CN1236071C - 高特异性聚合酶链式反应技术鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是利用DNA分子遗传标记技术鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法。设计了一对高特异性鉴别引物，通过高特异性聚合酶链式反应(PCR)技术鉴别中药材乌梢蛇与市场上常见的伪品：滑鼠蛇、黑眉锦蛇、红点锦蛇、王锦蛇、赤链华游蛇、玉斑锦蛇、赤链蛇、灰鼠蛇、眼镜蛇、三索锦蛇。使用此方法鉴别乌梢蛇的真伪，只通过简单的乌梢蛇及其伪品的DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测三步即可完成对药材真伪的鉴别。操作简单、易于掌握、准确性高。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用DNA分子遗传标记技术鉴别中药材乌梢蛇(Zaocys dhumnades)真伪的方法。
背景技术
经过市场调研及有关专家确认可作为中药材乌梢蛇的伪品有滑鼠蛇(Ptyas mucosus)黑眉锦蛇(Elaphe taeniura cope)红点锦蛇(Elaphe refuodorsata)王锦蛇(Elapherefuodorsata)赤链华游蛇(Sinonatrix annula.ris)玉斑锦蛇(Elaphe mandarinus)赤链蛇(Dinodon rufozonatum)灰鼠蛇(Ptyas korros)眼镜蛇(Naja naja)三索锦蛇(Elapheradiata)。目前的现有技术中，药典主要采用性状鉴别：表面黑褐色或绿黑色，密度菱形鳞片；背鳞行数成双，背中央2-4行鳞片强烈起棱，形成两条纵贯全体的黑线。头盘在中间，扁圆形，眼大而下凹陷，有光泽。上唇鳞8枚，第4、5枚入眶，颊鳞1枚，眼前下鳞1枚，较小，眼后鳞2枚。脊部高耸成屋脊状。腹部剖开边缘向内卷曲，脊肌肉厚，黄白色或淡棕色，可见排列整齐的肋骨。尾部渐细而长，尾下鳞双行。剥皮者仅留头尾之皮鳞，中段较光滑。气腥，味淡。依其外部形态、骨骼和鳞片的特征进行性状鉴别，具有一定的主观性，另外，如果外形不完整、有损伤就很难鉴别，同时也要求鉴别者具备相当丰富的鉴别经验。仅根据形态特征来进行鉴别已经不能满足市场的需求。王义权1999年在《药学学报》曾报道用DNA分子遗传标记测序鉴别技术分析乌梢蛇DNA片段的核苷酸序列，已成功地鉴别出乌梢蛇的真伪，但因对DNA进行测序成本较高，操作有一定的难度，所以在药材鉴别中的适用性较差。
发明内容
本发明的任务是设计了一对用于鉴定中药材乌梢蛇的高度特异性引物HWL-1和HWH-1。建立简便准确易于操作的鉴别中药材乌梢蛇真伪的DNA分子遗传标记方法。
本发明首先提取乌梢蛇正品及上述10种非正品(红点锦蛇、玉斑锦蛇、三索锦蛇、灰鼠蛇、黑眉锦蛇、王锦蛇、赤链蛇、赤链华游蛇、眼镜蛇、滑鼠蛇)的DNA，用12S rRNA通用引物(H1478和L1091)PCR反应扩增出12S rRNA的片段，测序，由于12S rRNA片段中含有种内非常保守，种间差异大的序列片段，根据此片段设计了能鉴别乌梢蛇正品的高特异性引物HWH-1(5’-GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA-3’)和HWL-1(5’-CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG-3’)。其方法是：模板DNA的提取：选取无霉变和虫蛀的药材标本肌肉部分约1g，置于研钵中经液氮速冻后研成粉末，将粉末速转移至50ml离心管中，加入6ml已灭菌的匀浆缓冲液(蔗糖0.25mol/L，Tris-Hcl 10mmol/L PH＝8.0，Na2EDTA1mmol/L PH＝8.0)进行混匀，加入蛋白酶K至终浓度为150μg/ml，再加入10％SDS至终浓度为0.8％。55℃水浴中3-4h，其间轻摇数次，取出冰浴至4℃，400g离心5min，取上清液，加入等体积Tris饱和酚抽提，混匀10min，两相成乳状，5000g离心15min，取上层水相，重复一次，再用CHCl3抽提两次.CHCl3抽提离心后取上层水相加入两倍无水乙醇沉淀DNA，-20℃冰箱中过夜.第二天取出，5500g离心15min，沉淀物用70％EtOH洗涤两次，室温挥干EtOH，用适量TE溶解DNA，-20℃备用。PCR扩增：PCR反应体系：30μl含10mmol/l Tris-HCl PH＝8.0，50mmol/lKCl，0.1％Triton X-100，1.5mmol/l MgCl2，1.5mmol/ldNTPs，两种高度特异性鉴别引物HWL-1和HWH-1各10pmol/l，DNA模板约100ng，反应在(PTC-100)基因扩增仪上进行扩增；PCR反应条件循环参数：95℃预变性4min；95℃变性40S，65℃退火1min，72℃延伸30S；10个循环；95℃变性40S，60℃退火1min，72℃延伸30S；15个循环；72℃延伸5min。电泳检测：PCR实验中设置无模板DNA的阴性对照，反应完成后，取5μl反应液经EB染色，1.8％琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像观察，在310bp-320bp范围内处扩增出明亮唯一条带的样品即为正品乌梢蛇，混淆品均应无任何条带出现。本方法操作简单、易于掌握、准确性高。
附图说明
图1：为乌梢蛇及混淆品12srRNA片段扩增(阳性对照)
图2：为乌梢蛇高特异性PCR鉴别
样品编号；1乌梢蛇 2滑鼠蛇 3黑眉锦蛇 4红点锦蛇 5王锦蛇 6赤链华游蛇7玉斑锦蛇 8赤链蛇 9灰鼠蛇 10眼镜蛇 11三索锦蛇 12阴性对照
M：DNAladder(100bp)最亮的条带为500bp，向下依次为400bp、300bp、200bp、
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
1.材料和方法
1.1实验材料实验用中药材乌梢蛇及其混淆品11种共23件标本见表1
表1：Tab1lNumber and source of original of 11 species
| Species | Code | Number | Source |
| 乌梢蛇Zaocys dhumnades | 1 | 3 | 江西樟树、昌北、河北安国 |
| 红点锦蛇Elapherefuodorsata | 2 | 2 | 河北安国、中检所 |
| 玉斑锦蛇Elaphemandarinus | 3 | 2 | 河北安国、中检所 |
| 三索锦蛇Elaphe radiata | 4 | 2 | 河北安国、中检所 |
| 灰鼠蛇Ptyas korros | 5 | 2 | 江西樟树、中检所 |
| 黑眉锦蛇Elaphe taeniuracope | 6 | 2 | 江西樟树、昌北 |
| 王锦蛇Elapherefuodorsata | 7 | 2 | 江西樟树、昌北 |
| 赤链蛇Dinodonrufozonatum | 8 | 3 | 江西樟树、昌北、河北安国 |
| 赤链华游蛇Sinonatrixannula.ris | 9 | 3 | 江西樟树、昌北、河北安国 |
| 眼镜蛇Najanaja(Linnueus) | 10 | 1 | 江西樟树 |
| 滑鼠蛇Ptyas mucosus | 11 | 1 | 中检所 |
1.2实验仪器
台式高速离心机(Eppendorf公司)、PTC-100基因扩增仪、电泳仪、紫外凝胶成像分析仪。
1.3方法
模板DNA的提取选取无霉变和虫蛀的药材标本肌肉部分约1g，置于研钵中经液氮速冻后研成粉末，将粉末速转移至50ml离心管中，加入6ml已灭菌的匀浆缓冲液(蔗糖0.25mol/L，Tris-Hcl 10mol/L PH＝8.0，Na2EDTA 1mmol/L PH＝8.0)进行混匀，加入蛋白酶K至终浓度为150μg/ml，再加入10％SDS至终浓度为0.8％。55℃水浴中3-4h，其间轻摇数次，取出冰浴至4℃，400g离心5min，取上清液，加入等体积Tris饱和酚抽提，混匀10min，两相成乳状，5000g离心15min，取上层水相，重复一次，再用CHCl3抽提两次.CHCl3抽提离心后取上层水相加入两倍无水乙醇沉淀DNA，-20℃冰箱中过夜.第二天取出，5500g离心15min，沉淀物用70％EtOH洗涤两次，室温挥干EtOH，用适量TE溶解DNA，-20℃备用.
2.PCR引物及反应条件
PCR反应体系30μl含10mmol/l Tris-HCl PH＝8.0，50mmol/l KCl，0.1％Triton X-100，1.5mmol/l MgCl2，1.5mmol/ldNTPs，两种高度特异性鉴别引物(HWL-1和HWH-1)各10pmol/l，DNA模板约100ng，反应在(PTC-100)基因扩增仪上进行扩增．
循环参数：95℃预变性4min；95℃变性40S，65℃退火1min，72℃延伸30S；10个循环；95℃变性40S，60℃退火1min，72℃延伸30S；15个循环；72℃延伸5min。
PGR实验中设置无模板DNA的阴性对照，反应完成取5μl反应液经EB染色，1.8％琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像观察.
3结果
在约320bp处扩增出明亮唯一条带的样品即为正品乌梢蛇。混淆品均应无任何条带出现。
用12srRNA通用引物(L1091和H1478)进行扩增的阳性对照，均应在约430bp处出现明亮的单一扩增条带。
Claims (1)
1.一种高特异性聚合酶链式反应(PCR)技术鉴别真伪乌梢蛇的方法，其特征在于包括DNA模板提取、PCR扩增、电泳检测三个步骤；①模板DNA的提取：选取无霉变和虫蛀的药材肌肉部分1g，置于研钵中经液氮速冻后研成粉末，将粉末速转移至50mL离心管中，加入6mL已灭菌的匀浆缓冲液，匀浆缓冲液由蔗糖0.25mol/L，Tris-Hcl 10mmol/L PH＝8.0，Na2EDTA1mmol/L PH＝8.0组成，加入蛋白酶K至终浓度为150μg/mL，再加入10％SDS至终浓度为0.8％；55℃水浴3-4小时，其间轻摇数次，取出冰浴至4℃，400g离心5分钟，取上清液，加入等体积Tris饱和酚抽提，混匀10分钟，两相成乳状，5000g离心15分钟，取上层水相，重复一次，再用CHCl3抽提两次，CHCl3抽提离心后取上层水相加入两倍无水乙醇沉淀DNA，-20℃冰箱中过夜；第二天取出，5500g离心15分钟，沉淀物用70％乙醇洗涤两次，室温挥干乙醇，用适量TE溶解DNA，-20℃备用；②PCR扩增：PCR反应体系30μl含10mmol/l Tris-HCl PH＝8.0，50mmol/l KCl，0.1％Triton X-100，1.5mmol/l MgCl2，1.5mmol/1dNTPs，两种高度特异性鉴别引物HWL-1即5’-GCGAAAG-CTCGACCTAGCAAGGGGACCACA-3’和HWH-1即5’-CAGGCTCCTCTA-GGTTGTTATGGGGTACCG-3’，各10pmol/L，DNA模板约100ng，反应在PTC-100基因扩增仪上进行扩增；循环参数：95℃预变性4分钟；95℃变性40秒，65℃退火1分钟，72℃延伸30秒；10个循环；95℃变性40秒，60℃退火1分钟，72℃延伸30秒；15个循环；72℃延伸5分钟；③电泳检测：PCR实验中设置无模板DNA的阴性对照，反应完成后，取5μL反应液经溴化乙锭染色，1.8％琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像观察，在310bp-320bp范围内处扩增出明亮唯一条带的样品即为正品乌梢蛇，混淆品均应无任何条带出现。
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