CN1228814A - 木薯叶脉花叶病毒启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于产生转基因植物的组合物和方法。具体地说,本发明涉及木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子序列和含CsVMV启动子序列的表达盒。本发明描述了含有操作连接到异源DNA序列、得自CsVMV启动子的启动子的核酸分子、载体及转基因植物,并描述了用于含这些启动子的转基因植物的产生方法。

Description

木薯叶脉花叶病毒启动子及其应用

技术领域

本发明涉及用于产生转基因植物的组合物和方法。具体地说，本发明涉及植物病毒(CsVMV)启动子序列和含CsVMV启动子序列的表达盒。本发明也涉及含有可操作性连接到异源DNA序列的CsVMV启动子序列的载体及转基因植物。另外，本发明涉及采用含CsVMV启动子序列的载体产生转基因植物的方法。

发明背景

分离的植物病毒启动子可用于植物基因工程，以产生具有所需要表型特征的转基因植物。为了产生这类转基因植物，将分离的启动子插入到载体并与异源DNA序列操作性连接。然后以多种方式，用含与异源DNA序列融合的分离启动子的DNA构建物转化植物细胞。这种转化的结果是，与异源DNA可操作连接的启动子插入到转化植物细胞的基因组。此外，在转化植物细胞中，异源DNA表达的调节受该启动子的控制。

根据偶联到分离启动子的异源序列的性质，有多种不同的用于在转基因植物中产生需要表型的方法。例如，在植物或植物的特定组织中表达通常不表达的新基因可以赋予表型改变。另一方面，导入转基因植物的有义或反义构建物的表达可以引起内源植物基因表达的抑制。这种表达抑制可以依次产生需要的表型变化。

需要多种不同的用于植物基因工程的启动子。这些启动子有几种类型。组成型启动子为普遍使用类型启动子。组成型启动子为能够在正常发育的整个过程中、在植物所有组织中表达操作连接的DNA序列的启动子。与组成型启动子相反，组织特异型启动子为能够在某些植物组织中选择性表达异源DNA序列的启动子。启动子也可以是诱导型的，例如应用外源诱导剂诱导。组织型、诱导型和组织特异型启动子用于植物基因工程，且在该领域具有许多不同潜在的应用价值。

组成型植物启动子可以通过分离组成性表达的植物操纵子的调节区而获得。除了从植物基因获得启动子外，也有用于在植物组织组成性表达新序列的细菌和病毒启动子。得自细菌的这类启动子的实例包括章鱼碱合酶(ocs)启动子、胭脂碱合酶(nos)启动子和其它得自天然Ti质粒的启动子(参见Herrera-Estrella等，Nature,303:209-213,1983)。花椰菜花叶病毒的35S和19S启动子是普遍使用的病毒启动子实例(参见Odel等，Nature,313:810-812,1985)。

与组成型启动子相反，组织特异性启动子一般是从在特定植物组织选择性表达的植物基因的调节启动子区分离获得的。这些启动子可以与异源DNA序列融合并用来转化植物细胞，以产生在特定组织选择性表达异源DNA的转基因植物。例如，得自果实特异性乙烯调节基因E4和E8，以及得自果实特异性的聚半乳糖醛酸酶基因的启动子区已经用来指导异源DNA序列在转基因番茄植物中的果实特异性的表达。(参见Cordes等，Plant Cell,1；1025-1034,1989；Deikman等，EMJO J,7；3315-3320,1988；和Della Penna等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:6420-6424,1986)。

已经描述了几种不同植物病毒的各方面特征，包括基因组克隆、分子特征记述及序列分析、以及启动子描述，所述植物病毒包括花椰菜花叶病毒(CaMV),Hull，载于“病毒分类学(Virus Taxonomy)”,Murphy等编辑，Wein,New York,Springer-Verlag，第189-192页，1995；鸭跖草黄斑点病毒(ComYMV),Medberry等，Nuc.Acid Res,18:5505-5513,1990；东格鲁水稻杆菌状病毒(RTBV),Hay等，Nuc.Acids Res,19:2615-2621,1991；甘蔗杆菌状病毒(ScBV),Bouhida等，J.Gen.Virol,74:15-22,1993；大豆褪绿斑点病毒(SbCMV),Hasegawa等，Nuc.Acids Res,17:9993-10013,1989；玄参花叶病毒(FMV),Richins等，Nuc.Acids Res,15:8451-8466,1987；香石竹蚀环斑病毒(CERV),Hull等，EMBO J,5:3083-3090,1986；花生褪绿条斑病毒(PCSV),Reddy等，Phytopathol.,83:129-133,1993；草莓嵌脉病毒(SVBV)，基因库登记号X97304；和可可树肿枝病毒(CSSV)，基因库登记号L14546。

Calvert等(J.Gen.Virol.,76:1271-1276,1995)描述了木薯叶脉花叶病毒(以前称为CVMV，现在称为CsVMV)，且也作为基因库登记号U59751和U20341公开了序列资料。另外，最近Verdaguer等(Plant Mol.Biol.,31:1129-1139,1996)描述了CsVMV启动子。

希望发现新组成型启动子和新组织特异型启动子用来控制工程操作到转基因植物的不同核酸序列的表达。植物基因工程有许多有价值的潜在用途。为了实现这些潜在用途，可望有多种具有不同特性和在不同植物种中均有效的植物启动子。

发明概述

现在已经克隆并分子特征鉴定了得自CsVMV的启动子，该启动子可以作为异源基因表达启动子用于各种转基因植物细胞类型。该CsVMV启动子和本文所述衍生启动子提供各种各样的优点和利益。

表明所述启动子在单子叶植物种和双子叶植物种中均有活性，因此可容易地用于各种栽培作物。尽管本文所述的衍生启动子一般是组成型的，但是它们包括能够以组织特异性方式调节表达的启动子，所以可用于以组织特异性方式控制异源基因的表达。

因此在一个实施方案中，本发明设想一种分离核酸分子，它包含能够在植物细胞中起始转录的操作连接异源核酸序列的启动子核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO 3(pA)中所示的木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子的18个连续核苷酸的同一性至少为80％。

推荐的核酸分子包括选自CVP1、CVP2、pA、pB、pC、pD、pE、pΔB、PΔC、pΔD1、pΔD2、pΔD3、pΔDE1、pΔDE2、pΔDE3和pΔE的核酸序列。

也设想了一种包含操作连接到异源核酸序列的本发明启动子序列的载体。也描述了包含操作连接到异源核酸序列的启动子的嵌合基因。

本发明还设想了一种包含操作连接到异源核酸序列的本发明启动子核苷酸序列的转基因植物。

本发明也描述了在植物细胞表达异源核酸序列的方法，包括：

a)用本发明的载体转化植物细胞，以及

b)在异源核酸在植物细胞表达的条件下培养植物细胞。

基于本文说明书，其它优点和好处对于本领域技术人员而言是浅显明白的。

附图简述

在形成本发明一部分的附图中：

图1图解说明CsVMV病毒基因组中的CsVMV启动子的结构和含有实施例1所述的或者CVP1或CVP2 CsVMV启动子片段的uidA融合基因的构建。启动子片段的位置用数字标记在CsVMV基因组DNA中。用AluI限制位点分离CVP1片段，而CVP2片段采用所述引物通过PCR扩增获得，CVP2在5’末端多75个核苷酸，而在3’末端多52个核苷酸。CVP2的3’末端刚好是病毒基因组的第一个ATG密码子的上游。也指明了转录起始位点(“Tsp”，右向箭头)和共有tRNA结合位点(“tRNAmet”)的位置。示意图未按比例画出。

图2图释确定如实施例2中所述的CsVMV启动子的转录起始位点。按所述方法进行引物延伸反应，用两种退火温度(30℃和40℃)获得的延伸反应产物和用同一种标记引物进行的CVP1-uidA基因构建物(A、C、G和D道)的参比测序反应产物在7M尿素、7.5％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。显示了正链DNA序列(凝胶上显示的序列的互补序列)，核苷酸(nt.)7604号的箭头指出转录起始位点(A*)。数字对应于CsVMV基因组的核苷酸序列标号，Calvert等，J Gen Virol,76:1271-1276,1995。

图3图释也在SEQ ID NO 3显示的CsVMV启动子区域的核苷酸序列，包括在实施例2中所述的CVP1和CVP2启动子片段。采用不同于基因组序列编号系统的以转录为基础的编号系统，转录起始位点称为+1。框注了共有TATA框(类as1序列)(Lam等，Proc.Natl.Acad of Sci USA,86:7890-7894,1989)和与ComYMV启动子同源的区(Medberry等，PlantJ,6129-626,1993)。AluⅠ位点(箭头)指示CVP1启动子的3’和5’末端。下划线的是类似于先前特征鉴定的植物启动子中顺式元件的序列基元(指示了类似于rbcS启动子的框I元件(Donald等，EMBO J,9:1717-1726,1990)、MNF1结合位点(Yanagisawa等，Plant Mol Biol,19:545-553,1992)、SV40核心增强子(Ondek等，EMBO J,6:1017-1025,1987)的基元。

图4图示CsVMV基因组结构与实施例2中所述的花椰菜花叶病毒和badnaviruses病毒基因组的比较。所有图谱均从基因间隔区的起始位点开始。编码类似推定功能的多个或一个ORF区段用垂直线连接。数字“1”指示DNA复制起点。 :MP活性位点；◆:RT活性位点；《:TAV活性中心；]:RNA结合位点；◇:PR活性位点；

:RNA酶H共有序列。

图5图释在实施例7a)所述的烟草和木薯原生质体中的CsVMV启动子的表达。通过电穿孔将嵌合uidA基因构建物与表达荧光素酶的质粒共导入木薯(点状条带)和烟草(交叉影线条带)原生质体中。启动子活性以同一蛋白质提取物的GUS活性和LUC活性的比率表示。GUS活性测定结果为每单位发射光每小时pmol 4-甲基伞形基(umbelliferyl)-β-D-葡糖苷酸。条带代表四次独立实验的平均值+/-标准差。用不同原生质体制品进行每一次实验。pe35GN是一种构建物，该构建物中“强化的”35S启动子(Kay等，Science,236:1299-1302,1987)控制uidA基因的转录。pGN100是含无启动子的uidA基因的对照质粒。

图6A-6J图示如实施例7b)所述的在含有CsVMV启动子uidA嵌合基因的转基因烟草和水稻植株中GUS表达的组织化学定位。在用X-Gluc染色后通过深靛蓝染料沉积显示GUS活性。A：烟草叶切片；B：显示中脉维管组织的烟草叶切片祥图(×10)；C：穿过烟草叶片的横向切片(×30)；D：烟草茎横截面切片中的维管组织(×30)；E：烟草根(×10)；F：穿过烟草子房的横向切片(×10)；G：水稻叶横截面切片(×50)；H：稻叶鞘的横截面切片(×50)；I：轴向剖开并随后染色以显示GUS活性的水稻花(×10)；J:GUS在自体外小植株的木薯茎上的瞬时表达。bs：维管束鞘；cy：绿色组织；ep：外生韧皮部；ip：内生韧皮部；mx：后生木质部；p：韧皮部；ph：髓；pm：栅栏叶肉；pp：韧皮薄壁组织；py：薄壁组织；rt：根尖；sc：厚壁组织；sm：叶肉；x：木质部；cp：木薄壁组织。

图7A和7B图示如实施例7b)所述的烟草(A)和水稻(B)转基因植物品系的不同器官组织中CsVMV/uidA嵌合基因表达的GUS活性的量分布。具体的GUS活性表示为每分钟每毫克蛋白pmol的4-甲基伞形酮(4MU)。检测在含有嵌合基因中的或者CVP1(实心点)或者CVP2(空心点)的转基因烟草或水稻品系的不同器官组织的GUS活性，所述器官组织是3-5cm长的幼叶(Y)、长10cm或10cm以上的成熟叶(M)、茎(S)、根(R)和叶鞘外植体(ST)。用于蛋白提取的样品取自生长在温室的成熟(5-7周龄)R1转基因烟草植株。所用的水稻植株是生长在温室的R0转化体(2月龄)。每一点代表单个独立转基因系。实验的品系数标示在图中。实心箭头指示不同器官和每一构建物的GUS活性的平均水平。对数刻度用来容纳不同品系间的大变异。

图8简略图示按实施例9所述制备的不同嵌合CsVMV启动子/uidA基因融合表达构建物。含有不同所述构建物和5’末端终点和构建物内部缺失的不同质粒的名称表示在图的左侧。内部缺失用符号“Δ”表示。pA含有图3中图示的全长的CsVMV启动子。所有5’末端缺失的启动子均在其5’末端具有BamHⅠ位点。内部缺失通过BanHⅠ连接5’末端截短的启动子和3’末端缺失的启动子片段产生。

图9A-9I图示实施例10b)所述的含有CsVMV启动子/uidA嵌合基因缺失构建物的转基因烟草植株中GUS表达的组织化学定位。所有图(除了图H和I)均是5周龄转基因烟草植株的展开的嫩叶的横截面切片。a)pB；b)pD；c)pE；d)pΔC；e)pΔD1；f)pΔDEl；g)pΔDE2；h)得自携带pB构建物(右)或pD构建物(左)的10天龄转基因的叶子；I)自含有pC构建物(顶部)或pD构建物(底部)的转基因烟草植株的根。m：叶肉；v：叶脉；py：薄壁组织；RT：根尖。

图10图示如实施例10c)所述的在转基因烟草叶中由CsVMV启动子/uidA嵌合基因缺失构建物表达的GUS酶活性。蛋白从5周龄转基因植物的展开的嫩叶收集的叶片中提取。对于每一种构建物。检测6-10种独立的转基因系的GUS活性。数据如图7中所述方法表示。每一种植物的结果用空心点标示。每一种不同的启动子构建物分别标示。其中的平均GUS水平用垂直箭头标示。对数刻度用来容纳转基因系间的大变异。

图11图示如实施例10e)所述在BY-2(交叉阴影条带)和叶肉(斜条纹条带)原生质体中的CsVMV启动子/uidA嵌合基因构建物的瞬时GUS表达。从BY-2细胞悬液或烟草叶制备的电穿孔的原生质体在培养24小时后用于分析GUS活性。所标示的不同启动子构建物与作内标准品的荧光素酶质粒进行共转染。将GUS表达水平相对于荧光术酶表达归一化，并表示为相对于采用全长启动子活性的GUS表达的百分率，其中设定构建物pA为100％值。每一条带各自代表四次独立实验的平均值，并也标明+/-标准误。

图12图示说明如实施例11中所述的CsVMV启动子的功能图谱。数字用图3的转录起始位点记数系统指示相对位置和特征。垂直箭头指示组织特异性功能，同时通过箭头的相对大小指示对该功能相对重要的结构域。图顶部的箭头代表实施例11中讨论的协同相互作用。鉴别出基元asl、GAGA和GTAA，它们并在启动子调节功能中起作重要的作用。本发明的详细说明

A．定义

本文所用的术语“核酸”是指或者DNA或者RNA。“核酸序列”或“多核苷酸序列”指从5’末端到3’末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链多聚体。它包括自我复制型质粒、感染性DNA或RNA多聚体和非功能性DNA或RNA。在本文所用的多核苷酸符号标示中除非特别的说明，否则，单链多核苷酸序列的左手末端是5’末端；双链多核苷酸序列的左手方向是指5’端方向。

术语“启动子”指翻译起始密码子的DNA上游区，它参与识别和结合RNA多聚酶和起始转录的其它蛋白质。“植物启动子”是能够在植物细胞起始转录的启动子。本文所用的术语“CsVMV植物启动子”或“CsVMV启动子”指得自CsVMV基因组的启动子区的启动子，并如本文进一步定义的。

本文所用的术语“组成型启动子或组成型植物启动子”指能够在正常发育过程中在植物的所有组织或几乎所有组织中表达操作性连接的DNA序列的植物启动子。本文所用的术语“诱导型启动子”或“诱导型植物启动子”指能够对内源或外源刺激反应、在特定时间或特定组织中选择性表达操作性连接的DNA序列的植物启动子。

本文所用的术语“组织特异性启动子”指能够在特定组织中选择性表达操作性连接的DNA序列。这意味着操作性连接的DNA序列的表达在一种或几种植物组织中较在该植物其它组织中的表达更高。例如，存在于构建物pΔDE1的CsVMV启动子是在根尖组织中选择性表达操作性连接的异源DNA序列的组织特异性启动子。

本文所用的术语“操作性的或可操作连接的”指将启动子相对于异源核酸序列在5’末端连接，使得该启动子介导连接DNA序列的转录。当然，该启动子序列也含有转录起始密码子和翻译起始密码子间的转录序列。

词组“表达盒”指能够在与所述序列相容的宿主中指导核酸序列或结构基因表达的核苷酸序列。这种盒至少包括启动子和转录终止信号。如本文所述，也可以采用在有效的表达中必需或有辅助作用的其它因子。

术语“载体”是指表达系统，即基于核酸的穿梭载体、用于核酸传递的核酸分子和自主自我复制型环状DNA(例如质粒、粘粒、噬菌体等等)。当重组微生物或细胞培养物描述为“表达载体”的宿主时，这包括染色体外的环状DNA(例如线粒体DNA或叶绿体)、已经掺入到宿主染色体的DNA或以上二者。当载体由宿主细胞保持时，所述载体可以或者作为掺入在宿主的基因组中的自主结构在有丝分裂期间由所述细胞稳定复制，或者保持在宿主的核或胞质中。

术语“质粒”指能够在细胞中复制的自主环状DNA分子，包括表达和非表达两种类型。当重组的微生物或细胞培养物描述为“表达载体”的宿主时，这包括染色体外的环状DNA分子和已经掺入到宿主染色体的DNA。当质粒由宿主细胞保持时，该质粒或者作为自主结构在有丝分裂中由该细胞稳定复制，或者掺入到宿主的基因组中。

本文所用的“异源序列”、“异源DNA序列”或“异源核酸序列”是来源于外源(或种)序列，或者假如是同一来源，则是由原形式修饰后的序列。因此，操作连接到启动子的外源DNA编码序列源自不同于衍生启动子的序列或者，假如是与启动子是同一来源，外源DNA编码序列是由其原始形式修饰后的序列。可以对异源DNA序列进行修饰，例如用限制酶处理该DNA，以产生能够操作连接到所述启动子的DNA片段。用诸如定点诱变的技术可以进行修饰。

词组“选择性杂交到”是指当靶序列存在于制备物中或总细胞DNA或RNA时，仅在特定靶DNA或RNA序列的核酸探针上杂交、形成双链体或结合。“互补的”或“靶”核酸序列指那些选择性杂交到核酸探针的核酸序列。适当的退火条件取决于例如探针的长度、温度、碱基组成和错配数及其探针上的位置，且通常必须根据实验确定。为了讨论核酸探针的设计和退火条件，参见例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册(第二版)，第1-3卷，冷泉港实验室，(1989)；或者CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel等，编辑，Green Publishingand Wiley-Interscience，纽约(1987)。

词组“编码的…核酸序列”指编码用于表达特定蛋白、肽、或核酸的核酸。所述核酸序列包括转录成RNA的DNA链序列和翻译成蛋白质的RNA序列。所述核酸序列包括全长的核酸序列及得自全长序列的非全长序列。另外不用说，该序列包括天然序列或可以导入以在特定宿主细胞种提供密码子优先的序列的简并密码子。

术语“分离的”当指核酸序列或分子时是指这样的主题核酸，它们不含有天然存在的相邻相应物序列，例如在CsVMV基因组的环境下的CsVMV启动子，而是从CsVMV基因组的其它部分操作分离或与异源序列重组的。

词组“大致纯的”当指核酸时，是指主题核酸是从其生物学来源纯化的且是已获得的组合物中的主要分子类型，相对于诸如蛋白质、糖、脂类等之类的其它物质，主题核酸优选为至少50％纯度，更优选的是至少为90％纯度的核酸。

术语“植物”包括完整植物、植物器官(例如叶、茎、根等等)、种子和植物细胞及其子代。可用于本发明方法的植物类别一般与可用于转化技术的高等植物一样广泛，包括单子叶的(单子叶植物)和双子叶的(双子叶植物)植物。它包括不同倍性水平的植物，包括多倍体、二倍体和单倍体的植物。

术语“转基因植物”指通过基因工程技术产生的植物。例如，用含有操作连接到异源DNA序列的CsVMV启动子的载体转化的植物细胞可以用来产生具有改变表型特征的转基因植物。

下列术语用来描述两种或两种以上核酸或多核苷酸之间的序列关系：“参比序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列相同的百分率”和“大致相同”。“参比序列”是定义用作序列比较的基准的序列；参比序列可以是较大序列的子序列(subset)，例如为在诸如核酸序列的序列表中给出的全长基因序列的区段，或者可以包含完整的基因序列。

可以进行用于对齐比较窗口的最佳序列对齐，方法有Smith等(Adv.Appl.Math.,2:482,1981)的局部同源性算法、Needleman等(J.Mol.Biol.,48:443,1970)的同源性对比算法、Pearson等(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),85:2444,1988)的相似性检索或这些算法的计算机实现(Wisconsin Genetics软件包版本7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)。本文描述了其它方法。

用于核酸序列和用在本文的术语“大致相同”或“大致序列相同”表示多核苷酸序列的特性，其中与至少有20个核苷酸位置的比较窗口、通常至少有25-50个核苷酸的参比序列比较，所述多核苷酸包含的序列至少有85％的序列相同，优选至少有90-95％的序列相同，更优选至少有99％的序列相同；其中的序列相同的百分率的测算是通过比较参比序列和可能含有缺失或增加的多核苷酸，所述缺失或增加总计为在比较窗口范围内的参比序列的20％或更少。参比序列可以是较大序列的子序列，例如为本文公开的CsVMV启动子区域的区段。

B．木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子

本发明提供CsVMV启动子和含有操作连接到异源核酸序列的CsVMV启动子的DNA构建物。CsVMV启动子是一种启动子核苷酸序列，当它存在于能够支持转录的转录媒介(例如在植物细胞、植物或本文所述的类似环境中)中时能够启动异源核酸序列的转录。所述启动子启动操作性连接到该启动子的异源核酸的转录。

用在本文的“CsVMV启动子”包括本文鉴定的野生型CsVMV启动子、其片段(例如本文所述的CVP1和CVP2片段)、其衍生体(例如本文所述的缺失构建物)，所有这些序列的共同特征是含有得自本文所述和在SEQ ID NO 3中显示的全长CsVMV启动子序列的核苷酸序列

推荐的CsVMV启动子是至少有80％核苷酸与在SEQ ID NO 3中显示的CsVMV启动子的18个连续核苷酸相同的核苷酸序列。优选的是，所述同一性至少是90％，更优选为至少98％。优选的是同一性存在于20个连续的核苷酸中，更优选的是存在于25个连续的核苷酸中。同一性百分率是测定与特定长度的靶核酸序列比较，非间断的线性(即连续的)核苷酸序列中相同的核苷酸的数目。

本文所用的核苷酸序列的“同一性”是指在两种各自独立的序列中所比较的核苷酸残基是相同的。因此，100％同一性是指，例如在比较两种不同分子的25个连续核苷酸时，所有25对所比较的核苷酸的残基是相同的。

转录媒介可以是植物生物技术领域熟知的许多环境中任何一种，因此不必受限制。然而，典型的和推荐的媒介包括用含有主题启动子的核酸转化的植物细胞，例如培养的植物细胞、植物原生质体、或其它的植物组织培养物构型(configuration)、未分化的植物细胞、诸如在培养的小植株中的分化植物细胞、转基因植物、成熟的植物和类似的媒介。正如本领域众所周知的，也包括包含由纯化蛋白、底物、和支持转录所需要的成分组成的再组成表达媒介的体外生化表达系统。

本发明的启动子可以采用的形式有分离的核酸、嵌合基因、表达盒和本文所定义的类似重组DNA(rDNA)形式。

分离的核酸分子包括含有上述CsVMV启动子的启动子核苷酸序列。

嵌合基因是含有两种不同核苷酸序列的融合物，其中主题启动子核苷酸序列操作性连接到异源核酸序列，这样在合适的转录媒介中所述异源核酸在所述主题启动子的控制下进行转录。用于嵌合基因的典型异源核酸序列可以是编码有用基因产物的任何核酸序列。本文还要进一步描述有用的基因产物和异源核酸序列。

本文所述的各种启动子特别有用，它在其中将起始转录的植物和植物组织类型的范围内提供控制。例如，对于许多植物类型、单子叶植物和双子叶植物、包括植物的大多数组织的表达而言，本文所述的是组成型的启动子；有一些描述的启动子优先地限制转录到某些植物组织。

推荐的启动子核苷酸序列包括衍生自SED ID NO 3中所示的CsVMV启动子的核苷酸序列。本文中的“衍生自”是指主题启动子或者通过CsVMV启动子的缺失、断裂或置换来机械操作制得；或者通过分析该序列，然后设计和合成一序列，该衍生物保留本文鉴定的CsVMV启动子的重要的、功能性特征，从而制得所述主题启动子。

优选的是，启动子核苷酸序列是本文所述序列中的一种，即是存在于命名为CVP1、CVP2、pA、pB、pC、pD、pE、pΔB、pΔC、pΔD1、pΔD2、pΔD3、pΔDE1、pΔDE2、pΔDE3和pΔE的构建物中的启动子序列中的任何一种。这些推荐启动子核苷酸序列在本文的序列表中分别以SED ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16显示。

CsVMV启动子在产生转基因植物中是有用的。作为含有操作连接到CsVMV启动子的异源DNA序列的DNA构建物转化植物细胞的结果，在转基因植物中产生所需要的表型。因此，DNA构建物可以在许多用于各种植物细胞的种种表达载体中任何一种中包含表达盒。

本领域技术人员已知的许多方法可用来制备或分离CsVMV启动子。例如可以从基因组的CsVMV DNA片段分离CsVMV启动子。

CsVMV启动子序列也可以通过用其序列得自本文所述CsVMV启动子DNA序列的寡聚核苷酸序列筛选植物DNA文库而分离。采用SEQ ID NO3的CsVMV启动子序列，本文所述的各种克隆方法学也可以用来分离CsVMV启动子。本领域技术人员已知的其它方法也可以用来分离含有CsVMV启动子的植物DNA片段。关于分离与已知顺序DNA分子相关的DNA的其它技术的介绍，参见Sambrook等。

为制备cDNA文库，从表达待克隆的靶表达基因的组织中分离mRNA。例如可以利用植物果实的果皮组织。从mRNA制备cDNA，然后，合成第二条互补DNA链。随后，将该双链DNA分子连接到重组载体中。该载体转染到重组宿主中进行繁殖、筛选和克隆。制备和筛选cDNA文库的方法是众所周知的。参见Gubler等，Gene,25:263-269,1983和Sambrook等。

为了基因组文库，通常从植物组织中提取所述DNA，然后或者机械剪切或者酶消化以产生大约15-20kb的片段。之后通过梯度离心，将所述片段与从不需要的大小片段分离，并构建到λ噬菌体载体中。按Sambrook等所述的方法，体外包装这些载体和噬菌体。通过按Benton等，Science,196:180-182,1997一般描述的噬菌斑杂交法分析重组噬菌体。按由Grunstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),72:3961-3965,1975所述的方法进行克隆性杂交。例如载DNA印迹上，在或者cDNA或者基因组文库中，通过其与核苷酸探针杂交的能力可以鉴定目的DNA，这些DNA区用本领域技术人员熟悉的标准方法分离。参见Sambrook等。

诸如聚合酶链反应(PCR)技术之类的核酸扩增技术，可以用来从mRNA、cDNA和基因组文库或cDNA文库扩增核酸序列。在PCR技术中，合成与待扩增DNA区的两个3’末端边缘互补的寡核苷酸引物，然后用这两个引物进行聚合酶链反应。参见PCR Protocols:A Guide to Methodsand Applications(Inns等编辑)，Academic Press,San Diego(1990)。可以选择引物来扩增含有所需要的启动子的完整区。也可以用PCR来扩增所需要的这些区的较小DNA片段。

PCR和有关扩增技术可以以多种方式用来分离含有CsVMV启动子的DNA分子。例如，PCR可以用在许多方案中以分离含有CsVMV启动子的核酸。在这些方案中，由分析本文所列的DNA序列，产生用于扩增含有CsVMV启动子的DNA的合适引物和探针。

通过Beaucage等(Tetrahedron Lett.,22(20):1859-1862,1981)所述的固相亚磷酰胺三酯法(phosphoramidite triester)，按照Needham-VanDevanter等，Nucl.Acads Res.,12:6159-6168,1984中所述，采用自动合成仪，可以化学合成用于所述公开方法中的寡核苷酸。寡核苷酸的纯化是通过或者天然聚丙烯酰胺凝胶电泳或者如Pearson等(J.Chrom.,255:137-149,1983)所述的阴离子交换HPLC进行。可以采用Maxam等(Meth.Enzymol.,65:499-560,1980)的化学降解法确认合成寡核苷酸的序列。

可以产生具有本文所示不同特性的不同形式的CsVMV启动子。可以用本领域技术人员已知的多种方法构建CsVMV启动子。例如通过作图分析CsVMV启动子中的限制酶位点，然后用该构建图谱确定合适的限制酶切割以切去所述序列的子序列，来构建启动子。然后可以将较短的限制片段插入到合适的载体。本文说明了控制操作连接的异源DNA序列表达的特定启动子的构建。其它形式的启动子也可以用类似方式制备。

衍生型启动子可以显示出表达操作连接的异源DNA序列。这可以首先通过制备具有操作连接到报道基因的替代型启动子的载体来完成。然后用所示载体转化植物细胞，再由该转化植物细胞产生转基因植物。之后测定在该启动子控制下所述基因的表达。参见本文关于证实用替代型CsVMV启动子表达的异源DNA序列的实施例。

另一方面，在本文所述启动子的顺序基础上，用多种方法可以合成包含本发明启动子的核酸分子。正如本文所述，用产生寡核苷酸的化学合成法可以完成合成。另外，通过合成一系列的寡核苷酸可以制备核酸分子，所述寡核苷酸顺序对应于所述启动子的不同部分，可以通过其连接结合形成较大的核酸分子。

C．用于表达异源蛋白的载体

本文所述的不同形式CsVMV启动子可以用于表达盒、载体和其它DNA构建物。

本发明的载体是包含根据本发明的启动子核苷酸序列的核酸分子，所述启动子操作性连接到异源核酸序列。通常，该载体能够表达作为嵌合基因的操作性连接的启动子和异源核酸序列。适合用于表达嵌合基因的载体一般是大家熟知的，并且不必受限制。

用于本文载体中的嵌合基因是操作性连接到异源核酸序列的本发明启动子核苷酸序列的融合物。各种异源核酸序列中的任何一种均可用于能够改变植物表型的嵌合基因，可包括植物、动物或其它生物的蛋白或核酸。代表性蛋白包括农业上用于提高植物产量、抗病性、利用改良营养物质能力的有用蛋白质，以及类似蛋白。

例如，可以使用操作连接到基因的所述CsVMV启动子，所述基因有除草剂抗性基因、真菌病抗性基因、(例如壳多糖酶和葡聚糖酶)、细菌性疾病抗性基因(例如杀菌肽)和寄生虫抗性基因(例如B.Thuringiensis毒素)。另外的例子包括病毒外壳蛋白，诸如CsVMV的外壳蛋白或非洲木薯花叶病毒复制酶。

也可以使用操作连接到以下基因的CsVMV启动子，例如成熟基因或降解基因(例如Acc氧化酶、Acc合酶、聚半乳糖醛酸酶、八氢番茄红素合酶)；颜色基因；甜味物质基因以及类似基因。

可以以多种方式构建含有CsVMV启动子的表达盒。这些技术是本领域技术人员熟悉，在上述的Sambrook等中有全面的描述。例如，诸如定点诱变之类的各种方法可以用来在异源基因片段的起始密码子处导入限制位点。然后将异源DNA序列连接到CsVMV启动子，使得该启动子调节异源序列的表达。然后将由操作连接到异源DNA序列的CsVMV启动子组成的DNA构建物插入到各种载体。这类载体包括在植物细胞转化中有用的表达载体。可以通过应用本领域技术人员熟知的重组DNA技术，构建在植物细胞转化中有用的许多其它的这类载体。

用于在原生质体或植物组织中表达的代表性载体包括pUC18/19或pUC118/119(GIBCO BRL,Inc.,MD)；pBluescriprt SK(+/-)和pBluescript KS(+/-)(Stratagene,La Jolla,CA)；pR7Blue T-载体(NOVAGEN,Inc.WI)；pGEM-3Z/4Z(PROMEGA Inc.,Msdison,WI)和诸如本文所述的类似的载体。

用于用根癌农杆菌介导的植物转化的表达的典型载体，包括pBin19(Clontech Inc.),Frisch等，Plant Mol.Biol.,27:405-409,1995,pCAMBIA 1200和pCAMBIA 1201(Center for the Application ofMolecular Biology to International Agriculture,Canberra，澳大利亚)；pGA482,An等，EMBO J.,4:277-284,1985；pCGN1547(CalgeneInd.)McBride等，Plant Mol.Biol.,14:269-276,1990和本文所述的类似载体。

用于基因的核酸操作的技术，诸如亚克隆主题启动子或异源核酸序列到表达载体中、标记探针、DNA杂交等等全面描述在Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第二版)，第1-3卷，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989中，该手册通过引用结合到本文中。此操作在本文中称为“Sambrook等”。

D．转基因植物

本发明也设想在本文所述的嵌合基因构建物中含有本发明启动子的转基因植物。在主题启动子控制下表达的异源核酸序列的表达，引起所述植物具有改变的表现型。因此所述转基因植物含有作为该植物的一部分的本文所定义的表达盒，该表达盒已通过用本发明的载体转化植物而导入。

因为本发明的启动子能够在广泛的植物种类中(包括单子叶植物和双子叶植物)发挥作用，所以转基因植物可以是含有主题启动子、并且能够表达含有该启动子的嵌合基因中的所述异源核酸序列的任何类型的植物。典型植物种和属还将进一步描述。

转化各种各样的植物种类的技术是众所周知的且描述于科技文献中。参见例如Weising等，Ann.Rev.Genet.,22:421-477,1988。如本文所述，组成型或诱导型CsVMV启动子在合适的载体中操作连接到所需要的异源DNA序列。含有融合到异源DNA的CsVMV启动子的载体通常含有赋予植物细胞可选择表型的标记基因。例如该标记可以编码杀生物剂抗性、特别是抗生素抗性(诸如抗卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素)或除草剂抗性，诸如抗氯磺隆或草铵膦。这些选择性标记基因在产生转基因植物的方案中是有用的。

含有连接到异源DNA的CsVMV启动子的DNA构建物可以通过多种常规的技术导入到所需要的植物宿主的基因组中。例如，用诸如电穿孔和微量注射植物细胞原生质体之类的技术，可以将所述DNA构建物直接导入到植物细胞的DNA中。或者，采用诸如DNA微粒轰击的生物发射(biolistic)法，将所述DNA构建物直接导入植物组织中。另外，所述DNA构建物可以与合适的T-DNA侧翼区域结合并导入常用的根癌农杆菌宿主载体中。当根癌农杆菌感染植物细胞时，该菌宿主的毒力作用指引所述构建物和邻近的标记基因插入到该植物细胞DNA。

微量注射技术是本领域众所周知的，并在科技、专利文献中有很好的描述。用聚乙二醇沉淀导入DNA构建物描述在Paszkowski等，EMBOJ.,3:2717-2722,1984。电穿孔技术描述在Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:5824,1985。生物发射转化技术描述在Klein等，Narure 327:70-73,1987。所有引用文献的全部公开内容均通过引用结合到本文中。

变化包括通过或者在小珠或小颗粒的基质中或者在其表面上具有核酸的小颗粒的高速生物发射穿透(Klein等，Nature,327:70-73,1987)。尽管通常只需要单一导入新核酸片段，但是本方法特别提供多份导入。

根癌农杆菌介导的转化技术详细描述于科学文献中。参见例如Horsch等，Science,23:496-498,1984，和Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:4803,1983。参见本文关于证实用含有CsVMV启动子的载体通过根癌农杆菌转化植物细胞的实施例。

更具体地讲，用所述区段转化的根癌农杆菌感染植物细胞、外植体、分生组织或种子。在本领域已知的合适条件下，将转化植物细胞生长形成苗枝、根，及进一步发育成植株。例如通过根癌农杆菌的Ti质粒，所述核酸区可以导入到合适的植物细胞中。在用根癌农杆菌感染时，将所述Ti质粒传递到植物细胞，并稳定地整合到植物基因组(Horsch等，Science,233:496-498,1984；Fraley等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A,80:4803,1983。

Ti质粒含有产生转化细胞必需的两个区。其中命名为转移DNA(TDNA)的一个区段诱导肿瘤形成。另一个叫做毒力区，是所述T DNA导入植物所必需的。转移到植物基因组的转移DNA区可以通过插入外源核酸序列增加其大小，而不影响其转移能力。通过去除引起肿瘤的基因使得它们不在进行干扰，之后修饰Ti质粒可以用作转移本发明的基因构建物到合适植物细胞的载体，这样的质粒为“无能(disable)Ti质粒”。

根据本发明，可以被农杆菌转化的所有植物细胞和由转化细胞再生的完整植物也可以bz转化，从而产生含有所述转移外源核酸序列的转化完整植物。

用农杆菌转化植物细胞有多种方法，包括：

(1)农杆菌与培养分离的原生质体共培养；

(2)细胞或组织与农杆菌共培养；

(3)用农杆菌转化种子、顶端(apices)或分生组织。

方法(1)要求允许培养原生质体和由培养原生质体再生植物的确立的培养系统。

方法(2)要求(a)所述植物细胞或组织可由农杆菌转化，和(b)所述转化细胞或组织可以诱导再生成完整植物。

方法(3)要求微繁殖。

在该双元系统(binary system)中，为了感染，需要两种质粒：含有T-DNA的质粒和vir质粒。可以使用为数众多的含有质粒的T-DNA中的任何一种，唯一的要求是该质粒对于所述两种质粒的每一种都能独立选择。

在所述植物细胞或植物转化后，那些由所述Ti质粒转化使得所需要的DNA区段整合的植物细胞或植物可以通过合适的表型标记选择。这些表型标记包括但不限于抗生素抗性、除草剂抗性或肉眼可视变化。其它表型标记是本领域众所周知的并可用于本发明。

在转化任何植物包括单子叶植物和双子叶植物时，本发明包括利用要求保护的启动子。双子叶植物的转化描述于上述文献中。采用各种技术转化单子叶植物是已知的，所述技术包括电穿孔(例如Shimamoto等，Nature,338:274-276,1992弹道冲击(ballistics)(例如欧洲专利申请270,356)；和农杆菌(例如Bytebier等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,84:5345-5349,1987)。

采用任何一种上述转化技术产生的转化植物细胞可以培养再生成具有所需要转化表型的完整植物。这类再生技术取决于组织培养生长培养基中某些植物激素的操作，通常取决于已经与所述核苷酸序列一起导入的杀生物剂和/或除草剂标记基因。由培养的原生质体再生植物描述于Evans等，植物细胞培养手册，第124-176页，MacMillanPublishing Company，纽约，1983；和结合、植物再生、植物原生质体，第21-73页，CRC Press,Boca Raton,1985。从植物愈合组织、外植体、器官或这些的某一部分也可以获得再生。这类再生技术由Klee等(Ann.Rev.Plant Phys.,38:467-486,1987)进行了全面描述。

可用于本发明中产生转基因植物的其它方法描述于美国专利5,188,642；5,202,422；5,463,175和5,639,947号中，其说明书通过引用结合到本文中。

技术人员会知道，在含有所述CsVMV启动子的表达盒稳定地掺入在转基因植物中并证实是可操作的之后，该表达金可以通过有性杂交导入其它植物。根据待杂交的物种，可以使用众多标准育种技术中的任何一种。

本发明的方法和组合物在广泛种类的植物中具有用途，所述植物包括以下属的种：草莓属、莲属、苜蓿属、驴喜豆属、三叶草属、葫芦巴属、豇豆属、岩蔷薇属、亚麻属、Geranium、木薯属、胡萝卜属、拟南芥属、芸苔属、萝卜属、欧白芥属、颠茄属、辣椒属、莨菪属、番茄属、烟草属、茄属、矮牵牛属、毛地黄属、Majorana、Ciohorium、向日葵属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、Herecocallis、龙面花属、天竺葵属、黍属、狼尾草属、毛莨属(Ranuncultis)、千里光属、蛾蝶花属、香瓜属、Browaalia、大豆属、毒麦属、玉米属、小麦属、高粱属、曼陀罗属、菊属、石竹属、大丁草属、大戟草属、番薯属、西番莲属、仙客来属、苹果属、樱桃属、蔷薇属、悬钩子属、杨属、檀香属、葱属、百合属、水仙属、Ananas、花生属、菜豆属和豌豆属；而更具体地说，包括油料作物，例如canola(芸苔属种)、棉花(棉属种)、花生(花生属种)、向日葵(向日葵属种)、棕榈(油棕属种)、亚麻(亚麻属种)、红花(红花属种)、椰子(椰子属种)和大豆(大豆属种)，谷类作物，例如小麦(小麦属种)、玉米(玉米属种)、高粱(高粱属种)、大麦(大麦属种)、黑麦(黑麦属种)、燕麦(Averia种)和水稻(稻属种)；果实作物例如香蕉((芭蕉属种)、柑桔(柑桔属种)、浆果(例如草莓(草莓属种)或悬钩子(悬钩子属种)、芒果(芒果属种)、甜瓜(香瓜属种)、梨(梨属种)、黄瓜(黄瓜属种)、和杏、桃、樱桃、李和洋李(樱桃属种)，蔬菜作物，例如豌豆(豌豆属种)、菜豆(野豌豆属种)、嫩茎花椰菜和相关的十字花科植物(芸苔属种)、菠菜(菠菜属种)、洋葱(葱属种)、芹菜(Apiurti种)、胡萝卜(胡萝卜属种)、芦笋(天门冬属种)、和洋蓟(向日葵属种)，番茄(Lycopersiconesculenium)，胡椒(Capsicum annuum)；其它观赏作物，例如郁金香(郁金香属种)、金鱼草(金鱼草属种)、鸢尾(鸢尾属种)、兰花(兰属和卡特来兰属种)、天竺葵属植物；饮料作物，例如咖啡(咖啡数种)和茶(山茶属种)；草本作物，例如薄荷(薄荷数种)、百里香属植物(百里香属种)、半至菜(牛至属种)、秋葵、咖啡、马铃薯、块茎作物、野芋。

E．在植物中表达异源核酸的方法

含有本发明CsVMV启动子的DNA构建物、嵌合基因和表达盒可以用来转化植物细胞，并产生具有所需要表型特征的转基因植物。有众多不同的方法供人们利用，以在转基因植物产生所需要的表型。例如，通过采用本文所述方法，人们可以操作性连接新的基因到CsVMV启动子并转化植物细胞。由转化植物细胞可以产生转基因植物，使得所述新基因产物在所有组织中或只在转基因植物的某些组织中产生。在本文中，术语“新基因”是指在植物中正常不存在或者，假如存在，则在特定的植物细胞组织中通常不能表达的基因。所述新基因的表达可导致产生赋予转基因植物改变表型的蛋白。

因此，本发明设想了在植物细胞中表达异源核酸序列的方法，包括：

a)用含有操作连接到异源核酸序列的根据本发明启动子核苷酸序列的载体转化所述植物细胞；和

b)在所述异源核酸序列在该植物细胞中表达的条件下培养所述植物细胞。

转化植物细胞的方法可以广泛变化并且是不需要如此不限制的。在本文中是描述典型的转化方法。

用于表达的方法包括多种目的，诸如提供在表达和转录该核酸序列时赋予需要的表型的异源蛋白，提供可作为反义分子发挥作用的表达核酸，提供能够调节基因表达或加工核酸的表达核酸的目的；以及在转基因植物中的类似目的。

因此，含有操作连接到异源DNA序列的CsVMV启动子的DNA构建物可用于许多技术方法中，以抑制外源植物基因的表达，例如有义和反义抑制。在反义技术学中，克隆来自所需要的植物基因的核酸区段，并将其操作地连接到CsVMV启动子，使得合成RNA的反义链。然后，该构建物转化到植物中，并产生RNA的反义链。在植物细胞中，已经表明反义RNA抑制基因表达，参见例如Sheehy等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:8805-8809,1988，和Hiatt等，美国专利4,801,340号，这些文献通过引用结合到本文中。

在反义抑制中待导入的核酸区段一般至少与待阻遏的一个或多个内源基因的一部分、一种或多种功能大致相同，但是不必一致。可设计本发明的载体，使得所述抑制作用施加到表现出与靶基因同源或大致同源的家族基因中的其它蛋白上。基因的区段可(1)直接用来抑制不同植物种中的同源基因的表达，或(2)用作获得可以用来抑制所述基因的相应序列的工具。

所述导入序列也不需要是相对于或者原初转录产物或者完全加工mRNA的全长。一般来说，较高同源性可以用来补偿较短序列的使用。此外，该导入序列不需要具有相同内含子或外显子模式，而非编码区段的同源性将同样有效。通常，应该应用大约30或40个核苷酸到大约2,000个核苷酸之间的序列，尽管优选至少大约100个核苷酸的序列，更优选至少大约200个核苷酸的序列，而特别优选至少大约500个核苷酸的序列。

也已经报告催化RNA分子或核酶具有作为抑制内源植物基因表达工具的用途。设计核酶是可能的，所设计的核酶与事实上任何靶RNA均特异性配对，并且在特定位置切割磷酸二酯主链，因此功能性使该靶RNA失活。在进行这种切割时，核酶本身无变化，因此能够再循环并切割其它分子，从而使得它成为真正的酶。这时在反义RNA中包含核酶序列时赋予切割RNA的活性，由此提高该构建物的活性。

已经鉴定了许多类型的核酶。一类核酶衍生自多种小环状RNA，所述环状RNA能够自我切割并在植物中复制。所述RNA或者独立复制(类病毒RNA)或者与辅助病毒一起复制(卫星RNA)。实例包括自鳄梨白斑病类病毒的RNA和自烟草环斑病毒的卫星RNA、紫花苜宿短暂条纹病毒、绒样烟草斑点病病毒、茄斑点病毒和地三叶斑点病毒。靶RNA特异性核酶的设计和应用描述于Haseloff等，Nature,334:585-591,1988。

优选的抑制方法是有义抑制。已经表明导入以有义方向配置的核酸是有效的方法，通过该方法阻断靶基因的转录。关于应用该方法调节内源基因的表达的实例，参见Napoli等，The Plant Cell,2:279-289,1990和美国专利5,034,323号。有义抑制是用于成熟过程控制(例如Acc氧化酶或Acc合酶)、甜度控制(例如ADPG焦磷酸化酶)或颜色修饰(例如苯基苯乙烯酮合酶)的优选方法；参见美国专利5,034,323号。

一般而言，在有义抑制中发生所述导入序列的转录。当所述导入序列本身不含编码序列，而只含有内含子或与存在于内源序列原始转录物的序列同源的非翻译序列时，也发生该效应。所述导入序列一般与计划抑制的内源序列大致相同。该最小同一性通常高于约65％，但是更高的同源性可用于对所述内源序列的表达发挥更有效的抑制。优选高于大约80％的大致更高的同一性，虽然大约95％到绝对同一性是最优选的。该效应可以用于显示同源或大致同源的类似基因家族中的其它蛋白。基因区段可(1)直接用来抑制不同植物种中同源基因的表达，或(2)用作获得可以用来抑制所述基因的相应序列的工具。

在有义抑制中，需要低于绝对同一性的导入序列也不需要相对于或者原始转录产物或者完全加工的mRNA是全长。在短于全长序列中的更高的同一性补偿更长的较低同一性的序列。而且，所述导入序列不需要具有相同的内含子或外显子模式，而同一性的非编码区段可以同样有效的。优选具有至少50个碱基对大小的序列，而更优选更长的序列；参见美国专利5,034,323号。

根据异源序列的性质，可以用多种方法检测到连接到CsVMV启动子的异源DNA序列的表达。例如人们可以检测所需要的表型。根据所导入的表型性状，用多种方法可以测定所需要的表型，该表型在CsVMV启动子控制下产生自异源DNA序列的成功表达。例如通过用除草剂处理可以检测到除草剂抗性。

异源DNA的表达也可以通过测定特定RNA转录产物而检测到。例如可以用RNA酶保护或RNA印迹法进行此过程。假如异源DNA序列编码一种新蛋白，例如通过该蛋白的功能或众多的免疫检测技术可以检测该蛋白产物。例如可以在酶检测中检测具有酶活性的新的蛋白产物。实施例

提供以下实施例是为了说明而不是限制本发明。1．木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子的分离

基本上按照Sambrook等的所述方法(Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Clod Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,1989)，实施分子技术。

核苷酸数目是指由Calvert等(J Gen Virol,76:1271-1276,1995)报告的以及以基因库登记U59751和U20341号公布的木薯叶脉花叶病毒基因组核酸序列。基因库(GeneBank)是美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,Bethesda,MD)下属的国立生物技术情报中心(National Center for Biotechnolgy Information)的国立医学图书馆提供的核酸序列数据库。原始CsVMV全长基因组克隆由R.Shepherd博士(University of Kentucky)提供。通过连接在质粒pCKIZ(Anza,O.,Replication and mapping of caulimoviruses,博士论文，University of California,Dayid,USA,1982)的BglⅡ位点中的唯一的BglⅡ位点处切割的所述全长CsVMV病毒基因组DNA，构建该克隆。用方便的限制位点分离六个重叠片段，每一种片段在质粒pUC119中克隆。通过采用染料标记的引物进行Taq介导的延伸，用Applied Biosystems 373A型测序仪进行自动测序。必要时，进行PCR反应，并进行该PCR产物的直接测序。采用自动测序仪制造商提供的SeqEd软件编译序列资料。

将直接产生自基因组克隆的限制片段克隆到pUC119质粒。采用这些亚克隆，分离含有共有TATA框基元的两种病毒DNA片段(图1)。命名为CVP1的片段包含CsVMV核苷酸7235-7632，而且可通过AluⅠ酶消化获得。用PCR扩增分离含CsVMV核苷酸7160-7675且命名为CVP2的较长的片段。用于该PCR反应的两种寡核苷酸是：引物15’ACCGGTACCAGAAGGTAATTATCCAAGATGT3’(SEQ ID NO 18)(得自核苷酸7160-7183并在其5’末端添加上一个KpnⅠ限制位点的CsVMV序列)和引物25’CGGAATTCAAACTTACAAATTTCTCTGAAG3’(SED ID NO 19)(与核苷酸7652-7675互补并在5’末端添加上一个EcoRⅠ限制位点的CsVMV序列)。该扩增反应含有每种引物25pmol、每种dNTP 200μM、含待扩增序列的质粒DNA 100ng、Pfu聚合酶2.5U和合适的缓冲液(Stratagene)。在94℃进行首次变性5分钟，之后该反应混合物在94℃变性1分钟，再在60℃退火1分钟，及在72℃延长1分钟，重复上述每一过程15个循环。在72℃进行最后延长5分钟。随后用双脱氧核苷酸链终止序列分析(Sequenase-USB)证实所扩增产物的序列准确性。

嵌合质粒pILTAB:CVP1和pILTAB:CVP2(图1)用来研究启动子活性并按下述方法制备。如图1所示，将CVP1和CVP2启动子片段分别连接到pGN100的SmaⅠ和EcoRⅠ/KpnⅠ位点中，pGN100是含有连接到胭脂碱合酶的3’多腺苷酸化信号(nos 3’)的uidA编码序列的pUC119衍生质粒。

通过KpnⅠ/HindⅢ消化，从pILTAB:CVP1和pILTAB:CVP2切下含CsVMV启动子：uidA融合基因的盒，并将其亚克隆在pBIN19双元载体(Clontech)中的KpnⅠ/HindⅢ位点，所述双元载体用于农杆菌介导的植物转化。质粒pe35GN含有增强的35S启动子(Kay等，Science,236:1299-1302,1987)和连接到nos 3’末端的uidA编码序列。质粒pDO432含有得自石楠Photinus pyralis并受35S启动子控制的荧光素酶编码序列，OW等，Science,234:856-859,1986。用于瞬时分析实验的质粒pILTAB:CVP1、pILTAB:CVP2和pe35GN的大小均为大约5.5kb。2．关于CsVMV启动子的转录起始位点

采用从转基因烟草植株回收的总RNA，通过引物延伸分析确定CsVMV启动子的转录起始位点，按实施例4所述制备的的转基因烟草植株包含CVP1:uidA融合基因。

按改变很少的Prescitt和Martin(Plant Mol Biol.Reporter,4:219-224,1987)所述方法，从转基因烟草植株的嫩叶提取总RNA。用含有序列5’-CGCGATCCAGACTGAATGCCCACAGGCCGTCGAG-3’(SEQ ID NO20)的34个碱基对长的寡核苷酸进行引物延伸，所述序列与uisA基因中的ATG起始密码子下游的34个核苷酸区互补。采用6U T4多核苷酸激酶(USB)和7μCi[γ-32P]ATP(3000μCi/mmol,10μCi/μl)进行5’末端标记所述寡核苷酸(20pmol)。标记反应之后，用Nuctrap Push柱(Stratagene)纯化该引物。0.1pmol的标记引物与50μg得自转基因植物的总RNA混合。根据Sambrook等(Molecular cloning:Alaboratory manul,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,1989)所述方法进行该实验，只是在30℃或40℃退火12小时，且用20U的AMV逆转录酶(Gibco-BRL)让该扩增反应在42℃继续进行1小时。在含7M尿素的7.5％聚丙烯酰胺凝胶上分离所述延伸产物。用相同标记引物进行的序列反应物在同一凝胶的相邻泳道中进行电泳。

检测单一的主要延伸产物，且将其作图到位于推定的TATA框下游35个核苷酸的腺嘌呤残基(nt.7604)(图2)。与报道的关于其它植物副逆转录病毒启动子的转录起始位置(Guilley等，Cell,30:763-773,1982；Hay等，Nucl Acids Res,19:2615-2612,1991；Medberry等，Nucl Acids Res,18:5505-5513,1990；和Sanfaon,H.,Virology,198:39-49,1994)比较，本文报道的在nt.7604的转录起始位点代表所述CsVMV转录的5’末端。通过比较得自TATA框的CsVMV启动子的序列与具有花椰菜花叶病毒启动子FMV34和CaMV35S的序列的转录起始位点(Gardner等，Nucl Acids Res,9:2871-2887,1981.17；和Richins等，Nucl Acids Res,15:8451-8466,1987)，我们得出结论：在该区中的这三个启动子彼此间是密切相关的。相反，与得自badnaviruses(ComYMV和RTBV)的启动子的同源性较低。

CsVMV基因组的启动子区的核苷酸顺序标示在图3中，并得到Calvert等(J Gen Virol,76:1271-1276,1995)报道的结果的证实。图3中所示的编号系统是基于转录起始位点，其中+1对应的是本文报告的转录起始位点，为采用基因组顺序编号的nt.7604。因此，CVP1包括从-368位到+20位的387个核苷酸，而CVP2包括从-443位到+72位的514个核苷酸的片段(图3)。

所述CsVVMV启动子序列与副逆转录病毒启动子序列即35S CaMV(Gardner等，Nucl Aacids Res,9:287l-2887,1981)、34S FMV(Richins等，Nucl Aacids Res,15:8451-8466,1987)、RTBV(Qu等，Virology,185:354-364,1991)和ComYMV(Medberry等，NuclAacids Res,18:5505-5513,1990)启动子的比较显示，存在上述的保守TATA框和17个核苷酸的基元AGACGTAAGCACTGACG(从-203位到-219位)(SEQ ID NO 21)，所述基元与35S CaMV、FMV和ComYMV启动子中发现的转录增强子as1高度同源。也鉴定了一个22个核苷酸的序列CTTATCACAAAGGAATCTTATC(从-90位到-111位)(SEQ ID NO 22)，该序列存在于ComYMV启动子，但不存在于RTBV或花椰菜花叶病毒启动子中。这种有限的同源性表示，我们已经分离出一种不同的植物副逆转录病毒启动子。

另外，病毒分类学领域的新进展已经了解了花椰菜花叶病毒CaMV和木薯叶脉花椰菜病毒(CsVMV)之间的差异，并达到已经将CsVMV归于新属的程度。具体来说，病毒分类学国际委员会(ICTV)已经在1997年5月开会，并采用病毒命名的变化，使得CsVMV归于“木薯花叶病毒(cassemovirus)”属，而CaMV归于花椰菜花叶病毒属。

所述变化的基础总结于图4中，该图图示说明众多相关病毒的基因组结构的比较。详细地说，注意到两种主要蛋白(外壳蛋白和移动蛋白)的顺序在基因组上相对于CaMV是相反的，而且被加工成聚合蛋白的这两种蛋白由一个ORF编码，而CaMV上的这两种蛋白由命名为ORF1和ORF4的两个独立的ORF编码，且许多ORF的实际核苷酸序列与CaMV显著不同。

用Macintosh(DNASTAR Inc.,Madison,WI)的DNASTAAR软件包的程序分析病毒序列。采用下述每种病毒株的公开号(括号内)从GeneBank获得所述公布序列：CaMV Strasbourg株(J02048)、CERV(X04658)、FMV(X06166)、SVBV(X97304)、PCSV(U13988)、SbCMV(X15828)、RTBV(M65026)、ComYMV(X52938)、CSSV(L14546)、ScBV(M89923)。

关于CaMV和CsVMV之间的同源程度，注意到所述启动子序列之间有大约23％的同源性，而CaMV与FMV启动子显示大约47％的同源性。同样地，通过ORF1的起始端到ORF5的末端之间的区域的序列对比，CsVMV和CaMV之间有35％的同源性，相比之下CaMV与FMV有56％的同源性。3．原生质体的分离、转化及培养

基本按Kikkawa等(J.Gen.Virol.,63:457-467,1982)所述，从BY-2(烟草，cv.Bright Yellow)细胞悬浮培养物分离烟草原生质体，并用DNA转染。

从木薯(Manihot esculenta L.cv TMS60444)胚性细胞悬浮培养物制备木薯原生质体，Taylor等，Proceedings of the SecondInternational Scientific Meeting of the Cassava BiotechnologyNetwork-CBNⅡ,Bogor，印度尼西亚，第229-240页，1995。收集50ml10天龄的培养物(培养液每2天更换一次)用于原生质体的分离。在酶消化之前，将细胞悬浮在30ml含有0.55M甘露醇、3.2g/L Schenk和Hinderbrandt盐(Sigma)、1×Murashige和Skoog维生素(Sigma)、20mM CaCl₂,pH5.8的培养液(培养液A)中。让细胞沉降，并用补加2％纤维素酶Onozuka RS和0.1％果胶溶酶(Pectolyase)Y23的培养液A组成的酶消化液替代培养液A。在27℃避光进行消化3.5h。在处理的第一个小时轻轻搅动细胞。所述温育混合物顺序通过100μm和70μm的滤网过滤。原生质体在培养液A中通过100×g离心10分钟洗涤3次。用血细胞计数器估计原生质体数。

纯化的原生质体在含5mM Mes、130mM NaCl、10mM CaCl₂、0.45M甘露醇，pH5.8的电穿孔缓冲液中再悬浮为终密度10⁶细胞/ml。将200μl的含本文制备的每一种质粒30μg的电穿孔缓冲液加到0.4cm光程比色杯中的800μl的原生质体悬液中。用基因脉冲发生仪(GenePulse Instrument)(Biorad)以500μF的电容施以300V脉冲，以进行DNA摄取。电穿孔后，所述原生质体在冰中温育30分钟，之后在添加2％蔗糖和5×10^-5M Pichloran的培养液A中以10⁵细胞/ml的密度再悬浮。在27℃避光温育24小时后，通过离心(10分钟，100×g)收集原生质体，并再悬浮在pH7.7 GUS提取缓冲液中，Jefferson等，EMBO J,6:3901-3907,1987。4．用农杆菌的植物转化

将存在于pBIN19质粒并按实施例所述制备的基因构建物通过电穿孔导入到根癌农杆菌菌株LAB4404,Singh等，Focus,15:84-87,1993。根据Horsch等(Plant Molecular Biology Mannul，第A5/1-A5/9页.Kluwer academic publishers,Dordrecht,1988)所述方法，用修饰的农杆菌来感染烟草cv Xanthi NN叶圆盘。将再生的卡那霉素抗性植物转移到土壤并在温室中生长。产生了7种含所述CVP1构建物的独立转基因系和8种含所述CVP2构建物的转基因系。让温室生长的植物自花受精，并收集R1种子。R1种子在含卡那霉素的Murashige和Skoog(MS)培养基(Murashige等，Physiol Plant,15:473-497,1962)上萌发，且幼苗生长在温室中。5．用粒子轰击的植物转化

从木薯小植株(栽培品种Mcol 1505)切下叶和茎，所述小植株体外生长在含MS盐和维生素、蔗糖20g/L、CuSO42μM、Phytagel 3g/L,pH5.7的培养基上。将外植体切片，随后将该组织段在含固化培养基的9cm的培养皿中排列。用氦驱动粒子传递系统(PDS1000/He-BioRad)进行微粒子轰击。基本上按照使用说明书(BioRad)制备金粒子(平均直径为1.6μm)和包被DNA的粒子。将靶平板置于从底部计起的第三层(level)的枪室中，同时组装的大载体/终止屏置于第五层。每一平板用大约1μg质粒DNA以1100PSI的压力枪击2次，所述质粒DNA按实施例中所述制备。轰击之后，将无菌水加到平板中，以防止材料干燥。在组织化学GUS检测之前，外植体于25℃避光培养2天。

通过如Li等(Plant Cell Reports,12:250-255,1993)所述的粒子轰击，用与pMON410(Monsanto Co.)结合的pILTAB:CVP2，获得7个转基因水稻品系(Oryza sativa L.Taipei309)；pMON410携带潮霉素抗性基因。6．荧光素酶和萄萄糖醛酸糖苷酶分析以检测CsVMV启动子活性

在pH7.7的GUS提取缓冲液中，通过涡流搅拌2分钟裂解转染的原生质体。在微型离心机中于4℃离心(5000×g,5min)澄清提取物。回收上清液用于MUG和LUC检测。采用4-甲基-伞形基-β-D-葡萄糖醛酸(MUG-Sigma)，通过Jefferson等(EMBO J,6:3901-3907,1987)的方法测定GUS活性，并将50μl的提取物以pmol甲基伞形酮(MU)每小时定量。在50μl的相同蛋白提取物中，采用荧光素酶检测(AnalyticalLuminescence Laboratory,San Diego,CA)，应用发光计(Monolight2010)测定LUC活性。用uidA基因加荧光素酶质粒共转染细胞，允许我们实验之间的GUS活性的变异归一化，Leckie等，BioTechniques,17:54-57,1994。所述归一化数据表示为pmol甲基伞形酮(MU)每小时每单位发射光。

转基因植物组织在pH8的GUS缓冲液中研磨，并按Jefferson等(EMBO J,6:3901-3907,1987)所述测定GUS活性。所述酶活性(pmol/min)是指按Bradford,M.(Anal.Biochem,72:248-254,1976)所述的染料结合法测定的mg蛋白。

基本上按照Jefferson等(EMBO J,6:3901-3907,1987)所述进行GUS活性的组织化学分析。取自原代转化体或R1子代的叶及茎的小片段在含1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡萄糖苷酸(X-gluc)、100mM pH7磷酸钠缓冲液，pH7.2、2mM亚铁氰化钾和铁氰化钾以及0.1％Triton-100的反应缓冲液中，于37℃温育4-8小时。根和花器官在无氰化物盐而含0.1％巯基乙醇的相同培养液中培养，以减少组织褐变。取手工切片在70％的乙醇中洗净。在Zeiss显微镜下观察染色切片。7．用CsVMV启动子表达外源基因

a．在烟草和木薯原生质体中的表达

在瞬时分析实验中用得自细胞悬浮培养物的烟草和木薯原生质体测试启动子片段CVP1和CVP2。在该实验中，我们采用质粒pILTAB:CVP1和pILTAB:CVP2。含受增强35S启动子(e35S)(Kay等，Science,236:1299-1302),1987)控制的uidA序列的质粒pe35GN用作阳性对照。每一种质粒与含受CaMV 35S启动子(Ow等，Science,234:856-859,1986)控制的荧光素酶基因的质粒共转染到原生质体中。在每一转染实验后测定GUS/LUC的比率。进行了4次独立的转染实验，获得类似结果并总结在图5中。在烟草原生质体中，对于CVP1启动子，GUS/LUC比率为0.58，或者，由e35S启动子(1.32)测定的表达水平为大约50％。然而，当使用所述CVP2片段时，该比率为1.3，或者活性高于CVP12倍。这两个片段间的差别表明，CVP1缺乏一个或多个用于高水平表达的重要元件。CVP2和e35S启动子产生类似的GUS活性，表明所述CsVMV启动子在烟草原生质体中是强启动子。在木薯原生质体中类似研究获得的结果与烟草结果相似，表明所述CsVMV启动子在这些细胞中也是非常有效的。

b．在烟草和水稻植株中的表达

如本文所述，获得了7个含CVVP1启动子-uidA基因融合物的转化烟草品系和8个含CVP2启动子的转化烟草品系。由原代转化体(由转基因愈伤组织再生的植物)的PCR分析证实存在全长的基因盒。

采用原代转化体及其R1子代的各种器官的新鲜组织手工切片进行GUS积聚的详细组织化学分析。尽管染色强度在不同转化体中有不同，但是含有或者所述CVP1或者CVP2片段的所有烟草植株基本上具有相同的基因模式。在叶子中，在中脉和侧二级脉的韧皮部组织中观察到强GUS活性(图6A和6B)。尽管中脉的薄壁组织细胞不含可检测的GUS活性(图6A和6B)，只是除紧靠表皮下的绿色组织细胞外(图6C)，但邻近木质部分子的薄壁组织细胞也发生蓝色染色图案。尽管在表皮中的保卫细胞和毛状体、尤其是腺顶端细胞出现强染色，但在叶片的栅栏层和叶肉细胞显示非常强的染色(图6A和6C)。非特异化表皮细胞几乎不积聚染色剂或无染色剂。茎的横截面切片显示韧皮细胞强染色，包括位于中髓组织的内生韧皮束和位于木质部外部的韧皮细胞(图6D)。在木质部薄壁组织细胞中也可见到较弱的表达。在髓细胞或茎的皮质薄壁组织细胞中检测不到GUS染色(图6D)。与X-Gluc温肓的根组织显示染蓝色的维管柱(图6E)；由于该组织易碎的特性未取其横截面切片。根尖是根部区域染色最深的(图6E)。在花中，子房的基部显示强蓝色染色。花组织的维管分子在雄蕊、子房内的花柱和胎座(图6F)以及在萼片和花瓣中显示强染色。花粉粒也显示蓝色。R1幼苗与所述R0亲代转化体一样产生相同染色总体模式，只是子叶叶肉中的GUS活性较成熟叶小一些。

在含CVP2:uidA基因的7个独立转化的水稻品系中以类似的方式进行检测GUS活性的组织化学分析。所述CVP2启动子：uidA基因的一般模式在水稻和烟草中非常相似，尽管这些植物的解剖学有差异。与X-Gluc底物温育的叶子横向切片在维管束和叶肉细胞中产生强染色(图6G)。尽管后生木质部管状分子和较大的筛管分子似乎无任何蓝色沉积物，但是小韧皮部薄壁组织细胞和木薄壁组织细胞显示强染色。维管束鞘细胞、泡状细胞和厚壁组织纤维也无染色。在叶表皮中保卫细胞和叶毛细胞显示染色。叶鞘组织的横截面切片(图6H)中显示的GUS活性模式与在叶中观察到的模式类似。正如在烟草植株观察到的一样，在薄壁组织细胞中检测不到GUS活性(图6H)。根只在其维管柱和根尖被染上色。水稻花组织基本上与烟草花具有相同模式的GUS活性(图6I)。

在按所述实施例中所述的方法制备的烟草和水稻转化体中，采用4-甲基-伞形基-β-D-葡萄糖苷酸(MUG)荧光检测法(Jefferson等，EEMBO J,6:3901-3907,1987)，定量测定由不同器官制备的提取物中的GUS活性。所测试的器官包括嫩叶、成熟叶、茎和根。这些检测的结果显示在图7，且证实所述CssVMV启动子在水稻和烟草的所有器官中均是有活性的。该CsVMV启动子在叶中的活性高于其它器官，而在根中的表达水平最低。在含CVP2启动子的烟草植株中的GUS活性不表现出明显强于含CVP1启动子的植株。由于所述转基因表达的变化、所述MUG检测的相对易变性和导致蛋白在植物组织中积聚的GUS的高度稳定性，在转基因植物中，在原生质体测定的CVP1和CVP2之间的启动子活性的两倍差异可能检测不到。

c．在木薯植物外植体中的瞬时表达

在木薯植物中，通过微粒轰击得自体外生长材料的茎和叶外植体，测试图1中所示的CVP2片段的启动子活性。质粒pILTAB:CVP2和质粒pe35GN(作为阳性对照)用于该研究，并按实施例5中所述通过轰击进行转化。因此，用实施例6的组织化学方法分析小植株的组织表达。采用含有二者中任何一种启动子的质粒发现，显示GUS表达的染强蓝色的斑点数大致相同。在表皮细胞、保卫细胞、叶肉细胞和沿小叶的叶脉发现染蓝色的细胞。这些实验提供在木薯的不同细胞类型中CVP2片段的启动子活性的证据。8．实施例1-7的讨论

所述实施例描述了从新的特征鉴定的木薯叶脉花叶病毒的病毒基因组中分离启动子，Calvert等，J Gen Virol,76:1271-1276,1995。采用从含pCsVMV-uidA基因的转基因植物中分离的RNA，确定该启动子的转录起始位点。本文结果表明，该CsVMV启动子在烟草和木薯原生质体中相对较强，且其活性类似于用e35S启动子获得活性。在原生质体中所测试的2个启动子片段中，其中较短片段CVP1的活性大约低于较长的CVP2片段两倍。然而，两个片段在转基因的烟草和水稻植株中均产生相同的表达型。在原生质体中观察到的表达水平的不同可能是由较长片段的5’区中的转录加强子或较长的不翻译的前导序列引起的。

相比之下，注意到CaMV前导序列的前60个核苷酸(从+1到第一个ATG)刺激下游基因表达增加约2倍(Dowson等，Plant Mol Biol,23:97-109,1993；和F tterer等，EMBO J,9:1697-1707,1990)。关于东格鲁水稻杆菌状病毒(RTBV)启动子的非翻译前导序列的类似效应已经报道，F

tterer等，EMBO J,9:1697-1707,1990。然而，CsVMV前导序列与CaMV前导序列或RTBV前导序列之间存在有限的序列同源性。转基因植物的分析表明，与花椰菜花叶病毒启动子的情况一样，CsvMV启动子在所有器官和各种类型细胞中都有活性。CsVMV启动子在水稻和烟草植株的维管组织、叶子的叶肉细胞和根尖中强表达。然而，在烟草髓和皮质薄壁组织的非叶绿素细胞中无GUS活性。这可能表明CsVMV启动子具有两个主要活性域，即维管分子和绿色的含有叶绿体的细胞。然而我们不能排除这些观察结果是由于染色检测法的限制引起的可能性。与具有致密胞质的小细胞相比，几乎没有胞质的大细胞(例如薄壁组织细胞)可能看起来几乎不含有或没有染料。同样，具有不同代谢活性的细胞可能染色强度不同。

本文的数据表明，CsVMV启动子在原生质体和转基因植物中的表达相对类似于35S启动子。然而，CsMMV启动子的核苷酸序列与花椰菜花叶病毒启动子的同源性有限，这可能意味着该启动子的调节机制不同。分析CsVMV启动子序列表明存在几种基元，所述基元类似于以前鉴定的与转录调节有关的顺式元件。在CsVMV启动子存在这类基元可以解释转基因植物中的表达型。在CsVMV启动子的nt-203到nt-219中，鉴定了与CaMV 35S启动子as1元件高度同源的16个碱基对的基元(Lam等，Proc Natl Acad of Sci USA,86:7890-7894,1989)。特征为TGACG同向重复的as1元件结合到AS1核因子(Fromm等，Plant Cell,1:977-984,1989)以及克隆的TGAl转录因子(Katagiri等，Mol CellBiol,12:4809-4816,1992)，且该元件指导根特异性基因表达(Benfey等，EMBO J,8:2195-2202,1989)。CsVMV启动子在根中的表达类似于CaMV 35S(Benfey等，EMBO J,8:2195-2202,1989)和ComYMV启动子(Medberry等，Plant Cell,4:185-192,1992)诱导的表达，这两种启动子均含有as1元件。虽然在花椰菜花叶病毒启动子中，as1基元一般紧邻TATA框(在35S CaMV启动子中的n.t.-83到-63；在FMV启动子中为-57到-73)，但是在CsVMV启动子中as1基元位于位置-203到-219。然而，在ComYMV启动子中，as1基元位于核苷酸-205到-227之间，且不是根活性必需的(Medberry等，Plant J,619-626,1993):提示在ComYMV启动子在根部的表达调节中涉及另外的元件。必需另外的研究，以确定as1元件相对于TATA框序列的位置是否调节其在根基因表达中的作用。

在位置-90到-111鉴定了一个22个核苷酸的序列CTTATCACAAAGGAATCTTATC(SEQ ID NO 23)，该序列存在于ComYMV启动子相同的相对位置(n.t.-78到n.t.-100)，但是在其它植物副逆转录病毒启动子中无该序列。在ComYMV启动子中该基元位于在维管组织表达所需要的区中，Medberry等，Plant J,619-626,1993。CsVMV启动子也包括基元AAGATAAGG(n.t.-186到-194)，该基元包含存在于Rbcs基因启动子中的框I共有序列GATAAG,Donald等，EMBO J,9:1717-1726,1990。另外，在位置-257到-263鉴定出的序列GTAGAAA与MNF1叶子特异性核因子的结合位点序列相同，序列GTAGAAA发现于PEPc基因启动子以及35S启动子中，Yanagisawa等，Plant Mol Biol,19:545-553,1992。这些基元可能参与在叶肉细胞CsVMV启动子的强基因表达。核苷酸-170到-130(图3)含有类似于所述SV40增强子核心序列GTGGAAAG的两种基元，Ondek等，EMBO J,6:1017-10251987。9．CsVMV启动子缺失构建物的制备

通过进行性5’末端缺失和内部缺失，使CsVMV启动子突变。

用于该研究的起始质粒是含有从位置+72延伸到-443的CsVMV启动子片段的pILTAB:CVP2,Verdaguer等，Plant Mol Biol,31:1129-39,1996。由于在所述CsVMV启动子片段中缺乏便利的限制位点，使用聚合酶链式反应(PCR)来产生一组5’末端和内部缺失。

通过PCR扩增直接获得该启动子的5’末端缺失。我们应用在该启动子的3’末端杂交的共用反向引物P1’(表1)，该引物与CsVMV特异性引物P2、P3、P4、P5及P6成对(表1)，以产生具有野生型CsVMV启动子序列各种缺失的命名为B、C、D、E及F的5种启动子片段。

                      表1名称      序列(5′to 3′)               位置              有义            SIDP1    GCTCTAGACCAGAAGGTAATTATCCAAG      -443/-423          +               24P2    TATGGATCCTATGTTCAAAAATGAAG        -330/-312          +               25P3    AAAGGATCCTGAAGACGTAAGCACTG        -222/-206          +               26P4    AGAGGATCCGGTCGGTGATTGTGAA         -178-/163          +               27P5    AAAGGATCCTTATCACAAAGGAATC         -112/-95           +               28P6    TATGGATCCGTGTCATTTTTGCCCTTG       -63/-43            +               29P1′  CGGAATTCAAACTTACAAATTTCTCTAAG     +72/+50            -               30P2′  TAAGGATCCTTTCCGCCCTTACATT         -116/-132          -               31P3′  CATGGATCCTCTATGTCTCTTTCAC         -149/-168          -               32P4′  ACAGGATCCGACCTTATCTTCT            -173/-187          -               33P5′  ACCGGATCCTCTTCTTTTCATTGTTC        -182/-199          -               34P6′       TCAGGATCCTTTTCTTCGCCTGGT         -228/-243        -         35P7′       ATAGGATCCATATGTGCCGCATA          -334/-348        -         36

表1说明用通过PCR扩增产生Cs VMV启动子片段的寡核苷酸引物。“SID’是指SEQENCE ID NO。引物含有有义(+)或反向(-)CsVMV启动子序列。注释了图3中显示的相对于转录起始位点的引物坐标。与P2-P6结合的引物P1’用来产生5’末端缺失的CsVMV启动子。同样地，与P2’-P7’结合的P1用于3’末端缺失。虽然其它引物在5’末端具有一个BamHⅠ位点，但是P1和P1’在其5’末端分别含有XbaⅠ和EcoRⅠ位点。限制位点用粗体字母标示。

在商业卖主(Gibco BRL Life Technology,Inc.)的自动合成仪上，用亚磷酰胺化学合成法制备表1中的寡核苷酸引物。

产生的PCR扩增片段在位置+72具有共用3’末端，以及其5’末端分别在位置-330、-222、-178、112、-63(图8)。也用引物P1和P1’(表1)再合成全长的启动子片段(A片段)。用100ng pILTAB:CVP2、2.5UTaq DNA聚合酶(Gibco-BRL)和标准浓度的引物、MgCl2及dNTP进行PCR反应。进行20个循环(94℃,30s；56℃,30s；72℃,30s)的扩增，最后在72℃延伸5分钟。所扩增的5种DNA片段中的每个用BamHⅠ和EcoRⅠ消化，并连接到含有uidA基因编码序列(编码β-葡萄糖醛酸糖苷酶-GUS)的质粒的相同位点，所述uidA基因连接到胭脂碱合酶基因的3’端多腺苷酸化信号(图8)。产生的质粒根据它们携带的启动子缺失命名为pA、pB、pC、pD、pE、pF(图8)。

以两步法构建内部启动子缺失。首先，按如上所述进行PCR反应，以产生一组3’端缺失的CsVMV启动子。将在启动子5’末端杂交的有义引物(P1，表1)与6种特定CsVMV反向引物(P2’-P7’，表1)中的一一配对，以产生在位置-443的共用5’末端以及从位置-116到-334跨度的3’末端点的6种截短启动子。然后，通过把5’端缺失启动子上游的不同3’末端截短启动子克隆到先前获得的质粒(pB到pF)中，从而工程制备内部缺失。相应地，包含核苷酸-443到-334的3’缺失启动子片段用BamHⅠ和XbaⅠ消化，并连接到所述pC质粒中的相同位点。所产生的命名为pΔB的质粒包含从核苷酸-334到-222的内部缺失(图8)。同样地，将从核苷酸-443到-228的片段融合到D启动子片段，产生质粒pΔC(图8)。在-443具有共用5’末端、而3’末端位于位置-182、-173和-149的三种片段各自克隆到质粒pE中，分别产生质粒pΔD1、pΔD2和pΔD3(图8)。将相同的三种片段克隆到pF中，产生质粒pΔDE1、pΔDE2和pΔDE3(图8)。用同样方法将含核苷酸-443到-116的片段克隆到质粒pF中，产生质粒pΔE(图8)。所有启动子序列均用二脱氧核苷酸序列分析证实。所述不同CsVMV启动子-uidA融合基因用XbaⅠ和HindⅢ切下，且连接到用于农杆菌介导植物转化的pBin19双元载体的相同位点。10．CsVMV启动子缺失构建物的表达分析

a．用农杆菌转化植物

携带缺失启动子构建物的pBin19衍生质粒通过电穿孔转移到根癌农杆菌菌株LBA4404中。如前所述进行农杆菌介导的烟草cv XanthiNN的转化，Horsch等，Plant molecular biology manul，第A5/1-A5/9.Kluwer academic publishers,1988。再生的卡那霉素抗性植物在温室中生长成熟并允许自花受精。R1种子在含有100mg/l卡那霉素的Murashige and Skoog(MS)培养基(Murashig & Skoog,PhysiolPlant,15:473-497,1962)中萌发，之后转移到温室土壤中。对于每一种构建物产生10-20种独立转基因系。对于每一种启动子构建物分析10种独立R1系。

b．组织化学分析在嫩幼苗中的CsVMV表达

为了分析所述缺失启动子在发育早期的表达型，对质粒转化10天龄的幼苗进行组织化学GUS分析。

收集植物顶部的展开嫩叶用于GUS分析。取新鲜组织切片，置于在含1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡萄糖苷酸(X-gluc)、100mM pH7磷酸钠缓冲液、2mM亚铁氰化钾和铁氰化钾以及0.1％Triton-100的反应缓中液中，于37℃温育6-12小时。为了嫩R1幼苗的GUS组织化学分析，收集萌发后一周左右的完整小植株，并将其侵入在GUS缓冲液中，Jefferson等，Embo J,6:3901-7,1987。在几分钟的真空浸润后，于37℃温育过夜。样品在70％乙醇中洗涤几次清洗干净。如Jefferson等(Embo J,6:3901-7,1987)所述，用底物4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖苷酸(MUG)进行定量GUS分析。

在转化的转基因烟草植株中，用GUS活性的组织化学染色法分析不同启动子构建物的表达型。用PCR和/或Southern分析，证实存在完整的启动子：uidA基因盒。在含有相同启动子构建物的植物之间所观察到的GUS表达型相似，仅有下面报告的几个例外。在一些启动子构建物之间可以清楚见到显著且可重复的染色强度的不同。在本研究中测试的植物含有1-5个拷贝的uidA融合基因。拷贝数不影响用每种构建物所观察到的特征性表达型。而且，在拷贝数与染色表观强度之间未观察到明显的关系。启动子之间的不同染色模式表明缺失对启动子调节的影响。CsVMV启动子在转基因植物的所有器官表达。最高启动子表达的区域位于维管分子、叶和根尖的叶肉细胞。相应地，分析这三种不同组织中GUS活性，所得结果总结于表2。

            表2

启动子      叶肉 韧皮部 根尖-443        pA    +    +    +-330        pB    +    +    +-222        pC    +    +    +-178        pD   (+)   +    --112        pE    +  (+/-)  --63         pF    +    -    --334/-222   pΔB  +    +    +-228/-178 pΔC        +    +     +-182/-112 pΔD1       +    +     +-173/-112 pΔD2       +    +     +-149/-112 pΔD3       +    +     +-182/-63  pΔDE1      -   (-)    +-173/-63  pΔDE2      -  (+/-)   +-149/-63  pΔDE3      -  (+/-)   +-116/-63  pΔE        +    +     +

表明了表2中所示的各构建物d启动子构建物名称和缺失终点。评价所检测到的GUS活性表达水平并以4个水平报告于表2中：“+”：与全长启动子(即pA)无可见的区别；“+/-：染色强度低于全长启动子；“(-)”：很少表达；“-”：无可检测的染色。

a)5’末端缺失：

在携带缺失到位置-222的启动子构建物的转基因植物中出现相同模式的GUS染色，并且与用全长启动子(构建物pA，图9A)所观察到的染色强度范围相同。该启动子再缺失到位置-178(构建物pD)引起GUS表达型的重要变化(表2)。在大多数携带pD构建物的植物的叶子横截面切片中，观察到局限于维管分子的强染色(图9B)。在栅栏叶肉细胞和叶肉细胞中未检测到可检测的GUS活性。然而10种中的3种植物品系在叶肉细胞中呈现浅染色。在用pD构建物转化的所有植物中，根尖未显示GUS染色(图9I)，而具有所述全长启动子的该组织强染色。由缺失到位置-112的启动子构建物pE引起的GUS表达限于维管分子(表2，图9C)。该表达的强度非常低，并需要长时间温育来检测蓝色沉淀物。构建物pF不显示任何可检测的表达。本研究表明，器官特异性功能可能归因于不同的启动子区。尽管核苷酸-443到-222区看来不是启动子活性必需的，但是-222到-178的区在叶肉细胞以及根尖中明显地引起启动子表达。虽然缺失到位置-178的启动子包括维管表达所必需的所有元件，结果它在绿色组织中几乎无活性。pE构建物显示非常低的维管表达。用pD构建物观察到的强维管表达可能是由或者该区中的强维管元件引起或者存在于该区中的非特异性激活剂引起，所述激活剂影响存在于该E启动子中的维管元件。

b)内部缺失

核苷酸-334到-222区的内部缺失(启动子ΔB)不影向所述CsVMV启动子的总体表达型(表2)。在用pΔC转化的的植物叶肉组织中观察到GUS表达显著降低(表2，图9D)。与由5’末端缺失获得的数据一致，该结果表明-222到-178区含有控制绿色组织中启动子表达的重要元件。然而，在测试的所有植物品系中观察到叶肉细胞染色密度低，提示在该细胞类型的启动子表达中也涉及次要作用的其它元件，推定所述元件位于包含核苷酸-443到-222的区中。另外，所述维管元件显示强染色，提示该组织中的启动子活性不受这种缺失的影响(图9D)。pΔC构建物不抑制在根尖的表达。这提示，除了(-222/-178)区外，在该组织的启动子表达中可能涉及位于(-443/-222)区的另一个元件。缺失自-182到-112的缺失(构建物pΔD1)对启动子表达有显著影响(表2)。实际上，构建物pΔD1显示在维管分子中仅有弱染色的维管特异性表达分布型(图9E)。另外，在根尖也观察到GUS表达。该启动子构建物含有涉及较早期定义的叶肉组织表达的结构域的大部分。在pΔD1缺失的情况下，该叶肉域不能激活所述绿色组织中的启动子。此结果可能是由于缺失位于核苷酸-182与-112之间、且为所述叶肉域启动子激活所需要的一个或多个的顺式元件所致。构建物pΔE显示类似于非缺失启动子的组成型表达型(表2，图9G)。用该构建物观察到的强维管表达提示，对于维管组织中的强启动子表达不需要较早提及存在于(-112/-63)区中的维管分子。因此，重要的维管功能可能归因于(-178/-112)区。包括核苷酸-182到-63的内部缺失(pΔDE1)对启动子活性有明显的影响(表2)。所测试的10个独立转基因植物中，8个在叶子和茎中没有任何可检测的GUS活性。延长温育后，在两个植株中观察到定位于韧皮部分子的非常淡的蓝色点(图9F)。相反，根尖显示强染色以及根部的维管分子较弱的染色。这些结果一定程度上与上述数据一致。实际上，pΔDE1启动子未含有维管表达的区(-178到-63)以及在叶肉组织表达所需要的区(-182到-112)。推测在根组织中检测到GUS活性是因为存在在根尖表达中涉及的(-443/-182)区。

c)(-178-112)启动子域

所述5’末端缺失的结果突出了(-182/-112)区对于所述CsVMV启动子组成型表达的重要性。缺失pΔD1实际上抑制叶肉组织中的启动子活性，同时也减少维管表达(图9F)。结果是，我们制备了构建物ΔD2和pΔD3以便更详细地研究该区(表)。从核苷酸-173到-112缺失的构建物pΔD2显示类似于全长CsVMV启动子的表达分布型(图9G)。该结果提示，在(-182/-112)缺失的5’终点加上9个核苷酸可以恢复用构建物ΔD1改变的完全表达型。有趣的是，这9个核苷酸含一个GATA基元。在叶肉细胞观察到最为显著的不同，所述叶肉细胞当用ΔD1构建物转化时不显示任何蓝色。因此，从-182到-173的区是叶肉表达所必需的。在构建物pΔD2和pΔD3之间未检测到显著差别。

相反，分别将序列-182/-173和-182/-149加到pΔDE1以产生pΔDE2和pΔDE3，并不会引起启动子活性的恢复(表2)，只是根尖除外。在用pΔDE2和pΔDE3转化的植物中，虽然在维管分子中的表达非常低，但是在叶肉细胞中未观察到GUS染色(图9E)。构建物pΔD2和pΔD3与构建物pΔDE2和pΔDE3的比较暗示对于总启动子活性而言(-112/-63)区的重要作用。然而，如比较pΔDE3和pΔE时所提示的(表2，图9E和9F)，加接(-149/-116)区可抑制该区缺失的明显的作用。这些结果表明，从-222到-173的上游区不能单独获得完整组成表达型。存在功能上冗余且与上游区(-222到-173)结合的或者(-149/-116)区(通过pΔD3显示)或者从-112到-63(通过pΔD2和pΔD3显示)的区，对于所有组织中的CsVMV启动子的最佳活性是必需的。

我们的结果表明(如比较pΔE和pΔDE3所显示)，(-149/-116)区可能引起用所述截短启动子D观察到的强维管表达。

所述缺失启动子构建物指导类似于在成熟植物观察到的特异性表达型。在子叶的叶中，在成熟植物展开叶中赋予维管特异性表达型的构建物pD、pE、pΔD1，只在维管分子中表现出GUS染色模式(图9H)。同样地，在烟草植株的叶肉和维管组织具有活性的pB和pC构建物在幼苗中具有相同组成表达型(图9H)。这些结果提示，在转基因植物中用不同缺失观察到的特异性表达型不受植物发育阶段的影响。

c．在转基因幼苗植株中的表达

用荧光检测法定量测定由叶组织制备的蛋白提取物中的GUS活性，Jefferson等，Embo J,6:3901-7,1987。从按实施例10.a)中所述制备的5周龄转基因烟草植株展开嫩叶的叶脉间(interveinal)组织收集样品。结果检测到的酶活性水平主要反映叶肉组织中的所述启动子表达。如图10所示，携带相同启动子构建物的不同转基因系的GUS活性值最大变化17倍。转基因表达的变异可能归因于包括反映周围染色质对基因表达影响的推定位置效应、拷贝数或基因沉默的因素的组合。这些数据证实了转基因植物中GUS表达的组织化学定位数据。在携带启动子构建物pΔD1、pΔDE1、pΔDE2和pΔDE3的植物的提取物中检测到最低GUS活性水平。该结果与所述组织化学分析一致，因为这些缺失构建物在转基因植物叶肉细胞中不表达报告基因，但是维管分子中显示弱GUS染色。相应地，这些缺失的GUS活性水平低于用构建物pB和pC检测到的水平大约20倍，所述pB和pC在转基因植物中显示强组成表达型。如构建物pD所示，假如缺失从-222到-178的序列，发现活性水平显著下降。同样，内部缺失从-222到-178的序列将用高表达构建物pB或pC检测到的GUS活性水平降低5倍。这些结果突出了从核苷酸-228到-178的区对于绿色组织中的启动子表达的作用。

用构建物pΔD2和pΔD3检测到的平均活性水平高于pΔD1构建物。然而，pΔD3活性水平在较高范围内，而构建物pΔD2产生中等水平的表达。应用组织化学检测法检测不到这一不同。构建物pΔD2在转基因植物的叶肉细胞中表达，但是根据荧光检测，GUS染色观察过高估测该启动子构建物的活性水平是可能的。结果荧光GUS检测提示，包括核苷酸-173到-149的区对于绿色组织中的表达水平是重要的。正如用组织化学检测观察到的，缺失核苷酸-112到-63的区(构建物pΔDE3)消除用构建物pΔD3检测到的高表达水平。然而，尽管缺失包含核苷酸-116到-63的区(构建物pΔE)，仍然检测到高水平的GUS活性，提示从-149到-116的区对于高水平启动子活性是有用的(如比较pΔDE3和pΔE时所示)。

d．原生质体的分离、转化和培养

基本按Watanabe等(FEBS Letters,219:65-69,1987)所述方法，从BY-2烟草悬浮细胞制备原生质体并用DNA转染。从生长于生长室的5周龄植物的完全展开叶中分离烟草叶肉原生质。通过浸入5％chlorox液中5分钟，然后用无菌水洗涤3次，从而使该叶子表面消毒。所述叶子在层流通风柜中干燥，并通过去皮去除下表皮。去皮的叶片在0.6M甘露醇中洗涤，然后转移到含1.5％纤维素酶R10、0.3％离析酶R10和0.6M甘露醇，pH7.5的酶溶液中。在28℃进行消化12-16小时。消化混合物通过一层Miracloth过滤，随后在医用离心机以300rpm离心10分钟。收集上清夜并用同所述同样设定离心第二次。原生质体离心球团用20％蔗糖溶液再悬浮并转移到50ml容积的容量瓶(volumetricflask)。所述容量瓶在J6B Beckman转子中以100g离心7分钟。用Pasteur移液管收集漂浮在所述蔗糖溶液表面的完整圆形原生质体，并用血细胞计数器计数。大约1×10⁶原生质体用于各次电穿孔。

在600μl含0.55M甘露醇、5mM MES、70mM KCl、pH5.8的电穿孔缓冲液中再悬浮叶肉原生质体。30μg质粒DNA和用作内标准品的30μg 35S-荧光素酶构建物(Ow等，Science,234:856-859,1986)加到原生质体溶液中，且用BioRad基因脉冲发生器在200伏和250μF下进行该DNA转移。在施加脉冲后，让所述原生质体在冰中沉降1小时。原生质体在培养基中以10⁵细胞/ml的密度培养，所述培养基含0.4M甘露醇、30％蔗糖、4.3g/l MS盐、10mg/l盐酸硫胺素、5mg/l烟酸、10mg/l盐酸吡多醇、100mg/l肌醇、2mg/l甘氨酸、2mg/l NAA、0.5mg/l BAP,pH5.8。于25℃培养24小时后收集原生质体用于蛋白质提取。

如上所述，对原生质体蛋白提取物进行MUG和LUC检测。结果以CsVMV启动子构建物的GUS活性与内部对照的LUC活性之比表示。

e．CsVMV启动子构建物在原生质体中的表达

如实施例10中所述，用CsVMV启动子构建物转染由BY-2悬浮细胞以及烟草叶的叶肉细胞制备的原生质体。在电穿孔之后24小时时，如实施例6所述检测相对于共转染的荧光素酶质粒表达的内标准品的GUS瞬时表达。每个原生质体系统进行4次独立转染实验。所获得的结果总结于图11。

在BY-2原生质体中，含有缺失到位置-222的CsVMV启动子的构建物pC保留全长启动子片段活性的88％。该启动子进一步缺失到位置-178时，其启动子活性迅速下降到只有完全活性的24％。尽管缺失延伸至位置-63时观察到活性第二次下降，但构建物pD和pE几乎具有相同的表达水平。具有12％的完整启动子活性的构建物pF刚好高于背景水平。自核苷酸-228到-178的内部缺失(构建物pΔC)使总表达下降大于50％。令人惊奇的是，在转基因植物中非常低表达的构建物pΔD1和pΔDE1提供高水平表达。该结果与我们在植物中观察到的截然相反，可能反映了在两个系统中所使用的细胞类型不同，即得自完整植物的分化细胞与得自细胞培养物的未分化细胞。为了阐明该问题，我们用叶子叶肉原生质体进行转染实验。自-443到-222的5’缺失(构建物pC)引起启动子表达下降35％。构建物pD的GUS活性仅仅是全长启动子活性的15％，而构建物pF的活性水平并不高于背景。就BY-2细胞而言，在叶肉原生质体中(-228/-178)内部缺失的作用是显著的。实际上，当使用构建物pΔC时，GUS表达水平下降到28％。构建物pΔD1保持全长启动子活性的57％，它大致与构建物pΔE的活性相同(未在BY-2细胞测试)。测得所述ΔDE1启动子的活性为非缺失CsVMV启动子水平的43％。

在两种原生质体系统中，当通过或5’端缺失或内部缺失去除自-222到176的序列时，观察到基因表达显著下降。我们可以估计该区在原生质体中负责大约60％的启动子表达。pD和pE的低活性在某种程度上与得自转基因植物的组织化学数据一致，这些构建物在转基因植物中表现出维管特异性表达型。

构建物pΔD1恒定产生全长启动子GUS活性的50％以上。虽然该构建物与pΔE在植物中的表达水平非常不同，但是在叶子叶肉原生质体中它们的活性相同。同样地，构建物pΔDE1产生与在转基因植物获得结果不一致地高水平表达。基于这些结果，我们得出结论，在原生质体中的控制CsVMV启动子活性的调节机制不同于在植物中起作用的机制。(-222/-178)区在原生质体中起着关键作用，而自-178到-63的区看来在原生质体具有的作用较在植物中的作用小。11．实施例9-10讨论

进行本研究以确定CsVMV启动子的功能结构。通过缺失分析该启动子的调节区，确定在转基因植物中负责启动子表达的不同域。我们的结果表明，CsVMV启动子的组成表达型是由不同组织特异性结构域引起的。而且，获得最佳启动子活性需要元件之间协同互作。如图12所示，综合得自转基因植物的所有数据，以确定CsVMV启动子的原始功能图谱(first functional map)。自核苷酸-222到-173的区含有控制启动子在绿色组织和根尖中表达的顺式元件。正如已经描述的，Verdaguer等，Plant Mol Biol,31:1129-39,1996，该区含有在所述35S CaMV启动子中鉴定的激活序列1(as1)的共有序列，Lam等，ProcNatl Acad Sci USA,86:7890-4,1989。在那种启动子中，as1元件直接参与根尖表达，Fromm等，Plant Cell,1:977-84,1989，而as1元件与上游基元相互作用，以在其它组织提供启动子活性(Benfey&Chua,Science,250:959-966,1989；Fang等，Plant Cell,1:141-50,1989；Benfey等，Embo Journal,9:1677-1684,1990a；和Benfey等，Embo Journal,9:1685-96,1990b)。Lam等，Proc Natl Acad SciUSA,86:7890-4,1989a，报道在35S启动子中该元件的突变导致在根和茎中的启动子活性下降80％，而在叶子中下降50％。将CsVMV启动子截短到核苷酸-178也突出as1区在根尖的基因表达中的作用。指导限于根组织的GUS染色模式的构建物pΔDE1(缺失182/-63区)具有完整as1元件。表明as1元件与TGAla相互作用，TGAla是主要存在于根组织中得自烟草的bzip转录因子，Katagiri等，Nature,340:727-730,1989；和Neuhaus等，Plant Cell,6:827-834,1994。因此，用pΔDE1构建物观察到的根表达型可能产生自TGAla和as1序列之间的相互作用。然而pΔDE1构建物以及pΔD1缺失(-182到-112)表明，在CsVMV启动子中as1元件不能独自激活绿色组织中的启动子表达。另一方面，我们表明自-182到-173的区是指导叶肉细胞中的启动子表达所必需的。有趣的是，该短区包含一个GATA基元。不能评价该GATA区独立于as1元件的特殊作用。因此，可以想象两种假说：或者该GATA区独自控制绿色组织中的启动子表达，或者该GATA区和as1元件一起协同控制叶肉组织中的CsVMV启动子活性。公开数据报道，在CaMY启动子中的GATA基元命名为激活序列2(as2),Lam&Chua,Plant Cell,1:1147-56,1989，它也在叶子表达中涉及。而且受该GATA区控制的叶子表达依赖于位于35S启动子的-90到-46区中的序列(它含有as1元件)。相同类型的相互作用可以控制绿色组织中的CsVMV启动子表达。然而，在CsVMV启动子中鉴定的GATA基元与CaMV启动子的as2基元不同。我们发现与在东格鲁水稻杆菌状badnavirus启动子中鉴定的GATA框(Yin&Beachy,PlantJ,7:969-980,1995)有强同源性，该GATA盒在激活该启动子中也起重要的作用。我们也注意到，在CsVMV启动子中的GATA基元类似于在几种光和昼夜节律钟调节的启动子中发现的框Ⅰ共有序列(GTAAPu),Donald和Cashmore,The Embo Journal,9:1717-1726,1990；和Teakle及Key,Plant Molecular Biology,29:1253-1266,1995。

含有as1和GATA元件的构建物pΔDE2和pΔDE3在转基因植物中表现出弱GUS表达型。该资料暗示，绿色组织中的启动子激活需要一种或多种其它元件。我们观察到自核苷酸-149到-112的区或区-112/-63能够恢复叶肉细胞中的启动子活性，该活性由于使用pΔDE2和pΔDE3构建物而丧失。这两个区可能含有具有丰余功能的顺式作用元件，所述元件对于绿色组织中的启动子激活是必需的。如构建物pD或pE所示的，这些推定的顺式元件位于不能指导叶肉细胞中的基因表达的启动子区中。可能在GATA区和-149到-63的区之间协同或联合作用机制占优势，以允许在叶肉细胞中表达。然而，可以提出另一种解释。我们注意到，当在GATA元件(-182到-173)和位置-63之间存在至少49个核苷酸时，该启动子实际上是有活性的。GATA区和TATA框之间的距离可能引起所观察到的结果。包括保持GATA区和TATA框之间的正确距离的中性接头的构建物允许该问题得到阐明。尽管如此，在CaMV 35S启动子中，as1和GATA基元位于位置-64和-105之间，与在CsVMV启动子中的比较，它们非常靠近TATA框。因此，通过pΔDE2和pΔDE3内部缺失产生的GATA区和TATA框之间的较小距离应该不会妨碍as1和GATA顺式元件的活性。另外，采用能够指导维管分子中的高水平基因表达的构建物pD所获得结果清楚提示，自-178到-63的区含有重要顺式作用元件。用区-161到-56进行的体外结合检测揭示与核蛋白的特异性相互作用，支持该假说。我们只检测到一个滞留带，通过用自核苷酸-141延伸到-99的43个核苷酸的片段的竞争，有效地破坏该带的形成。因为自-149到-112和自-112到-63的两个区在激活过程中起着有效作用，假如已经检测到两种滞留复合物，则它会与我们的体内数据更一致。由于在我们的核提取物中转录因子浓度低或对于结合位点的亲合力较低，或者因为需要与其它因子协作结合，因此不能检测到一个特异带是可能的。-149/-99片段与核苷酸数据库的序列比较分析没有显示任何强同源性。检测该片段的核苷酸序列显示存在位于位置-129到-113的GTAA重复。在各种功能性顺式作用元件中已经发现了GTAA基元，所述顺式作用元件例如玉米醇溶蛋白基因启动子的胚乳盒(Maier等，The EmboJournal,6:17-22,1987；和Muller和Knudsen,Plant J,4:343-55,1993)、as1元件和OCS共有序列，Ellis等，Plant J,4:433-43,1993。拟南芥(Arabidopsis thaliania)EF-1a基因启动子的tefl框(Curie等，Nucleic Acids Res,19:1305-1310,1991；Curie等，Plant Mol Biol,18:1083-1089,1992)和番茄也包含GTAA重复，且与CsVMV启动子的GTAA框表现出相似性。已经报道位于EF-1a启动子的-100区中的Tefl框参与循环细胞中的启动子激活，Regad等，Mol GenGenet,248:703-711,1995。CsVMV启动子中的GTAA重复的作用必须进一步确定。

包括核苷酸-178到-63的区指导维管分子中的CsVMV启动子表达。该维管域含有两个分别位于-149/-112区和-112/-63区中的独立元件。正如较早期所述，Verdaguer等，Plant Mol Biol,31:1129-39,1996，后者包含特征为CTTATC重复的22个核苷酸序列，该核苷酸序列位于鸭跖草黄斑点badnayirus启动子(ComYMV)的维管域中的相同对应位置(-78到-100),Medberry和Olszewski,Plant.J,3:619-26,1993。我们的结果提示，参与CsVMV启动子的维管表达的该类元件可能是与上游叶肉区相互作用的一类元件。有趣的是，注意到CsVMV启动子中维管元件直接位于TATA框的上游。该布置非常类似于关于RTBV和ComYMV启动子的报道，Medberry和Olszewski,Plant J,3:619-26,1993；以及Yin和Beachy,Plant J,7:969-980,1995。在如Benfey等(Embo J,9:1685-96,1990b)所报道的CaMV启动子中，所述维管元件位于从核苷酸-310到-209的B4亚域中。而且，在该启动子中，在维管表达的调节中也涉及as1元件。缺失CsVMV中的as1区不会影响维管表达。调节CsVMV和CaMV启动子中维管启动子活性的机制不同是可能的。

在原生质体中，CsVMV启动子活性看来基本上是受包含核苷酸-222到-178的区的控制，所述区包含as1共有序列。令人惊奇的是，观察到得自该启动子的表达与自-182到-63的序列无关。例如在BY-2原生质体中，我们表明pΔDE启动子构建物保留80％以上的野生型启动子活性。关于35S CaMV启动子，也提及基于原生质体的瞬时检测和转基因植物之间的结果偏差，Fang等，Plant Cell,1:141-50,1989；和Lam,Results Probl Cell Differ,20:181-196,1994。Ow等(Proceedingof the National Academy of Science of the USA,84:4870-4874,1987)报道-90截短的35S CaMV启动子在胡罗卜原生质体中的活性高于转基因植物。同样地，我们观察到35S启动子的-90衍生物在BY-2原生质体中产生强CAT活性(资料未展示)，然而报道用相同构建物在转基因植物中未检测到CAT转录，Fang等，Plant Cell,1:141-50,1989。原生质体处于高度应激生理状态，Roest等，Acta BotanicaNeerlandica,42:1-25,1993。该应激状态可能引起激活或失活与所述启动子相互作用的各种反式作用因子。在这一方面，特别有关的是几个关于as1元件对多种应激相关信号响应的报道，应激相关信号诸如植物生长素、水杨酸、茉莉酮酸甲酯，Liu和Lam,J Biol Chem,269:668-675,1994；Qin等，The Plant Cell,6:863-874,1994；Zhang和Singh,Proc Natl Acad Sci USA,91:2507-11,1994；和Xiang等，Plant Mol Biol,32:415-26,1996。

我们以前表明，在BY-2原生质体中，包含核苷酸-368到+20的CsVMV启动子构建物的活性低于全长启动子(-443到+72)2倍，Verdaguer等，Plant Mol Biol,31:1129-39,1996。本研究表明，5’末端截短该启动子到位置-222不影响其活性水平。实际上，在BY2原生质体中，构建物pC保持80％以上的全长启动子活性。因此，在较早期检测到的启动子表达中的差别最可能是由所述较长的前导片段引起的。通常已知非翻译病毒前导序列影响信使稳定性或翻译起始，Gallie和Walbot,Nucleic Acids Res,20:4631-4638,1992；和Dowson等，Plant Mol Biol,23:97-109,1993。最近，Chen等(J Virol,70:8411-8421,1996)报道RTBV前导序列对转录激活的直接作用。我们不能排除在CsVMV前导序列片段中存在这样的顺式作用序列的可能性。

所述CsVMV启动子含有由不同域组成的模块结构，所述不同域对组织特异性表达型显示不同作用。而且，启动子表达需要不同顺式元件之间协同或联合互作。这些结论使人想起用所述CaMV 35S启动子所获得的那些结论，Benfey和Chua,Science,250:959-966,1990。CaMV和CsVMV启动子的组成表达型似乎是通过相同调节策略获得的。as1和GATA顺式元件的共同重要性强调了它们功能结构的相似性。然而，这两种启动子在其功能结构上不是完全同源的。在CsVMV启动子中，从位置-63延伸到-149的区含有在植物中表达的必需元件。在CaMV启动子中未鉴定出这些元件，可能表示在这两种花椰菜花叶病毒启动子所用的调节机制中存在某些分歧。

前面的书面说明是考虑用来说明本发明，而不是限制本发明。实际上，由前面描述来看，除了本文所说明和描述的外，本发明的各种修改对本领域技术人员来说是浅显明白的，且这些修改在附加权利要求书范围内。

序列表(1)一般资料：

(ⅰ)申请人：

    (A)姓名：THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE

    (B)街道：10550 North Torrey Pines Road

    (C)城市：La Jolla

    (D)州：加利福尼亚

    (E)国家：美国

    (F)邮政编码：92037

    (G)电话：(619)784-2937

    (H)传真：(619)784-9399

(ⅱ)发明名称：木薯叶脉花叶病毒启动子及其应用

(ⅲ)序列数：36

(ⅳ)计算机可读形式：

    (A)媒体类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容机

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25

(ⅴ)当前申请数据：

    (A)申请号：PCT/US 97/

    (B)提交日期：1997年6月20日

(ⅵ)在先申请数据：

    (A)申请号：US60/020,129

    (B)提交日期：1996年6月20日(2)SEQ ID NO:1的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：392个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:1AGCTCAGCAA GAAGCAGATC AATATGCGGC ACATATGCAA CCTATGTTCA AAAATGAAGA       60ATGTACAGAT ACAAGATCCT ATACTGCCAG AATACGAAGA AGAATACGTA GAAATTGAAA      120AAGAAGAACC AGGCGAAGAA AAGAATCTTG AAGACGTAAG CACTGACGAC AACAATGAAA      180AGAAGAAGAT AAGGTCGGTG ATTGTGAAAG AGACATAGAG GACACATGTA AGGTGGAAAA      240TGTAAGGGCG GAAAGTAACC TTATCACAAA GGAATCTTAT CCCCCACTAC TTATCCTTTT      300ATATTTTTCC GTGTCATTTT TGCCCTTGAG TTTTCCTATA TAAGGAACCA AGTTCGGCAT      360TTGTGAAAAC AAGAAAAAAT TTGGTGTAAG CT                                    392(2)SEQ ID NO:2的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：524个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:2GGTACCAGAA GGTAATTATC CAAGATGTAG CATCAAGAAT CCAATGTTTA CGGGAAAAAC       60TATGGAAGTA TTATGTGAGC TCAGCAAGAA GCAGATCAAT ATGCGGCACA TATGCAACCT      120ATGTTCAAAA ATGAAGAATG TACAGATACA AGATCCTATA CTGCCAGAAT ACGAAGAAGA      180ATACGTAGAA ATTGAAAAAG AAGAACCAGG CGAAGAAAAG AATCTTGAAG ACGTAAGCAC      240TGACGACAAC AATGAAAAGA AGAAGATAAG GTCGGTGATT GTGAAAGAGA CATAGAGGAC      300ACATGTAAGG TGGAAAATGT AAGGGCGGAA AGTAACCTTA TCACAAAGGA ATCTTATCCC      360CCACTACTTA TCCTTTTATA TTTTTCCGTG TCATTTTTGC CCTTGAGTTT TCCTATATAA      420GGAACCAAGT TCGGCATTTG TGAAAACAAG AAAAAATTTG GTGTAAGCTA TTTTCTTTGA      480AGTACTGAGG ATACAAGTTC AGAGAAATTT GTAAGTTTGA ATTC                       524(2)SEQ ID NO:3的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：526个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:3TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA        60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC       120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA       180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGAATCTTGA AGACGTAAGC       240ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAAGATA AGGTCGGTGA TTGTGAAAGA GACATAGAGG       300ACACATGTAA GGTGGAAAAT GTAACGGCGG AAAGTAACCT TATCACAAAG GAATCTTATC       360CCCCACTACT TATCCTTTTA TATTTTTCCG TGTCATTTTT GCCCTTGAGT TTTCCTATAT       420AAGGAACCAA GTTCGGCATT TGTGAAAACA AGAAAAAATT TGGTGTAAGC TATTTTCTTT       480GAAGTACTGA GGATACAAGT TCAGAGAAAT TTGTAAGTTT GAATTC                      526(2)SEQ ID NO:4的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：411个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:4GGATCCTATG TTCAAAAATG AAGAATGTAC AGATACAAGA TCCTATACTG CCAGAATACG        60AAGAAGAATA CGTAGAAATT GAAAAAGAAG AACCAGGCGA AGAAAAGAAT CTTGAAGACG       120TAAGCACTGA CGACAACAAT GAAAAGAAGA AGATAAGGTC GGTGATTGTG AAAGAGACAT       190AGAGGACACA TGTAAGGTGG AAAATGTAAG GGCGGAAAGT AACCTTATCA CAAAGGAATC       240TTATCCCCCA CTACTTATCC TTTTATATTT TTCCGTGTCA TTTTTGCCCT TGAGTTTTCC       300TATATAAGGA ACCAAGTTCG GCATTTGTGA AAACAAGAAA AAATTTGGTG TAAGCTATTT       360TCTTTGAAGT ACTGAGGATA CAAGTTCAGA GAAATTTGTA AGTTTGAATT C                411(2)SEQ ID NO:5的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：305个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:5GGATCCTGAA GACGTAAGCA CTGACGACAA CAATGAAAGG AAGAAGATAA GGTCGGTGAT        60TGTGAAAGAG ACATAGAGGA CACATGTAAG GTGGAAAATG TAAGGAAAGT AAGTAACCTT       120ATCACAAAGG AATCTTATCC CCCACTACTT ATCCTTTTAT ATTTTTCCGT GTCATTTTTG       180CCCTTGAGTT TTCCTATATA AGGGAACCAA TTCGGCATTT GTGAAAACAA GAAAAAATTT       240GGTGTAAGCT ATTTTCTTTG AAGTACTGAG GATACAAGTT CAGAGAAATT TGTAAGTTTG       300AATTC                                                                   305(2)SEQ ID NO:6的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：261个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:6GGATCCGGTC GGTGATTGTG AAAGAGACAT AGAGGACACA TGTAAGGTGG AAAATGTAAG      60GGCGGAAAGT AACCTTATCA CAAAGGAATC TTATCCCCCA CTACTTATCC TTTTATATTT     120TTCCGTGTCA TTTTTGCCCT TGAGTTTTCC TATATAAGGA ACCAAGTTCG GCATTTGTGA     180AAACAAGAAA AAATTTGGTG TAAGCTATTT TCTTTGAAGT ACTGAGGATA CAAGTTCAGA     240GAAATTTGTA AGTTTGAATT C                                               261(2)SEQ ID NO:7的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：193个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:7GGATCCTTAT CACAAAGGAA TCTTATCCCC CACTACTTAT CCTTTTATAT TTTTCCGTGT       60CATTTTTGCC CTTGAGTTTT CCTATATAAG GAACCAAGTT CGGCATTTGT GAAAACAAGA      120AAAAATTTGG TGTAAGCTAT TTTCTTTGAA GTACTGAGGA TACAAGTTCA GAGAAATTTG      180TAAGTTTGAA TTC                                                         193(2)SEQ ID NO:8的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：143个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:8GGATCCGTGT CATTTTTGCC CTTGAGTTTT CCTATATAAG GAACCAAGTT CGGCATTTGT        60GAAAACAAGA AAAAATTTGG TGTAAGCTAT TTTCTTTGAA GTACTGAGGA TACAAGTTCA       120GAGAAATTTG TAAGTTTGAA TTC                                               143(2)SEQ ID NO:9的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：420个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:9TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA        60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGGATC       120CTGAAGACGT AAGCACTGAC GACAACAATG AAAAGAAGAA GATAAGGTCG GTGATTGTGA       180AAGAGACATA GAGGACACAT GTAAGGTGGA AAATGTAAGG GCGGAAAGTA ACCTTATCAC       240AAAGGAATCT TATCCCCCAC TACTTATCCT TTTATATTTT TCCGTGTCAT TTTTGCCCTT       300GAGTTTTCCT ATATAAGGAA CCAAGTTCGG CATTTGTGAA AACAAGAAAA AATTTGGTGT       360AAGCTATTTT CTTTGAAGTA CTGAGGATAC AAGTTCAGAG AAATTTGTAA GTTTGAATTC       420(2)SEQ ID NO:10的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：482个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:10TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA        60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC       120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA       180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGGATCCGGT CGGTGATTGT       240GAAAGAGACA TAGAGGACAC ATGTAAGGTG GAAATTGTAA GGGCGGAAAG TAACCTTATC       300ACAAAGGAAT CTTATCCCCC ACTACTTATC CTTTTATATT TTTCCGTGTC ATTTTTGCCC       360TTGAGTTTTC CTATATAAGG AACCAAGTTC GGCATTTGTG AAAACAAGAA AAAATTTGGT       420GTAAGCTATT TTCTTTGAAG TACTGAGGAT ACAAGTTCAG AGAAATTTGT AAGTTTGAAT       480TC                                                                      482(2)SEQ ID NO:11的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：458个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:11TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA       60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC      120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA      180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGAATCTTGA AGACGTAAGC      240ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAGGATC CTTATCACAA AGGAATCTTA TCCCCCACTA      300CTTATCCTTT TATATTTTTC CGTGTCATTT TTGCCCTTGA GTTTTCCTAT ATAAGGAACC      360AAGTTCGGCA TTTGTGAAAA CAAGAAAAAA TTTGGTGTAA GCTATTTTCT TTGAAGTACT      420GAGGATACAA GTTCAGAGAA ATTTGTAAGT TTGAATTC                                   458(2)SEQ ID NO:12的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：468个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:12TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA        60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC       120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA       180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGAATCTTGA AGACGTAAGC       240ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAAGATA AGGTCGGATC CTTATCACAA AGGAATCTTA       300TCCCCCACTA CTTATCCTTT TATATTTTTC CGTGTCATTT TTGCCCTTGA GTTTTCCTAT       360ATAAGGAACC AAGTTCGGCA TTTGTGAAAA CAAGAAAAAA TTTGGTGTAA GCTATTTTCT       420TTGAAGTACT GAGGATACAA GTTCAGAGAA ATTTGTAAGT TTGAATTC                    468(2)SEQ ID NO:13的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：491个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:13TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA       60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC      120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA      180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGAATCTTGA AGACGTAAGC      240ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAAGATA AGGTCGGTGA TTGTGAAAGA GACATAGAGG      300ATCCTTATCA CAAAGGAATC TTATCCCCCA CTACTTATCC TTTTATATTT TTCCGTGTCA      360TTTTTGCCCT TGAGTTTTCC TATATAAGGA ACCAAGTTCG GCATTTGTGA AAACAAGAAA      420AAATTTGGTG TAAGCTATTT TCTTTGAAGT ACTGAGGATA CAAGTTCAGA GAAATTTGTA      480AGTTTGAATT C                                                           491(2)SEQ ID NO:14的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：408个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:14TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA        60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC       120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA       180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGAATCTTGA AGACGTAAGC       240ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAGGATC CGTGTCATTT TTGCCCTTGA GTTTTCCTAT       300ATAAGGAACC AAGTTCGGCA TTTGTGAAAA CAAGAAAAAA TTTGGTGTAA GCTATTTTCT       360TTGAAGTACT GAGGATACAA GTTCAGAGAA ATTTGTAAGT TTGAATTC                    408(2)SEQ ID NO:15的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：418个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:15TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA        60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC       120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA       180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGAATCTTGA AGACGTAAGC       240ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAAGATA AGGTCGGATC CGTGTCATTT TTGCCCTTGA       300GTTTTCCTAT ATAAGGAACC AAGTTCGGCA TTTGTGAAAA CAAGAAAAAA TTTGGTGTAA       360GCTATTTTCT TTGAAGTACT GAGGATACAA GTTCAGAGAA ATTTGTAAGT TTGAATTC         418(2)SEQ ID NO:16的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：441个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:16TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA       60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC      120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA      180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGAATCTTGA AGACGTAAGC      240ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAAGATA AGGTCGGTGA TTGTGAAAGA GACATAGAGG      300ATCCGTGTCA TTTTTGCCCT TGAGTTTTCC TATATAAGGA ACCAAGTTCG GCATTTGTGA      360AAACAAGAAA AAATTTGGTG TAAGCTATTT TCTTTGAAGT ACTGAGGATA CAAGTTCAGA      420GAAATTTGTA AGTTTGAATT C                                                441(2)SEQ ID NO:17的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：476个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:17TCTAGACCAG AAGGTAATTA TCCAAGATGT AGCATCAAGA ATCCAATGTT TACGGGAAAA        60ACTATGGAAG TATTATGTGA GCTCAGCAAG AAGCAGATCA ATATGCGGCA CATATGCAAC       120CTATGTTCAA AAATGAAGAA TGTACAGATA CAAGATCCTA TACTGCCAGA ATACGAAGAA       180GAATACGTAG AAATTGAAAA AGAAGAACCA GGCGAAGAAA AGAATCTTGA AGACGTAAGC       240ACTGACGACA ACAATGAAAA GAAGAAGATA AGGTCGGTGA TTGTGAAAGA GACATAGAGG       300ACACATGTAA GGTGGAAAAT GTAAGGGCGG AAAGGATCCG TGTCATTTTT GCCCTTGAGT       360TTTCCTATAT AAGGAACCAA GTTCGGCATT TGTGAAAACA AGAAAAAATT TGGTGTAAGC       420TATTTTCTTT GAAGTACTGA GGATACAAGT TCAGAGAAAT TTGTAAGTTT GAATTC           476(2)SEQ ID NO:18的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：31个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:18ACCGGTACCA GAAGGTAATT ATCCAAGATG T        31(2)SEQ ID NO:19的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：30个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:19CGGAATTCAA ACTTACAAAT TTCTCTGAAG          30(2)SEQ ID NO:20的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：34个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:20CGCGATCCAG ACTGAATGCC CACAGGCCGT CGAG     34(2)SEQ ID NO:21的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：17个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:21AGACGTAAGC ACTGACG                        17(2)SEQ ID NO:22的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：22个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:22CTTATCACAA AGGAATCTTA TC                  22(2)SEQ ID NO:23的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：22个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:23CTTATCACAA AGGAATCTTA TC                  22(2)SEQ ID NO:24的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：28个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:24GCTCTAGACC AGAAGGTAAT TATCCAAG            28(2)SEQ ID NO:25的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：26个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:25TATGGATCCT ATGTTCAAAA ATGAAG              26(2)SEQ ID NO:26的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：26个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:26AAAGGATCCT GAAGACGTAA GCACTG              26(2)SEQ ID NO:27的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：25个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:27AGAGGATCCG GTCGGTGATT GTGAA               25(2)SEQ ID NO:28的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：25个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:28AAAGGATCCT TATCACAAAG GAATC               25(2)SEQ ID NO:29的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：27个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：否

(ⅹⅰ)顺序描进：SEQ ID NO:29TATGGATCCG TGTCATTTTT GCCCTTG             27(2)SEQ ID NO:30的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：29个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：是

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:30CGGAATTCAA ACTTACAAAT TTCTCTAAG           29(2)SEQ ID NO:31的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：25个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：是

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:31TAAGGATCCT TTCCGCCCTT ACATT               25(2)SEQ ID NO:32的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：25个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：是

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:32CATGGATCCT CTATGTCTCT TTCAC               25(2)SEQ ID NO:33的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：22个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：是

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:33ACAGGATCCG ACCTTATCTT CT                  22(2)SEQ ID NO:34的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：26个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：是

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:34ACCGGATCCT CTTCTTTTCA TTGTTC              26(2)SEQ ID NO:35的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：24个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：是

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:35TCAGGATCCT TTTCTTCGCC TGGT                24(2)SEQ ID NO:36的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：23个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(ⅲ)假说：无

(ⅳ)反义：是

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:36ATAGGATCCA TATGTGCCGC ATA                 23

Claims (15)

1．分离核酸分子，包含在植物细胞中能够起始操作连接的异源核酸序列转录的启动子核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO3(pA)中所示木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子的18个连续核苷酸的同一性至少为80％。

2．权利要求1的核酸分子，包含选自分别示于SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16中的CVP1、CVP2、pA、pB、pC、pD、pE、pΔB、pΔC、pΔD1、pΔD2、pΔD3、pΔDE1、pΔDE2、pΔDE3和pΔE的核酸序列。

3．权利要求1的核酸分子，其中所述植物细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。

4．权利要求1的核酸分子，其中所述转录在植物叶肉组织中起始。

5．权利要求1的核酸分子，其中所述转录在植物韧皮部组织中起始。

6．权利要求1的核酸分子，其中所述转录在植物根尖组织中起始。

7．权利要求1的核酸分子，其中所述分子具有选自CVP1、CVP2、pA、pB、pC、pD、pE、pΔB、pΔC、pΔD1、pΔD2、pΔD3、pΔDE1、pΔDE2、pΔDE3和pΔE的核苷酸序列。

8．载体，包含在植物细胞中能够起始操作连接的异源核酸序列转录的启动子核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO 3(pA)中所示木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子的18个连续核苷酸的同一性至少为80％，并且所述核苷酸序列操作连接到异源核酸序列。

9．权利要求8的载体，其中所述启动子包含与按照权利要求1的核酸序列。

10．转基因植物，包含在植物细胞中能够起始转录操作连接的异源核酸序列的启动子核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO 3(pA)中所示木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子的18个连续核苷酸的同一性至少为80％，并且所述核苷酸序列操作连接到异源核酸序列。

11．权利要求10的转基因植物，其中所述启动子包含按照权利要求1的核酸序列。

12．在植物细胞中表达异源核酸序列的方法，包括：

a)用包含启动子核苷酸序列的载体转化所述植物细胞，所述启动子核苷酸序列在植物细胞中能够起始转录操作连接的异源核酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO 3(pA)中所示木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子的18个连续核苷酸的同一性至少为80％，并且所述核苷酸序列操作连接到异源核酸序列；和

b)在所述异源核酸序列在所述植物细胞中表达的条件下培养所述植物细胞。

13．权利要求12的方法，其中所述启动子包含按照权利要求1的核酸序列。

14．在植物细胞中表达异源核酸序列的嵌合基因，包含以5’端到3’端方向操作连接序列的：

a)启动子核苷酸序列，它在植物细胞中能够起始转录操作连接的异源核酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO 3(pA)中所示木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子的18个连续核苷酸的同一性至少为80％；和

b)相对于所述启动子为异源的结构核酸序列。

15．权利要求14的嵌合基因，其中所述启动子包含按照权利要求1的核酸序列。

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