CN1202097C - 苯并噻二唑类化合物及其在植物细胞中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类苯并噻二唑类新化合物的结构及其在促进植物细胞次生代谢产物生长中用途，本发明选取中国红豆杉(T.chinensis)细胞作为应用体系，从免疫激活剂噻二唑的结构出发，设计、合成新型植物细胞诱导激活剂，实验结果表明：发明人所设计、合成的苯并噻二唑类化合物的促进紫杉烷生产能力类似或高于现有的甲基茉莉酮酸酯。
Description
技术领域
本发明涉及一类苯并噻二唑化合物及其用途。
背景技术
自然界丰富的植物资源蕴涵着数量可观的次生代谢产物，其中包括许多昂贵的医药品。为了开发这些宝贵的资源，除了从植物原材料进行提取或有可能进行化学合成以外，植物细胞体外大规模培养技术也是一条有效之途径。利用诱导子进行次生代谢产物调控已得到越来越多国内外学者的关注，并成为大幅度提高培养物中代谢产物含量和产量的重要方法之一(谢秋玲，郭勇，食品科学，1998，19(10)，7-9)。
目前用于植物细胞培养中的诱导子主要有：(1)糖蛋白类：如在培养基中加入糖基化的氧化牛血清白蛋白(BSA)和氧化溶菌酶可使烟草叶产生抗原性尼克碱次生代谢产物的产量增加10倍(Lang L.，Aloj L.，Kiesewetter DO.，Nucl MedBiol，1996，23(6)，669～672)。(2)蛋白质类诱导子：Jonathan等为了解酪胺代谢途径中某些酶的活性，使用果胶酶及链状蛋白酶作为诱导子来考察烟草细胞悬浮培养情况。(3)多糖类诱导子：Daizo等用不同种诱导子分别作用于多种代表单子叶植物和双子叶植物的模型植物上，所用的诱导子有镰刀霉菌丝体、乙烯、水杨酸、几丁质和脱乙酰几丁质及其低聚糖。(4)微生物类诱导子：通常是真菌诱导子。它们主要是菌类及生物提取物，真正意义上的人工设计、合成的有机小分子植物细胞诱导激活剂几乎为空白。
在植物细胞体外大规模培养中，紫杉醇的获取最为引人注目。紫杉醇(paclitaxel或taxol)是70年代首次从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树皮中分离到的二萜烯类化合物(Wriekremesinhe E.R.M.，Arteca R.N.，J.Liq.Chromatogr.，1993，16(15)，3263-3274)。其化学结构独特、抗肿瘤效果显著。然而，红豆杉在自然界中生长缓慢且资源日趋匮乏。为了解决紫杉烷类化合物的长期供给问题，人们在红豆杉组织细胞培养领域做了不少工作，取得了一定进展(Japan Patent WO 95/14103；US Patent 5407816)。利用茉莉酮酸酯作为诱导子可有效提高云南紫杉烷(Tc)的生产量(钟建江，董浩迪，中国发明专利申请号00125305.0)。到目前为止，天然的茉莉酮酸酯被认为是最有效的紫杉烷类诱导激活剂。
本发明选取中国红豆杉(T.chinensis)细胞作为应用体系，从免疫激活剂噻二唑的结构出发，设计、合成植物细胞诱导激活剂，并且实验结果表明：所合成的苯并噻二唑类化合物促进紫杉烷的生产能力高于甲基茉莉酮酸酯(MJA)。
发明内容
本发明所说的苯并噻二唑类化合物具有如下结构式：
式中：R为CH2CF3，CH2CF2CF3，C6F5CH2，(CH2)2OCOC6F5，
或(CH2)2OCOCH2OR1其中：R1为氯代苯基或羟基取代的苯基。
优选的R为(CH2)2OCOC6F5或(CH2)nOCOCH2OR1，n＝2，R1为2，4-二氯苯基；优选的化合物为1-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-(2-羟基苯甲酸)-乙二酯或1-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-(1-萘乙酸)-乙二酯。
上记化合物的合成路线是这样的：
以7-羧基苯并-1，2，3-噻二唑(制备方法参见US 4931581)为原料，先通过酰氯化反应制得酰氯，然后再与相应的醇反应制得目标化合物。
本发明所说的化合物是一类植物细胞诱导激活剂，其能促进植物细胞次生代谢产物的生长。实验表明本发明所说苯并噻二唑类化合物促进紫杉烷的生产能力类似或高于甲基茉莉酮酸酯(MJA)。
具体实施方法
下面通过实施例对本发明作进一步的说明，所举之例并不限制本发明的保护范围：
实施例1
7-羧基苯并-1，2，3-噻二唑三氟乙酯(化合物1)的合成：
7-羧基苯并噻二唑(3.3mmol)和8ml二氯亚砜混合，加干燥管和尾气吸收装置，油浴加热至80-100℃，并保持7-8小时。冷却至室温，减压蒸去未反应的二氯亚砜，得到有些发粘的固体，此固体溶于甲苯待用。量取4ml三氟乙醇和4ml干燥甲苯混合于小烧瓶中，加入三乙胺，搅拌下慢慢滴加酰氯甲苯溶液。室温搅拌2-4小时。此反应混合物倾入冰水中，乙酸乙酯萃取，用NaHCO3饱和溶液洗涤一次，水洗两次，无水MgSO4干燥。过滤，浓缩，得到黄棕色固体，300-400目硅胶柱层析分离。得到的淡黄色固体用乙醇重结晶，得到淡黄色晶体0.47克，收率53.8％，熔点119-121℃。
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HRMS，M+(m/e)262.0026(calc.262.0024)。
实施例2
苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸-2，2，3，3，3-五氟丙酯(化合物2)的合成：
将由7-羧基苯并噻二唑(2.2mmol)制备的酰氯(酰氯的制备与实施例1相同)溶解甲苯中，搅拌下滴加到由五氟丙醇、甲苯和三乙胺组成的溶液中，滴加时间约1小时。继续室温反应5小时。将反应混合物倒到水中，乙酸乙酯萃取，稀K2CO3溶液洗涤、水洗，无水MgSO4干燥。过滤，浓缩，得棕色溶液，300-400目硅胶柱层析分离，得到淡黄色棱状晶体0.23克，收率33.5％，熔点79-80℃。
1HNMR(SF：500MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：9.10-9.12(d，1H，J＝8.12Hz)，8.44-8.45(d，1H，J＝7.32Hz)，7.98-8.01(t，1H，J1＝8.23Hz，J2＝7.57Hz)，5.22-5.27(t，2H，J＝13.47Hz)。HRMS，M+(m/e)311.9963(calc.311.9992)。
实施例3
苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸-五氟苄酯(化合物3)的合成
除五氟苄醇外其它反应条件同实施例1。得到淡黄色针状晶体0.42克，收率53.0％，熔点146-7℃。
1HNMR(SF：500MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：9.03-9.05(d，1H，J＝8.10Hz)，8.39-8.41(d，1H，J＝7.35Hz)，7.91-7.94(t，1H，J1＝7.65Hz，J2＝7.83Hz)，5.62(s，2H)。HRMS，M+(m/e)359.9983(calc.369.9992)。
实施例4
1-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-五氟苯甲酸乙二酯(化合物4)的合成：
(1)五氟苯甲酸乙二醇单酯的合成
五氟苯甲酸(0.014mol)和乙二醇混合，搅拌下加入98％浓硫酸，100℃油浴加热5个小时。反应混合物倒入水中，搅拌下加入NaHCO3至无气泡。乙酸乙酯萃取，K2CO3溶液、水洗，无水MgSO4干燥，过滤浓缩后得到无色粘状液体3.4克，收率94.9％。
(2)1-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-五氟苯甲酸乙二酯的合成
7-羧基苯并噻二唑(0.83mmol)制备的酰氯溶解于甲苯中，在室温条件下，滴加到五氟苯甲酸乙二醇单酯(0.93mmol)、甲苯和三乙胺组成的溶液中。继续反应5小时。将反应混合物倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，水洗，无水MgSO4干燥，过滤浓缩后得到棕黄色液体，300-400目硅胶柱层析分离，得到的淡黄色粘状液体0.16克放置几天后形成白色固体，收率46.1％，熔点56-58℃。
1HNMR，δ(ppm)：9.04-9.06(d，1H，J＝8.37Hz)，8.41-8.43(d，1H，J＝7.30Hz)，7.94-7.97(t，1H，J1＝7.91Hz，J2＝7.62Hz)，4.79-4.80(t，2H)，4.75-4.76(t，2H)。
实施例5
1-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-(2，4-二氯苯氧乙酸)-乙二酯(化合物5)的合成
(1)2，4-二氯苯氧乙酸乙二醇单酯的合成：
2，4-二氯苯氧乙酸(0.01mol)和一定量乙二醇混合后，在搅拌下加入98％浓硫酸，油浴加热至浴温约120℃，维持反应2.5小时。冷却后倾入水中，底部有油状物。搅拌下加入NaHCO3，至无气泡生成。倾掉上层清液，再用稀NaHCO3溶液和水洗涤，溶于乙酸乙酯，无水MgSO4干燥，过滤浓缩后得到无色粘状液体2.3克，收率86.8％。
(2)1-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-(2，4-二氯苯氧乙酸)-乙二酯的合成：
由0.2克(1.1mmol)7-羧基苯并噻二唑制备的酰氯(酰氯的制备与实施例1相同)溶解于4ml干燥的甲苯中，在室温条件下，滴加到有2，4-二氯苯氧乙酸乙二醇单酯0.3克1.1mmol)，干燥甲苯3ml和0.3ml三乙胺组成的溶液中，滴加时间约40分钟。然后继续反应20小时。将反应混合物倒入冰水中，乙酸乙酯30ml×2萃取，水洗两次，无水MgSO4干燥过夜，过滤浓缩后得到灰白色固体，乙酸乙酯重结晶得到0.26克白色晶体，收率55.5％，熔点119-120℃。
1HNMR(SF：500MHz，DMSO-d6)(ppm)：9.04-9.06(d，1H，J＝8.29Hz)，8.34-8.35(d，1H，J＝7.26Hz)，7.91-7.94(t，1H，J1＝7.85Hz，J2＝7.85Hz)，7.42(s，1H)，7.12-7.14(d，1H，J＝8.96Hz)，7.05-7.07(d，1H，J＝8.98Hz)，4.99(s，2H)，4.62-4.64(t，2H，J1＝3.23Hz，J2＝3.51Hz)，4.55-4.57(t，2H，J1＝4.39Hz，J2＝3.95Hz)。
HRMS，M+(m/e)425.9909(calc.425.9844)。
实施例6
1-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-(2-羟基苯甲酸)-乙二酯(化合物6)的合成
(1)乙酰水杨酸乙二醇单酯的合成：
乙酰水杨酸(0.02mol)和乙二醇混合，搅拌下加入一定量浓硫酸，100℃油浴反应1.5小时，冷却后倒入水中，NaHCO3中和，乙酸乙酯萃取，水洗两次，无水MgSO4干燥，过滤浓缩后得到无色液体3.0克，收率67.0％。
(2)1-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-(2-羟基苯甲酸)-乙二酯的合成：
7-羧基苯并噻二唑(0.83mmol)制备的酰氯(酰氯的制备与实施例1相同)溶解于甲苯中，在室温条件下，滴加到有乙酰水杨酸乙二醇单酯(1.12mmol)、甲苯和三乙胺组成的溶液中。继续反应15小时。将反应混合物倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，水洗，无水MgSO4干燥，过滤浓缩后得到无色油状液体，300-400目硅胶柱层析分离，得到的淡黄色粘状液体。再次柱层析分离，得到白色固体0.12克，收率42％，熔点92-94℃。
1HNMR(SF：500MHz，DMSO-d6)(ppm)：10.38(s，1H，OH)，9.03-9.05(d，1H，J＝8.34Hz)，8.44-8.46(d，1H，J＝7.33Hz)，7.92-7.95(t，1H，J1＝7.46Hz，J2＝7.49Hz)，7.77-7.80(t，1H)，7.48-7.51(t，1H)，6.88-6.97(m，2H)，4.78-4.80(t，2H)，4.71-4.72(t，2H，)。HRMS，M+(m/e)344.0451(calc.344.0467)。
实施例7
1-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-(1-萘乙酸)-乙二酯(化合物7)的合成
(1)萘乙酸乙二醇单酯的合成：
萘乙酸(0.01mol)和乙二醇混合，搅拌下加入一定量浓硫酸，120℃油浴反应2.5小时，冷却后倒入水中，NaHCO3中和，乙酸乙酯萃取，水洗，无水MgSO4干燥，过滤浓缩后得到淡黄色液体2.2克，收率95.7％。
(2)1-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-(1-萘乙酸)-乙二酯的合成：
7-羧基苯并噻二唑(0.83mmol)制备的酰氯(酰氯的制备与实施例1相同)溶解于甲苯中，在室温条件下，滴加到有萘乙酸乙二醇单酯(1.0mmol)、甲苯和三乙胺组成的溶液中，继续反应16小时。将反应混合物倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，水洗，无水MgSO4干燥，过滤浓缩后得到无色油状液体，300-400目硅胶柱层析分离，得到的淡黄色粘状液体。再次柱层析分离，得到无色液体，加少量乙醚析出白色固体0.14克，收率43.0％，熔点111-113℃。
1HNMR(SF：500MHz，DMSO-d6)(ppm)：9.01-9.03(d，1H，J＝8.51Hz)，8.11-8.12(d，1H，J＝7.30Hz)，7.89-7.91(t，1H，J1＝4.26Hz，J2＝5.15Hz)，7.82-7.85(t，1H)，7.73-7.75(d，1H)，7.73-7.74(d，1H)，7.70-7.71(d，1H)，7.40-7.42(d，1H)，7.32-7.35(m，3H)，4.57-4.59(t，2H)，4.46-4.48(t，2H)，4.16(s，2H)。
HRMS，M+(m/e)392.0828(calc.392.0831)。
苯并噻二唑类化合物应用实施例(中国红豆杉细胞的培养，Tc的生产及测定方法参见钟建江，董浩迪，中国发明专利申请号00125305.0)：
实施例8
采用从植株幼茎外植体诱导愈伤组织得到的中国红豆杉细胞。250mL摇瓶培养，采用MS培养基，另添加0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸，0.2mg/L萘乙酸，100mg/L抗坏血酸及30mg/L蔗糖。
将真空过滤得到的5g湿细胞接种到含有50mL上述培养基的摇瓶中，在旋转式摇床转速为110rpm、25℃中暗培养。第一组作为对照；第二组在第7天添加化合物1至最终浓度为100μM，第三组在第7天添加化合物5至最终浓度为50μM，继续培养至第21天结束，收获细胞并在40℃干燥至恒重。实验结果表明，第一组细胞密度在第12天达到最高，为12.7g干重/L；第二组细胞密度在第15天达到最高，为12.2g干重/L，第三组细胞密度在第12天达到最高，为14.3g干重/L。细胞Tc分析结果如下表所示(*代表最大值)。
第一细(对照)：
Tc含量 Tc生产量
培养时间(天)
[mg·(g DW)-1] (mg·L-1)
12 7.9±0.4 101.1±3.8
15 7.6±0.2 94.2±5.3
18 10.3±0.7* 121.9±10.9*
21 7.7±0.1 89.0±2.6
第二组(化合物1)：
Tc含量 Tc生产量
培养时间(天)
[mg·(gDW)-1] (mg·L-1)
12 13.0±0.8 195.0±4.6
15 10.5±0.0 127.1±3.3
18 19.8±1.5 225.7±15.5
21 21.3±0.3* 228.3±2.2*
第三组(化合物5)：
Tc含量 Tc生产量
培养时间(天)
[mg·(gDW)-1] (mg·L-1)
12 7.2±0.8 103.0±10.5
15 3.1±1.1 38.7±4.2
18 12.1±0.1 147.7±9.2
21 13.8±0.2* 147.8±8.3*
实施例9
培养条件同实例8。第一组作为对照；第二组在第7天添加MJA化合物至100μM；继续培养至第21天结束。实验结果表明，细胞密度均在第12天达到最高，依次分别为15.3g干重/L、15.3g干重/L、13.9g干重/L。第三组Tc产量和生产率均在第18天达到最高，分别为427.4mg/L和30.2mg/(L·d)；而对照培养Tc最高产量(第21天达到)和最高生产率(第15天达到)仅为149.5mg/L和6.8mg/(L·d)。各组的Tc生产能力(以含量mg/g DW表示)见下表。
第一组(对照)：
Tc含量 Tc生产量
培养时间(天) Tc生产率(mg·L-1·d-1)
[mg·(gDW)-1] (mg·L-1)
12 5.5±0.5 84.6±8.4 4.1±0.9
15 9.9±0.7 137.0±6.5 6.8±0.2*
18 10.4±0.8 126.7±11.3 5.1±0.7
21 14.0±0.1* 149.5±4.5* 5.4±0.2
第二组(MJA诱导)：
Tc含量 Tc生产量 Tc生产率
培养时间(天)
[mg·(gDW)-1] (mg·L-1) (mg·L-1·d-1)
12 25.7±0.2 393.9±1.5 29.9±0.3*
15 30.3±2.1 400.2±29.9 24.3±2.2
18 33.7±1.6* 402.0±22.5* 20.4±1.4
21 32.4±0.8 332.5±29.3 14.1±1.5
实施例10
培养条件同实例8。第一组作为对照；第二组在第7天添加化合物6至100μM；第三组在第7天添加化合物7至75μM，继续培养至第21天结束。各组细胞密度和Tc分析结果如下表所示。
最大细胞密度 最高Tc含量 最高Tc生产量
条件
(gDW·L-1) [mg·(g DW)-1] (mg·L-1)
第一组(对照) 15.6±0.5(day 12) 9.6±1.9(day 18) 121.4±25(day 18)
第二组(化合物6) 16.2±0.2(day 12) 39.4±3.3(day 21) 454.5±31(day 21)
第三组(化合物7) 13.1±0.2(day 21) 17.6±0.4(day 21) 146.8±18(day 15)
实施例11
培养条件同实例8。第一组作为对照；第二组在第7天添加化合物2至100μM；第三组在第7天添加化合物3至100μM，继续培养至第21天结束。各组细胞密度和Tc分析结果如下表所示。
最大细胞密度 最高Tc含量 最高Tc生产量
条件
(gDW·L-1) [mg·(gDW)-1] (mg·L-1)
第一组(对照) 15.1±0.3(day 12) 13.7±1.4(day 21) 153.6±12(day 21)
第二组(化合物2) 12.5±0.1(day 15)) 19.1±2.6(day 21) 208.4±27(day 21)
第三组(化合物3) 15.3±0.5(day 12) 17.6±0.4(day 21) 204.0±4.8(day 21)
Claims (6)
1、一种苯并噻二唑类化合物，其特征在于，所说化合物具有如下结构式：
式中：R为CH2CF3，CH2CF2CF3，C6F5CH2，(CH2)2OCOC6F5，
或(CH2)2OCOCH2OR1其中：R1为氯代苯基或羟基取代的苯基。
2、如权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中R为(CH2)2OCOC6F5。
3、如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物为1-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-(2-羟基苯甲酸)-乙二酯。
4、如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物为1-(苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酸)-2-(1-萘乙酸)-乙二酯。
5、如权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中R为(CH2)nOCOCH2OR1，n＝2，R1为2，4-二氯苯基。
6、如权利要求1～5任意一项权利要求所述的化合物在作为植物细胞诱导激活剂方面的应用。
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