CN1227245C - 食品和生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明叙述了包含一种或多种异黄酮的食品和药物制剂。本发明特别涉及高纯晶体异黄酮和生产高纯晶体异黄酮的方法，在配制到食品和药物制剂中时，高纯晶体异黄酮具有适宜的味道、特征和口感。

Description

食品和生产方法

                     发明领域

本发明一般涉及包含一种或多种异黄酮的食品和药物制剂。更具体而言，本发明涉及高纯的晶体异黄酮，它们的生产方法，和高纯异黄酮在食品工艺、食品、和药物制剂中的应用。

                     发明背景

植物异黄酮和它们的代谢物在医疗文献中已经引起很大的关注，因为这些化合物产生一些有益的生物活性。人类和其它动物能从服用或摄取包含异黄酮的植物体和植物萃取物中受益。生物学的益处包括雌激素、抗雌激素、抗氧化、消炎、和抗癌作用。异黄酮的另一些益处包括血管的应变性和功能、骨质疏松症的治疗、血液脂蛋白水平的改变、减轻形成血栓过程的倾向、和稳定或减轻绝经症状。几乎只在具有最高已知量的豆科植物以及苜蓿、大豆、kudzu、和鹰嘴豆中才能找到在生物学上重要的异黄酮。有四种主要的植物异黄酮，以黄豆苷原、染料木黄酮、以及它们相应的甲基化的醚类——7-羟基-4′-甲氧异黄酮和鹰嘴豆素——为代表。认为产生有益的保健作用所需的任一种或所有这些异黄酮的量一般是每天20-100mg。

如大豆、鹰嘴豆、和扁豆等所有的食品都可以提供植物异黄酮。然而，为了获得规定的可预测水平和比例的异黄酮，这种方法是非常不可靠的。人们广泛认为大豆粉是非常有价值的植物异黄酮来源，其异黄酮含量一般为100-300mg/100g。然而，由于大豆包含几乎可以忽略水平的甲基化的异黄酮——7-羟基-4′-甲氧异黄酮和鹰嘴豆素，所以异黄酮的含量中主要是染料木黄酮和黄豆苷原。鹰嘴豆和扁豆一般包含所有这四种异黄酮，但含量仅为大豆粉的约十分之一。而且，异黄酮的类型和含量的变化也是很大的，这取决于育种背景(品种和栽培)、植物年龄、环境条件和应激、植物产品的储存条件、烹调和加工方法。因此，普通人为了特定的保健利益，依靠全部食物获得预定量的特定异黄酮如果不是几乎不可能的，那也是非常困难的。如果是多半不能预测，那么由于异黄酮含量的可变性和每克全部食品中异黄酮的含量较少，为了达到所希望的结果，就需要摄取大量的食物。由于这些原因，人们广泛认为需要萃取半纯形式的异黄酮，以便以食物中的保健增补剂的形式或以规定量的药物制剂的形式给以提供。这样，消费者就能方便地获得确实量的异黄酮。

以浓缩的形式利用异黄酮还有另一个好处。有很强的证据说明，人类食物中的四种主要雌激素异黄酮(黄豆苷原、染料木黄酮、7-羟基-4′-甲氧异黄酮、和鹰嘴豆素)中的每一种，都具有特殊的生物性质，按指定剂量服用特定的异黄酮或它们的混合物，可以获得所选择的保健利益。寻求这些利益的个人，采用普通的饮食方式，获得包含指定剂量特定异黄酮或特定比例异黄酮的膳食，是根本不可能的。因此，希望能够制备具有规定比例或可变比例异黄酮的异黄酮萃取物。

在科学文献中，出现大量在食品和饮料中施加植物雌激素和异黄酮类化合物的参考文献。如前面所述，在这些添加剂中，异黄酮的浓度和异黄酮的比例是变化的，而且有涩味。

WO 00/64276(Chen等人)叙述了一种油包水型的涂抹食品，其中包含具有有益的保健作用的含钙、和维生素的植物雌激素、异黄烷酮。涂抹食品也可以包含甾醇和甾醇酯、stanol和stanol酯、和大豆蛋白质。

专利说明书“包含植物雌激素、类似物或其代谢产物的保健补品”(Kelly WO 93/23069)提到，可以从豆科等植物中萃取异黄酮，使其成为干粉末的形式，这种形式能很方便地配制到面包、甜食或饮料等食品中，或配制到如片剂或胶囊等药物组合物中。

Crank等人的美国专利5,858,449叙述了含异黄酮丰富的大豆蛋白质产品和它们的制造方法。Crank的产品具有所希望的香味，并可放在婴儿处方、营养饮料、牛奶代替物、bologna、人造干酪涂抹食品、酸奶和冷冻甜食等奶制品和肉基食品中。

Kelly和Joannou的WO 98/08503公开一种适合各种条件使用的异黄酮类型化合物的服用。它也可以用作饮料和保健巧克力糖的食品添加剂。

Gorbach等人的美国专利5,498,631叙述了一种通过服用有效量的异类黄酮治疗绝经症、经前综合症、或产生降低雌激素水平的条件。所述的异类黄酮可以以甜食巧克力糖、饼干、谷类食品或饮料的形式食用获得。

Gorbach的美国专利5,733,926叙述了一种治疗早老性痴呆或与年龄有关的认识功能丧失的方法，其中包括特定的异类黄酮。可以以糖块、饼干、谷类食品、或饮料等食品的形式供给。

Barnes等人的美国专利5,506,211叙述了为抑制破骨细胞的酸分泌作用和减少骨吸收，以包括大豆等食品在内的各种形式供给染料木黄酮/葡糖苷的共轭物。

Feuer等人的美国专利4,163,746叙述了用作重量增加促进剂的5-甲基烷氧基异黄酮。这种产品组合物可以是液体的或固体的形式，并可以包含维生素和氨基酸等其它有益的添加剂。

Jackson等人的美国专利5,654,011公开了一种增加绝经前后(perimenopausal)妇女营养的营养强化剂，其中包含8-＜50mg的植物雌激素，以及各种维生素和矿物质。这种补品可以以片剂、胶囊、粉末、凝胶或液体、或食疗糖块的形式供给。

Kuznicki等人的美国专利5,464,619叙述了一种组合物，优选制成饮料的形式，其中包含固体的绿茶、黄酮醇、钠和钾离子、以及碳水化合物。

Zilliken的美国专利4,157,984叙述了在食品组合物中用作抗氧化剂的基于甜醅的产品。这种产品可以单独使用，也可以与异黄酮或其它化合物组合使用。Zilliken的美国专利4,390,559采用异黄酮作为抗氧化剂，稳定食用脂肪和油类。

Shylankevich的美国专利5,424,331公开一种治疗和预防骨质疏松症的材料，其中包括一种或多种植物雌激素化合物和其它矿物质。可以以食物补充剂或以药物的形式提供。

Potter等人的美国专利5,855,892公开了能使胆甾醇水平发生有益变化的食物补充剂或药物形式的黄豆苷原给药。

Shylankevich的美国专利5,569,459叙述了应用植物雌激素化合物调节雌激素的分泌。

Schouten Industries的WO 9610341公开采用大豆下胚轴作为异黄酮的来源。可以在饮料、奶制品、各种面包、保健茶和其它产品中使用这种材料。Schouten美国有限责任公司目前生产一种从大豆分离的产品，称作SoyLife，在各种食品和食谱饮料中可以包括这种材料。此外，Archer Daniels Midland(ADM)生产一种称作Novasoy的食物补充剂，其中含有丰富的染料木苷和黄豆苷。

Internutria WO 9821947叙述了包含植物雌激素和褪黑激素的食品或饮料，减缓持续再现性的夜间症状。

上面的许多参考文献都叙述了在促进摄取异黄酮萃取物和浓缩物方面遇到的困难，因为它们往往具有由异黄酮萃取物的性质和组合物引起的令人讨厌的味道和不愉快的口感，和因为它们存在的形式。

有许多方法普遍用于制备富含异黄酮的萃取物(例如，参见BarnesS，Kirk M和Coward L的大豆食品中的异黄酮和它们的共轭物：萃取条件和HPLC-质谱分析。(农业食品化学杂志(J Agric Food Chem)1994，42：2466-74)。具体方法在很大程度上取决于在原料中是否以苷或苷元的形式包含异黄酮。植物中天然形式的异黄酮是以苷的形式存在，即结合到如葡萄糖的糖的部分上，这些化合物既可以以简单的苷形式存在，也可以以不常见的丙二酸单酰或乙酰丙二酸单酰的形式存在。各种苷形式的异黄酮都非常易溶于水，但在有机溶剂中溶解得很差。相反，游离的苷元形式，水溶性差，但非常易溶于大多数的极性有机溶剂。从如红色苜蓿叶子、kudzu或大豆等植物原料中，或从如大豆糖浆或大豆乳清等食品工业的副产品中萃取异黄酮，一般包括使原料与水、有机溶剂、或水与有机溶剂的混合物接触。任何或所有的这些萃取方法都存在萃取方法没有选择性的缺点。如果采用水介质萃取苷，则数百种其它水溶性的植物成分也同样被萃取。同样，如果以有机溶剂相萃取苷元，则数百种其它极性的有机植物化合物如皂草苷、甾醇、和黄酮也随着异黄酮无选择性地进入溶剂相。这些各种各样的萃取方法，一般生产异黄酮含量为5-40％的最终产品，但更通常为约10-20％。这些高含量的非异黄酮污染物的存在，通常造成最终产品具有令人不愉快的味道，使产品作为食品成分没有吸引力。为了制备可口的混合物，通常必须采用蔗糖等掩蔽剂。至于药用，虽然该材料松散的性质往往使最终配方具有不能接受的大体积，但在该材料装在胶囊等中的情况下，这种涩味通常是不成问题的。

其中包括选择性的应用各种有机溶剂和色谱法的若干其它步骤，是公认适合提高异黄酮纯度的方法。这些方法的缺点是，(a)它们一般生产的异黄酮产量低，(b)方法贵，和(c)对于工业规模，在经济上它们是没有生命力的。而且没有提到任何一种方法适合工业规模，也没有提到任何一种方法能选择性地优先分离特定的异黄酮。由于这个原因，在文献中没有提到分离包含规定比例异黄酮的制剂。

因此目前需要能用作食品添加剂并具有下列优点的异黄酮萃取物和组合物：(a)有足够高的纯度，具有可口的或可以忽视的味道，和(b)混合物具有所需要的结构特征和溶混性，以便很容易地将它们加入种类繁多的食品中。在药物制剂中应用这些萃取物和组合物时，这些性质也具有显著的工业和实用优点。对这些异黄酮萃取物和组合物还有另一个要求，即具有所规定的异黄酮比例。

                      发明概述

本发明人意外地发现，可以以可加工的数量并以高纯晶体的形式分离高纯形式的植物异黄酮。可将提纯的异黄酮配制在具有适宜味道、结构和口感的食品和保健补品中。可将高度纯化的异黄酮方便地加入一般的食品中，以便在通常的饮食过程中摄取这些重要的异黄酮。例如涂抹食品、人造奶油、油类、调味酱、早餐的谷类食品等食品，可以包含有效量所需的植物异黄酮，同时又不损害食品的香味和口感。

根据本发明的方法，一般包括采用含水的有机溶剂混合物萃取如苜蓿叶子和磨碎的大豆等包含异黄酮的植物原料，使其通过细径过滤器，除去大分子量的化合物，通过蒸发缩减有机溶剂相进行选择性的异黄酮结晶，最后回收结晶的异黄酮。获得的异黄酮产品，最优选呈α-晶形，这种晶形的纯度高，实际上是无色无嗅的，且具有适宜的味道、结构和口感。

根据本发明的第一个方面，提供一种生产α-晶形异黄酮的方法，其中包括从包含异黄酮的植物体中萃取异黄酮的步骤，即使包含异黄酮的植物体与含水的有机溶剂混合物接触，获得萃取溶液；将萃取溶液过滤，减少分子量大于异黄酮的植物体量；缩减滤液中的溶剂进行异黄酮α-结晶；回收α-晶体异黄酮。

根据本发明的第二个方面，提供-种生产α-晶形异黄酮的方法，其中包括从包含异黄酮的植物体中萃取异黄酮的步骤，即使包含异黄酮的植物体与含水的有机溶剂混合物接触，获得萃取溶液；将萃取溶液过滤，减少分子量大于异黄酮的植物体量；缩减滤液中的溶剂进行异黄酮α-结晶；回收α-晶体异黄酮；将回收的异黄酮晶体溶解在有机溶剂中；逐渐缩减有机溶剂的体积进行异黄酮选择性的α-结晶；回收选择性结晶的α-晶体异黄酮。

根据本发明的第三个方面，提供采用本发明第一或第二个方面的方法制备的α-晶体异黄酮。α-晶体异黄酮的异黄酮含量＞50％，更优选＞65％。选择性结晶的α-晶体异黄酮的异黄酮含量＞80％，更优选＞90％。

根据本发明的第四个方面，提供一种α-晶形的异黄酮。在配制到食品和制剂中时，α-晶形是无色、无嗅、和实际上无味的。α-晶形的异黄酮，一般基本上是纯的。

根据本发明的第五个方面，提供包含一种或多种高纯异黄酮的食品或药物制剂。

根据本发明的第六个方面，提供一种制作食品和药物制剂的方法，其中包括将α-晶形的异黄酮与所述食品或药物制剂中的一种或多种成分制成混合物的步骤。在配制到所述的食品或药物制剂中时，α-晶形基本上是无色、无嗅、和实际上无味的。优选在配制到所述的食品和药物制剂中之前，将α-晶体异黄酮磨碎或粉化。

除非正文另有要求，在整个本说明书和随后的权利要求中，“包括”一词及其变化形式“包含”，都应理解为系指所述的整体或步骤的内含物、或整体或步骤的一部分，但不排斥任何其它的整体或步骤、或整体或步骤的一部分。

                    附图说明

图1示出采用3^#进料(苜蓿萃取物)鉴别异黄酮峰的高压液相色谱图。

图2示出采用四种不同进料的高压液相色谱图。

图3示出各种渗透或滤液的色谱图。

图4示出采用一段(K1)和二段(K1K1)超滤的滤液色谱图。

图5示出一种滞留物试样的色谱图。

图6示出α-晶体异黄酮的X-射线粉末衍射图。

图7示出“粗”红色苜蓿萃取物的X-射线粉末衍射。

图8示出“粗”红色苜蓿萃取物的X-射线粉末衍射。

                      发明详述

在本发明的方法和组合物中使用的异黄酮，可来源于所有的植物原料，合成的或衍生的异黄酮，或异黄酮母体和前体药物。容易获得的异黄酮来源来自整个苜蓿植物原料，其中异黄酮大部分包含在这种植物的叶子中。

适宜的苜蓿包括红色苜蓿(T.pratense)，地下苜蓿(T.subterranean)、或白色苜蓿(T.repens)。其它适宜的包含异黄酮的植物原料包括kudzu、大豆、和鹰嘴豆等其它豆科植物范围。选择不同类型和数量的包含异黄酮的植物原料，可以控制从其中分离的萃取物的异黄酮含量。采用某些类型的苜蓿，例如含7-羟基-4′-甲氧异黄酮高的苜蓿，或选择另一种包含鹰嘴豆素等不同的异黄酮为主的苜蓿，都是可行的。

在采用苜蓿等多叶植物原料的情况下萃取植物异黄酮，一般是在溶剂萃取过程之前，将叶子粉碎或切碎。优选以它们苷元的形式萃取异黄酮。在粉碎、切碎或磨碎叶片之后，植物体释放出包含在植物中的葡糖苷酶，使异黄酮苷发生酶解，生成相应的苷元。在如大豆粉或大豆加工的废液材料等材料惰性较大的情况下，采用本领域的技术人员已知的暴露于热和/或酸中进行水解，或采用酶处理等技术，可使苷键破裂。

磨碎或切碎的植物体采用溶剂进行萃取，溶剂一般是水和有机溶剂，优选能与水溶混的有机溶剂。水与有机溶剂的比例一般可为1∶10-10∶1，例如可以包括等比例的水和溶剂。可以采用任何有机溶剂或这些溶剂的混合物。有机溶剂可优选是C2-10，更优选C1-4的有机溶剂(例如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丁二醛基、丙二醇、赤藓醇、氯仿、二氯甲烷、三氯乙烷、乙腈、乙二醇、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甘油二羟基丙酮、四氢呋喃、乙醚或丙酮)，最优选是如乙醇的C1-4的醇类。可采用本领域众所周知的方法，使植物原料与水-溶剂的混合物接触，制备这种萃取物。混合物还可包括酶，酶有助于将异黄酮苷分解成苷元的形式。可以剧烈地搅拌这种混合物，以便生成乳状液。也可以放置混合物，使其进行酶解。混合物的温度，例如可以为环境温度至溶剂的沸点。接触时间可以为1小时至几周。可以采用一些常见的方法，例如过滤、离心、或澄清、或其它标准的方法，将萃取物与未溶解的植物原料进行物理分离。

发明人意外地发现，在获得的溶剂中的苷元异黄酮，在有机溶剂中出现与众不同的图案的行为，这取决于分子量较高的化合物的存在或不存在。现已发现，在使所得到的水浆液通过过滤器以除去粒状的未溶解的植物原料以及溶解的或悬浮的分子量大于异黄酮的植物原料时，异黄酮出现的行为，与分子量较高的化合物的存在量基本上完全没有减少或除去时截然不同。特别是发现，在不存在高分子量的植物化合物时，能诱发异黄酮生成α-晶体。不局限于理论，相信在过滤步骤能够获得所需要的从包含异黄酮的有机溶剂浓缩物中沉淀的α-晶体异黄酮。

强制含水的有机溶剂混合物通过细径的物理分离阻挡层进行过滤。这一般是超滤装置，其中包括塑料或纸过滤层，它阻挡分子量大于约500的化合物通过。这种方法能除去大部分的蛋白质、碳水化合物、类脂、油类、树脂、和叶绿素，从装置流出的一般是无色透明的液体。

然后处理获得的含水的有机溶剂混合物经缩减混合物中的有机溶剂量。在旋转式蒸发器中非常容易进行这种处理。在含水的混合物中有机溶剂量达到临界点时，异黄酮出现引人注意的α-晶形沉淀。沉淀一般出现在水：有机溶剂的比例很窄的范围内。在这一点可以停止蒸发，通过简单的沉降或过滤收集晶体。在干燥箱中或就在环境温度下干燥以后，异黄酮的纯度一般为65-75％，是相对无色无嗅的，只有轻微的涩味，从原料异黄酮的回收率＞90％，产品异黄酮的比例与原料混合物相似。可将这种异黄酮产品看成是加入食品或药物制剂中的最终产品。

此外，可能需要对最终产品中的异黄酮进行更大程度的纯化，或分离选择性结晶的异黄酮。为了获得这两种结果，需要进行进一步结晶。为此目的，将第一次结晶的晶体溶解在有机溶剂中。该溶剂优选是与水不溶混的溶剂，例如C1-4的酯或醚。选择的溶剂是乙酸乙酯。再将溶液加入旋转式蒸发器中，溶剂的体积逐渐缩减。在该过程的临界点上，出现第一次结晶，接着在溶剂量进一步缩减以后，出现第二次结晶。仔细地控制溶剂的蒸发速率，使得容易将第一和第二次结晶分开。发现第一次晶体主要是7-羟基-4′-甲氧异黄酮和黄豆苷原，其中包含约8-12％的鹰嘴豆素和染料木黄酮，还发现第二次晶体主要是鹰嘴豆素和染料木黄酮，其中包含5-25％的7-羟基-4′-甲氧异黄酮和黄豆苷原。收集每一次晶体，并单独干燥。发现在每一种情况下，干材料中的异黄酮含量都为90-95％。采用另一种方案，不将最后的二个结晶步骤分开。可将结晶当作一个过程进行，只在第二次结晶后才回收晶体。

将采用过滤收集的晶体进行空气干燥，采用如锤磨机或球磨机等本领域众所周知的方法将晶体粉碎成细粉末。特别是在配制到食品和药剂中时，所得到的细粉末几乎是无色无嗅和实际上无味的。这使结晶的产品特别适合用作食品添加剂，而不需掩蔽异黄酮产品晶体的味道。此外，已经发现本发明细粉末状的α-晶体异黄酮在各种食品加工方法中都能很好地掺合。加入富含异黄酮的晶体，不会明显地增加食品和药物制剂的体积，而且能迅速地加入所述的制剂中。

应用膜技术，能使本发明人以高产率和高纯度回收异黄酮，同时又保持其生理活性和功能。在本发明之前，分离和回收异黄酮的通用方法包括从有机/水的溶剂混合物中蒸发有机溶剂，沉淀粗异黄酮，随后进行回收。可将回收的异黄酮重新萃取到有机溶剂中，用水洗涤，除去水溶性的杂质，并重新沉淀，获得粗异黄酮萃取物。本发明人发现，可以采用超滤膜，方便地对最初的异黄酮萃取物进行异黄酮萃取物的纯化。对于除掉大量分子量大于异黄酮本身分子量的异黄酮的杂质，应用F4膜特别有效。

超滤过程的作用，是在采用蒸发、接着是有机再萃取、和沉淀依次回收固体之前，纯化粗萃取物。除掉的杂质一般是天然的生物高分子树胶，发现它干扰下游操作的加工预测和产品的质量控制。而且，树胶成分能显著降低产品的活性、增加颜色(棕色和绿色)、与异黄酮共沉淀、特别是溶解在有机溶剂中。

超滤器的作用是防止大于一定尺寸的分子通过过滤器。对本发明最有效的超滤器是选择拦截尺寸比生物高分子杂质小，但又比有价值的异黄酮大的超滤器。正如从图1-6所看到的，膜F4能提供纯度非常高且浓度也比实验过的其它膜高得多的异黄酮。

超滤对产品活性的影响示于附图1-8，并列在下面的表1中。表1包括经过各种超滤膜的异黄酮萃取物(3^#给料)的分析结果，这些膜是以膜拦截尺寸降低的顺序列出的。

“滤液”的结果表明，前6种滤液的异黄酮含量(0.069±10.005％)和比例(0.85±0.06)完全没有改变，这表明异黄酮很容易通过膜。膜Y3和F4引起异黄酮浓度的降低，是因为膜的拦截尺寸非常接近于异黄酮分子的大小。即使如此，膜Y3和F4也没有发生异黄酮比例的变化。

“固体产品”的数据说明了采用从滤液中沉淀的方法回收的固体的组成。膜过滤的主要作用是提高产品的活性。对比例(不过滤)产生的活性为47.1％，采用每一种膜处理，都显著地超过了该值。膜Y3和F4产生的活性全都超过目标范围40-70％。

提高活性的原因是，超滤除掉了一些生物高分子杂质，这些杂质与异黄酮一起，从15％的醇中共沉淀，又被共-萃取到乙酸乙酯中。调节膜F4的产品活性(76.5％对85.2％)因为与不受阻碍通过的杂质——盐和糖相比，异黄酮通过得缓慢而受调整。

在表1的最后一栏中，对比例产生的比例为0.755，该值在一定程度上低于进料范围，因为鹰嘴豆素在15％醇中的剩余溶解度较高。由于该溶解度的作用，除F4(0.85)以外，所有膜产品的比例都在预定的范围0.69-0.81。

                                           表1超滤试样的分析

3#进料	滤液		产品固体
					膜	异黄酮％	比例	活性％	比例
无	0.074	0.81	47.3	0.73
					无	0.065	0.91	47.0	0.78
K1	0.063	0.91	52.7	0.78
					K1	0.072	0.82	62.6	0.76
K1K1	0.068	0.82	64.1	0.77
					Om1	0.073	0.79	63.4	0.71
Y3	0.055	0.83	85.2	0.77
					F4	0.023	0.92	76.1	0.85

上面的表1突出了超滤产品与微滤产品相比所具有的优点。预料微滤的固体产品与不采用膜的上述对比例固体产品相当，即其中异黄酮萃取物的活性为约47％，比例为约0.75。这表明粗异黄酮萃取物水浆液的微滤，仅仅是一种方法的改进，而粗萃取物的超滤，则导致产品的改进。

超滤的作用是除掉絮凝的杂质，这意味着异黄酮能够结晶，优选以它们的α-晶形结晶，而不是通过絮凝强制下沉。因此在不降低产率的情况下，从产品活性的观点来看，超过滤显著地提高了处理能力。通过除掉能引起絮凝和增加颜色的叶绿素和生物高分子，超滤步骤可以从原料苜蓿萃取物中脱树胶，并能浓集到所需的任何纯度。重要的是，经过超滤步骤的异黄酮萃取物，特别是在配制到食品和制剂中以后，基本上是无色、无嗅和实际上无味的。

本发明的晶体异黄酮产品，显著优于从前已知的植物雌激素萃取物。例如，Chen等人(WO 00/64276)所述的油包水型涂抹食品，包括一种植物雌激素萃取物，其中包含其它植物成分和杂质。在本发明的结晶异黄酮中，这些污染物如大豆蛋白质、甾醇和甾醇的酯类、stanol和stanol的酯类、植物树胶、叶绿素、和生物高分子或不存在，或以显著减少的量存在。这些污染物一般使包含它们的食品具有不希望有的颜色、涩味、和令人不愉快的口感。

因此，α-晶形的异黄酮产品在涂抹食品、人造奶油、奶油制品、油类、调味酱、早餐的谷类食品、各种面包、和饮料等食品中作为重要成分获得了应用。本领域的技术人员，可以采用已知的标准方法，将结晶的异黄酮掺入各种类型的食品中。本发明异黄酮晶体产品的存在，不会损害食品的香味和口感。使得能够根据需要，在通常的饮食过程中，将有益的异黄酮供给一般公众。选择具体的食品或药物制剂的α-晶体异黄酮就可以获得摄入植物异黄酮的益处，而不需特意致力于用包含异黄酮萃取物的丸剂和胶囊来补足饮食。

采用下列实施例进一步说明和解释本发明。而这些实施例不是对本发明的限制。

实施例1  异黄酮的α-晶形

在收割的2小时内，浸渍和压榨新收割的红色苜蓿(100kg)。将浸渍的苜蓿在环境温度下放置6小时，提供酶解过程，将异黄酮从它们的苷转化成苷元的形式。然后在连续搅拌和搅动下，使浸渍的苜蓿在室温下与1000升含50％乙醇的水接触4小时。然后通过格栅压榨或采用开槽的转鼓，将浸渍液与剩下的植物原料分离。

然后浸渍液经过超滤步骤，使液体通过一系列装有聚乙烯过滤层的滤筒。初级过滤器拦截孔的大小为1,000-10,000MW，第二级过滤器拦截孔的大小为500-1000MW。在约2000kPa的压力下，强制液体通过这些过滤器。

经过超滤的浸渍液在减压下蒸馏，溶剂从水中约50％的乙醇缩减到约10％的乙醇。在蒸发过程的这一点附近，异黄酮大量结晶。降低蒸发速率，溶剂中的乙醇含量进一步缩减约1-2％，这时观察到不再有大量的晶体生成。这时停止蒸馏过程，排出溶剂和晶体悬浮液，用纸过滤器分离晶体和溶剂，空气干燥，锤磨成细粉末。采用高压液体色谱法测定产品的异黄酮含量。

这种产品的特征如下：

物理外观：浅黄到无色，无嗅，略有涩味

异黄酮含量：78％的纯度

            52％的鹰嘴豆素；29％的7-羟基-4′-甲氧异黄酮；

            10％的染料木黄酮；9％的黄豆苷原

实施例2  包含α-晶体异黄酮的人造黄油

由包括葵花/低芥酸菜子油和硬浆的人造黄油脂肪，制作人造黄油涂抹食品，硬浆由充分硬化的棕榈仁油和充分硬化的棕榈油随意进行酯交换的混合物组成。根据本领域已知的标准技术，将人造黄油脂肪配制成人造黄油涂抹食品，其中使人造黄油脂肪和其它成分一道，与采用根据实施例1制备的粉末状α-晶体异黄酮掺合，其它成分包括盐、乳皮和乳清粉末、乳化剂、色素、香料、维生素、和水。配制人造黄油涂抹食品，使人造黄油涂抹食品中含0.1％(重量/重量)的粉末状异黄酮晶体。包含异黄酮的涂抹食品，其味道、外观、和口感与不加任何异黄酮晶体制作的对比涂抹食品没有明显的差别。相比之下，不经过超滤步骤制备的红色苜蓿萃取物，却使所配制的包含这种萃取物的涂抹食品具有令人不愉快的味道、颜色、和质地。

实施例3  不同异黄酮比例的制剂

将根据实施例1制备的α-晶体异黄酮制剂(1200g)溶解在乙酸乙酯中(50升)。将溶液加入旋转式蒸发器中，加热和施加真空。当乙酸乙酯的体积缩减到约30升时，出现第一次结晶。在这一点释放真空，停止旋转蒸发，使晶体沉降。取出晶体和溶剂，通过纸过滤器，收集晶体。然后将过滤的溶剂返回旋转蒸发器，进一步加热和施加真空。当再蒸馏出约10升乙酸乙酯时，出现第二次结晶。采用过滤收集这些晶体。将这二批晶体干燥并磨成粉末。

这二种产品的特征如下：

                          第一次晶体产品       第二次晶体产品

物理外观：                无色、无嗅、无味     无色、无嗅、无味

异黄酮含量：              92％                 94％

7-羟基-4′-甲氧异黄酮：   82％                 20％

鹰嘴豆素：                11％                 75％

黄豆苷原                  5％                  1％

染料木黄酮                2％                  4％

实施例4  α-晶体异黄酮的X-射线粉末衍射数据

使实施例1分离的α-晶体异黄酮经过X-射线粉末衍射。图6示出X-射线粉末衍射图。为了对比，使“粗”红色苜蓿萃取物经过同样的X-射线粉末衍射，其结果示于图7和图8，在图中已经除去了噪声。目前在生产Promensil(Novogen)时，采用粗红色苜蓿萃取物。图7和8表明，粗红色苜蓿萃取物是无定形的物质混合物。相反，图6所示的α-晶体异黄酮具有格外高度有序的晶体结构。

实施例5  分子量和异黄酮的分析

一般方法

采用尺寸排阻色谱法在50％的乙醇中分析试样，以说明生物大分子杂质分子大小的分布。由于碰巧有一部分类似，还同时分析了异黄酮的分布。

分子量范围是标示性的，而不是绝对的，因为醇对柱子的校准有影响，而且没有密切相关的MW标准。

用四种异黄酮的混合标准增敏苜蓿萃取物试样(3^#进料)(图1)，在色谱图上鉴别异黄酮峰。异黄酮对该柱呈现亲和力，因此在它们的实际大小250-300Dalton(道尔顿)后被洗提(即它们在较小的LogMW值0-1.7出现)。

图2表明，在一组四个不同的苜蓿萃取物中，在Log MW＝0-2.5有许多其它少量的成分，它们可能与异黄酮有密切的关系，因为它们具有类似的亲和力，这种亲和力使它们在Log MW＝2.5通过尺寸排阻分离柱的末端。在四个不同的苜蓿萃取物的范围内，主要吸收UV的少量杂质出现在Log MW＝1.5-2.5。

注意，异黄酮标准与苜蓿萃取物中异黄酮的峰位置不相重。根据亲和力，它们的洗提受其它成分的类型和数量的影响，这些其它成分竞争发生作用或竞争通过柱子。

树胶或生物高分子的大小范围，为约1,000-40,000Dalton。绿色叶绿素的尖锐峰出现在Log MW＝3附近。在Log MW为3.5-4.0的高级聚合物呈黄、棕、红棕、或黑色，视浓度而定。生物高分子的吸收度一般比小的芳香族有机分子低，这意味着这里所示的MW分布将试样中存在的生物高分子的比例估计得过低。

粗异黄酮沉淀物的微滤

采用微滤回收从15％的醇中沉淀的粗异黄酮。将最后排出的生成的稀悬浮液浓缩成仍能流动的浓稠浆体。浆体的浓缩有助于异黄酮沉淀的纯化，除掉仍留在滤液中的水溶性成分。

在长时间的过滤实验中，在最高压力下，提供最大通过量的微滤器是AF500，其通过量为在100kPa下的68L·m^-2·h^-1至在200kPa下的45L·m^-2·h^-1。在较高的压力下通过量下降，是由于形成滤饼和滤饼经压实所致。在适当选择的低尺寸范围内，并采用低进料压力，滤液是完全透明的，没有任何浊雾迹象。采用微滤步骤获得的异黄酮回收率为95％。进行第二次微滤，收集第一次过滤后生成的沉淀，二段微滤异黄酮的总回收率为99％。

在50％的醇中溶解的异黄酮的超滤

在顺序进行旋转蒸发-固体回收-乙酸乙酯再萃取之前，采用超滤方法纯化粗异黄酮萃取物。已经发现，超滤能除掉下游操作中干扰加工预测和产品质量的聚合杂质(即脱树胶)。树胶成分能显著地降低产品活性，增加颜色(棕色和绿色)，在15％的醇中与异黄酮共沉淀，并部分地溶解在有机溶剂中。作为药物成分，这一部分树胶也引起了异议，因为它是没有药物作用的。最简单和最理想的解决办法，是除掉它。

采用尺寸排阻色谱法分析粗萃取物，确定分子的大小和质量分布，利用这些信息选择适宜的超滤器。超滤器的作用是防止大于一定大小的分子通过过滤器，过滤器与血液透析和肾机能以及与植物细胞壁在防止其遗传材料释放方面的操作和生化机能完全相似。

通过孔的大小来区分超滤器，孔的大小决定了被拦截分子的大小，选择孔的大小小于生物高分子，但大于有价值的小分子。采用进行纯化要求的致密膜，在400kPa及1-10L·m^-2·h^-1的条件下，对苜蓿萃取物进行超滤。这种类型的膜，通常在1000-2000kPa的压力下操作，在这种情况下预期通过量为5-25L·m^-2·h^-1。

当发现所有的进料都通过了50kD的超滤器时(图3，膜＝HZ20P，其中P＝渗透或滤液试样)，就用实验证实了上限MW为约40kD(图1和2)的色谱法结果。图3中所有的渗透分析，是采用不同的逐渐致密的膜由同一种进料(3^#进料)进行的。如图3中的一系列曲线所示，随着膜变得更加致密，除掉的生物高分子递增。

可以看到，膜F4能使叶绿素大大降低。F4是唯一能在LogMW＝1.8-2.5的情况下显著影响异黄酮材料的膜。虽然异黄酮浓度的降低使异黄酮通过该过程的质量迁移变慢，但在除去杂质方面的巨大收益比这个问题更为重要。图3中的处理K1K1，是3^#进料通过二段膜K1串联进行处理的。在图4中更清楚地示出，采用一段(K1)和二段(K1K1)超滤对除去生物高分子的改善。异黄酮仍然不受影响，但叶绿素和生物高分子却显著减少。采用K1K1获得的纯化作用，优于采用Om1，即使Om1是比K1更致密的膜(这种现象对多段膜过程在基本原理上是合理的)。

至于膜HZ20、GR61和YW3，脱树胶的性能不够。

超滤的目的之一是改善产品的质量。为了论证这一点，使3^#进料在50％的醇中进行超滤，(对比例＝不超滤)。用水将滤液稀释到含15％的醇，用微滤器收集异黄酮产品，从其中将异黄酮重新萃取到50％的醇中。产品分析表明，在这二种采用超滤的情况下，产品萃取物比对比例包含较高的异黄酮浓度和较低的生物高分子浓度。

此外，图5示出一种滞留物试样，该试样是采用超滤将进料的初始体积缩减28.8倍产生的。与图2的进料试样相比，生物高分子的峰显著增强，而异黄酮的峰却仍保持不变。损失到这种滞留废物流中的异黄酮产量，为滞留物体积与进料体积成比例。当浓集因数为28.8时，产量损失为3.5％。设计甚至更高的浓集因数或重新萃取(膜过滤(diafiltration))滞留物，可进一步降低这种损失。

本说明书中涉及的任何现有技术不应看作是对该技术的认可或任何形式的建议，在所致力的领域内，这些现有技术已经成为普通常识的一部分。

本领域的技术人员会理解，除了特别加以说明的以外，这里所述的本发明，是可以变动和改进的。应当理解为本发明包括所有这些变动和改进。本发明还包括在说明书中涉及或指出的所有步骤、特征、组合物、和化合物，无论是单独的还是整体的，以及任何二个或多个所述步骤或特征的任何和一切组合。

Claims (30)

1.一种生产α-晶形异黄酮的方法，其中包括下列步骤：

(a)通过使包含异黄酮的植物体与含水的有机溶剂混合物接触从包含异黄酮的植物体中萃取异黄酮，获得萃取液；

(b)使萃取液进行超滤，以减少分子量大于异黄酮的植物体量；

(c)缩减滤液中的溶剂，使异黄酮发生α-结晶；和

(d)回收α-晶体异黄酮。

2.权利要求1的方法，其中含水的有机溶剂混合物的水∶有机溶剂的比例为1∶10-10∶1。

3.权利要求2的方法，其中水∶有机溶剂的比例为约1∶1。

4.权利要求3的方法，其中有机溶剂是C1-4的有机溶剂，它们选自醇类、氯代烷、二醇类、烷基酯、和烷基醚。

5.权利要求4的方法，其中有机溶剂是乙醇。

6.权利要求1的方法，其中α-晶体异黄酮的异黄酮含量＞65％。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中异黄酮的α-晶形具有基本如图6所示的X-射线粉末衍射图。

8.一种生产α-晶形异黄酮的方法，其中包括下列步骤：

(a)通过使包含异黄酮的植物体与一种含水的有机溶剂混合物接触从包含异黄酮的植物体中萃取异黄酮，获得萃取液；

(b)使萃取液进行超滤，以减少分子量大于异黄酮的植物体量；

(c)缩减滤液中的溶剂，使异黄酮发生α-结晶；

(d)回收α-晶体异黄酮；

(e)将从步骤(d)中回收的异黄酮晶体溶解在一种有机溶剂中；

(f)逐渐缩减有机溶剂的体积，使异黄酮产生选择性的α-结晶；和

(g)分离选择性结晶的α-晶体异黄酮。

9.权利要求8的方法，其中步骤(a)中含水的有机溶剂混合物的水∶有机溶剂的比例为1∶10-10∶1。

10.权利要求9的方法，其中水∶有机溶剂的比例为约1∶1。

11.权利要求10的方法，其中有机溶剂是C1-4的有机溶剂，它们选自醇类、氯代烷、二醇类、烷基酯、和烷基醚。

12.权利要求11的方法，其中有机溶剂是乙醇。

13.前述权利要求8的方法，其中α-结晶异黄酮的异黄酮含量＞50％。

14.权利要求13的方法，其中异黄酮的含量＞65％。

15.权利要求8的方法，其中步骤(e)的有机溶剂是C1-4的酯或醚。

16.权利要求15的方法，其中有机溶剂是乙酸乙酯。

17.权利要求8的方法，其中选择性结晶的α-晶体异黄酮的异黄酮含量＞80％。

18.权利要求17的方法，其中选择性结晶的α-晶体异黄酮的异黄酮含量＞90％。

19.权利要求18的方法，其中选择性结晶的α-晶体异黄酮主要包含7-羟基-4′-甲氧异黄酮和黄豆苷原。

20.权利要求18的方法，其中选择性结晶的α-晶体异黄酮，主要包含鹰嘴豆素和染料木黄酮。

21.权利要求8-20任一项的方法，其中异黄酮的α-晶形具有基本如图6所示的X-射线粉末衍射图。

22.α-晶形的异黄酮，其中该晶形具有基本如图6所示的X-射线粉末衍射图。

23.权利要求22的α-晶体异黄酮，其中α-晶形在配制到食品和药物制剂中时，基本上是无色、无嗅、和实际上无味的。

24.权利要求23的α-晶体异黄酮，其中α-晶形包含的异黄酮超过50％。

25.权利要求24的α-晶体异黄酮，其中α-晶形包含的异黄酮超过90％。

26.权利要求25的α-晶体异黄酮，其中α-晶形基本上是纯的。

27.一种食品或药物制剂，包含权利要求22-26任一项的α-晶形异黄酮。

28.权利要求27的食品或药物制剂，其是涂抹食品、人造奶油、奶油制品、油类、调味酱、早餐的谷类食品、各种面包或饮料。

29.一种制备食品或药物制剂的方法，其中包括使权利要求22的α-晶形异黄酮与所述食品或药物制剂中的一种或多种成分形成混合物的步骤，其中α-晶形在配制在所述的食品或药物制剂中时，基本上是无色、无嗅、和实际上无味的。

30.权利要求29的方法，其中在配制到所述的食品或药物制剂中之前，将α-晶体异黄酮磨碎或粉化。

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