CN1232517C

CN1232517C - 杯菊抗癌活性成分及其分离提纯方法

Info

Publication number: CN1232517C
Application number: CN 02128070
Authority: CN
Inventors: 李祖强
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2002-12-19
Filing date: 2002-12-19
Publication date: 2005-12-21
Anticipated expiration: 2022-12-19
Also published as: CN1508134A

Abstract

本发明是杯菊抗癌活性成分及其分离提纯方法。其特征在于抗癌化合物为9β-乙酰基-闭鞘姜内酯(CP-C)，分子式为C₁₇H₂₂O₄和9β-乙酰基-银胶菊内酯(CP-D)，分子式为C₁₇H₂₂O₅。其分离提纯方法是：将杯菊全株干燥粉碎，提取浸膏，得浸膏CP₀；加硅藻土和用乙醇混合水浴上炒干，分别用石油醚、氯仿∶乙酸乙酯＝1∶0～0∶1、乙酸乙酯、丙酮、甲醇依次萃取得5个组分；用L₁₂₁₀细胞分别对5个组分进行细胞毒活性筛选对有抗癌活性的3个组分进行柱层析，得到3个抗癌活性成分。本发明采用的分离提纯方法简易可行，得率高，有独到之处。所得的三个抗癌活性成分(CP-B、CP-C、CP-D)活性较强，超过了国际标准，而且杯菊原料易得(可以人工栽培)，具有开发为抗癌新药的前景。

Description

杯菊抗癌活性成分及其分离提纯方法

技术领域

本发明涉及医用药物技术领域，具体地说是从杯菊植物中提取抗癌活性成分及其分离提纯方法。

背景技术

杯菊是菊科杯菊属植物(Cyathocline Purpurea Buch.-Ham.ex De Don)，杯菊属植物全世界约有3种，中国有1种[林镕，陈艺林.中国植物志(第七十四卷).北京：科学出版社，81～82]。杯菊主要分布在中国西南亚热带地区及印度。

杯菊全株入药，民间用来消炎止血、防治各种炎症及感冒、发高烧等。

杯菊属植物化学成分国内外研究概况：

1981年，印度学者Bhimsen A.Nagasampagi等从印度产杯菊的地上部分，分离提纯得到5个成分(化合物1～5)，其中2个是挥发油成分桉叶烷内酯(Eudesmenolide)及衍生物、2个倍半萜内酯[Bhimsen A.Nagasampagi，JayantS.Sohoni，and Christa Zdero.A evdesmanolide and a gvaianolide from CyathoclinePurpurea.1981，Phytochemistry，20(8)：2034～2036]。

1991年，印度学者G.J.Chintawar等又从杯菊中分离得到1个具有植物生长调节作用的活性成分：6d-羟基-4(14)，10(15)-愈创内酯(化合物6)，并用X-衍射方法研究了该物质的晶体与分子结构[G.J.Chintawar andV.M.Pmdmanabhan.The cxystal and molecular structure of a guaianolidefrom Cyathocline Purpurea.1991，J of Natural products，54(5)：1397～1399]。

1993年，印度学者P.Pradhan等用高分辨2D NMR谱研究了2个愈创内酯(化合物5和6)的立体化学[P.Pradhan，G.J.Chintalwar and A.Bancrji.Stereochemistry of a guaianolide from Cyathocline Purpurea by highresolution NMR spectroscopy.1993，Spectroscopy letters，26(6)：997～1004]。

另外，印度学者Jayant S.Sohoni和S.R.Rojatkar等从杯菊属另外2个植物种(C.Lutea和C.Lyrata)中分离得到4个倍半萜烯内酯(化合物7～10)[Jayant S.Sohoni，Bhimsen A.Nagasampagi，Jvrgen Ziesche，et al.A germacranolide from Cyathocline Lutea 1984，Phytochemistry，23(5)：1181～1183和S.R.Rojatkar，M.Banerjee，D.D.Sawaikar，et al.Agermacranolide from Cyathocline Lutea.1994，Phytochemistry，37(4)：1211～1212]。

综上所述，印度学者从杯菊地上空茎部分获得了6个倍半萜烯类成分，从杯菊属另外2个种中分离得到4个倍半萜烯内酯。并且由分子结构及其空间构型，预言其中的6α-羟基-4(14)，10(15)-愈创二烯-8β，12-内酯具有植物生长调节活性。上述化学成分的结构式为：

4R＝Ac5R＝Ac(8-epi)6R＝H

7R=β-OH,H9R＝OH8R=O 10R＝OAc

文献表明，国外上述工作仅只局限于化学成分，并未涉及任何应用研究。

目前未见其它关于杯菊属植物化学成分及其应用研究的报道。

发明内容

本发明的目的是从杯菊中分离提纯出新的化学成分，对其进行抗癌活性系统药理研究，寻找、研制出新结构、新活性作用机理的抗癌活性成分。

本发明的另一目的是提供一种杯菊植物中提取抗癌活性成分的分离提纯方法。

本发明的研究是按照新药研究——活性筛选、化学成分研究、药理研究、临床试验——四步曲，在活性筛选基础上，从杯菊植物中提纯抗癌活性成分。本发明分离提纯的化合物为：

(1)

CP-C(用乙酸乙酯重结晶)，白色针晶，mp152～154℃(从不同溶剂中得到的不同晶形化合物，熔点有差别)；由HRFAB-MS(291.1607)得分子式C₁₇H₂₂O₄(计算值：291.1596)(表1、2)。由¹HNMR、¹H-¹H cosy、¹³CNMR及DEPT谱(表3)，综合鉴定CP-C为9β-乙酰基-闭鞘姜内酯。

表1CP-C和CP-D的高分辨快速轰击质谱(HRFABMS)数据

	CP-C	CP-D
	CP-C	CP-D	Mol.formulam/z of MH⁺calculatedm/z of MH⁺observeddeviation in ppm	C₁₇H₂₂O₄291.1596291.1607+3.66	C₁₇H₂₂O₅307.1546307.1559+4.51

表2CP-C的化学电离质谱(CIMS)数据

m/z Abundance(％) Assignment

CH₄CI NH₃CI FAB

331 1 — — M+C₃H₅ ⁺

319 1 — — M+C₂H₅ ⁺

308c — 100 — M+NH₄ ⁺

291 25 b 60 MH⁺

271 5 — — M′+C₃H₅ ⁺

259 10 — — M′+C₂H₅ ⁺

231 100 b 100 (M-HOAc)H⁺or MH

表3CP-C的¹³CNMR、¹HNMR和¹H-¹H cosy谱数据

Position ¹³C chem. ¹H chem. ¹H ¹H-¹H splittings COSYto

shifts shifts multiplicity (or W_1/2)in Hz positions：

1 131.4 5.19 bd -11 14

2 25.5 2.0-2.35^b，c m (atδ～1.3)

3 39.2 2.0-2.35^b，c m (atδ～1.3)

4 141.6 — — — —

5 126.9 4.66^c bd ～9.8 6，15

6 81.2 4.57^c dd 8.7，9.8 5，7

7 47.3 2.73 m (W_1/222) 6，8a，13E，13Z

8 33.7 2.16^d(a) ddd 2，～2，～14.5 8b，9

1.95^d(b) ddd 10.5，～10.5，14.4 7，8a，9

9 80.8 5.21 dd 2.6，10.9 8a，8b，14

10 134.9 — — — —

11 138.9 — — — —

12 170.0 — — — —

13 120.4 5.55(E) d 3.2 7

6.29(Z) d 3.5 7

14 11.6 1.45 d 0.8 1.9

15 17.5 1.72 d 1.3 5

AcCH₃ 21.4 2.05 s — —

AcCO 170.5 — — — —

(2)

CP-D(乙酸乙酯-丙酮重结晶)，白色晶体，mp164～166℃(从不同溶剂中得到的不同晶形化合物，熔点有差别)；由HRFAB-MS(307.1559)得分子式C₁₇H₂₂O₅(计算值：307.1546)(表1、4)。由¹HNMR、¹H-¹H cosy、¹³CNMR及DEPT谱(表5)，综合鉴定CP-D为9β-乙酰基-银胶菊内酯，此为一新化合物。

表4CP-D的化学电离质谱(CIMS)数据

m/z Abundance(％) Assignment

CH₄CI NH₃CI FAB

347 3 — — M+C₃H₅ ⁺

335 3 — — M+C₂H₅ ⁺

324 — 30 — M+NH₄ ⁺

307 55 15 100 MH⁺

287 3 — M′+C₃H₅ ⁺

275 6 — M′+C₂H₅ ⁺

265 10 5 MH-CH₂CO

264 15 M⁺-CH₂CO

247 100 35 90 (MH-HOAc)H⁺or M′H

229 65 100 65 M′H-H₂O

表5CP-D的¹³CNMR、¹HNMR和¹H-¹H cosy谱数据

Position ¹³C chem. ¹H chem. ¹H ¹H-¹H splittings COSY to

shifts shifts multiplicity (or W_1/2)in Hz protons：

1 127.9 5.50 ddq 3.8，12.0；1.3 2a，2b，14

2 23.8 ～2.3^b(a) m 1，2b，

2.45(b) dddd 5.2，12.2，～13，～13 1，2a，3a

3 36.0^* 1.25(a) bddd 5.3，～13，～13 2b，3b

～2.2^b(b) m 3a

4 61.3 — — — —

5 66.1 2.70 d 8.9 6

6 81.6 3.85 t 8.6 5，7

7 44.2 2.91 ddddd 1.7，3.5，3.5，8.5，8.5 6，8a，8b，13E，13Z

8 36.2 2.18^b(a) bd ～14(W_1/26) 7，8b，9

2.01(b) ddd 8.5，10.8，14.6 7，8a，9

9 80.8 5.20 dd 2.3，10.9 8a，8b

10 133.0 — — — —

11 138.0 — — — —

12 170.0 — — — —

13 122.1 5.69(E) d 3.2 7

6.36(Z) d 3.6 7

14 11.8 1.73 t 1.3 1

15 17.4 1.32 s — —

AcCH₃ 21.3 2.09 s — —

AcCO 168.7 — — — —

本发明的提取方法还包括以下化合物的分离提纯：

CP-B(CHCl₃)，白色粒晶，mp134～136℃；由CI-MS(表6)得分子式C₁₁₅H₂₀O₃。

由¹HNMR、¹H-1H cosy、¹³CNMR及DEPT(表7)谱得到证实。上述数据与珊塔玛内酯素(Santamarin)的数据对照(表8)基本一致，指认CP-B为珊塔玛内酯素。

表6CP-B的化学电离质谱.(CIMS)数据

(M’＝M-H₂O)

化学电离排布

丰度(％)Abundance(％)

m/2 Assignment

CH₄CI NH₃CI

289 3 — M+C₃H₅ ⁺

277 2 — M+C₂H₅ ⁺

271 4 — M′+C₃H₅ ⁺

266 — 100 M+NH₄ ⁺

259 8 — M′+C₂H₅ ⁺

249 45 MH⁺

231 100 M′H

213 45 M′-H₂O

185 10

141 10

表7CP-B的¹³CNMR、¹HNMR和¹H-¹H cosy谱数据

¹³C NMR ¹H NMR

Carbon or ¹³C chem.shifts ¹H chem.shifts COSY^c multiplicity ¹H-¹H splittings

hydrogen (δcDCl₃ 77.1) (δCHCl₃ 7.25) to protons： (or W_1/2)

1 75.3 3.67 2α，2β dd 6.5，9.9

2 32.9 ～2.1^b(α) 1，2β，3 m

～2.4^b(β) 1，2α，3，14 m

3 121.3 5.35 2α，2β，14 dddq ～1.5，～1.5，～1.5，～1.5

4 133.5^* —

5 51.2 2.34^b 6 bd ～12

6 81.5 3.94 5，7 dd 10.7，11.2

7 51.1 2.49 6，8α，8β，13E，13Z dddd 3.4，3.4，10.8，12.2

8 21.3 ～2.05^b(α) 7，8β，9α m

1.65(β) 7，8α9α，9β dddd 4.0，12.4，13.5，～13.5

9 34.3 ～2.05^b(α) 8β，9 m

1.30(β) 8α，8β，9α，15 ddd 5.0，～13.5，～13.5

10 40.9 —

11 139.0^* —

12 170.8 —

13 116.9 5.40(E) 7 d 3.0

6.07(Z) 7 d 3.2

14 23.4 1.84 2β，3 m (Wh/25.5)

15 11.1 0.87 9β s

^aMeasured in CDCl₃ at 75MHz for ¹³C and 300MHz for ¹H.All signals of protonatedcarbon atoms have been analysed by DEPT and have been correlated with theconesponding ¹H signals by Heteronuclear Correlation(HETCOR).

^bOverlapping with other signals.

^cHomonuclear Correlated Spectroscopy.When signals overlap，COSY results may be indoubt.

上述数据及CP-B、CP-C、CP-D核磁谱数据由悉尼大学药学系提供。

¹³CNMR(75MHz)，¹HNMR(300MHz)。

所有带质子的碳都由DEPT谱及C-H异核相关谱得到证实。

表8CP-B与珊塔玛内酯素(Santamarin)的¹HNMR谱对照

Hydrogens Santamarin(e)in CDCl₃ CP-B in CDCl₃

(δTMS＝0) (δCHCl₃＝7.26)

1 3.68dd(6.5，9.7) 3.67dd(6.5，9.9)

3 5.36bs^b 5.35m(W_h/29.5)

6 3.95dd(10.8，11.1) 3.94dd(10.7，11.2)

13(E) 5.41d(3.0)^b 5.40d(3.0)

13(Z) 6.02d(3.3) 6.07d(3.2)

14 1.85bs 1.84m(W_h/25.5)

15 0.89s 0.87s

CP-B、CP-C、CP-D的核磁谱数据及质谱数据由悉尼大学药学系和云南大学提供。

本发明分离提纯上述化合物的方法是：

将杯菊全株干燥粉碎后，用95％乙醇浸泡30～40天，提取浸膏，得浸膏CP₀；取此浸膏，用浸膏∶硅藻土(重量比)＝1∶1～1∶2加入硅藻土(化学纯)用95％乙醇混合均匀，在水浴上炒干，称重，分别用石油醚、氯仿∶乙酸乙酯＝1∶0～0∶1、乙酸乙酯、内酮、甲醇依次萃取，得粗组分CP₁、CP₂、CP₃、CP₄、CP₅。

用L₁₂₁₀细胞分别对CP₁～CP₅进行细胞毒活性筛选，结果，抗癌活性大小依次为CP₂＞CP₃＞CP₁＞CP₄＞CP₅。

对CP₂进行柱层析，用40～63μm硅胶作吸附剂，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇作洗脱剂，湿法装柱，分得11个组分：A₁～A₁₁，经细胞毒活性试验测定，其中A₄、A₅、A₇等3个组分有活性。

分别对A₄、A₅、A₇等3个组分用TLC级硅胶作吸附剂，用正己烷-乙酸乙酯-甲醇作洗脱剂，真空柱层析，分别分得10个(C₁～C₁₀)、8个(B₁～B₈)、8个(D₁～D₈)组分。重结晶，得10个纯晶体，其中3个纯晶体是CP-B、CP-C、CP-D。

用L₁₂₁₀细胞系对粗提物、组分及10个纯晶体(化合物)进行抗癌活性筛选，结果表明：组分A₄、A₅、A₇具有抗癌活性，10个纯晶体中的CP-B、CP-C、CP-D是抗癌活性成分。

按照国际标准：(半数杀伤浓度)IC₅₀≤4μg/ml，即剂量小于或等于4μg/ml，可杀死或抑制50％的癌细胞的化学成分，被视为活性成分。

上述3个抗癌活性成分的鉴定：

在细胞毒试验结果指导下，从A₄、A₅、A₇组分中分离获得CP-B、CP-C、CP-D这3个抗癌活性成分。通过ClMS、HRFABMS、¹HNMR、¹³CNMR、DEPT及¹H-¹Hcosy谱，综合分析，鉴定了结构，CP-B、CP-C、CP-D分别是：珊塔玛内酯素(Santamarin)、9β-乙酰基-闭鞘姜内酯(新化合物)和9β-乙酰基-银胶菊内酯(新化合物)。

三个活性成分的药理研究及其抗癌活性：

选择5种癌细胞系：KB(人鼻咽癌)、MCF-7(人乳腺癌)、CCRF-CEM(人白血病)、L₁₂₁₀(小鼠白血病)、LS174T(人结肠癌)；分别对CP-B、CP-C、CP-D进行系统的细胞毒试验。

结果表明：①CP-B、CP-C、CP-D对5种癌细胞都有抗癌活性；活性均超过国际标准(IC₅₀≤4μg/ml)。②KB细胞对3个化合物最敏感，IC₅₀在0.16～0.29μg/ml之间，其次是L₁₂₁₀、MCF-7、CCRF-CEM、LS174T；对CP-B抗癌活性大小依次是KB＞L₁₂₁₀＞MCF-7＞CCRF-CEM＞LS174T，对CP-C依次是KB≥MCF-7＞CCRF-CEM＞L₁₂₁₀＞LS174T，对CP-D依次是KB＞CCRF-CEM＞MCF-7＞L₁₂₁₀＞LS174T。详细结果见下表及图6、图7、图8。

CP-B、CP-C、CP-D对L₁₂₁₀、CCRF-CEM、KB、LS174T

和MCF-7五种细胞生长抑制效果(48小时后)

Cell line Origin 来源 Estimated IC₅₀(μg/mL)推算

CP-B CP-C CP-D

L1210 murine leukaemia 0.41 0.89 0.59

CCRF-CEM human leukaemia 0.59 0.65 0.49

KB human nasopharyngeal cancer 0.16 0.25 0.29

LS174T human colon adenocarcinoma 0.92 1.28 1.08

MCF-7 human breasl adenocarcinoma 0.53 0.63 0.50

CP-B、CP-C、CP-D对L₁₂₁₀细胞生长抑制率(％)

Compound Dose Growth inhibition(％±SD) IC₅₀

(μg/mL) 48h after drug treatment^a (μg/mL)

Control 0 0

CP-B 0.1 14.4±5.3

0.3 39.3±6.7

1.0 80.8±2.3 0.41

3.0 98.9±1.1

10.0 100.0±0.0

CP-C 0.1 10.7±2.3

0.3 28.2±5.7

1.0 51.1±2.5 0.89

3.0 98.5±0.4

10.0 100.0±0.0

CP-D 0.1 13.8±4.6

0.3 30.3±10.4

1.0 79.3±10.1 0.49

3.0 98.2±0.3

10.0 100.0±0.0

上述药理试验在悉尼大学癌症医学系药理实验室完成。

本发明采用的分离提纯方法简易可行，得率高，有独到之处。所得的三个抗癌活性成分(CP-B、CP-C、CP-D)活性较强，超过了国际标准，而且杯菊原料易得(可以人工栽培)，具有开发为抗癌新药的前景。

附图说明

图1为本发明的杯菊化学成分(CP)粗提及溶剂分割工艺流程图：

图2为本发明的组分CP₂分离提纯的工艺流程图；

图3为本发明的从组分A₄分离提纯得到抗癌活性成分CP-C工艺流程图；

图4为本发明的从组分A₅分离提纯得到抗癌活性成分CP-B工艺流程图；

图5为本发明的从组分A₇分离提纯得到抗癌活性成分CP-D工艺流程图；

图6为本发明的CP-B对L₁₂₁₀、CCRF-CEM、KB、LS174T和MCF-7五种癌细胞生长的影响(曲线)图；

图7为本发明的CP-C对L₁₂₁₀、CCRF-CEM、KB、LS174T和MCF-7五种癌细胞生长的影响(曲线)图；

图8为本发明的CP-D对L₁₂₁₀、CCRF-CEM、KB、LS174T和MCF-7五种癌细胞生长的影响(曲线)图。

图中，CP₁～CP₅是石油醚、氯仿∶乙酸乙酯、乙酸乙酯、丙酮、甲醇依次对浸膏萃取(即溶剂分割)所得组分；A₁～A₁₁为CP₂柱层析得到的11个组分。

具体实施方式

实施例1：

1、将杯菊全株干燥粉碎后，取粉碎样10千克，用95％乙醇浸泡30天，提取浸膏，得浸膏CP₀≈800克；

2、取此浸膏800克，与硅藻土按1∶1比例混合，用95％乙醇搅拌混合均匀，在水浴上炒干，称重，W_样＝710克，用1L索式提取器，分别用石油醚、氯仿∶乙酸乙酯＝3∶1、乙酸乙酯、丙酮、甲醇依次萃取，得粗组分CP₁(120克)、CP₂(100克)、CP₃(100克)、CP₄(130克)、CP₅(150克)，如图1所示。

3、用L₁₂₁₀细胞分别对CP₁～CP₅进行细胞毒活性筛选，结果，抗癌活性大小依次为CP₂＞CP₃＞CP₁＞CP₄＞CP₅。

4、对CP₂进行柱层析，用40～63μm硅胶作吸附剂，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇作洗脱剂，湿法装柱，分得11个组分A₁～A₁₁，如图2所示，经细胞毒活性试验测定，其中A₄、A₅、A₇等3个组分有活性。

5、分别对A₄、A₅、A₇等3个组分用TLC级硅胶作吸附剂，用正己烷-乙酸乙酯-甲醇作洗脱剂，真空柱层析，分别分得10个(C₁～C₁₀)、8个(B₁～B₈)、8个(D₁～D₈)组分，重结晶，得10个纯晶体，其中3个晶体是CP-B、CP-C、CP-D。工艺流程如图3、图4、图5所示。

6、用L₁₂₁₀癌细胞系对粗提物CP₀、组分A₁～A₁₁、C₁～C₁₀、B₁～B₈、D₁～D₈及10个纯化合物进行抗癌活性筛选，结果表明：组分A₄、A₅、A₇具有抗癌活性，10个纯化合物中3个化合物CP-B、CP-C、CP-D是抗癌活性成分。

实施例2：

1、同实施例1；

2、取此浸膏800克，与硅藻土按1∶2比例混合，用95％乙醇搅拌混合均匀，在水浴上炒干，称重，W_样＝710克，用1L索式提取器，分别用石油醚、氯仿∶乙酸乙酯＝1∶0、乙酸乙酯、丙酮、甲醇依次萃取，得粗组分CP₁(120克)、CP₂(80克)、CP₃(120克)、CP₄(130克)、CP₅(150克)，如图1所示。

3、4、5、6与实施例1相同。

Claims

1、一种从杯菊中提取的化学成分，其特征在于该化合物为9β-乙酰基-银胶菊内酯CP-D，分子式为C₁₇H₂₂O₅，其结构式为：

2、如权利要求1所述的从杯菊中提取的化学成分的分离提纯方法，其特征在于：

(1)将杯菊全株干燥粉碎后，用95％乙醇浸泡30～40天，提取浸膏，得浸膏CP₀；

(2)取此浸膏用重量比浸膏∶硅藻土＝1∶1～1∶2加入硅藻土，用95％乙醇混合均匀，在水浴上炒干，称重，分别用石油醚、氯仿∶乙酸乙酯＝1∶0～0∶1、乙酸乙酯、丙酮、甲醇依次萃取，得粗组分CP₁、CP₂、CP₃、CP₄、CP₅；

(3)对CP₂进行柱层析，用40～63μm硅胶作吸附剂，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇作洗脱剂，湿法装柱，分得11个组分：A₁～A₁₁，经细胞毒活性试验测定，其中A₄、A₅、A₇等3个组分有活性；

(4)分别对A₄、A₅、A₇等3个组分用TLC级硅胶作吸附剂，用正己烷-乙酸乙酯-甲醇作洗脱剂，真空柱层析，分别分得10个C₁～C₁₀、8个B₁～B₈、8个D₁～D₈组分；重结晶，得10个纯晶体，其中3个晶体是CP-B、CP-C、CP-D；

3、根据权利要求1所述的从杯菊中提取的化学成分的用途，其特征在于化合物CP-C和CP-D在制备抗癌药物中的应用，CP-C的结构式为：