化合物购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，Missouri USA)，它以15mM储备溶液-20℃保藏。将甲羟戊酸溶解在无菌水中。
B.RNA分离，Northern印迹和cDNA探针
用TRIZOL(Sigma Chemical Co.)按照生产商说明书分离出总RNA。将乙醇沉淀RNA颗粒悬浮在无菌的、焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水中，测定260nm下的吸光度，用260/280nm之比作为纯度指数来对RNA进行定量测定。RNA(每份样品15μg)通过含2.2M甲醛的1％琼脂糖凝胶进行大小分级。在电泳后对凝胶用吖啶橙染色，就可显示出RNA整体。将RNA转移到尼龙膜上，然后使膜在80℃下烘焙2小时。使印迹与合适的32P标记的探针65℃杂交过夜。然后在含0.1％SSC和0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的溶液中室温下洗涤20分钟，再在65℃下洗涤20分钟。放射自显影在-70℃下进行。用β-肌动蛋白探测印迹以确认相同的加样。用光密度计定量测定合适的条带。
C.外皮蛋白和转谷氨酰胺酶蛋白水平
蛋白浓度用蛋白电泳和Western印迹法测定。使细胞在2％SDS中裂解，对裂解液进行超声处理。用二金鸡宁酸蛋白试验(Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois，USA)测定蛋白。在测定蛋白后，在7.5％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离等量蛋白(50μg)，然后电印迹到聚偏二氟乙烯膜(0.2-μ，购自Bio-Rad Laboratories，Hercules，California USA)上。通过与多克隆家兔抗人外皮蛋白抗体(1∶1000稀释度)一起4℃培育过夜来检测外皮蛋白。用光密度法定量测定放射自显影图上外皮蛋白特异性条带。用类似方式测定转谷氨酰胺酶蛋白的表达，采用的存贮样品和试验用的缓冲液含有4M尿素，在电泳后电印迹前用4M尿素、25mMTRIS-HCl(pH7.4)、7.5mM NaCl、0.1mM二硫苏糖醇(DTT)和2mM乙二胺四乙酸洗涤90分钟，使得转谷氨酰胺酶能被抗体检测。用光密度法定量测定放射自显影图上的特异性条带。
D.角质化包膜的形成
为了测定角质化包膜形成的速度，用35S-甲硫氨酸/半胱氨酸(2μCi/ml；反式35S标记(trans 35S label)，ICN Biomedical，Inc.，Irvine，California USA)标记细胞48小时，最后2小时用5μM离子霉素培育，用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤，收获到1.1毫升的2％SDS中。保留等份进行蛋白测定。对其余的细胞裂解液(1毫升)稍作超声处理(10秒)。然后加入1毫升4％SDS/4mM DTT，将混合物在高于95℃加热30分钟。然后，冷却混合物，将不溶于SDS/DTT的物质收集到滤盘上，用0.5％SDS/0.5％DTT洗涤，再用闪烁分光光度计定量测定。为了测定35S标记的48小时期间合成的总蛋白，用等体积的2％牛血清白蛋白(BSA)和1毫升10％(重量/体积)三氯乙酸(TCA)使细胞裂解液保留等份(在加热前取出)在冰上沉淀30分钟，将35S标记的沉淀蛋白收集到滤膜(孔径为P8，Fisher Scientific，Pittsburgh，Pennsylvania USA)上，用5％TCA洗涤，用闪烁光谱法进行定量测定。用常规方法测定总蛋白。
E.DNA分析
在与每毫升培养基2μCi 3H-胸苷(110Ci/mmol甲基-1′，2′-3H-胸苷(AmershamLaboratories，Arlington Heights，Illinois USA)培育16小时后，测定3H胸苷掺入细胞DNA中的量，从而确定DNA合成的速度。然后，将细胞溶解在1N NaOH中，用闪烁光谱法定量测定TCA洗后沉淀中的放射活性。
F.转染
如下对角质细胞进行转染：在转染前，使初级角质细胞在6孔多孔板上传代1-2天，在转染当天产生20-40％铺满。在最终体积为3.5毫升的培养基(KGM，含0.03mM Ca++)中加入外皮蛋白启动子构建物(1μg)、0.1μg RSV-β-gal和7.5μg1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(双六溴化物，Aldrich ChemicalCompany，Inc.，Milwaukee，Wisconsin USA)，37℃培育角质细胞5小时，每小时轻微摇动。然后用CMF PBS清洗细胞，在含10％甘油的培养基中室温培育3分钟。用CMF PBS清洗两次后，用含0.03mM Ca++的2毫升KGM培育角质细胞过夜。第二天用含10μM测试化合物或(of)载体(乙醇)的新鲜培养基(0.03或1.2mMCa++)处理角质细胞。清洗细胞并收获到250μL细胞裂解缓冲液中。以10,000×g 4℃旋转裂解液2分钟，用萤光素酶底物和β-半乳糖苷酶底物测定20μL上清液。用β-半乳糖苷酶活性标准化数据和校准转染无效率。
                          实施例12
本实施例证明了LXRα的氧固醇激活剂能刺激角质细胞分化(通过外皮蛋白和转谷氨酰胺酶mRNA水平表示)，而胆固醇、甲羟戊酸和22(S)-羟基胆固醇未表现出明显的效果。
在维持低钙(0.03mM)和单独载体(＜0.1％乙醇)、或单独含25-羟基胆固醇(10μM)、22(R)-羟基胆固醇(10μM)、胆固醇(10μM)或甲羟戊酸(500μM)的载体存在下培育24小时的角质细胞上进行Northern印迹分析。外皮蛋白(″INV″)和转谷氨酰胺酶(″TG＇ase″)的mRNA水平显示在图14a的条形图中，空心条表示外皮蛋白，带阴影条表示转谷氨酰胺酶，两者均示出了误差限度。图中显示出25-羟基胆固醇(″25-OH″)和22(R)-羟基胆固醇(″22R-OH″)的mRNA水平均比单用载体时增加约2倍。相反，胆固醇(″chol″)和甲羟戊酸(″mev″)却没有效果。
在相同条件下对22(R)-羟基胆固醇和22(S)-羟基胆固醇(″22S-OH″)进行测试作进一步比较，结果显示在图14b的条形图中，所用的条指示与图14a相同。在22S-OH数据中发现对外皮蛋白或转谷氨酰胺酶没有影响，而22R-OH数据则重复了图14a所发现的结果。
然后，用0、0.1μM、1.0μM、10.0μM和15.0μM的剂量测定22(R)-羟基胆固醇的剂量依赖性。结果显示在图15的条形图中，采用了与图14a和14b中INV和TG′ase mRNA相同的条说明。该图表明在10-15μM的剂量处可发现最大的效应，而约5μM处有最大效应的半值。
                         实施例13
1.2mM的胞外钙浓度能刺激角质细胞分化是众所周知的。本实施例证明了LXRα的氧固醇激活剂能在高钙浓度下进一步刺激角质细胞分化。
重复实施例12的实验，只是将钙浓度升高至1.2mM，测试单用载体以及载体加25-羟基胆固醇(10μM)、加22(R)-羟基胆固醇(10μM)或加胆固醇(10μM)。结果显示在图16的条形图中，采用的条说明与前述图相同。图16的条形图显示出25-羟基胆固醇和22(R)-羟基胆固醇均能诱导INV和TG′ase mRNA水平，INV约比对照高2.3-2.4倍，TG′ase约比对照高2.5-2.9倍，而胆固醇对两者均无效果。另外还测定了β-肌动蛋白mRNA水平，结果(图中未显示)表明这些含量在低钙(0.03mM)或高钙(1.2mM)条件下均不受氧固醇处理的影响。
                         实施例14
本实施例证明LXR的氧固醇激活剂刺激外皮蛋白和转谷氨酰胺酶的蛋白水平，而胆固醇却不能。
在低钙(0.03mM)条件下培育并用测试化合物处理24小时的角质细胞中测定外皮蛋白和转谷氨酰胺酶的蛋白水平。结果显示在图17a的条形图中，其中将测试化合物与单用载体(对照)和胆固醇作比较，采用图14至16相同的条说明。该图表明25-羟基胆固醇诱导出相对于对照而言大约1.7倍的INV水平和大约1.6倍的TG′ase蛋白水平，22(R)-羟基胆固醇诱导出相对于对照而言大约3.2倍的INV水平和大约2.8倍的TG′ase蛋白水平。胆固醇没有影响。
在高钙(1.2mM)条件下进行的测试结果显示在图17b(仅仅是22(R)-羟基胆固醇，有三种剂量水平)和17c(22(R)-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇和胆固醇，剂量均为15μM)中。22(R)-羟基胆固醇在浓度低达5μM时显示出TG′ase蛋白水平增加2.1倍(图17b)。对于INV蛋白，浓度为15μM时，22(R)-羟基胆固醇增加2.8倍，25-羟基胆固醇增加3.2倍，而胆固醇基本上没有增加(图17c)。
                        实施例15
角质细胞分化的另一个指标是角质化包膜形成的速度。用上文材料和方法章节中提到的步骤，在低钙(0.03mM)和高钙(1.2mM)条件下处理48小时，将25-羟基胆固醇(10μM)和22(R)-羟基胆固醇(10μM)与胆固醇(10μM)和单用载体(对照)作比较。结果显示在图18a(低钙)和图18b(高钙)的条形图中。低钙结果(图18a)表明用25-羟基胆固醇处理使角质化包膜(CE)的形成增加1.6倍，用22(R)-羟基胆固醇处理则使其增加1.3倍。高钙结果(图18b)表明用25-羟基胆固醇处理使CE形成增加1.75倍，而用22(R)-羟基胆固醇处理则使其增加2.1倍。胆固醇本身在低钙或高钙条件下均不能使其增加。
                         实施例16
本实施例证明了LXRα的氧固醇激活剂能抑制角质细胞的增生(通过角质细胞DNA合成速度来表示)。已经知道，氧固醇是其它细胞类型(如胸腺细胞和淋巴细胞)中细胞生长的强效抑制剂。
采用上文材料和方法章节中提及的步骤，在低钙(0.03mM)条件下处理24小时，将25-羟基胆固醇(10μM)和22(R)-羟基胆固醇(10μM)与胆固醇(10μM)和单用载体(对照)作比较。结果显示在图19的条形图中。条形图显示出，在测定DNA合成的16小时期间内，25-羟基胆固醇使DNA合成速度减少至对照的50％，22(R)-羟基胆固醇使速度减少至对照的42％。相反，胆固醇适度地但明显地增加了DNA的合成(对照的117％)。
                        实施例17
本实施例研究了氧固醇引起INV和TG′ase mRNA水平的增加是否与这些氧固醇抑制HMG CoA还原酶(该酶是胆固醇合成的速率限制酶，它导致异戊二烯化合物水平降低)有关。为了回答这个问题，在HMG CoA还原酶最早产物甲羟戊酸存在和不存在下，进行类似于实施例12所述的测试。
该测试测定了单用25-羟基胆固醇(10μM)或在甲羟戊酸(10μM)存在下，以及单用甲羟戊酸(10μM)处理24小时的角质细胞中的INV和TG′asse mRNA含量。单用甲羟戊酸处理对INV和TG′ase mRNA水平没有影响。用25-羟基胆固醇处理(单用以及在甲羟戊酸存在时)均使INV和TG′ase mRNA水平增加2倍。结论是HMG CoA还原酶的抑制并不是氧固醇引起INV和TG′ase mRNA水平增加的理论基础。
提供前述内容主要是为了便于描述。本领域技术人员显然能在不脱离本发明精神和范围内对本文所述的浓度、操作条件、材料、步骤和实验方案中的其它参数或过程进行进一步改动或以各种方式代替。

Claims (39)

1.一种治疗患有以表皮屏障功能紊乱为特征的疾病的陆生哺乳动物对象的方法，所述方法包括向所述表皮局部施用外用组合物，该组合物含有一种活性组分，该活性组分选自类金合欢醇X-激活的受体的激活剂、过氧化物酶体增生体-激活的受体α的激活剂和LXRα的氧固醇激活剂，所述活性组分以有效增强屏障发育的浓度存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性组分是类金合欢醇X受体的激活剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述激活剂选自金合欢醇、金合欢醛、甲基金合欢基醚、乙基金合欢基醚、金合欢酸甲酯、金合欢酸乙酯、7-甲基-9-(3，3-二甲基环氧乙烷基)-3-甲基-2，6-壬二烯酸甲酯和7-甲基-9-(3，3-二甲基环氧乙烷基)-3-甲基-2，6-壬二烯酸乙酯。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述激活剂选自金合欢醇、金合欢醛、甲基金合欢基醚、金合欢酸甲酯和7-甲基-9-(3，3-二甲基环氧乙烷基)-3-甲基-2，6-壬二烯酸甲酯。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述激活剂是金合欢醇。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述激活剂是7-甲基-9-(3，3-二甲基环氧乙烷基)-3-甲基-2，6-壬二烯酸甲酯。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性组分是过氧化物酶体增生体-激活的α受体的激活剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述激活剂选自亚油酸、油酸、5，8，11，14-二十碳四炔酸、4-氯-6-(2，3-二甲代苯氨基)-2-嘧啶基)硫代乙酸和氯贝特。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述激活剂是亚油酸。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述激活剂是氯贝特。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性组分是LXRα受体的激活剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述LXRα受体的激活剂选自22(R)-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、7α-羟基胆固醇、24-羟基胆固醇、27-羟基胆固醇、4β-羟基胆固醇、20，22-二羟基胆固醇和20(S)-羟基胆固醇。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述LXRα受体的激活剂是22(R)-羟基胆固醇。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述LXRα受体的激活剂是25-羟基胆固醇。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性组分的浓度为10-1000μM。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性组分是金合欢醇，所述活性组分的浓度为10-100μM。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性组分是7-甲基-9-(3，3-二甲基环氧乙烷基)-3-甲基-2，6-壬二烯酸甲酯，所述活性组分的浓度为10-200μM。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性组分是氯贝特，所述活性组分的浓度为100-1000μM。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性组分是油酸，所述活性组分的浓度为100-1000μM。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性组分是亚油酸，所述活性组分的浓度为5-50μM。
21.一种治疗陆生哺乳动物对象表皮或粘膜的方法，该对象患有分化紊乱或过度增生的疾病，所述方法包括向所述表皮或粘膜表面施用外用组合物，该组合物含有一种活性组分，该活性组分选自类金合欢醇X-激活的受体的激活剂、过氧化物酶体增生体-激活的受体α的激活剂和LXRα的氧固醇激活剂，所述活性组分以有效恢复正常屏障发育的浓度存在。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述活性组分是类金合欢醇X受体的激活剂。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述激活剂选自金合欢醇、金合欢醛、甲基金合欢基醚、乙基金合欢基醚、金合欢酸甲酯、金合欢酸乙酯、7-甲基-9-(3，3-二甲基环氧乙烷基)-3-甲基-2，6-壬二烯酸甲酯和7-甲基-9-(3，3-二甲基环氧乙烷基)-3-甲基-2，6-壬二烯酸乙酯。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述激活剂选自金合欢醇、金合欢醛、甲基金合欢基醚、金合欢酸甲酯和7-甲基-9-(3，3-二甲基环氧乙烷基)-3-甲基-2，6-壬二烯酸甲酯。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述激活剂是金合欢醇。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述激活剂是7-甲基-9-(3，3-二甲基环氧乙烷基)-3-甲基-2，6-壬二烯酸甲酯。
27.根据权利要求21所述的方法，其中所述活性组分是过氧化物酶体增生体-激活的α受体的激活剂。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述激活剂选自亚油酸、油酸、5，8，11，14-二十碳四炔酸、4-氯-6-(2，3-二甲代苯氨基)-2-嘧啶基)硫代乙酸和氯贝特。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述激活剂是亚油酸。
30.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性组分是LXRα受体的激活剂。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述LXRα受体的激活剂选自22(R)-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、7α-羟基胆固醇、24-羟基胆固醇、27-羟基胆固醇、4β-羟基胆固醇、20，22-二羟基胆固醇和20(S)-羟基胆固醇。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述LXRα受体的激活剂是22(R)-羟基胆固醇。
33.根据权利要求27所述的方法，其中所述激活剂是氯贝特。
34.根据权利要求21所述的方法，其中所述活性组分的浓度为10-1000μM。
35.根据权利要求21所述的方法，其中所述活性组分是金合欢醇，所述活性组分的浓度为10-100μM。
36.根据权利要求21所述的方法，其中所述活性组分是7-甲基-9-(3，3-二甲基环氧乙烷基)-3-甲基-2，6-壬二烯酸甲酯，所述活性组分的浓度为10-200μM。
37.根据权利要求21所述的方法，其中所述活性组分是氯贝特，所述活性组分的浓度为100-1000μM。
38.根据权利要求21所述的方法，其中所述活性组分是油酸，所述活性组分的浓度为100-1000μM。
39.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性组分是亚油酸，所述活性组分的浓度为5-50μM。
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