CN1226282A - 具有齿斑葡聚糖酶活性的重组酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及构建表达载体的方法,所说的表达载体含有得自适于外源生产的丝状真菌的齿斑葡聚糖酶基因,该方法包括以下步骤:a)从丝状真菌中分离编码齿斑葡聚糖酶的DNA序列,b)在编码前肽和齿斑葡聚糖酶成熟区的DNA序列之间导入Kex2位点或Kex2样位点,c)将步骤b)中得到的NDA序列克隆到适当的表达载体中。本发明还涉及含有所说的齿斑葡聚糖酶基因序列并在编码前肽与编码齿斑葡聚糖酶的成熟区的DNA序列之间有Kex2切割位点的重组表达载体、丝状真菌宿主细胞、生产重组齿斑葡聚糖酶的方法,以及所说的重组齿斑葡聚糖酶。本发明的另一个目的是提供可用于人和动物的口腔保健产品中的组合物。

Description

具有齿斑葡聚糖酶活性的重组酶
发明的领域
本发明涉及构建表达载体的方法，所说的表达载体含有得自适于外源生产的丝状真菌的齿斑葡聚糖酶基因，本发明还涉及含有所说的齿斑葡聚糖酶基因序列并在编码前肽的DNA序列与编码成熟齿斑葡聚糖酶的DNA序列之间有Kex2切割位点的重组表达载体、丝状真菌宿主细胞、生产重组齿斑葡聚糖酶的方法，以及所说的重组齿斑葡聚糖酶。
本发明的另一个目的是提供可用于人和动物的口腔保健产品中的组合物。
发明的背景
齿斑葡聚糖酶是降解齿斑葡聚糖中α-1,3-糖苷键的α-1,3-葡聚糖酶(也称为α-1,3-葡聚糖水解酶)。已描述了由两种木霉属(Hasegawa等人，(1969)，生物化学杂志244,p.5460-5470；Guggenheim和Haller,(1972)，牙科研究杂志51,p.394-402)和链霉菌属菌株(Takehara等人，(1981)，细菌学杂志145,p.729-735)、树脂枝孢(Hare等人,(1978)，碳水化合物研究66,p.245-264)、假单胞属(美国专利4,438,093)、黄杆菌菌种(JP 77038113)、环状芽孢杆菌(JP 63301788)和曲霉属菌种的齿斑葡聚糖酶。已克隆了Trichoderma harzianum中的齿斑葡聚糖酶基因并测定了其DNA序列(日本专利No.4-58889-A,Nissin shokuhin kaisha LDT)。
虽然齿斑葡聚糖酶在牙科和个人保健产品，例如牙膏、胶姆糖或其他口腔和牙齿保护产品中可作为抗龋剂具有商业开发价值，但目前还不能以商业上适用的大批量生产齿斑葡聚糖酶。
美国专利4,353,891(Guggenheim等人)涉及使用由Trichodermaharzianum CBS 243,71产生的齿斑葡聚糖酶降解经培养可鉴定为OMZ176的齿斑葡聚糖链球菌菌株所合成的齿斑葡聚糖，以去除齿斑。
本发明的目的是提供能够以商业上有用的量生产的Trichodermaharzianum的重组齿斑葡聚糖酶。
附图的简要说明
图1显示质粒pMT1796。
图2显示质粒pMT1796、pMT1802和pMT1815的质粒构建。
图3显示米曲霉重组齿斑葡聚糖酶表达载体pMT1802的构建。
图4显示重组和野生型T.harzianum CBS 243.71齿斑葡聚糖酶的pH相关曲线。
图5显示重组和野生型T.hozrzianum CBS 243.71齿斑葡聚糖酶在pH7时的温度相关曲线。
图6显示重组和野生型T.harzianum CBS 243.71齿斑葡聚糖酶在pH7时的温度稳定性。
图7显示37℃生长于BHI中的S.mutans、A.viscosus和F.nucleatum的混合培养物的间接Malthus标准曲线。
发明概要
本发明的目的是经异源表达来提供衍生于丝状真菌的重组齿斑葡聚糖酶。
本发明人已第一次能够异源表达丝状真菌齿斑葡聚糖酶基因，并因而弄清了提供基本上没有任何污染物的单组分的重组齿斑葡聚糖酶的方法。
本发明的第一个方面涉及构建含有齿斑葡聚糖酶基因的表达载体的方法，所说的基因得自适于异源生产的丝状真菌，该方法包括以下步骤：
a)从丝状真菌中分离编码齿斑葡聚糖酶的DNA序列，
b)在编码前肽和齿斑葡聚糖酶成熟区的DNA序列之间导入Kex2位点或Kex2样位点，或用包括另一种真菌酶的Kex2或Kex2样位点的(前)原序列取代齿斑葡聚糖酶(前)原序列。
c)将步骤b)中得到的DNA序列克隆到适当的表达载体中。
在一优选实施方案中，齿斑葡聚糖酶是从木霉属的菌株得到的。
在步骤b)中，例如可以用Lipolase(前)原序列或TAKA淀粉酶(前)原序列取代齿斑葡聚糖酶(前)原序列。
本发明的再一个目的是提供含有齿斑葡聚糖酶基因和编码(前)前肽的DNA序列的表达载体，其中在编码所说的(前)前肽和齿斑葡聚糖酶的成熟区的DNA序列之间有Kex2位点或Kex2样位点。
本发明还涉及生产衍生于丝状真菌之重组齿斑葡聚糖酶的宿主细胞。优选的宿主细胞包括木霉属、曲霉属和镰孢属的丝状真菌。
此外，本发明涉及在宿主细胞中生产重组齿斑葡聚糖酶的方法，其包括：
a)将含有齿斑葡聚糖酶基因，并在编码前肽和齿斑葡聚糖酶成熟区的DNA序列之间有Kex2位点或Kex2样位点的表达载体转化到适当的丝状真菌宿主细胞中。
b)在允许表达和分泌活性齿斑葡聚糖酶的条件下，在适当的培养基中培养宿主细胞。
c)从培养基中回收并酌情纯化被分泌的活性重组齿斑葡聚糖酶。
可按照上述的本发明的方法制备表达载体。
可按照本发明的上述方法生产本发明的重组齿斑葡聚糖酶。
从Trichoderma harzianum CBS 243.71中得到的基本上没有任何污染物的实质上纯的野生型齿斑葡聚糖酶也是本发明的一部分。
本发明还涉及含有本发明的重组齿斑葡聚糖酶或本发明的实质上纯的齿斑葡聚糖酶的组合物，该组合物可用于口腔保健产品及食物、饲料和/或宠物食品中。
最后，本发明涉及使用本发明的重组齿斑葡聚糖酶或本发明的实质上纯化的齿斑葡聚糖酶或本发明的组合物或产品预防人或动物齿斑形成或去除齿斑，以及用于食物、饲料和/或宠物食品中。发明的详细描述
本发明的目的是经异源表达来提供衍生于丝状真菌的重组齿斑葡聚糖酶。
本发明人已第一次能够异源表达丝状真菌齿斑葡聚糖酶基因，并因而弄清了提供基本上没有任何污染物的单组分的重组齿斑葡聚糖酶的方法。
本发明的原则可适用于来自丝状真菌如木霉属；例如Trichodermaharzianum菌株，特别是T.harzianum CBS 243.71，以及链霉属、枝孢属或曲霉属丝状真菌的所有齿斑葡聚糖酶。
以前没有可能异源产生丝状真菌的齿斑葡聚糖酶。因此，根据现有技术，齿斑葡聚糖酶是同源产生的，并包括除齿斑葡聚糖酶以外的其他酶的混合物(即含有不需要的污染物)。
其中一个例子是已知产生齿斑葡聚糖酶的如上述的Trichodermaharzianum CBS 243.71。在成功地完成本发明之前，衍生于TrichodermaharzianumCBS 243.71的齿斑葡聚糖酶只是同源产生的。
优越的是能够异源产生齿斑葡聚糖酶，这样就有可能提供没有不需要的污染物的单一成分齿斑葡聚糖酶。此外，其有利于以工业生产规模提供本发明的分离并纯化的酶。
根据本发明，有可能在编码前肽和成熟齿斑葡聚糖酶的DNA序列之间导入Kex2切割位点或Kex2样位点，或用含有另一种真菌酶的Kex2位点或Kex2样位点的(前)原序列取代齿斑葡聚糖酶(前)原序列，以在适当的宿主细胞中表达衍生于丝状真菌的齿斑葡聚糖酶。
(前)原序列例如可以是Lipolase(前)原序列或TAKA淀粉酶(前)原序列。
前肽
大量的成熟蛋白质最初都是从前肽，即从很小的(如GLA6氨基酸)到相对长的肽(如PEPA 49氨基酸)经N末端延伸而合成的。
前肽可完成许多不同的功能。首先，前肽可能提高蛋白质越过ER膜共翻译转运的效率。其次，前肽可参予多肽的共翻译蛋白水解加工。第三，它们可能起到导向特定细胞区室的细胞内靶向信号的作用。第四，在某些前蛋白质中，前肽可使蛋白质在达到其作用位点之前一直保持无活性状态。
通常在两个带正电荷的氨基酸残基Arg-Arg、Arg-Lys或Lys-Arg之后，使用特异性内肽酶加工，以从成熟蛋白质上去掉前肽。但已发现待加工的还有其他氨基酸组合，其中至少包括一个碱性氨基酸。
在成熟的、内源分泌的蛋白质中没有这些二联残基可使它们不能受到蛋白酶剪切。因为认为二元剪切发生在高尔基体中，所以胞质蛋白质中的内部二元肽序列不会受到这种加工的攻击。
Kex2位点
Kex2位点(例如参见酶学方法，Vol.185 ed.D.Goeddel,AcademicPress Inc.(1990),San Diego,CA，“基因表达技术”)和Kex2样点是见于某些蛋白质的前肽编码区和成熟区之间的二元识别位点(即切割位点)。
已显示在某些情况下插入Kex2位点或Kex2样位点可改善前肽切割位点处的正确内肽酶加工，从而提高蛋白分泌水平。
但在许多其他情况下，插入Kex2切割位点并不能增加分泌水平。例如，Cullen等人((1987)，生物/技术，Vol.5,p.369-376)发现，在凝乳酶的分泌信号(即信号肽和前肽，其编码葡糖淀粉酶信号肽和融合到凝乳酶原上的前肽)中插入Kex2位点，并不增加在构巢曲霉宿主细胞中表达的重组凝乳酶的分泌水平。
Valverde等人(1995)，生物化学杂志，p.15821-15826)也证明插入Kex2位点或Kex2样位点并不总是增加分泌水平。
本说明书中使用的术语“异源”生产是指在不同于原始供体生物体的宿主生物体中表达重组酶，或由供体生物体表达重组酶。
本语“同源”生产是指由原生物体表达野生型酶。
本发明的第一个方面涉及构建包括适于异源生产的齿斑葡聚糖酶基因的表达载体的方法，该方法包括以下步骤：
a)从已知产生齿斑葡聚糖酶的丝状真菌中分离编码齿斑葡聚糖酶的DNA序列，
b)在编码前肽和齿斑葡聚糖酶的成熟区的DNA序列之间导入Kex2位点或Kex2样位点，或用包括另一种真菌酶的Kex2或Kex2样位点的(前)原序列取代齿斑葡聚糖酶(前)原序列。
c)将步骤b)中得到的带有Kex2位点或Kex2样位点的齿斑葡聚糖酶基因克隆到适当的表达载体中。
在一优选实施方案中，齿斑葡聚糖酶基因是从木霉属，较好是T.harzianum的菌株，特别是T.harzianum CBS 243.71的菌株中得到的。
SEQ ID No.1中显示了衍生于T.harzianum CBS 243.71的完整齿斑葡聚糖酶基因DNA序列。
在步骤b)中，例如可用Lipolase(前)原序列或TAKA淀粉酶(前)原序列取代齿斑葡聚糖酶(前)原序列。
在下面举例说明本发明的实施例中，作为位点特异性突变E36→K36，将Kex2位点插入到SEQ ID No.1中给出的T.harzianum齿斑葡聚糖酶基因中。
齿斑葡聚糖酶基因的分离
可使用基于本文公开的DNA序列制备的合成的寡核苷酸探针，从适当来源，例如上述已知含有齿斑葡聚糖酶基因的任何生物体的DNA中，按已知方法方便地分离编码齿斑葡聚糖酶的DNA序列。
例如，可基于SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列，或SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列，或其任何适当的亚序列制备适当的寡核苷酸探针。
按照该方法，根据SEQ ID No.2的至少一部分序列设计引物。然后使用这些引物PCR扩增齿斑葡聚糖酶基因的片段。
另外，也可以使用下述一般方法分离编码齿斑葡聚糖酶的DNA序列：
-在适当的载体中克隆得自木霉属菌株的DNA或DNA文库，
-用所说的载体转化适当的宿主细胞，
-在适于表达由DNA文库中的克隆编码的任何感兴趣的酶的条件下培养宿主细胞，
-检测由这些克隆产生的酶的齿斑葡聚糖酶活性，以筛选阳性克隆，并且
-从这些克隆中分离编码酶的DNA。
WO93/11249中进一步公开了一般方法，该专利列为本文参考文献。
表达载体
本发明的另一个方面涉及含有齿斑葡聚糖酶基因和编码前肽的DNA序列的表达载体，其中带有插入到编码所说的前肽和齿斑葡聚糖酶的成熟区的DNA序列之间的Kex2位点或Kex2样位点。
在本发明的优选实施方案中，表达载体除了包括Kex2位点或Kex2样位点之外还包括一个可操作连接的编码前原肽(即信号肽和前肽)的DNA序列。前原序列优选是原始齿斑葡聚糖酶信号序列或Lipolase信号序列或TAKA信号序列，及原始齿斑葡聚糖酶前序列或Lipolase前序列或TAKA前序列。
启动子可以是TAKA启动子或TAKA:TPI启动子。
在本发明的一个特定实施方案中，表达载体是用于在下文实施例3中举例说明本发明的概念的pMT1796。
载体的选择常常取决于待导入该载体的宿主细胞。
因此，载体可以是自动复制载体，即作为染色体外整体存在，其复制不依赖于染色体的复制的载体，例如质粒。另外，载体可以是当导入宿主细胞内时即整合到宿主细胞基因组中，并且与它所整合进去的染色体一起复制的载体。
在载体中，编码齿斑葡聚糖酶的DNA序列应可操作地连接到适当的启动子和终止子序列上。启动子可以是在宿主细胞中表现有转录活性的并可衍生于编码同源或异源于宿主细胞的蛋白质的任何DNA序列。
用于分别连接编码齿斑葡聚糖酶的DNA序列、包括Kex2位点或Kex2样位点的前原序列、启动子及终止子的方法，以及将它们插入到适当的载体中的方法都是本领域技术人员已知的(例如参见Sambrook等人，(1989)，分子克隆，实验室手册，冷泉港，纽约)。
宿主细胞
本发明的第三个方面涉及生产衍生于丝状真菌的重组齿斑葡聚糖酶的丝状真菌宿主细胞，所说的丝状真菌可以是木霉属的菌株，例如T.harzianum的菌株，特别是T.harzianum CBS243.71的菌株，或曲霉属菌株，例如米曲霉或黑曲霉的菌株，或者是镰孢属的菌株，例如尖镰孢、禾谷镰孢的菌株(完好状况下称为玉蜀黍赤霉，以前称为玉蜀黍球壳霉，别名是粉红粉红赤霉和粘帚霉五谷变种)，或硫磺镰孢(完好状态下称为小麦赤霉，别称Fusarium trichothecioides，杆孢状镰孢，接骨木镰孢、粉红镰孢和粉红镰孢禾谷变种)、五谷镰孢(别称F.crokkwellnse)，或毒性镰孢。
优选的宿主细胞可以是WO96/00781中所述的禾谷镰孢(得自NovoNordiskA/S)，例如以登记号禾谷镰孢ATCC 20334保藏的菌侏。菌株ATCC20334以前被错误地分类为禾谷镰孢(Yoder,W.和Christianson,L,1997)。现在已基于RAPD分析和经典分类学分析证明，Quorn真菌，ATCC20334的真实身分是毒性镰孢Nirenburg新种。
本发明的再一个方面涉及在宿主细胞中生产重组齿斑葡聚糖酶的方法。所说的方法包括以下步骤：
a)将在编码前肽和齿斑葡聚糖酶的成熟区的DNA序列之间带有Kex2位点或Kex2样位点的，编码齿斑葡聚糖酶基因的表达载体转化到适当的丝状真菌宿主细胞内，
b)在允许该表达载体表达的条件下，在适当的培养基中培养宿主细胞，
c)从培养基中回收被分泌的重组齿斑葡聚糖酶，
d)并根据需要回收被分泌的重组齿斑葡聚糖酶。
重组表达载体可以是上述的任何一种表达载体。
此外，用于按照本发明的方法生产本发明的重组齿斑葡聚糖酶的丝状真菌宿主细胞可以是如上所述的任何一种细胞，特别是曲霉属、镰孢属或木霉属的细胞。
用于培养被转化的宿主细胞的培养基可以是适于生长所研究的宿主细胞的任何常规培养基。所表达的齿斑葡聚糖酶可以方便地分泌到培养基中并可用已知的方法回收，这些方法包括经离心或过滤从培养基中分离细胞，借助适当的盐例如硫酸铵沉淀培养基的蛋白质成分，然后进行离子交换层析、亲和层析等层析处理。
本发明的再一个重要目的是提供按本发明的方法生产的重组齿斑葡聚糖酶。
分离的重组齿斑葡聚糖酶基本上具有SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列。根据SDS-PAGE分析，发现其分子量约为80kDa。
发现重组齿斑葡聚糖酶的最适pH范围为3.5至5.5，此相当于野生型齿斑葡聚糖酶的最近pH(参见图4)。发现重组和野生型齿斑葡聚糖酶的最适温度在pH7时为大约45℃，在pH5.5时为大约55℃(参见图5)。此外，在pH7和40℃时残留活性开始下降，而酶在pH5.5时更为稳定，其中55℃时残留活性开始下降。
本发明人还提供了基本上没有任何活性污染物例如其他酶活性的，得自Trichoderma harzianum CBS 243.71的实质上纯的野生型齿斑葡聚糖酶。
组合物
本发明的再一个目的是提供包含本发明的重组齿斑葡聚糖酶或基本上没有任何活性污染物的纯化的野生型齿斑葡聚糖酶的组合物。
口腔保健组合物
再一个方面，本发明涉及作为口腔保健产品的成分的口腔保健组合物。
本发明的口腔保健组合物包括适当量的重组T.harzianum齿斑葡聚糖酶，其相当于计算的口腔保健终产品中约含0.001MU至1000MU/ml，较好0.01MU/ml至500MU/ml，例如0.1MU/ml至100MU/ml，特别是0.05MU/ml至100MU/ml的酶活性。
根据本发明，口腔保健组合物中还可包括除齿斑葡聚糖酶活性以外的其他酶活性。预期的酶活性包括选自葡聚糖酶、氧化酶如葡萄糖氧化酶或L氨基酸氧化酶、过氧化物酶例如WO95/10602(Novo NordiskA/S)中所述的Coprinus sp.过氧化物酶或乳过氧化物酶或卤过氧化物酶、漆酶、蛋白酶如木瓜蛋白酶或酸性蛋白酶(例如WO95/02044(NovoNordisk A/S)中所述的酸性蛋白酶)、内切葡糖苷酶、脂酶、淀粉酶、包括淀粉葡糖苷酶如AMG(Novo Nordisk A/S)、抗微生物酶及其混合物。
口腔保健产品
口腔保健产品可以具有任何适当的物理形式(如粉末、膏状物、凝胶、液体、软膏、片剂等)。“口腔保健产品”可定义为可用于保持或改善人和动物的口腔卫生、预防龋齿、预防齿斑和牙石形成、去除齿斑和牙石、预防和/或治疗口腔疾病等的产品。
至少在本说明书中，口腔保健产品还包括清洁牙托、假牙等的产品。
这样的口腔保健产品的实例包括牙膏、牙乳、凝胶或牙粉、洗牙水、漱口液、刷牙前或刷牙后漱洗配方、口香糖、锭剂和糖果。
牙膏和牙凝胶一般都包括研磨抛光材料、起泡剂、香味剂、润湿剂、粘结剂、增稠剂、甜味剂、增白剂/漂白剂/色斑清除剂、水，及酶。
包括牙斑去除液在内的漱口剂一般包括水/酶溶液、香味剂、湿润剂、甜味剂、起泡剂、着色剂及酶。
磨料
本发明的洁齿剂产品中也可掺入研磨抛光材料。根据本发明，所说的研磨抛光材料包括氧化铝和水合氧化铝，如α三水合氧化铝、三硅酸镁、碳酸镁、高岭土、硅铝酸盐如煅烧的硅酸铝和碳酸铝、碳酸钙、硅酸锆、以及粉末状塑料，如聚氯乙烯、聚酰胺、聚丁烯酸甲酯、聚苯乙烯、酚-甲醛树脂、蜜胺-甲醛树脂、脲-甲醛树脂、环氧树脂、粉末状聚乙烯、硅干凝胶、水凝胶和气溶胶等。适用的研磨剂还包括焦磷酸钙、非水溶性偏磷酸碱金属盐、磷酸二钙和/或其二水合物、正磷酸二钙、磷酸三钙、微粒羟磷灰石等。也可利用这些物质的混合物。
根据口腔保健产品的不同，研磨产品含量可以是0至70％(重量)，较好为1％至70％。在牙膏中，研磨材料含量一般为最终牙膏产品的10％至70％(重量)。
利用润湿剂防止水从牙膏中丢失。用于本发明的口腔保健产品中的适当的润湿剂包括下列化合物及其混合物：甘油、多元醇、山梨醇、聚乙二醇(PEG)、丙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、部分氢化的水解多糖等。牙膏中润湿剂含量一般为0％至80％，较好为5％至70％(重量)。
适用的增稠剂和粘结剂的例子包括硅石、淀粉、黄蓍胶、黄原胶、爱尔兰藓提取物、海藻酸、果胶、纤维素衍生物如羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基纤维素、聚丙烯酸及其盐、聚乙烯吡咯烷酮等，其可帮助稳定牙粉产品。牙膏乳剂和凝胶中增稠剂的含量为0.1至20％(重量)，粘结剂含量为终产品的0.01至10％(重量)。
起泡剂
可使用肥皂、阴离子、阳离子、非离子、两性和/或两性离子表面活性剂作为起泡剂。这些起泡剂可占终产品重量的0％至15％，较好占0.1至13％，最好占0.25至10％。
表面活性剂
表面活性剂只是那些对本发明的酶没有失活作用的表面活性剂。表面活性剂包括脂肪醇硫酸酯、磺化单酸甘油酯或有10至20个碳原子的脂肪酸的盐、脂肪酸-白蛋白缩合产物、脂肪酸酰胺和氨基乙磺酸的盐和/或羟乙磺酸脂肪酸酯的盐。
甜味剂
适用的甜味剂包括糖精。
香味剂
常常加有少量，例如0.01％至大约5％(重量)，特别是0.1％至5％的香味剂，例如薄荷。
增白剂/漂白剂
增白剂/漂白剂包括H2O2，并可按终产品重量的不足5％，较好0.25至4％的量加入。
增白剂/漂白剂可以是酶，例如氧化还原酶。适用的牙齿漂白酶的例子是WO97/06775(Novo Nordisk A/S)中描述的酶。
水
通常以可使例如牙膏产生流动的量加入水。
其他添加剂
另外还可包括水溶性抗菌剂，例如二葡糖酸氯己定(Chlorhexidinedigluconate)、双辛氢啶、阿来西定、季铵抗菌化合物及水溶性来源的某些金属离子如锌、铜、银和二价锡(例如锌、铜和二价锡氯化物、及硝酸银)。
根据本发明，另外还可加入用作氟化物来源的化合物、染料/着色剂、防腐剂、维生素、pH调节剂、抗龋剂、脱敏剂等。
酶
用于本发明的口腔保健产品中的其他基本成分是酶。在活体中，酶是化学反应的生物催化剂。酶与其作用的底物结合形成中间体酶-底物复合物。然后该复合物转化成反应产物，并释放出继续发挥其特异性酶促功能的酶。
当用于清洁口腔时，酶可提供几方面的好处。蛋白酶分解唾液蛋白质，后者吸附到牙齿表面上形成菌膜，即所得齿斑的第一层。蛋白酶和脂酶一起溶解那些构成细菌细胞壁和膜的结构成分的蛋白质和脂质，从而破坏细菌。
葡聚糖酶破坏由细菌产生的、形成细菌粘附基质的有机骨架结构。蛋白酶和淀粉酶不仅防止龋斑形成，而且经过破坏与钙结合的碳水化合物-蛋白质复合物，防止矿化进而防止牙石的生成。
牙膏
由本发明的口腔保健组合物生产的牙膏一般可包括下列成分(以所占最终牙膏组合物的重量百分比表示)：
研磨剂材料                  10至70％
润湿剂                      0至80％
增稠剂                      0.1至20％
粘结剂                      0.01至10％
甜味剂                      0.1至5％
起泡剂                      0至15％
增白剂                      0至5％
酶                          0.0001至20％
在本发明的一个特定实施方案中，口腔保健产品是含有下列成分的，pH范围为6.0至大约8.0的牙膏：
a)10％至70％                研磨剂材料
b)0至80％                   润湿剂
c)0.1至20％                 增稠剂
d)0.01至10％                粘结剂
e)0.1至5％                  甜味剂
f)0至15％                   起泡剂
g)0至5％                    增白剂
i)0.0001％至20％            酶
ⅰ)下所述的酶包括本发明的重组齿斑葡聚糖酶，并且也可以是上文提到的可用于牙膏等产品中的其他类型的酶。
漱口液
由本发明的口腔保健组合物生产的漱口液一般可包括下列成分(以所占最终漱口液组合物的重量百分比表示)：
0至20％                    润湿剂
0-2％                      表面活性剂
0-5％                      酶
0-20％                     乙醇
0-2％                      其他成分(例如香料、甜味剂、
                           氟化物等活性成分)
0-70％                     水
可用pH范围6-7.5的柠檬酸或磷酸钠等适当的缓冲液缓冲漱口组合物。
漱口液可以是未稀释形成的(即使用前必须进行稀释)。
制造方法
可以使用的口腔保健产品生产领域已知的方法制造本发明的口腔保健组合物和产品。
根据本发明，重组齿斑葡聚糖酶和/或实质上纯化的没有活性污染物的齿斑葡聚糖酶可用于食物、饲料和/或宠物食品中。材料和方法
材料
微生物
Trichoderma harzianum CBS 243.71
米曲霉JaL 125：米曲霉IFO 4177可得自日本大阪发酵研究所(Institute of Fermentation,Osake；17-25 Juso Hammachi 2-ChomeYodogawa-ku,Osaka,Japan)，其具有以一步骤基因置换法(参见G.May,“丝状真菌的应用分子遗传学”，(1992),p.1-25,Eds.J.R.Kinghorn和G.Turner,Blackie Academic and Professional)，使用米曲霉pyrG基因作为标记删除的称为“alp”的碱性蛋白酶基因(参见Murakami K.等人，农业生物化学，55,p.2807-2811)。
大肠杆菌DH5α。
质粒和载体：
pMT 1796(图1和图2)
pMT 1802(图2)
pMT 1815(图2)
pHD414：曲霉表达载体是质粒p775(EP238023中所述的)的衍生物。WO93/11249中进一步描述了pHD414的构建。pHD414含有黑曲霉葡糖淀粉酶终止子和米曲霉TAKA淀粉酶启动子。
pHD 414+mut(图3)
含有TAKA:PTI启动子的pHan37
接头：
接头#1：
GATCCTCACA ATG TTG GGC GTT GTC CGC CGT CTA GGC CTA GG
    GAGTGT TAC AAC CCG CAA CAG GCT GCA GAT CCG GAT CCG C
           Met Leu Gly Val Val Arg Arg Leu Gly Leu Gly
接头#2：
      C CAA TAC TGT TAG T
 GT ACG GTT ATG ACA ATC AGATC
Ala Cys Gln Tyr Cys ***
引物：引物1:5′GGGGGGATCCACCATGAG 3 ′(SEQ ID No.3)引物2:5′ACGGTCAGCAGAAGAAGCTCGACGAATAGGACTGGC 3′(SEQ IDNo.4)引物3:5′GCCAGTCCTATTCGTCGAGCTTCTTCTGCTGACCGT 3′(SEQ IDNo.5)引物4:5′CCACGGTCACCAACAATAC 3′(SEQ ID No.6)引物5:GGGGGGATCCACCATGAG(SEQ ID No.7),引物6:ACGGTCAGCAGAAGAAGCTCGACGAATAGGACTGGC(SEQ ID No.8)引物7:GCCAGTCCTATTCGTCGAGCTTCTTCTGCTGACCGT(SEQ ID NO.9),引物8:CCACGGTCACCAACAATAC(SEQ ID No.10).
酶：
无色杆菌属(Achromobacter)的赖氨酰特异性蛋白酶
Trichoderma harzianum CBS 243.71发酵液(批号PPM 3897)
培养基、底物和溶液：
YPM:2％麦芽糖、1％细菌蛋白胨和0.5％酶母提取物，
DAPI:4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(Sigma D-9542),
Britton-Robinson缓冲液，
BHI：脑心灌注液。
设备：
10KDa截止超滤盒(Alpha Minisette，购自Filtron)；
苯基-琼脂糖FF(高微细)柱(Pharmacia)；
Seitz EK1过滤板；
Q-琼脂糖FF柱(Pharmacia)；
Applied Biosystems 473A蛋白质序列分析仪；
2升Kieler发酵罐；
Olympus BX50型显微镜；
Malthus Flexi M2060(Malthus仪器有限公司)。
方法
分子生物学方法
包括限制性消化、DNA连接、大肠杆菌转化、DNA分离、Southern杂交、PCR扩增和文库构建及筛选在内的所有分子生物学方法均使用标准技术(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.，和Maniatis,T.,1989，分子克隆：实验室手册/E.F.冷泉港实验室出版社，Plainview，纽约)完成。
齿斑葡聚糖的制备
在包括下列成分的培养基(pH6.5)中，以75rpm通气速率，37℃(保持恒定)培养齿斑葡聚糖链球菌(Streptococcus mutans)CBS350.71，以制备齿斑葡聚糖。
NZ-Case            6.5g/升
酶母提取物         6g/升
(NH4)2SO4               20g/升
K2PO4                    3g/升
葡萄糖                     50g/升
Pluronic PE6100            0.1％
35小时后，加入蔗糖至终浓度为60g/升，以诱导葡糖基转移酶。总发酵时间为75小时。离心并过滤(无菌)发酵上清液。然后向上清液中加入蔗糖至5％终浓度(用乙酸调pH至pH7.0)，并于37℃搅拌溶液过夜。过滤溶液，在Propex上收获不溶性齿斑葡聚糖并用含有1％苯甲酸钠的去离子水(用乙酸调至pH5)彻底洗涤。最后，冻干并研磨不溶性齿斑葡聚糖。
齿斑葡聚糖酶活性(MU)的检测
1个齿斑葡聚糖酶单位(MU)是在标准条件下每分钟释放1μmol还原糖(作为葡萄糖计算的)的酶量。用碱性K3Fe(CN)6检测还原糖。
标准条件
底物…………………1.5％齿斑葡聚糖
反应时间……………15分钟
温度…………………40℃
pH……………………5.5
可向Novo Nordisk A/S公司索取Novo Nordisk的分析方法(AF180/1-GB)的详细说明。
齿斑葡聚糖酶平板检测法
在50mM乙酸钠，pH5.5中制备5％齿斑葡聚糖悬液，在UltraTurrax T25匀浆器中4℃将悬浮液匀化15分钟。使50mM乙酸钠，pH5.5中的1％琼脂糖变成相对于齿斑葡聚糖为0.2％，并将12.5ml琼脂糖加入各培养皿(d=10cm)中。在琼脂糖上打孔并向各样品孔内加入待分析齿斑葡聚糖酶活性的样品，平板于37℃保温过夜，之后在含齿斑葡聚糖酶的样品周围形成清晰的圈。
Westerm杂交
使用ECL Western印迹系统(Amersham Internationa4,plc,Buckinghamshire,England)和含有多克隆兔抗齿斑葡聚糖的第一抗体溶液进行Western杂交。检测限度为0.001mU/ml。
质谱
在VG Analytical TofSpec.中，使用基质辅助的激光解吸离子化飞行时间质谱法对纯化的野生型齿斑葡聚糖酶进行质谱分析。为进行质谱分析，将2ml样品与2ml饱和的基质溶液(溶于0.1％TFA∶乙腈(70∶30)中的α-氰基-4-羟基肉桂酸)混合，并将2ml混合物点样在靶板上。在导入质谱仪中之前，蒸发除去溶剂。使样品解吸并以阈值激光能量经4次激光脉冲(337nm)使之离子化，以25KV的加速电压加速到自由场飞行管中。以1850V微通道板检测离子。
羟基磷灰石圆片(HA)制备
在压片模内，以大约5900kg(13000lbs(的压力将250mg羟基磷灰石压5分钟，制成羟基磷灰石片。然后于600℃烧结4小时，最后用无菌去离子水水合。
羟基磷灰石圆片(HA)的蚀斑包被
干燥灭菌(121℃,2bar,20分钟)处理羟基磷灰石圆片(HA)并用滤膜除菌的唾液37℃包被18小时。将HA圆片放在烧杯中的无菌架上，向覆盖圆片的烧杯内倒入含有0.02％蔗糖的脑心灌注液(BHI)。接种前立即加入无菌Na2S(pH7.0)，使终浓度达到5g/升。将厌氧生长(BHI,37℃,24小时)的齿斑葡聚糖链球菌，粘放线菌和具核梭杆菌的1∶1∶1混合物作为约106cfu/ml浓度的接种物。在轻轻搅拌下将圆片37℃厌氧温育4天。
蚀斑的Malthus方法
Malthus方法是基于Johnston等人，(1995)，微生物学方法杂志21,p.15～26和Johansem等人m(1995)，应用细菌学杂志78,p,297～303所述的方法建立的。
实施例
实施例1：野生型齿斑葡聚糖酶的纯化
将100g T.harzianum CBS243.71的发酵液(批号PPM 3897)溶解在1升10mM乙酸钠，pH5.2中并于4℃保温过夜。
在3升10mM乙酸钠(pH5.2)中溶胀65g DEAE Sephadex A-50。溶胀后除去过量的缓冲液。将DEAE-Sephadex与齿斑葡聚糖酶粗制剂混合1小时，并通过Propex滤布过滤收集未结合的材料。进一步用2.5升10mM乙酸钠(pH5.2)洗凝胶。得到含未结合材料的4升集合物。通过Whatman GF/F滤膜过滤除去余留的DEAE-Sephadex颗粒。
在10mM乙酸钠(pH5.2)中平衡350ml S-Sepharose，并与600mlDEAE-Sephadex的集合物混合10分钟。通过Propex滤布过滤收集未结合的材料，并用500ml 10mM乙酸钠缓冲液(pH5.2)洗凝胶。用含有1M NaCl的同样缓冲液洗脱结合的材料。将此处理过程重复7次。在配有10kDa截留膜的Filtron浓缩器上浓缩含有未结合材料的合并的集合物(7升)，然后将缓冲液改变成10mM乙酸钠，pH4.7。通过WhatmanGF/F滤膜过滤浓缩物。浓缩物的终体积为600ml。
用10mM乙酸钠，pH4.7平衡S-Sepharose柱(180ml,2.6×33cm)。以每部分50ml将得自S-Sepharose批量离子交换的经pH调节的浓缩物上样到流速10ml/分的柱上。以3倍柱床体积用0至20mMNacl的线性梯度洗脱齿斑葡聚糖酶。用含有1MNaCl的同样缓冲液洗脱残留蛋白质。分析各洗脱部分的齿斑葡聚糖酶活性(平板检测法)并收集有高活性的部分。将上述步骤重复12次。在配有10KDa截留膜的Filtron浓缩器中浓缩合并的齿斑葡聚糖酶集合物。然后将缓冲液变成10mM Tris-HCl,pH8.0。浓缩物的终体积为870ml。
进一步在用10mM Tris-HCl,pHS.0平衡的HiLoad Q-Sepharose柱(50ml,2.6×10cm)上纯化从S-Sepharose柱上洗脱的浓缩集合物。按8ml/分流速以每份130ml上样。以12倍柱床体积和0至50mM NaCl的线性梯度洗脱齿斑葡聚糖酶。合并有高酶活性(平板检测法)的各管洗脱物，在配有10KDa截留膜的Amicon小室中浓缩。最后，将齿斑葡聚糖酶制剂对10mM磷酸钠(pH7.0)彻底透析并通过0.45mm滤膜过滤。
上述纯化中所得齿斑葡聚糖酶的产量为300mg。用SDS-PAGE和N末湍测序法分析HiLoad-Q制剂的纯度，并用两种方法判定纯度为大约95％。实施例2：野生型齿斑葡聚糖酶的N末端序列测定
在Applied Biosystems 473A型蛋白质序列分析仪中进行N末端氨基酸序列分析。
为了产生肽，于37℃用溶解于20mM NH4HCO3中的无色杆菌赖氨酰特异性蛋白酶(10mg)消化还原的和S-羧甲基化的齿斑葡聚糖酶(≥450mg)。使用Vydac C18柱以反相HPLC法分析所得到的肽，其中用含有0.08％TFA的溶于0.1％TFA水溶液中的80％2-丙醇线性梯度洗脱。再次用Vydac C18柱以反相HPLC法纯化肽，并用含有0.08％TFA的80％乙腈(溶于0.1％TFA水溶液)梯度洗脱，然后进行N末端氨基酸测序。
确定的氨基酸序列如下所示。N-末端：Ala-Ser-Ser-Ala-Asp-Arg-Leu-Val-Phe-Cys-His-Phe-Met-Ile-Gly-Ile-Val-Gly-Asp-Arg-Gly-Ser-Ser-Ala-Asp-Tyr-Asp-Asp-Asp-肽1：Val   Phe-Ile-Ser-Phe-Asp-Phe-Asn-Trp-Trp-Ser-Pro-Gly-Asn-Ala-Val-Gly-Val-Gly-Gln-Lys肽2：Pro-Tyr-Leu-Ala-Pro-Val-Ser-Pro-Trp-Phe-Phe-Thr-His-Phe-Gly-Pro-Glu-Val-Ser-Tvr-Ser-肽3：Trp-Val-Asn-Asp-Met-Pro-His-Asp-Gly-Phe-Leu-Asp-Leu-Ser-Lys实施例3：齿斑葡聚糖酶表达载体pMT1796,pMT1802和pMT1815的构建
在Trichoderma harzianum CBS243.71文库中通过与使用基于SEQ ID No.1所示齿斑葡聚糖酶序列设计的引物经PCR扩增得到的基因片段杂交鉴定了编码齿斑葡聚糖酶的cDNA克隆。
对分离的克隆pHD414+mut所作DNA序列分析显示其确实是编码齿斑葡聚糖酶的基因，并且构建物的5’末端含有一个长的前导序列。为了除去该前导序列，用EcoRⅠ、NarⅠ和XhoⅠ限制性消化pHD414+mut，并从消化产物中分离出3499nt(核苷酸)载体片段和610nt Nar1/Xho1片段。将这两个片段与接头1#(如上文所示)和含TAKA:TPI启动子的pHan 37中的618nt EcoRⅠ/BamHⅠ片段连接，得到质粒pJW99。然后用XhoⅠ和SphⅠ消化HD414+mut，并分离出一个编码齿斑葡聚糖酶的氨基酸35-598基因的1790nt片段。
将该片段与接头#2(如上所示)和已用限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ切成线性的pJW99连接。所得质粒pMT1802含有处于TAKA:TPI启动子控制下的T.harzianum齿斑葡聚糖酶基因。除了由于用PCR扩增的含所需突变的片段取代pMT1802的XhoⅠ/KpnⅠ片段，而使齿斑葡聚糖酶蛋白质的E36改变成了K36外，质粒pMT1796完全相同于pMT1802。
使用下列引物，按Ho等人((1989)，基因77,p.51-59)报导的两步骤法产生该PCR片段。
引物1(nt 2751 5′CAGCGTCCACATCACGAGC nt 2769)和
引物2(nt 3306 5′GAAGAAGCACGTTTCTCGAGAGACCG nt 3281)；
引物3(nt 3281 5′ CGGTCTCTGAGAAACGTGCTTCTTC nt 3306)和
引物4(nt 4266 5′GCCACTTCCGTTATTAGCC nt 4248)；
其中核苷酸编号参照pMT1802质粒(见SEQ ID No.11)。
为了产生pMT1815，再次使用两步骤法和下列引物PCR扩增127ntDNA片段：
引物5:GGGGGGATCCACCATGAG；
引物6:ACGGTCAGCAGAAGAAGCTCGACGAATAGGACTGGC；
引物7:GCCAGTCCTATTCGTCGAGCTTCTTCTGCTGACCGT,
引物8:CCACGGTCACCAACAATAC,并且在第一轮扩增中使用质粒pHan37和pMT1802作为模板。
该片段含有Bam HⅠ限制性酶切位点，然后是带有齿斑葡聚糖酶蛋白质的残基38-54的读框内的Lipolase前原肽，并终止在BstEⅡ位点。
用限制性内切酶BstEⅡ和BamHⅠ消化该片段，并插入利用同样一对酶切成线性的pMT1802中。经核苷酸序列测定进一步证实构建物中的改变，并检查所得编码区的完整性。
实施例4：重组齿斑葡聚糖酶在米曲霉中的表达
使用PEG介导的方法(参见EP238023)和含有0.5μg编码抗除草剂Basta抗性基因的质粒，及8.0μg三种齿斑葡聚糖酶表达质粒之一的DNA混合物转化米曲霉JaL125菌株。在含有0.5％Basta和作为氮源的50mM尿素的基本培养基平板上选择转化体。
摇瓶培养物
在选择培养基上两次孢子纯化被转化的集落并收获孢子。用孢子接种含有10ml YPM(2％麦芽糖、1％细菌蛋白胨和0.5％酵母提取物)的20ml通用容器(Nunc，目录号364211)，并于30℃振荡培养5天。生长5天后收获上清液。
                    表1  三个不同的表达构建物表达齿斑葡聚糖酶的比较
构建物 检测的最高齿斑葡聚糖酶水平 试验的转化体数目
pMT1802，齿斑葡聚糖酶前原序列+齿斑葡聚糖酶     ＜0.001     10
pMT1796，齿斑葡聚糖酶前原序列+KEX2+齿斑葡聚糖酶      3.8     4
pMT1815,Lipolase前原序列+齿斑葡聚糖酶      0.16     22
检测限度为0.001MU/ml
用Western杂交法检查培养物上清液中齿斑葡聚糖酶的存在。使用标准程序进行SDS-PAGE和蛋白质转移。
实施例5：重组齿斑葡聚糖酶的纯化
过滤并浓缩700ml发酵液。将pH调到4.7(传导率约为300μs/cm)并将发酵液上10mM乙酸钠(pH4.7)平衡过的S-Sepharose柱(XK50/22)(Pharmacia)。以线性NaCl梯度洗脱齿斑葡聚糖酶。大部分齿斑葡聚糖酶出现在未结合的部分中。合并这些部分并浓缩之。然后将浓缩物上已用10mM Tris-HCl,pH8.0(约600μs/cm)平衡的HiLoadQ-Sepharose柱(Pharmacia)。用NaCl线性梯度洗脱齿斑葡聚糖酶并根据纯度和活性合并含齿斑葡聚糖酶的洗脱部分。浓缩合并的部分并在Superdex75(16/60)柱(Pharmacia)上，于乙酸钠(pH6.0)中经凝胶过滤进一步纯化之。
纯化的齿斑葡聚糖酶的比活性约为10MU pr.吸光单位(280nm)。根据SDS-PAGE(Novex 4-20％；按制造商的说明书操作)结果，发现其分子量约为80Kda。
证明其N末端氨基酸序列与野生型(wt)齿斑葡聚糖酶的N末端氨基酸序列(Ala-Ser-Ser-Ala-)相同(参见实施例2)。
实施例6：齿斑葡聚糖酶的pH相关活性曲线
将500ml溶于不同pH的50mM Britton-Robinson缓冲液中的5％齿斑葡聚糖加到装在大玻瓶(以确保充分搅拌)内的2ml酶样品(在MilliQ过滤的水中稀释的)中，并在强烈搅拌下于40℃保温15分钟。加入0.5ml 0.4M NaOH终止反应并在Munktell滤器上过滤样品。向Eppendorf管内的100μl滤液中加入750μl铁氰化物试剂(0.4g/lK3Fe(CN)6,20g/l Na2CO3)，并于85℃保温15分钟。冷却样品之后，检测420nm吸光度的减少。以一系列的葡萄糖稀释液作为标准品。实验中一直包括有底物和酶空白。所有样品均一式两份。重组和野生型酶的最适pH约为pH3.5-5.5(参见图4)。
实施例7：齿斑葡聚糖酶的温度相关活性曲线
将500ml溶于100mM乙酸钠(pHS.5)或100mM磷酸钠,pH7中的5％齿斑葡聚糖加到装在大管(为确保充分搅拌)内的2ml酶样品(用MilliQ过滤的水稀释的)中，并在强烈摇动的同时，于不同温度下保温15分钟。加入0.5ml 0.4M NaOH并在Munktell滤膜上过滤样品。向Eppendorf管内的100μl滤液中加入750μl铁氰化物试剂(0.4g/lK3Fe(CN)6,20g/l Na2CO3)并于85℃保温15分钟。使样品冷却后，检测420mm吸光度的降低。包括一系列葡萄糖稀释液作为标准品。始终包括底物和酶空白。样品均为一式两份。重组和野生型齿斑葡聚糖酶的温度-活性关系曲线完全相同。在pH7时最适温度为大约45℃。pHS.5时最适温度为大约55℃(见图5)。
实施例8：齿斑葡聚糖酶的温度稳定性
在0.1M乙酸钠，pH5.5或0.1M磷酸钠，pH7中，于不同温度将酶样品保温30分钟，然后检测残留活性，以研究酶的温度稳定性。重组和野生型齿斑葡聚糖酶具有相似的温度稳定性分布图。残留活性在40℃,pH7时开始降低，但酶在pHS.5条件下更为稳定，并且在55℃时残留活性开始下降(见图6)。
实施例9：纯化的野生型齿斑葡聚糖酶的分子量
对齿斑葡聚糖酶的质谱分析(如上所述)表明其平均分子量约为75KDa。此外，从光谱中看出，齿斑葡聚糖酶的糖基化是异源的。齿斑葡聚糖酶的肽质量在64KDa以上，意味着11KDa的碳水化合物被连接在酶分子上。
实施例10：齿斑葡聚糖酶的抗齿斑活性
使蚀斑生物膜厌氧生长于唾液包被的如材料和方法部分中所述的羟基磷灰石圆片上。该蚀斑是齿斑葡聚糖链球菌(Streptococcus mutans)(SFAG,CBS 350.71)、粘放线菌(DSM 43329)和具核梭杆菌多形亚种(DSM 20482)的混合培养物。
将带有蚀斑的HA圆片转移到含有1MU/ml重组木霉齿斑葡聚糖酶的乙酸盐缓冲液(pH5.5)中，并旋转2分钟(使用无菌缓冲液作为对照)。
酶处理后，用DAPI着染HA圆片或转移到Malthus小室内。当计数活的粘附细胞时使用间接阻抗检测法(Malthus Flexi M2060.Malthus仪器有限公司)。
为了进行阻抗检测，将3ml BHI转移到间接Malthus小室的外腔中，并将0.5ml无菌KOH(0.1M)转移到内腔中。齿斑葡聚糖酶处理后用磷酸盐缓冲液轻轻淋洗带有蚀斑的HA圆片并转移至外腔内。使用与dt相关的cfu/ml的校正曲线，将Malthus中的检测时间(dt)转化成菌落计数(见图7)。
使用从混合的培养物制备的一系列10倍稀释率构成校正曲线。在BHⅠ中检测各稀释步骤的传导dt，并构成混合培养物的BHI中10倍稀释液的cfu/ml对dt的校正曲线(图7)。
也使用荧光显微镜检测从HA圆片上去除的蚀斑，齿斑葡聚糖酶处理后用DAPI(3mM)着染圆片，并于暗处20℃保温5分钟。用配有200W水银灯和紫外滤片的Olympus BX50型显微镜，以X100油浸荧光目镜检查DAPI着染的细胞。将结果与使用阻抗检测法得到的定量数据相比较。
酶处理后，以Malthus方法检测唾液处理的HA表面上活细胞的数目，并示于表1中。然而，使用Malthus方法不可能区分开齿斑葡聚糖酶的杀菌活性或是酶促去掉了蚀斑。因此，须将表面上活细菌数的减少与使用DAPI染色估计的同时去除的表面蚀斑进行比较。
                         表2：以阻抗检测法检测的从唾液处理的
                        羟基磷灰石中酶促蚀斑去除率(pH5.5,2分钟)
齿斑葡聚糖酶(MU/ml)  Log10降低(cfu/cm2)  蚀斑的去除(％) 观察数
      0     0      0   10
      1     1.4      96    6
用荧光显微镜测知，在经齿斑葡聚糖酶处理后，蚀斑被大量的去除。因此重组齿斑葡聚糖酶降低了粘附细胞的量。然而，如此检测到的活性是根据蚀斑去除确定的，而不是对蚀斑中的细胞的杀菌活性。
序列表(1)一般信息：(ⅰ)申请人：(A)名称：Novo Nordisk A/S(B)街道：Novo Alle(C)城市：Bagsvaerd(E)国家：丹麦(F)邮政编码(ZIP):DK-2880(G)电话：+45 4444 8888(H)传真：+45 4449 3256(ⅱ)发明名称：具有齿斑葡聚糖酶活性的重组酶(ⅲ)序列数：24(ⅳ)计算机可读形式：(A)介质类型：软盘(B)计算机：IBM PC可兼容(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：1905个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅵ)来源：(B)菌株：Trichoderma harzianum CBS 243.71(ⅸ)特征：(A)名称/键：CDS(B)定位：1..1905(C)名称/键：信号肽(D)定位：1..120(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:ATG TTG GGC GTT GTC CGC CGT CTA GGC CTA GGC GCC CTT GCT GCC GCA            48Met Leu Gly Val Val Arg Arg Leu Gly Leu Gly Ala Leu Ala Ala Ala1               5                  10                  15GCT CTG TCT TCT CTC GGC AGT GCC GCT CCC GCC AAT GTT GCT ATT CGG            96Ala Leu Ser Ser Leu Gly Ser Ala Ala Pro Ala Asn Val Ala Ile Arg
         20                  25                  30TCT CTC GAG GAA CGT GCT TCT TCT GCT GAC CGT CTC GTA TTC TGT CAC           144Ser Leu Glu Glu Arg Ala Ser Ser Ala Asp Arg Leu Val Phe Cys His
     35                  40                  45TTC ATG ATT GGT ATT GTT GGT GAC CGT GGC AGC TCA GCA GAC TAT GAT           192Phe Met Ile Gly Ile Val Gly Asp Arg Gly Ser Ser Ala Asp Tyr Asp
 50                  55                  60GAT GAC ATG CAA CGT GCC AAA GCC GCT GGC ATT GAC GCA TTC GCT CTG           240Asp Asp Met Gln Arg Ala Lys Ala Ala Gly Ile Asp Ala Phe Ala Leu65                  70                  75                  80AAC ATC GGC GTT GAC GGC TAT ACC GAC CAG CAA CTC GGG TAT GCC TAT           288Asn Ile Gly Val Asp Gly Tyr Thr Asp Gln Gln Leu Gly Tyr Ala Tyr
             85                  90                  95GAC TCT GCC GAC CGT AAT GGC ATG AAA GTC TTC ATT TCA TTC GAT TTC           336Asp Ser Ala Asp Arg Asn Gly Met Lys Val Phe Ile Ser Phe Asp Phe
        100                 105                 110AAC TGG TGG AGC CCC GGT AAT GCA GTT GGT GTT GGC CAG AAG ATT GCG           384Asn Trp Trp Ser Pro Gly Asn Ala Val Gly Val Gly Gln Lys Ile Ala
    115                 120                 125CAG TAT GCC AGC CGT CCC GCC CAG CTG TAT GTT GAC AAC CGG CCA TTC           432Gln Tyr Ala Ser Arg Pro Ala Gln Leu Tyr Val Asp Asn Arg Pro Phe
130                 135                 140GCC TCT TCC TTC GCT GGT GAC GGT TTG GAT GTA AAT GCG TTG CGC TCT           480Ala Ser Ser Phe Ala Gly Asp Gly Leu Asp Val Asn Ala Leu Arg Ser145                 150                 155                 160GCT GCA GGC TCC AAC GTT TAC TTT GTG CCC AAC TTC CAC CCT GGT CAA           528Ala Ala Gly Ser Asn Val Tyr Phe Val Pro Asn Phe His Pro Gly Gln
            165                 170                 175TCT TCC CCC TCC AAC ATT GAT GGC GCC CTC AAC TGG ATG GCC TGG GAT           576Ser Ser Pro Ser Asn Ile Asp Gly Ala Leu Asn Trp Met Ala Trp Asp
        180                 185                 190AAT GAT GGA AAC AAC AAG GCA CCC AAG CCG GGC CAG ACT GTC ACG GTG        624Asn Asp Gly Asn Asn Lys Ala Pro Lys Pro Gly Gln Thr Val Thr Val
    195                 200                 205GCA GAC GGT GAC AAC GCT TAC AAG AAT TGG TTG GGT GGC AAG CCT TAC        672Ala Asp Gly Asp Asn Ala Tyr Lys Asn Trp Leu Gly Gly Lys Pro Tyr
210                 215                 220CTA GCG CCT GTC TCC CCT TGG TTT TTC ACC CAT TTT GGC CCT GAA GTT        720Leu Ala Pro Val Ser Pro Trp Phe Phe Thr His Phe Gly Pro Glu Val225                 230                 235                 240TCA TAT TCC AAG AAC TGG GTC TTC CCA GGT GGT CCT CTG ATC TAT AAC        768Ser Tyr Ser Lys Asn Trp Val Phe Pro Gly Gly Pro Leu Ile Tyr Asn
            245                 250                 255CGG TGG CAA CAG GTC TTG CAG CAG GGC TTC CCC ATG GTT GAG ATT GTT        816Arg Trp Gln Gln Val Leu Gln Gln Gly Phe Pro Met Val Glu Ile Val
        260                 265                 270ACC TGG AAT GAC TAC GGC GAG TCT CAC TAC GTC GGT CCT CTG AAG TCT        864Thr Trp Asn Asp Tyr Gly Glu Ser His Tyr Val Gly Pro Leu Lys Ser
    275                 280                 285AAG CAT TTC GAT GAT GGC AAC TCC AAA TGG GTC AAT GAT ATG CCC CAT        912Lys His Phe Asp Asp Gly Asn Ser Lys Trp Val Asn Asp Met Pro His
290                 295                 300GAT GGA TTC TTG GAT CTT TCA AAG CCG TTT ATT GCT GCA TAT AAG AAC        960Asp Gly Phe Leu Asp Leu Ser Lys Pro Phe Ile Ala Ala Tyr Lys Asn305                 310                 315                 320AGG GAT ACT GAT ATA TCT AAG TAT GTT CAA AAT GAG CAG CTT GTT TAC       1008Arg Asp Thr Asp Ile Ser Lys Tyr Val Gln Asn Glu Gln Leu Val Tyr
            325                 330                 335TGG TAC CGC CGC AAC TTG AAG GCA TTG GAC TGC GAC GCC ACC GAC ACC       1056Trp Tyr Arg Arg Asn Leu Lys Ala Leu Asp Cys Asp Ala Thr Asp Thr
        340                 345                 350ACC TCT AAC CGC CCG GCT AAT AAC GGA AGT GGC AAT TAC TTT ATG GGA       1104Thr Ser Asn Arg Pro Ala Asn Asn Gly Ser Gly Asn Tyr Phe Met Gly
    355                 360                 365CGC CCT GAT GGT TGG CAA ACT ATG GAT GAT ACC GTT TAT GTT GCC GCA       1152Arg Pro Asp Gly Trp Gln Thr Met Asp Asp Thr Val Tyr Val Ala Ala
370                 375                 380CTT CTC AAG ACC GCC GGT AGC GTC ACG GTC ACG TCT GGC GGC ACC ACT       1200Leu Leu Lys Thr Ala Gly Ser Val Thr Val Thr Ser Gly Gly Thr Thr385                 390                 395                 400CAA ACG TTC CAG GCC AAC GCC GGA GCC AAC CTC TTC CAA ATC CCT GCC        1248Gln Thr Phe Gln Ala Asn Ala Gly Ala Asn Leu Phe Gln Ile Pro Ala
            405                 410                 415AGC ATC GGC CAG CAA AAG TTT GCT CTA ACT CGC AAC GGT CAG ACC GTC        1296Ser Ile Gly Gln Gln Lys Phe Ala Leu Thr Arg Asn Gly Gln Thr Val
        420                 425                 430TTT AGC GGA ACC TCA TTG ATG GAT ATC ACC AAC GTT TGC TCT TGC GGT        1344Phe Ser Gly Thr Ser Leu Met Asp Ile Thr Asn Val Cys Ser Cys Gly
    435                 440                 445ATC TAC AAT TTC AAC CCA TAT GTT GGC ACC ATT CCT GCC GGC TTT GAC        1392Ile Tyr Asn Phe Asn Pro Tyr Val Gly Thr Ile Pro Ala Gly Phe Asp
450                 455                 460GAC CCT CTT CAG GCT GAC GGT CTT TTC TCT TTG ACC ATC GGA TTG CAT        1440Asp Pro Leu Gln Ala Asp Gly Leu Phe Ser Leu Thr Ile Gly Leu His465                 470                 475                 480GTC ACG ACT TGT CAG GCC AAG CCA TCT CTT GGA ACC AAC CCT CCT GTC        1488Val Thr Thr Cys Gln Ala Lys Pro Ser Leu Gly Thr Asn Pro Pro Val
            485                 490                 495ACT TCT GGC CCT GTG TCC TCG CTG CCA GCT TCC TCC ACC ACC CGC GCA        1536Thr Ser Gly Pro Val Ser Ser Leu Pro Ala Ser Ser Thr Thr Arg Ala
        500                 505                 510TCC TCG CCT CCT GTT TCT TCA ACT CGT GTC TCT TCT CCC CCT GTC TCT        1584Ser Ser Pro Pro Val Ser Ser Thr Arg Val Ser Ser Pro Pro Val Ser
    515                 520                 525TCC CCT CCA GTT TCT CGC ACC TCT TCT CCC CCT CCC CCT CCG GCC AGC        1632Ser Pro Pro Val Ser Arg Thr Ser Ser Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser
530                 535                 540AGC ACG CCG CCA TCG GGT CAG GTT TGC GTT GCC GGC ACC GTT GCT GAC        1680Ser Thr Pro Pro Ser Gly Gln Val Cys Val Ala Gly Thr Val Ala Asp545                 550                 555                 560GGC GAG TCC GGC AAC TAC ATC GGC CTG TGC CAA TTC AGC TGC AAC TAC        1728Gly Glu Ser Gly Asn Tyr Ile Gly Leu Cys Gln Phe Ser Cys Asn Tyr
            565                 570                 575GGT TAC TGT CCA CCG GGA CCG TGT AAG TGC ACC GCC TTT GGT GCT CCC        1776Gly Tyr Cys Pro Pro Gly Pro Cys Lys Cys Thr Ala Phe Gly Ala Pro
        580                 585                 590ATC TCG CCA CCG GCA AGC AAT GGG CGC AAC GGC TGC CCT CTA CCG GGA        1824Ile Ser Pro Pro Ala Ser Asn Gly Arg Asn Gly Cys Pro Leu Pro Gly
    595                 600                 605GAA GGC GAT GGT TAT CTG GGC CTG TGC AGT TTC AGT TGT AAC CAT AAT        1872Glu Gly Asp Gly Tyr Leu Gly Leu Cys Ser Phe Ser Cys Asn His Asn
610                 615                 620TAC TGC CCG CCA ACG GCA TGC CAA TAC TGT TAG                            1905Tyr Cys Pro Pro Thr Ala Cys Gln Tyr Cys  *625                 630                 635(2)SEQ ID NO:2的信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：635个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Met Leu Gly Val Val Arg Arg Leu Gly Leu Gly Ala Leu Ala Ala Ala1               5                  10                  15Ala Leu Ser Ser Leu Gly Ser Ala Ala Pro Ala Asn Val Ala Ile Arg
         20                  25                  30Ser Leu Glu Glu Arg Ala Ser Ser Ala Asp Arg Leu Val Phe Cys His
     35                  40                  45Phe Met Ile Gly Ile Val Gly Asp Arg Gly Ser Ser Ala Asp Tyr Asp
 50                  55                  60Asp Asp Met Gln Arg Ala Lys Ala Ala Gly Ile Asp Ala Phe Ala Leu65                  70                  75                  80Asn Ile Gly Val Asp Gly Tyr Thr Asp Gln Gln Leu Gly Tyr Ala Tyr
             85                  90                  95Asp Ser Ala Asp Arg Asn Gly Met Lys Val Phe Ile Ser Phe Asp Phe
        100                 105                 110Asn Trp Trp Ser Pro Gly Asn Ala Val Gly Val Gly Gln Lys Ile Ala
    115                 120                 125Gln Tyr Ala Ser Arg Pro Ala Gln Leu Tyr Val Asp Asn Arg Pro Phe
130                 135                 140Ala Ser Ser Phe Ala Gly Asp Gly Leu Asp Val Asn Ala Leu Arg Ser145                 150                 155                 160Ala Ala Gly Ser Asn Val Tyr Phe Val Pro Asn Phe His Pro Gly Gln
            165                 170                 175Ser Ser Pro Ser Asn Ile Asp Gly Ala Leu Asn Trp Met Ala Trp Asp
        180                 185                 190Asn Asp Gly Asn Asn Lys Ala Pro Lys Pro Gly Gln Thr Val Thr Val
    195                 200                 205Ala Asp Gly Asp Asn Ala Tyr Lys Asn Trp Leu Gly Gly Lys Pro Tyr
210                 215                 220Leu Ala Pro Val Ser Pro Trp Phe Phe Thr His Phe Gly Pro Glu Val225                 230                 235                 240Ser Tyr Ser Lys Asn Trp Val Phe Pro Gly Gly Pro Leu Ile Tyr Asn
            245                 250                 255Arg Trp Gln Gln Val Leu Gln Gln Gly Phe Pro Met Val Glu Ile Val
        260                 265                 270Thr Trp Asn Asp Tyr Gly Glu Ser His Tyr Val Gly Pro Leu Lys Ser
    275                 280                 285Lys His Phe Asp Asp Gly Asn Ser Lys Trp Val Asn Asp Met Pro His
290                 295                 300Asp Gly Phe Leu Asp Leu Ser Lys Pro Phe Ile Ala Ala Tyr Lys Asn305                 310                 315                 320Arg Asp Thr Asp Ile Ser Lys Tyr Val Gln Asn Glu Gln Leu Val Tyr
            325                 330                 335Trp Tyr Arg Arg Asn Leu Lys Ala Leu Asp Cys Asp Ala Thr Asp Thr
        340                 345                 350Thr Ser Asn Arg Pro Ala Asn Asn Gly Ser Gly Asn Tyr Phe Met Gly
    355                 360                 365Arg Pro Asp Gly Trp Gln Thr Met Asp Asp Thr Val Tyr Val Ala Ala
370                 375                 380Leu Leu Lys Thr Ala Gly Ser Val Thr Val Thr Ser Gly Gly Thr Thr385                 390                 395                 400Gln Thr Phe Gln Ala Asn Ala Gly Ala Asn Leu Phe Gln Ile Pro Ala
            405                 410                 415Ser Ile Gly Gln Gln Lys Phe Ala Leu Thr Arg Asn Gly Gln Thr Val
        420                 425                 430Phe Ser Gly Thr Ser Leu Met Asp Ile Thr Asn Val Cys Ser Cys Gly
    435                 440                 445Ile Tyr Asn Phe Asn Pro Tyr Val Gly Thr Ile Pro Ala Gly Phe Asp
450                 455                 460Asp Pro Leu Gln Ala Asp Gly Leu Phe Ser Leu Thr Ile Gly Leu His465                 470                 475                 480Val Thr Thr Cys Gln Ala Lys Pro Set Leu Gly Thr Asn Pro Pro Val
            485                 490                 495Thr Ser Gly Pro Val Ser Ser Leu Pro Ala Ser Ser Thr Thr Arg Ala
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    515                 520                 525Ser Pro Pro Val Ser Arg Thr Ser Ser Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser
530                 535                 540Ser Thr Pro Pro Ser Gly Gln Val Cys Val Ala Gly Thr Val Ala Asp545                 550                 555                 560Gly Glu Ser Gly Asn Tyr Ile Gly Leu Cys Gln Phe Ser Cys Asn Tyr
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        580                 585                 590Ile Ser Pro Pro Ala Ser Asn Gly Arg Asn Gly Cys Pro Leu Pro Gly
    595                 600                 605Glu Gly Asp Gly Tyr Leu Gly Leu Cys Ser Phe Ser Cys Asn His Asn
610                 615                 620Tyr Cys Pro Pro Thr Ala Cys Gln Tyr Cys  *625                 630                 635(2)SEQ ID NO:3的信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：19个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物1”CAGCGTCCAC   ATCACGAGC                              19(2)SEQ ID NO:4的信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：26个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物2”GAAGAAGCAC GTTTCTGCAG AGACCG                        26(2)SEQ ID NO:5的信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：26个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物3”CGGTCTCTCG   AGAAACGTGC   TTCTTC                                     26(2)SEQ ID NO:6的信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：19个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物4”GCCACTTCCG TTATTAGCC                                                 19(2)SEQ ID NO:7的信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：18个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物5”GGGGGGATCC ACCATGAG                                               18(2)SEQ ID NO:8的信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：36个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物6”ACGGTCAGCA GAAGAAGCTC GACGAATAGG ACTGGC                        36(2)SEQ ID NO:9的信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：36个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物7”GCCAGTCCTA TTCGTCGAGC TTCTTCTGCT GACCGT                        36(2)SEQ ID NO:10的信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：19个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc=“引物8”CCACGGTCAC CAACAATAC                                                 19(2)SEQ ID NO:11的信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：6032个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅵ)来源：(B)菌株：Trichoderma harzianum CBS 243.71(ⅸ)特征：(A)名称/键：CDS(B)定位：3188..5092(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11:GACGAAAGGG   CCTCGTGATA   CGCCTATTTT   TATAGGTTAA   TGTCATGATA   ATAATGGTTT        60CTTAGACGTC   AGGTGGCACT   TTTCGGGGAA   ATGTGCGCGG   AACCCCTATT   TGTTTATTTT       120TCTAAATACA   TTCAAATATG   TATCCGCTCA   TGAGACAATA   ACCCTGATAA   ATGCTTCAAT               180AATATTGAAA   AAGGAAGAGT   ATGAGTATTC   AACATTTCCG   TGTCGCCCTT   ATTCCCTTTT               240TTGCGGCATT   TTGCCTTCCT   GTTTTTGCTC   ACCCAGAAAC   GCTGGTGAAA   GTAAAAGATG       300CTGAAGATCA   GTTGGGTGCA   CGAGTGGGTT   ACATCGAACT   GGATCTCAAC   AGCGGTAAGA               360TCCTTGAGAG   TTTTCGCCCC   GAAGAACGTT   TTCCAATGAT   GAGCACTTTT   AAAGTTCTGC               420TATGTGGCGC   GGTATTATCC   CGTATTGACG   CCGGGCAAGA   GCAACTCGGT   CGCCGCATAC               480ACTATTCTCA   GAATGACTTG   GTTGAGTACT   CACCAGTCAC   AGAAAAGCAT   CTTACGGATG       540GCATGACAGT   AAGAGAATTA   TGCAGTGCTG   CCATAACCAT   GAGTGATAAC   ACTGCGGCCA               600ACTTACTTCT   GACAACGATC   GGAGGACCGA   AGGAGCTAAC   CGCTTTTTTG   CACAACATGG               660GGGATCATGT   AACTCGCCTT   GATCGTTGGG   AACCGGAGCT   GAATGAAGCC   ATACCAAACG               720ACGAGCGTGA   CACCACGATG   CCTGTAGCAA   TGGCAACAAC   GTTGCGCAAA   CTATTAACTG       780GCGAACTACT   TACTCTAGCT   TCCCGGCAAC   AATTAATAGA   CTGGATGGAG   GCGGATAAAG       840TTGCAGGACC   ACTTCTGCGC   TCGGCCCTTC   CGGCTGGCTG   GTTTATTGCT   GATAAATCTG       900GAGCCGGTGA   GCGTGGGTCT   CGCGGTATCA   TTGCAGCACT   GGGGCCAGAT   GGTAAGCCCT       960CCCGTATCGT   AGTTATGTAC   ACGACGGGGA   GTCAGGCAAC   TATGGATGAA   CGAAATAGAC      1020AGATCGCTGA   GATAGGTGCC   TCACTGATTA   AGCATTGGTA   ACTGTCAGAC   CAAGTTTACT      1080CATATATACT   TTAGATTGAT   TTAAAACTTC   ATTTTTAATT   TAAAAGGATC   TAGGTGAAGA      1140TCCTTTTTGA   TAATCTCATG   ACCAAAATCC   CTTAACGTGA   GTTTTCGTTC   CACTGAGCGT      1200CAGACCCCGT   AGAAAAGATC   AAAGGATCTT   CTTGAGATCC   TTTTTTTCTG   CGCGTAATCT      1260GCTGCTTGCA   AACAAAAAAA   CCACCGCTAC   CAGCGGTGGT   TTGTTTGCCG   GATCAAGAGC      1320TACCAACTCT   TTTTCCGAAG   GTAACTGGCT   TCAGCAGAGC   GCAGATACCA   AATACTGTCC      1380TTCTAGTGTA   GCCGTAGTTA   GGCCACCACT   TCAAGAACTC   TGTAGCACCG   CCTACATACC      1440TCGCTCTGCT   AATCCTGTTA   CCAGTGGCTG   CTGCCAGTGG   CGATAAGTCG   TGTCTTACCG      1500GGTTGGACTC   AAGACGATAG   TTACCGGATA   AGGCGCAGCG   GTCGGGCTGA   ACGGGGGGTT      1560CGTGCACACA   GCCCAGCTTG   GAGCGAACGA   CCTACACCGA   ACTGAGATAC   CTACAGCGTG      1620AGCATTGAGA   AAGCGCCACG   CTTCCCGAAG   GGAGAAAGGC   GGACAGGTAT   CCGGTAAGCG      1680GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CGCACGAGGG AGCTTCCAGG GGGAAACGCC TGGTATCTTT      1740ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC CACCTCTGAC TTGAGCGTCG ATTTTTGTGA TGCTCGTCAG      1800GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCGGCCTT TTTACGGTTC CTGGCCTTTT      1860GCTGGCCTTT TGCTCACATG TTCTTTCCTG CGTTATCCCC TGATTCTGTG GATAACCGTA      1920TTACCGCCTT TGAGTGAGCT GATACCGCTC GCCGCAGCCG AACGACCGAG CGCAGCGAGT      1980CAGTGAGCGA GGAAGCGGAA GAGCGCCCAA TACGCAAACC GCCTCTCCCC GCGCGTTGGC      2040CGATTCATTA ATGCAGCCTG ATTAATGATT ACATACGCCT CCGGGTAGTA GACCGAGCAG      2100CCGAGCCAGT TCAGCGCCTA AAACGCCTTA TACAATTAAG CAGTTAAAGA AGTTAGAATC      2160TACGCTTAAA AAGCTACTTA AAAATCGATC TCGCAGTCCC GATTCGCCTA TCAAAACCAG      2220TTTAAATCAA CTGATTAAAG GTGCCGAACG AGCTATAAAT GATATAACAA TATTAAAGCA      2280TTAATTAGAG CAATATCAGG CCGCGCACGA AAGGCAACTT AAAAAGCGAA AGCGCTCTAC      2340TAAACAGATT ACTTTTGAAA AAGGCACATC AGTATTTAAA GCCCGAATCC TTATTAAGCG      2400CCGAAATCAG GCAGATAAAG CCATACAGGC AGATAGACCT CTACCTATTA AATCGGCTTC      2460TAGGCGCGCT CCATCTAAAT GTTCTGGCTG TGGTGTACAG GGGCATAAAA TTACGCACTA      2520CCCGAATCGA TAGAACTACT CATTTTTATA TAGAAGTCAG AATTCATAGT GTTTTGATCA      2580TTTTAAATTT TTATATGGCG GGTGGTGGGC AACTCGCTTG CGCGGGCAAC TCGCTTACCG      2640ATTACGTTAG GGCTGATATT TACGTGAAAA TCGTCAAGGG ATGCAAGACC AAAGTAGTAA      2700AACCCCGGAA GTCAACAGCA TCCAAGCCCA AGTCCTTCAC GGAGAAACCC CAGCGTCCAC      2760ATCACGAGCG AAGGACCACC TCTAGGCATC GGACGCACCA TCCAATTAGA AGCAGCAAAG      2820CGAAACAGCC CAAGAAAAAG GTCGGCCCGT CGGCCTTTTC TGCAACGCTG ATCACGGGCA      2880GCGATCCAAC CAACACCCTC CAGAGTGACT AGGGGCGGAA ATTTAAAGGG ATTAATTTCC      2940ACTCAACCAC AAATCACAGT CGTCCCCGGT ATTGTCCTGC AGAATGCAAT TTAAACTCTT      3000CTGCGAATCG CTTGGATTCC CCGCCCCTAG TCGTAGAGCT TAAAGTATGT CCCTTGTCGA      3060TGCGATGTAT CACAACATAT AAATACTAGC AAGGGATGCC ATGCTTGGAG TTTCCAACTC      3120AATTTACCTC TATCCACACT TCTCTTCCTT CCTCAATCCT CTATATACAC AACTGGGGAT      3180CCTCACA ATG TTG GGC GTT GTC CGC CGT CTA GGC CTA GGC GCC CTT GCT        3229Met Leu Gly Val Val Arg Arg Leu Gly Leu Gly Ala Leu Ala1               5                  10GCC GCA GCT CTG TCT TCT CTC GGG AGT GCC GCT CCC GCC AAT GTT GCT        3277Ala Ala Ala Leu Ser ser Leu Gly Ser Ala Ala Pro Ala Asn Val Ala15                  20                  25                  30ATT CGG TCT CTC GAG GAA CGT GCT TCT TCT GCT GAC CGT GTC GTA TTC        3325Ile Arg Ser Leu Glu Glu Arg Ala Ser Ser Ala Asp Arg Leu Val Phe35                  40                  45TGT CAC TTC ATG ATT GGT ATT GTT GGT GAC CGT GGC AGC TCA GCA GAC        3373Cys His Phe Met Ile Gly Ile Val Gly Asp Arg Gly Ser Ser Ala Asp50                  55                  60TAT GAT GAT GAC ATG CAA CGT GCC AAA GCC GCT GGC ATT GAC GCA TTC        3421Tyr Asp Asp Asp Met Gln Arg Ala Lys Ala Ala Gly Ile Asp Ala Phe65                  70                  75GCT CTG AAC ATC GGC GTT GAC GGC TAT ACC GAC CAG CAA CTC GGG TAT        3469Ala Leu Asn Ile G1y Val Asp Gly Tyr Thr Asp Gln Gln Leu Gly Tyr80                  85                  90GCC TAT GAC TCT GCC GAC CGT AAT GGC ATG AAA GTC TTC ATT TCA TTC        3517Ala Tyr Asp Ser Ala Asp Arg Ash Gly Met Lys Val Phe Ile Ser Phe95                 100                 105                 110GAT TTC AAC TGG TGG AGC CCC GGT AAT GCA GTT GGT GTT GGC CAG AAG        3565Asp Phe Asn Trp Trp Ser Pro Gly Asn Ala Val Gly Val Gly Gln Lys115                 120                 125ATT GCG CAG TAT GCC AGC CGT CCC GCC CAG CTG TAT GTT GAC AAC CGG        3613Ile Ala Gln Tyr Ala Ser Arg Pro Ala Gln Leu Tyr Val Asp Asn Arg130                 135                 140CCA TTC GCC TCT TCC TTC GCT GGT GAC GGT TTG GAT GTA AAT GCG TTG        3661Pro Phe Ala Ser Ser Phe Ala Gly Asp Gly Leu Asp Val Asn Ala Leu145                 150                 155CGC TCT GCT GCA GGC TCC AAC GTT TAC TTT GTG CCC AAC TTC CAC CCT        3709Arg Ser Ala Ala Gly Ser Asn Val Tyr Phe Val Pro Asn Phe His Pro160                 165                 170GGT CAA TCT TCC CCC TCC AAC ATT GAT GGC GCC CTC AAC TGG ATG GCC        3757Gly Gln Ser Ser Pro Ser Asn Ile Asp Gly Ala Leu Asn Trp Met Ala175                 180                 185                 190TGG GAT AAT GAT GGA AAC AAC AAG GCA CCC AAG CCG GGC CAG ACT GTC        3805Trp Asp Asn Asp Gly Asn Asn Lys Ala Pro Lys Pro Gly Gln Thr Val195                 200                 205ACG GTG GCA GAC GGT GAC AAC GCT TAC AAG AAT TGG TTG GGT GGC AAG        3853Thr Val Ala Asp Gly Asp Asn Ala Tyr Lys Asn Trp Leu Gly Gly Lys210                 215                 220CCT TAC CTA GCG CCT GTC TCC CCT TGG TTT TTC ACC CAT TTT GGC CCT       3901Pro Tyr Leu Ala Pro Val Ser Pro Trp Phe Phe Thr His Phe Gly Pro
    225                 230                 235GAA GTT TCA TAT TCC AAG AAC TGG GTC TTC CCA GGT GGT CCT CTG ATC       3949Glu Val Ser Tyr Ser Lys Asn Trp Val Phe Pro Gly Gly Pro Leu Ile
240                 245                 250TAT AAC CGG TGG CAA CAG GTC TTG CAG CAG GGC TTC CCC ATG GTT GAG       3997Tyr Asn Arg Trp Gln Gln Val Leu Gln Gln Gly Phe Pro Met Val Glu255                 260                 265                 270ATT GTT ACC TGG AAT GAC TAC GGC GAG TCT CAC TAC GTC GGT CCT CTG       4045Ile Val Thr Trp Asn Asp Tyr Gly Glu Ser His Tyr Val Gly Pro Leu
            275                 280                 285AAG TCT AAG CAT TTC GAT GAT GGC AAC TCC AAA TGG GTC AAT GAT ATG       4093Lys Ser Lys His Phe Asp Asp Gly Asn Ser Lys Trp Val Asn Asp Met
        290                 295                 300CCC CAT GAT GGA TTC TTG GAT CTT TCA AAG CCG TTT ATT GCT GCA TAT       4141Pro His Asp Gly Phe Leu Asp Leu Ser Lys Pro Phe Ile Ala Ala Tyr
    305                 310                 315AAG AAC AGG GAT ACT GAT ATA TCT AAG TAT GTT CAA AAT GAG CAG CTT       4189Lys Asn Arg Asp Thr Asp Ile Ser Lys Tyr Val Gln Asn Glu Gln Leu
320                 325                 330GTT TAC TGG TAC CGC CGC AAC TTG AAG GCA TTG GAC TGC GAC GCC ACC       4237Val Tyr Trp Tyr Arg Arg Asn Leu Lys Ala Leu Asp Cys Asp Ala Thr335                 340                 345                 350GAC ACC ACC TCT AAC CGC CCG GCT AAT AAC GGA AGT GGC AAT TAC TTT       4285Asp Thr Thr Ser Asn Arg Pro Ala Asn Asn Gly Ser Gly Asn Tyr Phe
            355                 360                 365ATG GGA CGC CCT GAT GGT TGG CAA ACT ATG GAT GAT ACC GTT TAT GTT       4333Met Gly Arg Pro Asp Gly Trp Gln Thr Met Asp Asp Thr Val Tyr Val
        370                 375                 380GCC GCA CTT CTC AAG ACC GCC GGT AGC GTC ACG GTC ACG TCT GGC GGC       4381Ala Ala Leu Leu Lys Thr Ala Gly Ser Val Thr Val Thr Ser Gly Gly
    385                 390                 395ACC ACT CAA ACG TTC CAG GCC AAC GCC GGA GCC AAC CTC TTC CAA ATC       4429Thr Thr Gln Thr Phe Gln Ala Asn Ala Gly Ala Asn Leu Phe Gln Ile
400                 405                 410CCT GCC AGC ATC GGC CAG CAA AAG TTT GCT CTA ACT CGC AAC GGT CAG       4477Pro Ala Ser Ile Gly Gln Gln Lys Phe Ala Leu Thr Arg Asn Gly Gln415                 420                 425                 430ACC GTC TTT AGC GGA ACC TCA TTG ATG GAT ATC ACC AAC GTT TGC TCT       4525Thr Val Phe Ser Gly Thr Ser Leu Met Asp Ile Thr Asn Val Cys Ser
            435                 440                 445TGC GGT ATC TAC AAT TTC AAC CCA TAT GTT GGC ACC ATT CCT GCC GGC       4573Cys Gly Ile Tyr Asn Phe Asn Pro Tyr Val Gly Thr Ile Pro Ala Gly
        450                 455                 460TTT GAC GAC CCT CTT CAG GCT GAC GGT CTT TTC TCT TTG ACC ATC GGA       4621Phe Asp Asp Pro Leu Gln Ala Asp Gly Leu Phe Ser Leu Thr Ile Gly
    465                 470                 475TTG CAT GTC ACG ACT TGT CAG GCC AAG CCA TCT CTT GGA ACC AAC CCT       4669Leu His Val Thr Thr Cys Gln Ala Lys Pro Ser Leu Gly Thr Asn Pro
480                 485                 490CCT GTC ACT TCT GGC CCT GTG TCC TCG CTG CCA GCT TCC TCC ACC ACC       4717Pro Val Thr Ser Gly Pro Val Ser Ser Leu Pro Ala Ser Ser Thr Thr495                 500                 505                 510CGC GCA TCC TCG CCT CCT GTT TCT TCA ACT CGT GTC TCT TCT CCC CCT       4765Arg Ala Ser Ser Pro Pro Val Ser Ser Thr Arg Val Ser Ser Pro Pro
            515                 520                 525GTC TCT TCC CCT CCA GTT TCT CGC ACC TCT TCT CCC CCT CCC CCT CCG       4813Val Ser Ser Pro Pro Val Ser Arg Thr Ser Ser Pro Pro Pro Pro Pro
        530                 535                 540GCC AGC AGC ACG CCG CCA TCG GGT CAG GTT TGC GTT GCC GGC ACC GTT       4861Ala Ser Ser Thr Pro Pro Ser Gly Gln Val Cys Val Ala Gly Thr Val
    545                 550                 555GCT GAC GGC GAG TCC GGC AAC TAC ATC GGC CTG TGC CAA TTC AGC TGC       4909Ala Asp Gly Glu Ser Gly Asn Tyr Ile Gly Leu Cys Gln Phe Ser Cys
560                 565                 570AAC TAC GGT TAC TGT CCA CCG GGA CCG TGT AAG TGC ACC GCC TTT GGT       4957Asn Tyr Gly Tyr Cys Pro Pro Gly Pro Cys Lys Cys Thr Ala Phe Gly575                 580                 585                 590GCT CCC ATC TCG CCA CCG GCA AGC AAT GGG CGC AAC GGC TGC CCT CTA         5005Ala Pro Ile Ser Pro Pro Ala Ser Asn Gly Arg Asn Gly Cys Pro Leu
            595                 600                 605CCG GGA GAA GGC GAT GGT TAT CTG GGC CTG TGC AGT TTC AGT TGT AAC         5053Pro Gly Glu Gly Asp Gly Tyr Leu Gly Leu Cys Ser Phe Ser Cys Asn
        610                 615                 620CAT AAT TAC TGC CCG CCA ACG GCA TGC CAA TAC TGT TAG TCTAGAGGGT          5102His Asn Tyr Cys Pro Pro Thr Ala Cys Gln Tyr Cys  *
    625                 630                 635GACTGACACC TGGCGGTAGA CAATCAATCC ATTTCGCTAT AGTTAAAGGA TGGGGATGAG       5162GGCAATTGGT TATATGATCA TGTATGTAGT GGGTGTGCAT AATAGTAGTG AAATGGAAGC       5222CAAGTCATGT GATTGTAATC GACCGACGGA ATTGAGGATA TCCGGAAATA CAGACACCGT       5282GAAAGCCATG GTCTTTCCTT CGTGTAGAAG ACCAGACAGA CAGTCCCTGA TTTACCCTGC       5342ACAAAGCACT AGAAAATTAG CATTCCATCC TTCTCTGCTT GCTCTGCTGA TATCACTGTC       5402ATTCAATGCA TAGCCATGAG CTCATCTTAG ATCCAAGCAC GTAATTCCAT AGCCGAGGTC       5462CACAGTGGAG CAGCAACATT CCCCATCATT GCTTTCCCCA GGGGCCTCCC AACGACTAAA       5522TCAAGAGTAT ATCTCTACCG TCCAATAGAT CGTCTTCGCT TCAAAATCTT TGACAATTCC       5582AAGAGGGTCC CCATCCATCA AACCCAGTTC AATAATAGCC GAGATGCATG GTGGAGTCAA       5642TTAGGCAGTA TTGCTGGAAT GTCGGGGCCA GTTGGCCGGG TGGTCATTGG CCGCCTGTGA       5702TGCCATCTGC CACTAAATCC GATCATTGAT CCACCGCCCA CGAGGGCGTC TTTGCTTTTT       5762GCGCGGCGTC CAGGTTCAAC TCTCTCCTCT AGCGCCTGAT GCGGTATTTT CTCCTTACGC       5822ATCTGTGCGG TATTTCACAC CGCATATGGT GCACTCTCAG TACAATCTGC TCTGATGCCG       5882CATAGTTAAG CCAGCCCCGA CACCCGCCAA CACCCGCTGA CGCGCCCTGA CGGGCTTGTC       5942TGCTCCCGGC ATCCGCTTAC AGACAAGCTG TGACCGTCTC CGGGAGCTGC ATGTGTCAGA       6002GGTTTTCACC GTCATCACCG AAACGCGCGA                                        6032

Claims (24)

1．构建包含得自适于异源生产的丝状真菌的齿斑葡聚糖酶基因的表达载体的方法，该方法包括以下步骤：
a)从丝状真菌中分离编码齿斑葡聚糖酶的DNA序列；
b)在编码前肽和齿斑葡聚糖酶成熟区的DNA序列之间导入Kex2位点或Kex2样位点，或用包括另一种真菌酶的Kex2或样位点的(前)原序列取代齿斑葡聚糖酶(前)原序列；
c)将步骤b)中得到的DNA序列克隆到适当的表达载体中。
2．根据权利要求1的方法，其中齿斑葡聚糖酶得自木霉属，较好是T.harzianum种的菌株，特别是T.harzianum CBS 243.71菌株。
3．根据权利要求1的方法，其中齿斑葡聚糖酶的DNA序列分离自T.harzianum CBS243.71的核酸文库，或是基于该文库生产的。
4．根据权利要求1至3中任何一项的方法，其中齿斑葡聚糖酶(前)原序列被Lipolase(前)原序列或TAKA淀粉酶(前)原序列所取代。
5．包含齿斑葡聚糖酶基因和编码前肽之DNA序列的表达载体，其中在编码所说的前肽和齿斑葡聚糖酶成熟区的DNA序列之间有Kex2位点或Kex2样位点。
6．根据权利要求5的表达载体，其进一步包括可操作地连接的启动子序列和/或前原序列。
7．根据权利要求5和6的表达载体，其中前原序列包括原始齿斑葡聚糖酶信号序列，或Lioplase信号序列，或TAKA原序列和带有Kex2或Kex2样位点的原始齿斑葡聚糖酶原序列，或Lioplase原序列，或TAKA原序列。
8．根据权利要求7的表达载体，其中启动子是TAKA启动子或TAKA:TPI启动子。
9．根据权利要求5至8中任何一项的表达载体，其为载体pMT1796。
10．用于生产衍生于丝状真菌的重组齿斑葡聚糖酶的丝状真菌宿主细胞是木霉属真菌，如T.harzianum的菌株，或曲霉属真菌，如米曲霉或黑曲霉，或镰孢属真菌，如尖镰孢、禾谷镰孢、硫磺镰孢、五谷镰孢的菌株。
11．根据权利要求10的宿主细胞，其中宿主细胞是蛋白酶缺陷的蛋白酶-菌株。
12．根据权利要求11的宿主细胞，其中宿主细胞是缺失了称为“alp”的碱性蛋白酶基因的蛋白酶缺陷型菌株米曲霉JaL125。
13．在宿主细胞中生产重组齿斑葡聚糖酶的方法，其包括以下步骤：
a)将含有齿斑葡聚糖酶基因，并在编码前肽和齿斑葡聚糖酶成熟区的DNA序列之间有Kex2位点或Kex2样位点的表达载体转化到适当的丝状真菌宿主细胞中。
b)在允许表达和分泌活性齿斑葡聚糖酶的条件下，在适当的培养基中培养宿主细胞。
c)从培养基中回收并酌情纯化被分泌的活性重组齿斑葡聚糖酶。
14．根据权利要求13的方法，其中重组表达载体是按权利要求1至4的方法制备的。
15．根据权利要求13和14的方法，其中丝状真菌宿主是根据权利要求7至9中任何一项的宿主细胞。
16．按照权利要求13至15中任何一项的方法生产的分离重组齿斑葡聚糖酶。
17．从基本上没有任何污染物的Trichoderma harzianumCBS243.71得到的实质上纯的野生型齿斑葡聚糖酶。
18．含有根据权利要求16的重组齿斑葡聚糖酶或根据要求17的实质上纯的野生型齿斑葡聚糖酶，以及常规用于食物、饲料和/或宠物食品中的其他成分的组合物。
19．含有根据权利要求16的重组齿斑葡聚糖酶或根据权利要求17的实质上纯的野生型齿斑葡聚糖酶，进一步含有选自葡聚糖酶、氧化酶、过氧化物酶、卤过氧化物酶、漆酶、蛋白酶、内切葡糖苷酶、脂酶、淀粉酶及其混合物的酶的口腔保健组合物。
20．含有根据权利要求16的重组齿斑葡聚糖酶或根据权利要求17的实质上纯化的齿斑葡聚糖酶或根据权利要求19的口腔保健组合物，并进一步包含常规用于口腔保健产品中的成分的口腔保健产品。
21．根据权利要求20的口腔保健产品是洁齿剂，例如牙膏、牙粉或漱口液。
22．根据权利要求16的重组齿斑葡聚糖酶或根据权利要求17的实质上纯化的齿斑葡聚糖酶或根据权利要求19的口腔保健组合物或根据权利要求20和21的口腔保健产品在预防齿斑形成或去除齿斑中的应用。
23．根据权利要求16的重组齿斑葡聚糖酶或根据权利要求17的实质上纯化的齿斑葡聚糖酶或根据权利要求19的口腔保健组合物或根据权利要求18和20的口腔保健产品在人和/或动物的口腔保健产品中的应用。
24．根据权利要求18的组合物在食物、饲料和/或宠物食品中的应用。
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