CN1194833A

CN1194833A - 肺活素

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Publication number: CN1194833A
Application number: CN97119731A
Authority: CN
Inventors: 刘柏宏; 杜群君; 皮建新
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-10-08
Filing date: 1997-10-08
Publication date: 1998-10-07
Also published as: AU9427898A; WO1999018982A1

Abstract

本发明涉及一种从动物肺脏中提取出生物活性成分用于预防和治疗呼吸系统疾病的组合物。含有分子量小于20KDa的组合物,主要成分为多肽、核酸,生物活性特征能够在内外刺激单核细胞和巨噬细胞吞噬功能;能够调节IL－1和IL－2等淋巴因子产生。本发明提供一种能够激活巨噬细胞的物质,其目的在于调节机体免疫功能,改善肺功能指标。

Description

肺活素

本发明涉及一种从动物肺脏中提取出生物活性成分用于预防和治疗呼吸系统疾病的组合物，原名肺细胞活化素，简称肺活素，其英文名称：

Pulmonary Cell Active Fartor(简称PCAF)。

在治疗哮喘等呼吸系统疾病中，以往单独使用支气管舒张药物进行治疗是不够全面的，对于中、重度哮喘，仅依靠规律地使用支气管舒张剂(如β₂激动剂)甚至是有害的，因为β₂激动剂无抗炎作用，单纯对症治疗会掩盖炎症发展，使AHR加重，因而必须联合应用抗炎药物治疗。在应用抗炎药物治疗后，虽然哮喘得到缓解或预防措施得以暂时控制，但大多数患者存在轻重度或间隔长短不等的复发，这主要是由于抗菌素对肺组织没有修复和促再生作用，所以复发率居高不下，出现停药犯病现象，专家普遍认为哮喘病人的疗效与巨噬细胞对各种药物的易感程度有关。

针对以上提出的问题，本发明提供一种能够激活巨噬细胞的物质，其目的在于调节机体免疫功能，改善肺功能指标。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

用于预防和治疗呼吸系统疾病的肺活素，含有分子量小于20KDa的组合物，并且具有下列特性：

1.1 可从哺乳动物肺脏组织提取；

1.2 组合物的主要成份：多肽、核酸；

1.3 生物活性特征：

1.3.1能够在体内外刺激单核细胞和巨噬细胞吞噬功能；

1.3.2能够调节IL-1和IL-2等淋巴因子产生。

此外，肺活素的技术特征还有：

2.1 大分子蛋白质试验—磺柳酸法测试其蛋白定性为阴性。

2.2 本组合物的水溶液经190-400nm紫外分光扫描可见两个峰，即205±10nm，260±10nm处，两峰中间的谷位在235±10nm处。

2.3 本组合物的水溶液经高效液相色谱法分析，有三、四个主要吸收峰，其主峰的相对面积百分比在40％以上。

肺活素能够保护动物和人的肺与支气管；能够修复动物和人的肺与支气管的损伤；促进人肺和支气管组织细胞的再生，从而增强抗菌素疗效；能在体外促进组织细胞生长。

肺活素从新生小牛的肺脏组织中提取，并能预防和治疗慢性支气管炎、哮喘、肺癌、肺气肿、肺结核、肺炎、呼衰、支气管扩张、肺脓肿等呼吸系统疾病。

制备肺活素的方法，其特征在于：1.清洗新鲜或冰冻保存的哺乳动物肺脏；2.将肺脏组织细胞进行破碎；3.然后加入肺重量0.5-3.0倍的蒸馏水；4.分离及澄清；5.将分离及澄清后的产物提取；6.除菌、分装；7.将肺活素制成水针或冻干粉针。

制备方法采用高速组织捣碎机、胶体磨等机械和超声方法进行肺脏组织破碎。

制备方法在破碎后加入蒸馏水的产物可反复冻融。

制备方法采用超滤方法将分离及澄清后的产物提取，超滤分子量截留20KDa以下的物质。

制备方法的成品标示量采用多肽含量标示法、核酸含量标示法和生物活性单位标示法。

本发明的优点是：

1、肺活素作为肺细胞生长因子成份的一部分，补充了哮喘病人生长细胞因子的缺如，中医学理论：以脏补脏；现在医学观点：以某种动物脏内的细胞因子可以补充人该种脏器内的细胞因子是十分理想的，因为它重建了细胞因子网络的完整，这是现有技术所达不到的。

2、肺活素可增强肺内巨噬细胞吞噬功能和分泌功能—这是肺内最重要的防御和保护体系，如此促进吞噬和消灭引起肺部疾病的致敏原和致炎细菌及病毒，既控制了I型变态反应的发生，减轻了气道慢性炎症的发展，又减少了支气管平滑肌的收缩与痉挛。

3、动物实验和临床应用未见任何毒副反应。

下面通过实施方式对本发明加以具体描述：

肺活素为新生小牛的肺脏提取液，新鲜的胎肺经清洗、破碎，破碎采用高速组织捣碎机、胶体磨等机械或超声方法进行肺脏组织破碎，然后加入肺重量0.5-3.0倍的蒸馏水，可反复冻融，然后进行分离及澄清；分离的方法可采用布过滤、筛网过滤、滤纸过滤、滤斗过滤、滤板过滤；澄清采用离心、甩干等方法。将分离及澄清后的产物提取；提取采用超滤方法和其它物理及化学方法，超滤分子量截留20KDa以下的物质。然后进行除菌、分装；将肺活素制成水针或冻干粉针。

成品标示量方法采用多肽含量标示法、核酸含量标示法和生物活性单位标示法。

所得的肺活素，具有以下技术特征：1.大分子蛋白质试验—磺柳酸法测试其蛋白定性为阴性。2.本组合物的水溶液经190-400nm紫外分光扫描可见两个峰，即205±10nm，260±10nm处，两峰中间的谷位在235±10nm处。3.本组合物的水溶液经高效液相色谱法分析，有三个主要吸收峰，其主峰的相对面积百分比在40％以上。

下面通过各项实验对本发明作进一步阐述：一、药理、药效、毒理研究：1、一般药理

本品对猫进行了一般药理试验，试验表明：肺活素对动物的神经系统、心血管系统(心率、心电图、血压等)和呼吸系统(频率、深度等)均无明显影响。2、药效学试验：

肺活素增强大白鼠肺支气管灌洗液中巨噬细胞吞噬功能。

肺活素有促进小白鼠IL-1生成的功能。

肺活素有促进小白鼠IL-2生成的功能。3、毒理研究：

热原质试验：严格按《中华人民共和国药典》二部进行，合格。

异常毒性试验：小白鼠尾静脉注射本品0.5ml，无异常，合格。

安全性试验：豚鼠腹腔注射本品5ml，健康增重，合格。

过敏试验：按《中华人民共和国药典》二部细胞色素C溶液过敏试验方法进行试验，合格。延长一倍时间攻击试验亦合格。

降压物质检查：严格按《中华人民共和国药典》二部进行的，不含降压物质。

急性毒性试验：两种动物(小白鼠、大白鼠)进行三种途径(即肌注、静注、腹腔注)给药，证明625以上倍于人体用量，无任何毒性反应，安全可靠。

长期毒性试验：80只大白鼠、12只狗，分别以三种剂量，两种途径给药十二周，观察一般体征、体重、外观、行为、尿常规、血常规、肝肾功能，肉眼观察和病理检查，未发现毒性反应，证明长期用本品无毒性反应，安全可靠。

局部刺激性观察：大白鼠局部刺激试验未发现注射部位皮肤异常。

毒理结论：经各种毒理试验证明，肺活素安全范围极大，短、长期应用不会有明显毒性反应。

总结肺活素安全性

1、热原质试验合格 2、异常毒性试验合格3、安全性试验合格 4、过敏试验合格5、不含降压物质 6、无局部刺激反应7、几百倍用量无毒性 8、慢毒试验指标无改变9、不影响神经系统 10、不影响心血管系统

二、肌注肺活素对小白鼠慢性支气管炎疗效的实验研究(摘要)

目的：

本研究以小白鼠为实验对象，经肌肉注射给药，研究了肺活素对小白鼠慢性支气管炎的疗效。1、慢性气管炎模型：

小白鼠吸入SO₂ 300-400ppm，每天2小时，每周5天，共6周，用病理方法确定气管炎的形成。2、给药方法：

分预防性给药和治疗性给药。预防性给药：染毒开始即肌肉注肺活素，设2个剂量组，即高剂量组和低剂量组，每周5天，给药共6周。治疗性给药：动物染毒6周后，气管炎模型已经建立，给予肺活素治疗，亦分为高剂量组和低剂量组，每周5天，共给药4周。此时SO₂浓度降至100-200ppm的维持量。

另设中毒对照(染毒不给治疗)和空白对照组(不作任何处理在同样条件下饲养)。3、实验结果：

无论是预防性给药还是治疗性给药。给药组动物在体重增长、平均咳嗽次数和肺脏器系数等项指标均比中毒对照组有明显改善；用光学显微镜对肺组织作病理检查，治疗组肺组织炎症病程度较轻；对气管作透射电镜和扫描电镜观察显示，治疗组气管粘膜上皮纤毛细胞的损伤亦较轻。

综上所述，肺活素对小白鼠吸入SO₂所致的气管炎均有较好的预防和治疗作用

1、气管的扫描电镜观察

正常小鼠气管扫描电镜观察结果如图1所示，可见细胞饱满，纤毛清晰自然。而中毒对照组气管的扫描电镜如图2所示，见细胞收缩、纤毛脱落且纤毛少而短。图3、4、5、6为给药组小鼠气管扫描电镜图，与图2比较，纤毛生长情况比中毒对照组好。采用每个视野内纤毛所占面积的大小来表示气管病损的程度以示肺活素的疗效，纤毛在视野内所占比例大，气管受损轻。反之，受损重，统计结果见表。从表可以看出，无论是预防性给药组或是治疗性给药组，视野内纤毛平均所占面积均大于中毒对照组，有统计学差异(P(0.05)，说明治疗后纤毛受损大大减轻。

2、气管的透射电镜观察：

给药组的透射电镜如图9、10、11、12所示，从预防和治疗性给药组气管透射电镜可以看出纤毛的生长和线粒体的数量均无明显改变，说明肺活素对SO2所致气管的损伤具有一定的保护和治疗作用。

3、肺脏病理检查：

备组动物肺组织均有不同程度的炎症反应，见表2，从表2可见，给药组肺组织炎症发现明显低于中毒对照组。表1 肺活素实验性治疗各组气管扫描电镜

每个视野平均纤毛所占面积统计(X±SD)组别动物数(n) 每个视野纤毛面积比例(％)空白对照 5 91.5±10.0中毒对照 9 14.0±7.6预防性给药高剂量 8 51.5±11.9预防性铪药低剂量 7 40.0±7.8治疗性给药高剂量 6 68.5±8.7治疗性给药低剂量 7 45.1±7.1

表2 肺活素实验性治疗组肺炎的发生率

预防性给药组治疗性给药组组别动物数肺炎动物数发生率动物数肺炎数发生率

(只) (只) (％) (只) (只) (％)空白对照组 10 1 10 10 2 20中毒对照组 10 4 40 12 8 66高剂量给药组 9 1 11 14 6 42低剂量给药组 7 1 14 10 5 50

肺活素对小鼠白介素II水平的影响1. 药品：肺活素，胸腺肽，氯化钠注射液。2. 实验方法2.1 IL-2的产生：抗凝血加入培养板各孔，再加TPA和PHA，培养24小时，每孔吸出20ul上清液作IL-2活性测定。2.2 ConA诱导IL-2反应细胞制备：C₅₇BL/6小鼠脾脏磨碎后配成细胞悬液，加入ConA，培养48小时。分层取界面层细胞即为IL-2反应细胞(淋巴母细胞)。2.3 检测方法：反应细胞加入各孔，再加待测血清，培养。每孔再加入³H-TdR继续培养。收获细胞，液体闪烁记数仪测定cpm值。3. 结果

肺活素各组的IL-2结果均明显增加(p＜0.001)。

附表肺活素对IL-2的影响

分组动物数 IL-2 P

只 (X±SD)空白对照组 14 46.14±9.42 ＜0.001胸腺肽组 14 95.04±23.96 ＜0.001肺活素1组 14 114.51±21.09 ＜0.001肺活素2组 14 274.01±48.55 ＜0.001肺活素3组 14 493.49±63.42 ＜0.0014. 结论(1)肺活素能促进小白鼠白细胞介素II的产生(P＜0.001)，即肺活素可以提高小白鼠的免疫功能。(2)小白鼠白细胞介素II的产生随注射肺活素的剂量增多而提高。

肺活素对大鼠肺巨噬细胞吞噬功能的影响1、药品：空白对照品—氯化钠注射液。

阳性对照品—(小牛)注射用胸腺肽。

实验药品—注射用肺活素。2、动物：实验动物分组

空白胸腺肽肺活素1组肺活素2组肺活素3组肌肉组 6只 6只 6只 6只 6只静脉组 6只 6只 6只 6只 6只3、诱导：动物注射药品后，放塑料桶中吸粉笔灰尘3分钟，以诱导单核细胞渗出，每日一次，连续七天。4、肺灌注—收集肺巨噬细胞

第八天分别用10％苯巴比妥钠1ml腹腔注射麻醉，解剖分离出完整的肺和气管，行气管插管，以氯化钠注射液洗去表面血渍，以20毫升HANK′S液灌洗支气管三次，吸出肺灌洗液，2000转/分离心5分钟，弃上清，其沉淀为肺巨噬细胞。5、孵育时间：向反应板孔中加入肺巨噬细胞0.5ml，2％鸡红细胞0.5ml，HANK′S液0.5ml混合，于37℃水浴30分钟，其间再吹打匀两次。

计数：在倒置镜下100计数个巨噬细胞，计算巨噬细胞吞噬率和吞噬指数。6、结果：

附表大鼠肺巨噬细胞吞噬鸡红细胞率和指数

分组吞噬率(％) P值吞噬指数 P值(X±SD) (X±SD)
分组吞噬率(％) P值吞噬指数 P值(X±SD) (X±SD)		肌肉注射组	空白对照组 2.17±1.33 3.67±2.58胸腺肽组 5.33±1.21 ＜0.01 9.50±3.73 ＜0.05肺活素1组 12.00±1.41 ＜0.001 17.83±2.32 ＜0.001肺活素2组 12.33±1.03 ＜0.001 20.33±2.80 ＜0.001肺活素3组 13.17±1.33 ＜0.001 26.33±4.89 ＜0.001
静脉注射组	空白对照组 2.00±0.63 2.67±1.21胸腺肽组 5.33±0.52 ＜0.001 8.33±1.03 ＜0.001肺活素1组 10.33±0.52 ＜0.001 16.83±2.04 ＜0.001肺活素2组 10.67±0.82 ＜0.001 17.67±1.21 ＜0.001肺活素3组 13.83±0.75 ＜0.001 27.33±2.88 ＜0.001	肌肉注射组

表中p值为各组与空白对照组比较值。7、从表中结果可以看出：(1)肺活素各组的大鼠肺巨噬细胞吞噬功能均增强，其吞噬指数和吞噬率比空白对照组和胸腺肽组均明显增多(p＜0.001)。(2)大鼠肺巨噬细胞吞噬指数和吞噬率随注射肺活素的剂量增多而提高，注射途径对其影响不明显。8、结论：肺活素可以促进大鼠肺巨噬细胞吞噬功能，即肺活素可以使巨噬细胞呈激活状态，对异物颗粒的吞噬作用增强。在炎性组织内，如果活化肺泡巨噬细胞选择性分泌物的质量强劲有效，则在遏制肺炎发展、增进病变吸收和防止组织纤维化，以及增进肺脏防御功能等方面，皆具有重要作用。9、巨噬细胞的主要功能(1)吞噬作用，是机体内吞噬能力最强的细胞。(2)加工、传递抗原给T细胞及B细胞，调节免疫反应，参与特异性免疫。(3)是细胞免疫中的重要效应细胞，致敏T细胞释放淋巴因子作用于巨噬细胞，增强其杀伤能力。(4)参与IV型变态反应的炎症过程。(5)能够产生多种因子如白细胞介素III，弹力蛋白酶、胶原酶、溶菌酶、前列腺素、中性粒细胞趋化因子、热原质、干扰素、补体等。

临床疗效初步观察：对两组60例支气管哮喘病人进行临床观察，治疗方法是：1、常规治疗组：采用抗炎、解痉进行常规治疗；解痉采用口服2、肺活素辅助治疗组：在常规治疗的基础上，每日给肺活素3mg(50kg)。观察指标：

结果1、肺活素对支气管哮喘患者T淋巴细胞亚群的影响：组别 CD₃ ⁺ CD₄ ⁺ CD₈ ⁺ CD₄ ⁺/CD₈ ⁺常规治疗前 50.22±13.4 46.40±12.0 24.22±9.13 1.54±0.31常规治疗后 48.69±11.82 43.34±8.49 25.90±7.26 1.48±5.26肺活素治疗前 49.36±9.60 49.70±10.0 22.92±7.6 1.47±0.86肺活素治疗后 45.47±12.5 33.56±8.45 23.43±4.56 1.21±0.46

常规治疗支气管哮喘患者前后外周血CD₃、CD₄、CD₈、CD₄/CD₈无明显改变(P＞0.05)。肺活素治疗后的患者外周血CD₄、均明显降低(P＜0.05)，CD₈无明显改变(P＞0.5)。

肺活素对支气管哮喘患者白细胞介素II及受体的影响

表肺活素对哮喘IL-2和IL-2R的影响组别 IL-2(％) IL-2R(u/L)常规治疗前 36.81±7.2 525±270常规治疗后 41.23±8.7 497±342肺活素治疗前 35.92±6.9 532±324肺活素治疗后 52.45±9.7 321±167常规治疗前后支气管哮喘患者IL-2无明显改变(P＞0.05)，IL-2R亦无明显改变(P＞0.05)，肺活素治疗后IL-2明显增高(p＜0.01)，IL-2R明显降低(p＜0.01)。

肺活素对支气管哮喘患者症状体征的影响组别咳嗽痰量喘息哮鸣音呼吸困难常规治疗前 ++ ++ +++ +++ +++常规治疗后 + + + + +肺活素治疗前 ++ ++ +++ +++ +++肺活素治疗后＿＿＿＿＿

肺活素治疗支气管哮喘患者前后FEV1、PEER改变情况：组别例数 FEV₁ PEER常规治疗前 60 52±7.6 34±5.6常规治疗后 60 78±5.4 26±3.4肺活素治疗前 60 54±6.6 32±4.8肺活素治疗后 60 88±4.8 16±5.2

肺活素辅助治疗支气管哮喘疗效对比：

表肺活素治疗与常规治疗的疗效对比组别例数疗效显效及以上者

临床控制显效好转无效常规治疗组 60 8 26 19 7 34/60(56.7％)肺活素治疗组 60 8 32 8 2 50/60(83.3％)临床疗效结论：

1、肺活素具有增强细胞免疫功能作用，在支气管哮喘时T细胞功能受影响，而肺活素作为免疫调节剂，有助于T细胞功能的提高。

2、肺活素具有调节机体细胞因子平衡的作用，在支气管哮喘细胞因子之间的平衡失调，肺活素可以促进IL-2产生，调节体内细胞因子平衡。

3、肺活素具有增强巨噬细胞吞噬功能的作用，在支气管哮喘时能激活巨噬细胞吞噬功能，使其膜活性增强，溶酶体及溶菌酶含量增高。提高抗炎效果，并能减少反复呼吸道感染而诱发哮喘发作的因素。我们采用肺活素辅助治疗60例支气管哮喘，达临床控制及显效者的50例中有23例已连续随访3年以上，仍处于较稳定状态。说明肺活素对减少和预防呼吸道感染，减少哮喘发作的感染诱因有一定作用。

4、研究结果表明，采用肺活素辅助治疗支气管哮喘对改善病人的症状，体征和肺功能状态均优于常规治疗，在支气管哮喘综合疗效中起到辅助治疗作用，提高了支气管哮喘的综合治疗效果。

5、肺活素安全、无局部刺激作用、不产生过敏反应，无全身毒副作用，是治疗支气管哮喘较为理想的辅助治疗药物。

Claims

1、一种用于预防和治疗呼吸系统疾病的肺活素，含有分子量小于20KDa的组合物，并且具有下列特性：

1.1 可从哺乳动物肺脏组织提取；

1.2 组合物的主要成份：多肽、核酸；

1.3 生物活性特征：

1.3.1能够在体内外刺激单核细胞和巨噬细胞吞噬功能；

1.3.2能够调节IL-1和IL-2等淋巴因子产生。

2、根据权利要求1所述的肺活素，具有以下技术特征：

2.1 大分子蛋白质试验—磺柳酸法测试其蛋白定性为阴性。

2.3本组合物的水溶液经高效液相色谱法分析，有三、四个主要吸收峰，其主峰的相对面积百分比在40％以上。

3、根据权利要求1所述的肺活素，具有以下技术特征：

3.1能够保护动物和人的肺与支气管；

3.2能够修复动物和人的肺与支气管的损伤；

3.3促进人肺和支气管组织细胞的再生，从而增强抗菌素疗效；

3.4能在体外促进组织细胞生长。

4、根据权利要求1所述的肺活素，其特征在于：可从牛的肺脏组织中提取，并能预防和治疗慢性支气管炎、哮喘、肺癌、肺气肿、肺结核、肺炎、呼衰、支气管扩张、肺脓肿等呼吸系统疾病。

5、制备如权利要求1所述组合物的方法，其特征在于：

5.1 清洗新鲜或冰冻保存的哺乳动物肺脏；

5.2 将肺脏组织细胞进行破碎；

5.3 然后加入肺重量0.5-3.0倍的蒸馏水；

5.4 分离及澄清；

5.5 将分离及澄清后的产物提取；

5.6 除菌、分装；

5.7 将肺活素制成水针或冻干粉针。

6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：采用高速组织捣碎机、胶体磨等机械和超声方法进行肺脏组织破碎。

7、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：破碎后加入蒸馏水的产物可反复冻融。

8、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：采用超滤方法将分离及澄清后的产物提取，超滤分子量截留20KDa以下的物质。

9、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于成品标示量方法如下：

4.1 采用多肽含量标示法；

4.2 采用核酸含量标示法；

4.3 采用生物活性单位标示法。