CN121540887A - Vars1基因的应用、vars1抑制剂和用途 - Google Patents

Vars1基因的应用、vars1抑制剂和用途

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Abstract

本发明属于药物领域，公开了VARS1蛋白在筛选和制备前列腺癌(PCa)治疗的药剂开发以及诊断前列腺癌以及前列腺癌恶性进展的试剂盒中的应用中的应用。本发明明确了VARS1在PCa中的作用，筛选特异性靶向结合VARS1的药物并验证其对PCa细胞的杀伤作用，为进一步提高PCa治疗效果提供新的治疗思路和药物。同时，本发明还公开了基于该基因筛选得到的多个化合物，并通过实验证明了这些化合物在细胞层面以及动物层面的作用；此外，本发明还提供了这些化合物的相关应用。

Description

VARS1基因的应用、VARS1抑制剂和用途
技术领域
本发明涉及药物领域，尤其涉及VARS1基因和蛋白的应用、VARS1抑制剂和用途。
背景技术
前列腺癌（Prostate Cancer，PCa）是威胁中老年男性健康的主因之一。针对早期PCa患者，雄激素剥夺治疗法(Androgen deprivation therapy，ADT）因其能阻断PCa细胞赖以生存的雄激素/雄激素受体(Androgen receptor，AR）信号通路，故是目前临床上广泛使用的一线治疗方法。ADT在治疗初期效果显著，但随着治疗时间的延长，几乎全部的患者会在2年内以去势抵抗性前列腺癌（Castration-resistant prostate cancer，CRPC）的形式复发，并常伴有转移。目前CRPC不仅无药可愈，且致死率高；主要是因为其恶性进展的分子机制尚未阐明，导致治疗靶点缺乏，实际可用的诊疗方案十分有限。所以应加强对CRPC发生发展的机制研究，评估其高危因素，寻找新的治疗靶点或策略。
发明内容
本发明的目的是提供一种VARS1基因和蛋白的应用，本发明明确了VARS1在PCa中的作用，筛选特异性靶向结合VARS1的药物并验证其对PCa细胞的体外和体内杀伤作用，为进一步提高PCa治疗效果提供新的治疗思路和药物。
同时，本发明还公开了基于该蛋白筛选得到的多个化合物，并通过实验证明了这些化合物在细胞层面以及动物层面的作用；此外，本发明还提供了这些化合物的相关应用。
为实现上述目的，本申请公开了：
VARS1蛋白或VARS1基因在筛选和制备前列腺癌治疗的药剂开发中的应用以及在开发诊断前列腺癌以及前列腺癌进展的试剂盒中的应用。
缬氨酸tRNA合成酶1（Valine tRNA synthetase 1，VARS1）参与缬氨酸tRNA生物发生，编码已知的唯一缬氨酸胞质定位氨基酰tRNA合成酶。VARS1基因编码的蛋白质属于I类氨基酸tRNA合成酶（aaRS）家族。VARS1以高保真度催化缬氨酸与同源tRNA连接，这一过程被称为缬氨酸的充电。aaRS在肿瘤发展中起到驱动或支持的作用。突变、异常表达、不受控制的分泌和其他致癌因素相互作用均会影响细胞内aaRS的表达水平，进而导致代谢组和蛋白质组的失衡，引发癌症。此外，aaRS表达的异常通过促进蛋白质合成和细胞增殖来支持癌症的生长。无论基因和蛋白质水平上，aaRS的变化最终都会影响蛋白质合成和代谢组的稳态（特别是与氨基酸、能量和RNA相关的代谢组）。目前已报道的与VARS1相关（主要为其突变）的疾病包括伴有小头畸形的神经发育障碍、癫痫、皮质萎缩和合并氧化磷酸化缺乏等，暂未见在前列腺癌的治疗方面的应用。
为了验证VARS1作为治疗靶点的可行性，本发明针对目前已报道的VARS1的AF-P26640-F1-v4结构，进行计算机虚拟筛选，蛋白分子使用Autodock Tools 1.5.6添加极性氢和电荷，最后转化为PDBQT格式。化合物SPECS数据库用Openbabel软件拆分，使用脚本批量转化为PDBQT格式。用Auto vina 1.1.2进行批量分子对接。依据结合能的大小进行虚拟评分，发现可能与VARS1相互作用的数百个小分子化合物，这些小分子化合物从一百多万个化合物中筛选出来，经过验证，得到了3个能够明显抑制前列腺癌细胞增殖的化合物。
然后通过体外实验进一步筛选可以结合并抑制VARS1活性的小分子抑制剂，并确证其靶向结合前列腺癌细胞内VARS1并抑制前列腺癌细胞的增殖。
同时，在本发明中，前列腺正常组织、前列腺上皮内肿瘤、前列腺原位癌和去势抵抗性前列腺癌中VARS1的表达依次升高。在前列腺癌细胞系中下调VARS1的表达可明显抑制细胞增殖，迁移和干性。该结果说明VARS1在前列腺癌中发挥促癌基因的作用。根据本领域的一般研究思路，通过检测VARS1的表达，有望实现对前列腺癌恶性进展的诊断作用。
具体的实施例中，前列腺正常组织、前列腺上皮内肿瘤、前列腺原位癌和去势抵抗性前列腺癌中VARS1的表达依次升高；
优选的实施例中，所述诊断试剂包括针对VARS1蛋白表达情况的免疫组化染色试剂。
因此，本发明所提出的VARS1基因在筛选和制备前列腺癌治疗的药剂开发中的应用可以是能够与VARS1蛋白特异性结合的小分子化合物、多肽、由小分子延伸而来的蛋白降解靶向嵌合体 (PROTAC）、小分子胶（Molecular Glue）等形式的物质作为制备前列腺癌治疗的药剂的应用，也可以是基于本领域各种可选的检测手段如基于引物、引物和探针、修饰抗体、抗体介导的免疫组化染色方法等各种可以明确表征该基因以及该基因表达量的相关的检测试剂、检测试剂盒的应用。
基于此，本发明还公开了一种VARS1抑制剂，所述VARS1抑制剂为如下式1至式3中一种或多种所示的化合物；
式1
式2
式3
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29、R30各自独立选自H、OH、CX3、CHX2、CH2X、OCX3、OCHX2、OCH2X、CN、C(O) Y1、C (O) OY1、C (O) NY1Y2、C (O) NHY1、NHC (O) Y1、NY1C (O) Y2、NY1C (O) OY2、NY1OY2、N3、NY1C (O) Y2、NY1NY2Y3、SO4Y1、SO3Y1、SO2Y1、SO4NY1Y2、SO3NY1Y2、SO2NY1Y2或SF5；
其中X为H、Cl、F、Br或I；Y1、Y2、Y3各自独立选自OH、CCl、CBr3、CF3、CI3、CH2Cl、CH2F、CH2Br、CH2I、CHCl2、CHF2、CHBr2、CHI2、CN、NH2、COOH、CONH、NO2、SH、SO3H、SO2HN2、SO4H、HNNH2、ONH2、NHC（O) NHNH2、NHC (O) NH2、NSO2H、NHC (O) H、NHC (O) OH、NHOH、OCCI3、OCBr3、OCF3、OCI3、OCHCl2、OCHBr2、OCHF2、OCHI2。
在上述的VARS1抑制剂中，所述VARS1抑制剂为如下式4至式6中一种或多种所示的化合物；
式4
式5
式6。
上述式4至式6所对应的化学式在数据库中的编号分别为ZINC04656109、ZINC02211211和ZINC08443122，在后文中的部分附图中，将ZINC04656109、ZINC02211211和ZINC08443122以编号2701、2901、3201进行表述；本发明后续的实验均从该数据库的持有者手中购买得到，并进行后续实验。
同时，本发明还公开了采用如上所述的VARS1抑制剂制备抗癌药物的用途。
在上述的用途中，所述抗癌药物的作用靶点为VARS1基因。
在上述的用途中，所述抗癌药物的适用病症为前列腺癌。
最后，本发明还公开了一种抗癌药，含有如上所述的VARS1抑制剂，所述抗癌药为治疗前列腺癌的抗癌药。
本申请至少具有如下有益效果：
1.本发明明确了VARS1在PCa中的作用，筛选特异性靶向结合VARS1的药物并验证其对PCa细胞的杀伤作用，为进一步提高PCa的检测以及治疗效果提供新的治疗思路和药物；
2.本发明研究结果明确了ZINC04656109（编号2701）、ZINC02211211（编号2901）和ZINC08443122（编号3201）在前列腺癌中的作用及机制，依据本发明研究结果，抑制VARS1能够实现对前列腺癌的治疗作用，抑制前列腺肿瘤的生长。
3.本发明研究结果筛选了VARS1的特异性靶向结合药物，有利于前列腺癌临床治疗药物开发，具有重要的临床意义。
附图说明
图1为实施例1中所述前列腺正常组织、前列腺上皮内肿瘤、前列腺原位癌和去势抵抗性前列腺癌中VARS1的表达情况。
图2为实施例1中所述在PCa细胞系中下调VARS1的表达后细胞生物学功能的情况；其中，图2A为下调后VARS1表达情况的验证，图2B为细胞增殖，图2C为细胞干性，图2D为细胞迁移，图2E为异种移植皮下瘤。
图3为VARS1小分抑制剂筛选流程示意图。
图4A为化合物ZINC04656109、ZINC02211211和ZINC08443122的化学结构式图；
图4B为化合物ZINC00629069和ZINC08435127的结构式以及与VARS1相互作用的曲线图；
图5为体外荧光滴定实验确证ZINC04656109、ZINC02211211和ZINC08443122与VARS1相互作用的曲线图。
图6为ZINC04656109、ZINC02211211和ZINC08443122对前列腺癌细胞增殖的作用情况。
图7 为化合物ZINC04656109、ZINC02211211和ZINC08443122对VARS1敲低细胞和对照细胞增殖的作用情况。
图8A为pLKO.1-EGFP-Puro慢病毒载体的质粒图谱。
图8B为VARS1敲低细胞和对照细胞中分析3个小分子化合物对细胞增殖的影响结果。
具体实施例方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明进行清楚、完整的描述，在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。在未做特殊说明的情况下，本发明的实施例中所用的份均为重量份。
实施例1 VARS1基因在前列腺癌中的作用分析
VARS1在前列腺癌中发挥的作用及机制仍不清楚。我们基于前列腺癌细胞系证实了VARS1在前列腺癌中扮演促癌基因的角色，并确定其作为前列腺癌治疗靶点的可能性。
1.1 VARS1在前列腺癌患者中的表达情况
为明确前列腺癌患者体内VARS1的表达情况，本实施例中收集了13例CRPC患者临床样本，10例PCa患者临床样本和10例前列腺正常组织样本。利用免疫组化染色实验检测了VARS1 蛋白水平的表达量。
免疫组化染色实验过程包括：
样本处理：脱蜡水化（石蜡切片）或固定（冰冻切片/细胞爬片）。
抗原修复：热修复（枸橼酸盐缓冲液）或酶修复。
阻断：3% H2O2处理10分钟（HRP系统）。
封闭：5% BSA室温封闭30分钟。
抗体孵育： 一抗4℃过夜/室温1-2h HRP/荧光（Proteintech, 15931-1-AP），二抗室温30-60min。
显色：DAB显色或直接观察荧光。
复染封片：苏木素复染，中性树胶封片。
测试结果如图1所示的结果显示：VARS1蛋白的表达在正常组织、PIN、PCa和CRPC中依次升高，表明VARS1的蛋白表达水平随着PCa恶性程度的升高而升高。
1.2在前列腺癌细胞系中下调VARS1的表达后对细胞生物学功能的影响
本实施例在PC3和LNCaP两种前列腺癌细胞系中利用siRNA下调VARS1的表达（图2A），siRNA通过RNA干扰机制特异性降解靶标mRNA从而抑制蛋白表达。
具体操作如下：将细胞接种于6孔板中，待融合度达60-70%时，将5μlLipofectamine 2000和50-100nM siRNA分别稀释于250μl Opti-MEM中，室温静置5分钟后混合形成脂质体-siRNA复合物，继续静置15分钟；弃去细胞培养基并用PBS清洗后，加入500μl Opti-MEM培养基和转染复合物，37℃培养6小时后更换为完全培养基，继续培养24-72小时即可检测蛋白表达水平。
该方法利用脂质体包裹siRNA促进其进入细胞，随后siRNA与RISC复合体结合并引导靶mRNA降解，实现基因沉默。
所用 siRNA 序列如下：
siNC：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；
siVARS1#542：5’-GUUACGCCGACACGGAGUUAATT-3’；
siVARS1#1782 ：5’-CCUCGUGUCCUUUGCCUAUAATT-3’；
siVARS1#3313 ：5’-GUCUACUUGGAGUGCCUGAAATT-3’。
最后通过细胞计数实验、细胞克隆形成实验、细胞成球实验和transwell实验等方法验证对细胞生物学功能的影响。
结果显示：在前列腺癌细胞系中下调VARS1的表达后，可以抑制细胞增殖（图2B），细胞克隆（图2C），细胞成球（图2D），以及细胞迁移（图2E）。
实施例2 特异性靶向结合VARS1的药物
由于VARS1的高表达与前列腺癌的发生发展高度相关，因此可基于VARS1设计新型靶向药物。本实施例首先利用VARS1的AF-P26640-F1-v4结构进行计算机虚拟筛选，寻找可能与VARS1相互作用的小分子化合物。然后通过体外实验进一步筛选可以结合并抑制VARS1活性的小分子抑制剂，并确证其靶向结合前列腺癌细胞内VARS1并抑制前列腺癌细胞增殖。
2.1计算机虚拟筛选发现ZINC04656109、ZINC02211211和ZINC08443122与VARS1相互作用
本发明选取SPECS数据库（306, 709个小分子化合物，http://www.specs.net）进行基于分子对接的虚拟筛选。人VARS1（AF-P26640-F1-v4）蛋白结构数据库来自于AlphaFold2 （https://alphafold.com/），蛋白分子使用Autodock Tools 1.5.6添加极性氢和电荷，最后转化为PDBQT格式。为了进一步确定小分子与化合物蛋白的结合口袋，我们首先在 proteinplus （https://proteins.plus/）网站预测蛋白结合口袋。利用 AutoDockTools 软件根据预测的口袋位置生成对接盒子的参数文件。使用 AutoDock Vina 软件进行分子对接。使用 pymol 寻找氢键相互作用。在proteinplus网站获得二维相互作用图。
VARS1蛋白分子的活性口袋的坐标设置为：center_x = 10.137，center_y =1.818，center_z = -11.350，size_x = 114，size_y = 72，size_z = 68，spacing =1.000，exhaustiveness = 32，num_modes = 10。除了特别说明，其他参数均采用默认值。最后，SPECS数据库用Openbabel软件拆分后，使用脚本批量转化为PDBQT格式，接着用Autodock vina 1.1.2进行批量分子对接。根据结合能的大小，进行虚拟评价打分。筛选流程如图3。通过高通量虚拟筛选，我们最终筛选到42种VARS1的候选抑制剂。为了评估这些抑制剂的对PCa细胞的毒性，我们从SPECs化合物库购买了其中的35种化合物（因部分化合物在库中已断货）。随后，我们对这些化合物进行了MTT细胞毒性实验的筛选。
结果如图4A所示，发现其中有16种化合物对PCa细胞PC3、DU145和LNCaP均具有显著的抑制作用。
2.2 体外确证小分子化合物ZINC04656109、ZINC02211211和ZINC08443122靶向结合VARS1
综合化学结构多样性和结合能对4.1筛选结果进行评价，从中选取16个小分子化合物，利用荧光滴定技术进一步确证小分子化合物与VARS1的相互作用。
具体方法为：配制100mM的化合物储备液，取1.0μL储备液加至99 μL Buffer（与VARS1蛋白Buffer一致）中，稀释至1000μM；96孔板中加入100 μL VARS1蛋白溶液（5 μM），平行对照加入等体积buffer。
然后加入固定体积化合物溶液（化合物与VARS1结合时用0，1，2，4，6，8，10和20 μL），轻柔吹打后于4℃孵育10分钟。在280 nm波长激发光下，读取每孔荧光值（332 nm），用蛋白孔荧光值扣除对应Buffer孔荧光值（扣除化合物的光学干扰），观察随着化合物量的增加，荧光强度是否下降并符合量效关系。
结果如图5所示，荧光滴定结果显示，其中ZINC04656109、ZINC02211211和ZINC08443122可以与VARS1相互结合。
参考图4B，ZINC00629069和ZINC08435127作为对照，在体外与VARS1没有靶向结合（Kd>10μM）。
2.3 化合物ZINC04656109、ZINC02211211和ZINC08443122对前列腺癌细胞生物学功能的作用
2.3.1 细胞增殖的抑制
根据荧光滴定结果，本实施例进一步在PC3细胞系中评价3个小分子化合物对细胞增殖的影响；
将细胞接种到96孔板中，随后用VARS1候选抑制剂处理。使用MTT试剂评估细胞活力。绝对活力测量归一化到DMSO对照组，并表示为百分比活力，结果如图6所示，发现ZINC04656109、ZINC02211211和ZINC08443122均抑制PC3、LNCaP细胞增殖。
2.3.2 小鼠实验
通过皮下小鼠荷瘤模型实验检测其对PCa体内生长的影响，具体方法为：将50μl的PBS细胞悬液和50μl基质胶混合，皮下注射细胞。当肿瘤大小达到70mm3左右时，根据肿瘤大小将小鼠平均分组，将药物配制成10% DMSO、20% PEG300、5% Tween80和65% ddH2O的混合溶液，按100μL/20g体重的剂量对小鼠（BALB/c-nu）进行腹腔注射，每2-3天注射一次，共8-10次后处死取材。每次注射药物量：2701：15mg/kg，2901：10mg/kg，20mg/kg，3201：10mg/kg，20mg/kg。
结果如图7所示，发现ZINC04656109、ZINC02211211和ZINC08443122均抑制体内前列腺癌的进展；
图7中，2701代表ZINC04656109，2901代表ZINC02211211，3201代表ZINC08443122。
2.3.3 细胞敲低实验
在此基础上，本实施例在VARS1敲低细胞和对照细胞中分析3个小分子化合物对细胞增殖的影响；
具体方法为：利用pLKO.1-EGFP-Puro慢病毒载体（图谱可见图8A）构建VARS1敲低的质粒，通过同源重组产生慢病毒载体，随后用polyethylenimine在HEK293T细胞中共转染三种质粒（慢病毒质粒、psPax2和pMD2.G），将其包装成慢病毒颗粒。
慢病毒质粒的构建方法为：通过在目的片段和线性化pLKO.1-EGFP-Puro慢病毒载体两端设计15-50 bp的同源序列，利用重组酶实现精准拼接；步骤包括：
1）PCR扩增目的片段时在引物5'端添加同源臂；
目的片段的序列为：
shVARS1#542:
5’ccggGTTACGCCGACACGGAGTTAACTCGAGTTAACTCCGTGTCGGCGTAACTTTTT 3’;（SEQID NO.1）
shVARS1#3313:
5’ccggGTCTACTTGGAGTGCCTGAAACTCGAGTTTCAGGCACTCCAAGTAGACTTTTT 3’。（SEQID NO.2）
载体构建所用引物为：
shVARS1#542-Forward: tggaaaggacgaaacaccggtCCGGGGAGGATTTCATCTCTTGTATCTCGAGATACAAG；（SEQ ID NO.3）
shVARS1#542-Reverse: AagttatgtaacgcggaattcAAAAAGGAGGATTTCATCTCTTGTATCTCGAGATACAA；（SEQ ID NO.4）
shVARS1#3313-Forward:
tggaaaggacgaaacaccggtccggGTCTACTTGGAGTGCCTGAAACTCGAGTTTCAGG；（SEQ IDNO.5）
shVARS1#3313-Reverse:
AagttatgtaacgcggaattcaaaaaGTCTACTTGGAGTGCCTGAAACTCGAGTTTCAG；（SEQ IDNO.6）
2）同时制备带同源末端的线性化载体（酶切位点EcoRⅠ和AgeⅠ）；
3）将片段与载体按比例混合，加入重组酶孵育；
4）直接转化感受态细胞，筛选阳性克隆并测序验证；
5）提取质粒并保存。
在OPTI-MEM溶液中以10:7.5:3.5的摩尔比制备转染混合物。在转染后48和72小时收获病毒上清。室温下，在polyebrene存在下进行病毒感染。通过慢病毒转导获得稳定的vars1敲低或过表达PCa细胞系，然后用嘌呤霉素（1 μg/mL）筛选2-4天。此时，稳定敲低VARS1的细胞株构建成功。并进一步使用MTT试剂评估VARS1候选抑制剂对稳定敲低VARS1的前列腺癌细胞株细胞活力的影响。并与对照组比较，稳定敲低VARS1的细胞株对VARS1候选抑制剂处理的耐药性是否增强。
结果如图8B所示，定敲低VARS1的细胞株的确增强了对VARS1候选抑制剂的耐药性，因此，在细胞水平确证了3个小分子化合物靶向抑制VARS1。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同。要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (9)

1.VARS1蛋白在筛选和制备前列腺癌治疗的药剂开发中的应用。
2.VARS1基因或VARS1蛋白在开发诊断前列腺癌以及前列腺癌恶性进展的试剂盒中的应用。
3.一种VARS1抑制剂，其特征在于，所述VARS1抑制剂为如下式1至式3中一种或多种所示的化合物；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29、R30各自独立选自H、OH、CX3、CHX2、CH2X、OCX3、OCHX2、OCH2X、CN、C(O)Y1、C(O)OY1、C(O)NY1Y2、C(O)NHY1、NHC(O)Y1、NY1C(O)Y2、NY1C(O)OY2、NY1OY2、N3、NY1C(O)Y2、NY1NY2Y3、SO4Y1、SO3Y1、SO2Y1、SO4NY1Y2、SO3NY1Y2、SO2NY1Y2或SF5；
其中X为H、Cl、F、Br或I；Y1、Y2、Y3各自独立选自OH、CCl、CBr3、CF3、CI3、CH2Cl、CH2F、CH2Br、CH2I、CHCl2、CHF2、CHBr2、CHI2、CN、NH2、COOH、CONH、NO2、SH、SO3H、SO2HN2、SO4H、HNNH2、ONH2、NHC(O)NHNH2、NHC(O)NH2、NSO2H、NHC(O)H、NHC(O)OH、NHOH、OCCI3、OCBr3、OCF3、OCI3、OCHCl2、OCHBr2、OCHF2、OCHI2。
4.根据权利要求3所述的VARS1抑制剂，其特征在于，所述VARS1抑制剂为如下式4至式6中一种或多种所示的化合物；
5.采用如权利要求3或4所述的VARS1抑制剂制备抗癌药物的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述抗癌药物的作用靶点为VARS1蛋白。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述抗癌药物的适用病症为前列腺癌。
8.一种抗癌药，其特征在于，含有如权利要求3或4所述的VARS1抑制剂。
9.根据权利要求8所述的抗癌药，其特征在于，所述抗癌药为用于治疗前列腺癌的抗癌药。
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