CN119452104A

CN119452104A - 用于检测性病淋巴肉芽肿(lgv)沙眼衣原体血清变型的组合物和方法

Info

Publication number: CN119452104A
Application number: CN202380050668.4A
Authority: CN
Inventors: K·C·卡迪; R·陈; K·陈; P·林; A·莫加达斯; R·谢赫; E·斯皮尔; 孙惊涛
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2022-06-30
Filing date: 2023-06-29
Publication date: 2025-02-14
Also published as: EP4547873A1; WO2024003260A1

Abstract

本公开大体上涉及用于快速检测生物学或非生物学样品中存在或不存在引起性病淋巴肉芽肿(LGV)的沙眼衣原体血清变型的方法。所述方法可包括执行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外，提供被设计用于检测L血清变型的靶向沙眼衣原体L血清变型的pmpH基因的寡核苷酸引物和探针以及试剂盒。

Description

用于检测性病淋巴肉芽肿(LGV)沙眼衣原体血清变型的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2022年6月30日提交的美国临时申请号63/357,179的优先权和权益，该美国临时申请的内容通过援引以其全文并入本文。

序列表

本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交并且据此通过援引以其全文并入。创建于2023年6月29目的所述ASCII副本被命名为“P37525-WO_Sequence_Listing”，并且大小为26.813个字节。

背景技术

本公开涉及分子诊断领域，并且更具体地涉及通过聚合酶链式反应(PCR)测定来检测沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)(沙眼衣原体(C.trachomatis))的引起性病淋巴肉芽肿(LGV)的血清型(L血清型)。

来自沙眼衣原体的感染是全世界性传播疾病的主要细菌原因，其中每年发生约8910万例(Bebear C.，de Barbeyrac B.，Clinical Microbial Infect.2009；15：4-10)。在美国，沙眼衣原体是最经常报告的细菌性性传播疾病(STD)，并且在年龄≤24岁的人群中患病率最高。在2013年，美国疾病控制与预防中心(CDC)报告了共1,401,906例沙眼衣原体感染的病例，相当于每100,000人中有446.6例病例(CDC，Sexually Transmitted DiseaseSurveillance 2013)。

微生物沙眼衣原体是一种具有独特的双相生命周期的革兰氏阴性、非运动性、专性细胞内细菌。多种感染由沙眼衣原体引起，包括尿道炎、宫颈炎、直肠炎、结膜炎、子宫内膜炎和输卵管炎；如果不及时治疗，这些感染可能会上升到子宫、输卵管和卵巢，导致盆腔炎综合征、异位妊娠和输卵管因素不孕。赖特综合征(尿道炎、结膜炎、关节炎和皮肤粘膜病变)也与生殖器沙眼衣原体感染相关联。许多感染仍然没有症状，并且大量被感染的患者可能没有寻求护理。如果他们的性伴侣没有得到治疗，患者常常变得被再次感染。受感染的母亲所生的婴儿可能会发展结膜炎、咽炎和肺炎。男性和女性的主要症状是排泄增加和排尿困难；女性也可能出现不规则子宫出血。

沙眼衣原体的血清型可以分为3组：血清型A、B和C(A-C)、血清型D、E、F、G、I、J和K(D-K)和L血清型，每种血清型都与衣原体疾病的不同临床表现相关联。血清型A-C表现为眼部感染，血清型D-K表现为肛门生殖器感染，并且血清型L表现为性病淋巴肉芽肿或LGV(生殖器溃疡/病变)。值得注意的是，L血清型包括多种不同的菌株，包括L1、L2、L2b和L3。区分性传播的血清型(D-K与L)尤为重要，因为对于每种血清型开出不同的治疗方案-对于大多数衣原体感染，通常为100mg强力霉素/口服/每天两次/7天，而对于LGV，为100mg强力霉素/口服/每天两次/21天(Sexually Transmitted Infections Treatment Guidelines，2021.“Lymphogranuloma Venereum.”疾病控制和预防中心，https：//www.cdc.gov/std/treatment-guidelines/lgv.htm，2021年9月3日)。最准确的诊断确保最合适的抗生素疗法。

19个血清型/血清变型的多态性膜蛋白H(pmpH)基因的核酸序列先前已经被描述于例如Verweij等人，Clin Microbiol Infect(2011)；17：1717-1726-NCBI登录号：A(AY184155)、B(AY184156)、Ba(AY184157)、C(AY184158)、D(AY184159)、Da(AY967759)、E(AY184160)、瑞典变体E(SW-E；FN652779)、F(AY184161)、G(AY184162)、H(AY184163)、I(AY184164)、Ia(AY967760)、J(AY184165)、K(AY184166)、L1(AY184167)、L2(AY184168)和L3(AY184169)。

目前诊断LGV的方法包括临床诊断、流行病学信息和LGV特异性分子测试(即核酸扩增检测或NAAT)；分子测试是可以明确地诊断LGV的唯一选项。在当前的LGV的分子诊断中，靶向多态性膜蛋白H(pmpH)基因占主导地位，因为所有LGV血清型都具有36个核苷酸的独特间隙，在其他血清型中不存在这种间隙(参见图1)。至少出于前述原因，需要用于特异性且选择性地检测核酸样品中沙眼衣原体的L血清型的改进的方法。

发明内容

本发明通过提供用于特异性且选择性地检测核酸样品中沙眼衣原体的L血清型的方法克服了上述缺点。

在本公开中，提供了PCR测定以特异性地检测生物学样品和非生物学样品中沙眼衣原体的L血清型的pmpH基因。尽管所有沙眼衣原体血清型都具有pmpH基因，但L血清型的pmpH基因包括至少两个区域，相对于非L血清型(例如，血清型A、B、C、D、E、F、G、I、J和K)的pmpH基因，这两个区域能够通过PCR实现特异性和选择性检测。在一个方面中，L血清型的pmpH基因的第一区域具有可以用于分子诊断的独特的36碱基对(bp)缺失。在另一个方面中，包含L血清型的pmpH基因的3’端的第二区域可以另外地或替代性地用于分子诊断。

本公开涉及用于通过单个试管中的实时PCR(RT-PCR)来快速检测生物学样品或非生物学样品中存在或不存在L血清型的方法。在本文中，检测L血清型的方法包括进行至少一个循环步骤，其可以包括扩增步骤和杂交步骤。此外，提供了被设计成用于在单个试管中检测L血清型的引物、探针和试剂盒。检测方法被设计成用于靶向L血清型的pmpH基因，这允许人们在单个测试中检测L血清型。

在一个方面中，提供了用于检测样品中的L血清型的方法，包括提供样品，进行扩增步骤，该扩增步骤包括使样品与被设计成用于靶向L血清型的多态性膜蛋白H(pmpH)基因的至少一组引物接触以产生扩增产物，如果在样品中存在L血清型，则进行杂交步骤，该杂交步骤包括使扩增产物(如果在样品中存在L血清型)与至少一种可检测的探针接触以靶向L血清型的pmpH基因，以及进行检测步骤，该检测步骤包括检测扩增产物的存在或不存在，其中扩增产物的存在指示在样品中存在L血清型，并且其中扩增产物的不存在指示在样品中不存在L血清型。本文中，该至少一组引物和该至少一种可检测的探针包括正向引物，其包含选自由SEQ ID NO：1、2、6和7或其组合组成的组的核酸序列或由其组成；反向引物，其包含选自由SEQ ID NO：3、4、8和9或其组合组成的组的核酸序列或由其组成；以及探针，其包含选自由SEQ ID NO：5、10和11或其互补序列组成的组的核酸序列或由其组成。在一些实施例中，正向引物包含选自由SEQ ID NO：1和2或其组合组成的组的核酸序列或由其组成；反向引物包含选自由SEQ ID NO：3和4或其组合组成的组的核酸序列或由其组成；并且探针包含SEQ ID NO：5或其互补序列的核酸序列或由其组成。在一些实施例中，正向引物包含SEQ ID NO：1和2或其组合的核酸序列或由其组成；反向引物包含SEQ ID NO：3的核酸序列或由其组成；并且探针包含SEQ ID NO：5或其互补序列的核酸序列或由其组成，或者正向引物包含SEQ ID NO：1和2或其组合的核酸序列或由其组成；反向引物包含SEQ ID NO：4的核酸序列或由其组成；并且探针包含SEQ ID NO：5或其互补序列的核酸序列或由其组成。在一些实施例中，正向引物包含选自由SEQ ID NO：6和7或其组合组成的组的核酸序列或由其组成；反向引物包含选自由SEQ ID NO：8和9或其组合组成的组的核酸序列或由其组成；并且探针包含选自由SEQ ID NO：10和11或其互补序列组成的组的核酸序列或由其组成。在某些实施例中，正向引物包含SEQ ID NO：7的核酸序列或由其组成；反向引物包含SEQ ID NO：9的核酸序列或由其组成；并且探针包含SEQ ID NO：11或其互补序列的核酸序列或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物和/或寡核苷酸探针具有50个或更少的核苷酸。在某些实施例中，寡核苷酸引物和/或寡核苷酸探针具有40个或更少的核苷酸(例如，35个或更少的核苷酸、30个或更少的核苷酸、25个或更少的核苷酸)。在一些实施例中，杂交步骤包括使扩增产物与可检测探针接触，该可检测探针用供体荧光部分和对应的受体部分标记；并且检测步骤包括检测在探针的供体荧光部分与受体部分之间存在或不存在荧光共振能量转移(FRET)，其中存在或不存在荧光指示在样品中存在或不存在L血清型。在一些实施例中，扩增步骤采用具有5′至3′核酸酶活性的聚合酶。在一些实施例中，样品为生物学样品。在特定实施例中，生物学样品是阴道拭子样本、临床医生采集的阴道拭子样本、宫颈内拭子样本、口咽(喉咙)拭子样本或肛门直肠拭子样本。在一些实施例中，重复扩增和杂交步骤。在本文中，重复次数取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多的扩增步骤和杂交步骤来扩增足以用于检测的靶序列。在一些实施例中，重复扩增和杂交步骤至少约20次，但是可以重复多达至少25次、30次、40次、50次、60次或甚至100次。此外，可以在每个扩增和杂交步骤期间或之后、在每隔一个扩增和杂交步骤期间或之后、在特定扩增和杂交步骤期间或之后或者在特定扩增和杂交步骤期间或之后检测扩增产物的存在或不存在，其中如果存在，预期有足够的扩增产物用于检测。在一些实施例中，供体荧光部分和受体部分(例如，猝灭剂)沿着探针的长度可以彼此相距不超过5至20个核苷酸(例如，8个或10个)。在一些实施例中，供体荧光部分和对应的受体部分在探针上彼此相距不超过8-20个核苷酸。在一些实施例中，受体部分为猝灭剂。在另一个实施例中，可检测探针进一步包括允许二级结构形成的核酸序列。这种二级结构形成通常会导致第一荧光部分与第二荧光部分之间的空间接近。根据该方法，探针上的第二荧光部分可以是猝灭剂。在一些实施例中，可检测探针可以用充当报告物的荧光染料标记。探针还可具有充当猝灭剂的第二染料。报告物染料在定义的波长下测量，从而允许检测和区分L血清型的扩增的pmpH基因。完整探针的荧光信号被猝灭剂染料抑制。在PCR扩增步骤期间，探针与特异性单链DNA模板的杂交导致DNA聚合酶的5′到3′核酸酶活性的切割，从而导致报告物染料和淬灭剂染料分离，并生成荧光信号。随着每个PCR循环，生成越来越多数量的经切割的探针，并且报告物染料的累积信号也随之增加。任选地，一种或多种另外的探针(例如，诸如内部参考对照或其他靶向探针(例如，其他病毒核酸)也可以用报告物荧光染料标记，其独特并且不同于与靶基因探针相关联的荧光染料标记物。在这种情况下，因为特异性报告物染料是在定义的波长下测量的，所以可以同时检测和区分经扩增的靶标以及一种或多种另外的探针。

在另一个方面中，提供了一种用于检测样品中沙眼衣原体的引起性病淋巴肉芽肿的血清型(L血清型)的方法，该方法包括：(a)进行扩增步骤，该扩增步骤包括使样品与被设计成用于靶向L血清型的多态性膜蛋白H(pmpH)基因的3’端的至少一组引物接触以产生扩增产物，如果在样品中存在L血清型；(b)进行杂交步骤，包括使扩增产物(如果在样品中存在L血清型)与至少一种可检测的探针接触，以靶向L血清型的pmpH基因；以及(c)进行检测步骤，包括检测扩增产物的存在或不存在，其中扩增产物的存在指示在样品中存在L血清型，并且其中扩增产物的不存在指示在样品中不存在L血清型，其中该至少一组引物被设计成用于靶向包含L血清型的pmpH基因的3’端的最后1000个核苷酸的至少一部分的区域。在一些实施例中，该至少一组引物被设计成用于靶向包含L血清型的pmpH基因的3’端的最后500个核苷酸的至少一部分的区域。在一些实施例中，该至少一组引物被设计成用于靶向包含L1血清型的pmpH基因的核苷酸2600至2900的至少一部分的区域或不同L血清型的对应区域。在一些实施例中，该至少一组引物被设计成用于靶向包含L1血清型的pmpH基因的核苷酸2600至2800的至少一部分的区域或不同L血清型的对应区域。在一些实施例中，该至少一组引物被设计成用于靶向包含L1血清型的pmpH基因的核苷酸2635至2766的至少一部分的区域或不同L血清型的对应区域。在本文中，L1血清型的pmpH基因的序列可以是Genbank登录号HE601950所示的核酸(基因：L1440_00934；CDS：CCP62925.1；位置：1032228..1035245，长度：3,018nt)并且进一步作为SEQ ID NO：18提供。在本文中，选择寡核苷酸引物和/或寡核苷酸探针以有效地与L血清型杂交，而不与其他血清型杂交。在一些实施例中，选择寡核苷酸探针以仅与L血清型杂交，但不与所有其他血清型杂交。在某些实施例中，选择寡核苷酸探针以与L1血清型(SEQ ID NO：18)的pmpH基因的核苷酸2660至2740的至少一部分或不同L血清型的对应区域杂交，更具体地与L1血清型(SEQ ID NO：18)的pmpH基因的核苷酸2670至2730的至少一部分或不同L血清型的对应区域杂交，或者甚至更具体地与L1血清型(SEQ ID NO：18)的pmpH基因的核苷酸2680至2720的至少一部分或不同L血清型的对应区域杂交。在一些实施例中，寡核苷酸引物和/或寡核苷酸探针具有50个或更少的核苷酸。在某些实施例中，寡核苷酸引物和/或寡核苷酸探针具有40个或更少的核苷酸(例如，35个或更少的核苷酸、30个或更少的核苷酸、25个或更少的核苷酸)。在一些实施例中，杂交步骤包括使扩增产物与可检测探针接触，该可检测探针用供体荧光部分和对应的受体部分标记；并且检测步骤包括检测在探针的供体荧光部分与受体部分之间存在或不存在荧光共振能量转移(FRET)，其中存在或不存在荧光指示在样品中存在或不存在L血清型。在一些实施例中，扩增步骤采用具有5′至3′核酸酶活性的聚合酶。在一些实施例中，样品为生物学样品。在特定实施例中，生物学样品是阴道拭子样本、临床医生采集的阴道拭子样本、宫颈内拭子样本、口咽(喉咙)拭子样本或肛门直肠拭子样本。在一些实施例中，重复扩增和杂交步骤。在本文中，重复次数取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多的扩增步骤和杂交步骤来扩增足以用于检测的靶序列。在一些实施例中，重复扩增和杂交步骤至少约20次，但是可以重复多达至少25次、30次、40次、50次、60次或甚至100次。此外，可以在每个扩增和杂交步骤期间或之后、在每隔一个扩增和杂交步骤期间或之后、在特定扩增和杂交步骤期间或之后或者在特定扩增和杂交步骤期间或之后检测扩增产物的存在或不存在，其中如果存在，预期有足够的扩增产物用于检测。在一些实施例中，供体荧光部分和受体部分(例如，猝灭剂)沿着探针的长度可以彼此相距不超过5至20个核苷酸(例如，8个或10个)。在一些实施例中，供体荧光部分和对应的受体部分在探针上彼此相距不超过8-20个核苷酸。在一些实施例中，受体部分为猝灭剂。在另一个实施例中，可检测探针进一步包括允许二级结构形成的核酸序列。这种二级结构形成通常会导致第一荧光部分与第二荧光部分之间的空间接近。根据该方法，探针上的第二荧光部分可以是猝灭剂。在一些实施例中，可检测探针可以用充当报告物的荧光染料标记。探针还可具有充当猝灭剂的第二染料。报告物染料在定义的波长下测量，从而允许检测和区分L血清型的扩增的pmpH基因。完整探针的荧光信号被猝灭剂染料抑制。在PCR扩增步骤期间，探针与特异性单链DNA模板的杂交导致DNA聚合酶的5′到3′核酸酶活性的切割，从而导致报告物染料和淬灭剂染料分离，并生成荧光信号。随着每个PCR循环，生成越来越多数量的经切割的探针，并且报告物染料的累积信号也随之增加。任选地，一种或多种另外的探针(例如，诸如内部参考对照或其他靶向探针(例如，其他病毒核酸)也可以用报告物荧光染料标记，其独特并且不同于与靶基因探针相关联的荧光染料标记物。在这种情况下，因为特异性报告物染料是在定义的波长下测量的，所以可以同时检测和区分经扩增的靶标以及一种或多种另外的探针。

在另一个方面中，提供了用于检测L血清型的试剂盒。具体地，提供了一种用于检测样品中沙眼衣原体的引起性病淋巴肉芽肿的血清型(L血清型)的pmpH基因的试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂，该扩增试剂包括：(a)具有5′至3′核酸酶活性的DNA聚合酶；(b)核苷酸单体；(c)至少一对引物和至少一种可检测探针，其包含：(i)正向引物，其包含SEQ IDNO：1、2、6和7或其任意组合的核酸序列；(ii)反向引物，其包含SEQ ID NO：3、4、8和9或其组合的核酸序列；以及(iii)可检测探针，其包含SEQ ID NO：5、10和11或其互补序列的核酸序列。在一些实施例中，正向引物包含选自由SEQ ID NO：1和2或其组合组成的组的核酸序列或由其组成；反向引物包含选自由SEQ ID NO：3和4或其组合组成的组的核酸序列或由其组成；并且探针包含SEQ ID NO：5或其互补序列的核酸序列或由其组成。在一些实施例中，正向引物包含SEQ ID NO：1和2或其组合的核酸序列或由其组成；反向引物包含SEQ ID NO：3的核酸序列或由其组成；并且探针包含SEQ ID NO：5或其互补序列的核酸序列或由其组成，或者正向引物包含SEQ ID NO：1和2或其组合的核酸序列或由其组成；反向引物包含SEQ IDNO：4的核酸序列或由其组成；并且探针包含SEQ ID NO：5或其互补序列的核酸序列或由其组成。在一些实施例中，正向引物包含选自由SEQ ID NO：6和7或其组合组成的组的核酸序列或由其组成；反向引物包含选自由SEQ ID NO：8和9或其组合组成的组的核酸序列或由其组成；并且探针包含选自由SEQ ID NO：10和11或其互补序列组成的组的核酸序列或由其组成。在某些实施例中，正向引物包含SEQ ID NO：7的核酸序列或由其组成；反向引物包含SEQID NO：9的核酸序列或由其组成；并且探针包含SEQ ID NO：11或其互补序列的核酸序列或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物和/或寡核苷酸探针具有50个或更少的核苷酸。在某些实施例中，寡核苷酸引物和/或寡核苷酸探针具有40个或更少的核苷酸(例如，35个或更少的核苷酸、30个或更少的核苷酸、25个或更少的核苷酸)。在一些实施例中，试剂盒可以包括已经用供体和对应的受体荧光部分标记的探针，或者可以包括用于标记探针的荧光部分。在一些实施例中，可检测探针用供体荧光部分和对应的受体部分标记。在一些实施例中，试剂盒还可以包括核苷三磷酸、核酸聚合酶以及核酸聚合酶的功能所必需的缓冲剂。在一些实施例中，试剂盒还可以包括使用引物、探针和荧光部分来检测在样品中存在或不存在L血清型的包装插页和说明。

在另一个方面中，提供了一种寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：1-11或其互补序列的核酸序列或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸可以具有50个或更少的核苷酸。在某些实施例中，寡核苷酸可以具有40个或更少的核苷酸(例如，35个或更少的核苷酸、30个或更少的核苷酸、25个或更少的核苷酸)。在一些实施例中，寡核苷酸可以用作寡核苷酸引物和/或寡核苷酸探针。在一些实施例中，寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸，例如以相对于未经修饰的核苷酸改变核酸杂交稳定性。在一些实施例中，该至少一个经修饰的核苷酸选自由N6-苄基-dA、N4-苄基-dC、N6-对叔丁基-苄基-dA和N4-对叔丁基-苄基-dC组成的组。任选地，寡核苷酸包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。在一些实施例中，寡核苷酸包括至少一种保守修饰的变异。特定核酸序列的“保守修饰的变异”或简称为“保守变异”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的序列。本领域技术人员将认识到，在编码的序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小部分的氨基酸(通常小于5％，更通常小于4％、2％或1％)的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变异”，其中这些改变导致缺失氨基酸、添加氨基酸或用化学上类似的氨基酸取代氨基酸。在一些实施例中，寡核苷酸以一组寡核苷酸的形式提供。在本文中，该组寡核苷酸可以包括：(i)正向引物，其包含SEQ ID NO：1、2、6和7或其任意组合的核酸序列或由其组成；(ii)反向引物，其包含SEQ ID NO：3、4、8和9或其组合的核酸序列或由其组成。在某些实施例中，该组寡核苷酸进一步包括(iii)可检测探针，其包含SEQ IDNO：5、10和11或其互补序列的核酸序列。在一些实施例中，正向引物包含选自由SEQ ID NO：1和2或其组合组成的组的核酸序列或由其组成；并且反向引物包含选自由SEQ ID NO：3和4或其组合组成的组的核酸序列或由其组成。在本文中，在某些实施例中，探针可以包含SEQID NO：5或其互补序列的核酸序列或由其组成。在一些实施例中，正向引物包含SEQ ID NO：1和2或其组合的核酸序列或由其组成；并且反向引物包含SEQ ID NO：3的核酸序列或由其组成。在本文中，在某些实施例中，探针可以包含SEQ ID NO：5或其互补序列的核酸序列或由其组成。在一些实施例中，正向引物包含SEQ ID NO：1和2或其组合的核酸序列或由其组成；并且反向引物包含SEQ ID NO：4的核酸序列或由其组成。在本文中，在某些实施例中，探针可以包含SEQ ID NO：5或其互补序列的核酸序列或由其组成。在一些实施例中，正向引物包含选自由SEQ ID NO：6和7或其组合组成的组的核酸序列或由其组成；并且反向引物包含选自由SEQ ID NO：8和9或其组合组成的组的核酸序列或由其组成。在本文中，在某些实施例中，探针可以包含选自由SEQ ID NO：10和11或其互补序列组成的组的核酸序列或由其组成。在某些实施例中，正向引物包含SEQ ID NO：7的核酸序列或由其组成；并且反向引物包含SEQ ID NO：9的核酸序列或由其组成。在本文中，在某些实施例中，探针可以包含SEQ IDNO：11或其互补序列的核酸序列或由其组成。在一些实施例中，靶向L血清型的pmpH基因的至少一种引物和/或可检测探针包含如上文详述的至少一种经修饰的核苷酸。

在另一个方面中，在上文提供的方法和试剂盒中确定沙眼衣原体的L血清型核酸的存在可以与确定沙眼衣原体的所有血清型核酸的存在组合。在本文中，在上述方法和试剂盒中使用的上文公开的寡核苷酸组可以与包含至少正向和反向寡核苷酸引物以及至少一种扩增和检测沙眼衣原体(CT)的所有血清型的寡核苷酸探针的寡核苷酸组进行组合。在一些实施例中，寡核苷酸组包含至少一种泛CT正向引物，其包含选自由SEQ ID NO：12和13或其组合组成的组的核酸序列；至少一种泛CT反向引物，其包含选自由SEQ ID NO：14和15或其组合组成的组的核酸序列；以及至少一种泛CT探针，其包含选自由SEQ ID NO：16和17或其互补序列组成的组的核酸序列。在某些实施例中，使用一组泛CT寡核苷酸的扩增、杂交和检测步骤是使用样品的第二部分在平行反应中进行的。在替代性实施例中，使用一组泛CT寡核苷酸的扩增、杂交和检测步骤在与用于测定L血清型的反应相同的小瓶中的多重反应中进行。在本文中，用于标记泛CT寡核苷酸探针的荧光团(或供体-受体对)不同于用于标记L血清型特异性寡核苷酸探针的荧光团(或供体-受体对)。更具体地，杂交步骤可以包括使扩增产物与两个或更多个探针接触，该探针各自用不同的供体荧光部分(例如，第一供体荧光部分和第二供体荧光部分)和对应的受体部分标记；并且检测步骤包括检测在探针的供体荧光部分(例如，第一供体荧光部分和第二供体荧光部分)与受体部分之间对于不同的供体荧光部分和对应的受体部分两者存在或不存在荧光共振能量转移(FRET)，其中存在或不存在荧光指示在样品中存在或不存在沙眼衣原体(CT)L血清型和/或存在或不存在任何沙眼衣原体(CT)血清型。

本公开还提供了检测来自个体的生物学样品中L血清型(即，具有36个碱基缺失的pmpH基因)核酸的存在或不存在的方法。可以采用这些方法来检测在生物学样品中存在或不存在L血清型或L血清型核酸以用于诊断测试，该生物学样品诸如阴道拭子标本、临床医生采集的阴道拭子标本、宫颈拭子标本、口咽(喉咙)拭子标本和肛门直肠拭子标本或其他被认为存在L血清型的生物学材料。此外，本领域有经验的人可以使用相同的测试来评估其他样品类型，以检测L血清型核酸。此类方法通常包括执行至少一个循环步骤，该至少一个循环步骤包括扩增步骤以及可检测探针杂交步骤或染料结合步骤。典型地，扩增步骤包括使样品与至少一对寡核苷酸引物接触以产生在核酸分子存在于样品中的情况下的一种或多种扩增产物，探针杂交步骤包括使扩增产物与一种或多种对扩增产物具有特异性的可检测探针接触，并且染料结合步骤包括使扩增产物与双链DNA结合染料接触。此类方法还包括检测存在或不存在双链DNA结合染料结合到扩增产物中，其中存在结合指示在样品中存在L血清型，并且其中不存在杂交指示在样品中不存在L血清型或L血清型核酸。代表性的双链DNA结合染料是溴化乙锭。其他核酸结合染料包括DAPI、Hoechst染料、和花青染料，例如和Green。此外，此类方法还可以包括确定扩增产物与双链DNA结合染料之间的解链温度，其中解链温度确认存在或不存在L血清型或L血清型核酸。

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本主题的实践或测试中，可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文合并于本文。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。

本发明的一个或多个实施例的细节在附图和下面的说明书中阐述。本发明的其他特征、目的和优点将从附图和详细描述以及权利要求中显而易见。

附图说明

图1是与血清型L1/L2/L3相比，沙眼衣原体血清型A-C/K/J的序列比对，示出了仅在血清型L1/L2/L3中存在的独特的36-bp缺失。如何可以设计引物/探针检测组以特异性地检测L血清型的实例。

图2是与血清型L1、L2、L2b和L3相比，沙眼衣原体血清型A、B、C、D、E、F、G、Ia、J和K的pmpH基因的序列比对，示出了包含仅在L血清型中存在的独特的36-bp缺失的第一区域(指示为R1)和位于pmpH基因的3’端的第二区域(指示为R2)。x轴指示沿着5’至3’方向的核苷酸中pmpH基因的距离。y轴从上到下示出了一张图表，说明所列出的血清型的共识身份(CID)，随后是血清型L2、L2b、L3、L1、A、B、C、F、G、E、D、Ia、K和J。三角形指示本公开内容的引物和探针的结合位置(参见表1)。

具体实施方式

I.定义

在本申请中，除非上下文另有明确说明，否则(i)术语“一个”(a)可以理解意为“至少一个”；(ii)术语“或”可以理解意为“和/或”；(iii)术语“包括”(comprising和including)可以理解为涵盖逐项列出的组分或步骤，无论它们是单独呈现还是与一个或多个其他组分或步骤一起呈现；(iv)术语“约”和“大约”可以理解为允许标准变化，如本领域普通技术人员将理解的那样；并且(v)其中提供范围，包括端点。

如本文所用，术语“扩增(amplifying)”或“扩增(amplification)”是指合成与模板核酸分子(例如，来自沙眼衣原体的L血清型的pmpH基因)的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性，在低于引物解链温度的温度将引物与模板核酸退火，以及从引物酶促延伸以产生扩增产物。扩增通常需要存在三磷酸脱氧核糖核苷、DNA聚合酶(例如Taq)以及用于优化聚合酶活性的适当缓冲剂和/或辅因子(例如MgCl₂和/或KCl)。

大约：如本文所用，术语“大约”或“约”，如应用于一个或多个感兴趣的值，是指类似于所陈述的参考值的值。在某些实施例中，术语“大约”或“约”是指在所述参考值的任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或以下范围内的值的范围，除非另有说明或从上下文可以明显看出(除非该数字超过可能值的100％)。

相关：如果一个事件或实体的存在、水平和/或形式与另一个事件或实体的存在、水平和/或形式有关，则两个事件或实体彼此“相关”，如本文所用术语。例如，如果特定实体(例如，多肽、遗传标记、代谢物等)的存在、水平和/或形式与疾病、病症或病状的发生率和/或易感性相关，则认为该特定实体与特定疾病、病症或病状相关(例如，在相关人群中)。在一些实施例中，如果两个或更多个实体直接或间接地相互作用，则它们在物理上彼此“相关”，使得它们在物理上彼此接近和/或保持彼此物理接近。在一些实施例中，两个或更多个彼此物理结合的实体彼此共价连接；在一些实施例中，两个或更多个彼此物理结合的实体不是彼此共价连接，而是非共价结合，例如通过氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、磁性及其组合。

生物学样品：如本文所用，术语“生物学样品”典型地是指从目标生物学来源(例如，组织或生物体或细胞培养物)获得或衍生的样品，如本文所述。在一些实施例中，目标源包括生物体，诸如动物或人，或由其组成。在一些实施例中，生物学样品包括生物学组织或流体，或由其组成。在一些实施例中，生物学样品可以是或包括骨髓；血液；血细胞；腹水；组织或细针活检样品；含细胞的体液；游离的浮动核酸；痰；唾液；尿液；脑脊液；腹膜液；胸膜液；粪便；淋巴；妇科液；皮肤拭子；阴道拭子；口腔拭子；鼻拭子；洗涤或灌洗液，诸如导管灌洗液或支气管肺泡灌洗液；抽出物；刮屑；骨髓标本；组织活检标本；手术标本；其他体液、分泌物和/或排泄物；和/或来自其中的细胞等。在一些实施例中，生物学样品包含从个体获得的细胞或由其组成。在一些实施例中，获得的细胞是或包括来自从其获得样品的个体的细胞。在一些实施例中，样品是通过任何适当的手段直接从目标源获得的“初次样品”。例如，在一些实施例中，通过选自由以下项组成的组的方法来获得原始生物学样品：活检(例如，细针抽吸或组织活检)、手术、体液收集(例如，血液、淋巴、粪便等)。在一些实施例中，如从上下文中将清楚的是，术语“样品”是指通过加工原始样品(例如，通过去除其一种或多种组分和/或通过向其中添加一种或多种试剂)来获得的制备物。例如，使用半透膜过滤。此类“经处理的样品”可以包括例如从样品中提取的核酸或蛋白质，或者通过使初次样品经受诸如mRNA的扩增或逆转录、某些成分的分离和/或纯化等技术而获得的核酸或蛋白质。

术语“其互补序列”是指与给定核酸具有相同长度并且与其完全互补的核酸。

包括：本文描述为“包括”一个或多个命名的元素或步骤的组合物或方法是开放式的，这意味着命名的元素或步骤是必不可少的，但是可以在组合物或方法的范围内添加其他元素或步骤。应当理解，被描述为“包括”(cOmprising或comprises)一个或多个命名的元素或步骤的组合物或方法还描述了对应的、更有限的基本上由相同的命名的元素或步骤“组成”(consisting essentially of或consists essentially of)的组合物或方法，这意味着组合物或方法包括命名的基本元素或步骤，并且还可以包括实质上不影响该组合物或方法的基本和新颖特征的附加元素或步骤。还应当理解，本文描述为“包括”或“基本上由”一个或多个命名的元素或步骤组成的任何组合物或方法还描述了对应的、更受限制的、封闭式的“由”命名的元素或步骤“组成”(consisting of或consists of)的组合物或方法，以排除任何其他未命名的元素或步骤。在本文公开的任何组合物或方法中，任何命名的必要元素或步骤的已知或公开的等同物可以代替该元素或步骤。

设计：如本文所用，术语“设计”是指如下试剂：(i)其结构是由人工选择的；(ii)其是由需要人工进行的方法所产生；和/或(iii)其与天然物质和其他已知试剂不同。

确定：阅读本说明书的本领域的那些普通技术人员将理解的，“确定”可以利用或通过使用本领域技术人员可用的多种技术中的任何一种来完成，包括例如本文中明确提及的特定技术。在一些实施例中，确定涉及对物理样品的操作。在一些实施例中，确定涉及对数据或信息的考虑和/或操作，例如利用适于执行相关分析的计算机或其他处理单元。在一些实施例中，确定涉及从来源接收相关信息和/或材料。在一些实施例中，确定涉及将样品或实体的一个或多个特征与可比参考进行比较。

当用于核酸时，术语“延伸”或“伸长”是指额外的核苷酸(或其他类似分子)掺入核酸时。例如，核酸任选地被掺入核苷酸的生物催化剂延伸，例如通常在核酸的3′末端添加核苷酸的聚合酶。

术语“杂交(hybridizing)”或“杂交(hybridization)”是指一种或多种探针与扩增产物的退火。杂交条件通常包括低于探针解链温度但避免探针非特异性杂交的温度。

同一性：如本文所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如，核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施例中，如果聚合物分子的序列是至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同，则认为它们彼此“基本上相同”。例如，出于最佳比较目的，两个核酸或多肽序列的同一性百分比计算可以通过比对两个序列来进行(例如，可以在第一序列和第二序列中的一个或两个中引入空位以用于最佳比对，而出于比较目的，可以忽略不相同的序列)。在某些实施例中，出于比较目的而比对的序列的长度是参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或基本上100％。然后比较相应位置的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的残基(例如，核苷酸或氨基酸)占据时，则分子在该位置是相同的。考虑到每个空位的数目和空位的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置的数目的函数，这需要引入以实现两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。例如，可以使用Meyers和Miller的算法(CABIOS，1989，4：11-17)来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比，该算法已经被并入到ALIGN程序(2.0版)中。在一些示例性实施例中，用ALIGN程序进行的核酸序列比较使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。可替代地，可以使用NWSgapdna.CMP矩阵，使用GCG软件包中的GAP程序确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。

寡核苷酸上下文中的“经修饰的核苷酸”是指如下改变，其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸被不同的核苷酸替换，从而为寡核苷酸提供所需的特性。在本文所述的寡核苷酸中，可被取代的示例性修饰的核苷酸包括例如C5-甲基-dC、C5-乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基-dU、2,6--二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基-dA、C7-丙炔基-dG、C5-炔丙基氨基-dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙基氨基-dA、C7-炔丙基氨基-dG、7-脱氮-2-脱氧黄嘌呤核苷、吡唑并嘧啶、假-dU、硝基吡咯、硝基吲哚、2′-O-甲基核糖-U、2′-O-甲基核糖-C、N4-乙基-dC、N6-甲基-dA等。可以在寡核苷酸中取代的许多其他修饰的核苷酸在本文中提及或在本领域中另外已知。在某些实施例中，经修饰的核苷酸取代相对于对应的未经修饰的寡核苷酸的解链温度修饰寡核苷酸的解链温度(Tm)。为了进一步说明，在一些实施例中，某些经修饰的核苷酸取代可减少非特异性核酸扩增(例如，最小化引物二聚体形成等)，增加预期的靶扩增子的产量等。这些类型的核酸修饰的示例在例如美国专利号6,001，611(通过引用并入本文)中描述。这些类型的核酸修饰的示例在例如美国专利号6,001，611(通过引用并入本文)中描述。

如本文所用的术语“引物”是本领域技术人员已知的，并且指能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成的寡聚化合物，主要是指寡核苷酸，但也指经修饰的寡核苷酸，即例如寡核苷酸的3′-端提供游离3′-OH基团，另外的“核苷酸”可通过模板依赖性DNA聚合酶附接到该基团，从而建立3’至5’磷酸二酯键，其中使用三磷酸脱氧核苷并由此释放焦磷酸盐。因此，除了可能的预期功能之外，“引物”、“寡核苷酸”或“探针”之间没有根本区别。

样品：如本文所用，术语“样品”是指是或包含用于定性和/或定量评估的目标组合物的物质。在一些实施例中，样品是生物学样品(即，来自生物(例如，细胞或生物体))。在一些实施例中，样品来自地质、水生、天文或农业来源。在一些实施例中，目标源包括生物体，诸如动物或人，或由其组成。在一些实施例中，用于法医分析的样品是或包含生物学组织、生物学流体、有机或无机物质，诸如例如衣服、污垢、塑料、水。在一些实施例中，农业样品包含有机物质或由其组成，该有机物质诸如叶子、花瓣、树皮、木材、种子、植物、水果等。

特异性：如本文所用，术语“特异性”意指酶对特定底物的偏好。

选择性：如本文所用，术语“选择性”意指酶对一种特定底物相对于另一种特定底物的偏好。

基本上：如本文所用，术语“基本上”是指展现出目标特征或特性的全部或接近全部范围或程度的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解的，生物学和化学现象很少(如果有的话)去完成和/或继续完成或达到或避免绝对结果。因此，本文使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在完整性不足。

合成的：如本文所用，术语“合成的”意指由人工产生的，并且因此以自然界中不存在的形式产生，要么是因为它具有自然界中不存在的结构，要么是因为它与一种或多种其他组分(在自然界中与其不结合)结合，要么不与一种或多种其他组分(在自然界中与其结合)结合。

术语“热稳定聚合酶”是指热稳定的聚合酶，即该酶催化与模板互补的引物延伸产物的形成，并且在经受升高的温度持续实现双链模板核酸变性所需的时间时不会不可逆地变性。通常，合成在每个引物的3′末端处起始，并且沿着模板股以5′至3′方向前进。已从黄栖热菌(Thermus flavus)、红栖热菌(T.ruber)、嗜热栖热菌(T.thermophilus)、水生栖热菌(T.aquaticus)、乳栖热菌(T.lacteus)、红色栖热菌(T.rubens)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)分离出热稳定的聚合酶。然而，并非热稳定的聚合酶也可用于PCR测定中，条件是补充该酶。

术语“5′至3′核酸酶活性”是指核酸聚合酶的活性，通常与核酸股合成相关，由此从核酸股的5′末端去除核苷酸。

II.某些实施例的详细描述

通过核酸扩增诊断沙眼衣原体的引起性病淋巴肉芽肿(LGV)的血清型(L血清型)的感染提供了一种用于快速和准确地检测细菌感染的方法。本文描述了用于检测样品中的L血清型的RT-PCR测定。提供了用于检测沙眼衣原体的L血清型的pmpH基因的引物和探针，以及含有此类引物和探针的制品或试剂盒。与其他方法相比，RT-PCR用于检测L血清型的增加的灵敏度，以及RT-PCR的改进特征，包括样品容纳和扩增的产物的实时检测，使得在临床实验室中实施该技术用于常规诊断由沙眼衣原体的引起LGV的血清型的感染是可行的。

沙眼衣原体的L血清型是工业界中男性与男性发生性行为的新兴病原体，通常与HIV合并感染有关。L血清型引起急性疾病，可能持续延长的时间段，并且如果不治疗，则可能会促进HIV的传播。由于缺少广泛可用的、快速、标准化的用于LGV的诊断的测试，临床护理、监测和研究受到严重阻碍。

最近，发布了许多基于PCR的测试系统，有助于识别LGV相关的L血清型。这些中的一些涉及在给定的样品中沙眼衣原体的几乎所有血清型的检测和分型。将沙眼衣原体的L血清型与其他血清型区分具有重要的临床意义，因为需要不同的抗生素治疗方案。检测通常基于pmpH基因的扩增，其中L血清型中的独特缺失有助于L血清型特异性PCR的设计。

本公开提供了通过扩增例如来自L血清型的pmpH核酸序列的第一区域或第二区域来检测沙眼衣原体的L血清型的方法(参见图2)。来自沙眼衣原体的各种血清型的pmpH基因的核酸序列是可获得的(例如，来自血清型L1的GenBank登录号AY184167、来自血清型L2的AY184168、来自血清型L3的AY184169)。此外，如上所述，L1血清型的pmpH基因的序列可以是如Genbank登录号HE601950中所示的核酸(基因：L1440_00934；CDS：CCP62925.1；位置：1032228..1035245，长度：3,018nt)。具体地，通过本公开中的实施方案提供了用于扩增和检测来自L血清型核酸分子靶标的pmpH基因的引物和探针。

本公开至少部分地基于以下令人惊讶的发现：pmpH基因提供至少两个可用于相对于其他引起非LGV的血清型选择性且特异性地检测沙眼衣原体的L血清型的区域。在本文中，如图2所示，区域R1，其是来自pmpH基因的5′端的400-600个核苷酸的区域，在L血清型中包含36bp的缺失(在L血清型中标记为灰色框)，而所有其他血清型缺少这种缺失。因此，在第一方面中，一组寡核苷酸引物被定位成与R1区域杂交，以便扩增该靶区域(图2中的灰色三角形)，同时选择跨越缺失位点杂交的寡核苷酸探针。使用这种设置，跨越缺失位点的寡核苷酸探针专门与仅存在于L血清型中的缺失位点杂交，并且因此，仅针对L血清型(L1、L2、L2b、L3)检测到信号。

在第二方面中，令人惊讶地鉴定了第二区域，如图2所示的区域R2，其是靠近pmpH基因的3’端并且距离pmpH基因的5′端2600至2900个核苷酸(在一些实施例中，距离pmpH基因的5′端2600至2800个核苷酸)的区域。在本文中，L血清型的鉴定不依赖于仅存在于L血清型中的缺失的具体确定。相反，区域R2提供了在L血清型与所有其他血清型的序列之间不同的多种核苷酸。在本文中，选择寡核苷酸引物和/或寡核苷酸探针以有效地与L血清型杂交，而不与其他血清型杂交。特别地，可以选择寡核苷酸探针以仅与L血清型杂交，而不与所有其他血清型杂交(参见图2三角形，其指示寡核苷酸引物组和/或寡核苷酸探针的有益的杂交位点)。在本文中，可以选择寡核苷酸探针以与L1血清型的pmpH基因的核苷酸2660至2740的至少一部分或不同L血清型的对应区域杂交，更具体地与L1血清型的pmpH基因的核苷酸2670至2730的至少一部分或不同L血清型的对应区域杂交，或者甚至更具体地与L1血清型的pmpH基因的核苷酸2680至2720的至少一部分或不同L血清型的对应区域杂交。

表1：针对沙眼衣原体的L血清型的pmpH基因的引物和探针

如表1所示，F引物＝正向引物；R引物＝反向引物；F/FAM/HEX＝染料；Q/ZEN/BHQ2＝猝灭剂；3IABkF′Q＝阻滞剂；t_BB_dA＝叔丁基苯甲基A；Spc_C3＝3′C₃间隔区。

更具体地，如表1所示，提供了合适的引物和探针寡核苷酸，各自包括具有选自SEQID NO：1-11、其基本上相同的变体(其中该变体与SEQQID NO：1-11中的一者或SEQ ID NO：1-11的互补序列具有至少例如80％、90％或95％的序列同一性)以及变体的序列的核酸。在本文中，提供了与区域R1杂交的引物和探针寡核苷酸，各自包括具有选自SEQ ID NO：1-5、其基本上相同的变体(其中该变体与SEQ ID NO：1-5中的一者或SEQ ID NO：1-5的互补序列具有至少例如80％、90％或95％的序列同一性)以及变体的序列的核酸。此外，还提供了与区域R2杂交的引物和探针寡核苷酸，各自包括具有选自SEQ ID NO：6-11、其基本上相同的变体(其中该变体与SEQ ID NO：6-11中的一者或SEQ ID NO：6-11的互补序列具有至少例如80％、90％或95％的序列同一性)以及变体的序列的核酸。

在一个实施例中，使用表1中描述的引物和探针组以便提供对怀疑含有沙眼衣原体的一种或多种L血清型的生物学样品中所述一种或多种L血清型的检测。引物和探针组可以包括对来自L血清型核酸序列的pmpH基因具有特异性的引物和探针或者由这些引物和探针组成，这些引物和探针含有SEQ ID NO：1-11的核酸序列或者由这些核酸序列组成。

可以通过在所公开的方法中使用引物和/或探针来鉴定SEQ ID NO：1-11的任何引物和/或探针的功能活性变体。SEQ ID NO：1-11中任一者的引物和/或探针的功能活性变体涉及与SEQ ID NO：1-11的相应序列相比在所描述的方法或试剂盒中提供相似或更高特异性和灵敏度的引物和/或探针。

变体可以例如由于一个或多个核苷酸添加、缺失或取代(诸如在SEQID NO：1-11的相应序列的5′端和/或3′端处的一个或多个核苷酸添加、缺失或取代)而与SEQ ID NO：1-11的序列不同。如上所述，引物(和/或探针)可以是经化学修饰的；即，引物和/或探针可以包括经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。探针(或引物)则是经修饰的寡核苷酸。“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)与天然“核苷酸”的不同之处在于一些修饰，但仍由碱基或碱基样化合物、戊呋喃糖基糖或戊呋喃糖基糖样化合物、磷酸部分或磷酸样部分或它们的组合组成。例如，可将“标记”附接到“核苷酸”的碱基部分，由此获得“经修饰的核苷酸”。“核苷酸”中的天然碱基也可以被例如7-去氮杂嘌呤替换，由此也获得“经修饰的核苷酸”。术语“经修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中可互换使用。“经修饰的核苷”(或“核苷类似物”)与天然核苷的不同之处在于以如上文针对“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)概述的方式进行的一些修饰。

此外，在一些应用中，将沙眼衣原体的L血清型核酸的存在的测定与沙眼衣原体的所有血清型核酸的存在的测定结合起来可能是有益的。当使用上文讨论的图2的设置时，通过使用跨越缺失的探针检测区域R1中L血清型的缺失或使用寡核苷酸引物和/或在L血清型的区域R2内杂交但不与其他血清型杂交的寡核苷酸探针检测L血清型，该方法可能是特别有益的。在本文中，仅针对L血清型的存在检测到信号，而针对所有其他血清型的存在没有检测到信号。然而，信号的缺少也可能是由于扩增/检测运行失败造成的，从而可能导致假阴性结果。为此，本文还提供了寡核苷酸引物和探针，其允许测定沙眼衣原体(CT)的所有血清型。如表1所示，提供了示例性的寡核苷酸组，其包含至少一种泛CT正向引物，其包含选自由SEQ ID NO：12和13或其组合组成的组的核酸序列；至少一种泛CT反向引物，其包含选自由SEQ ID NO：14和15或其组合组成的组的核酸序列；以及至少一种泛CT探针，其包含选自由SEQ ID NO：16和17或其互补序列组成的组的核酸序列。本文公开了使用泛CT寡核苷酸的扩增和检测反应可以在平行反应中使用样品的第二部分进行。然而，也可以在与用于确定L血清型的反应相同的小瓶中的多重反应中使用泛CT寡核苷酸进行扩增和检测反应。在本文中，用于标记泛CT寡核苷酸探针的荧光团(或供体-受体对)不同于用于标记L血清型特异性寡核苷酸探针的荧光团(或供体-受体对)。更具体地，杂交步骤可以包括使扩增产物与各自用不同的供体荧光部分(例如，第一供体荧光部分和第二供体荧光部分)和对应的受体部分标记的两个或更多个探针接触；并且检测步骤包括检测在探针的供体荧光部分(例如，第一供体荧光部分和第二供体荧光部分)与受体部分之间对于不同的供体荧光部分和对应的受体部分两者存在或不存在荧光共振能量转移(FRET)，其中存在或不存在荧光指示在样品中存在或不存在沙眼衣原体(CT)L血清型和/或存在或不存在任何沙眼衣原体(CT)血清型。

可以使用例如计算机程序诸如OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.，Cascade，Colo.)来设计扩增来自L血清型核酸序列的pmpH基因的核酸分子的寡核苷酸，包括经修饰的寡核苷酸和寡核苷酸类似物。当设计待用作扩增引物的寡核苷酸时，重要的特征包括但不限于适当大小的扩增产物以便于检测(例如，通过电泳)、一对引物的成员的相似解链温度以及每个引物的长度(即，引物需要足够长以与序列特异性退火并启动合成，但不能太长以至于在寡核苷酸合成期间保真度降低)。通常，寡核苷酸引物的长度为8至50个核苷酸(例如，长度为8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48个或50个核苷酸)。

除了一组引物之外，这些方法还可以使用一个或多个探针以便检测L血清型的存在或不存在。术语“探针”是指合成或生物产生的核酸(DNA或RNA)，其通过设计或选择而包含特定核苷酸序列，允许它们在定义的预定严格性下特异性(即优先性地)杂交到“靶核酸”，在本例中为来自L血清型核酸的pmpH基因。“探针”可以称为“检测探针”，意指其检测靶核酸。

在一些实施例中，探针可以用至少一种荧光标记物进行标记。在一个实施例中，针对来自L血清型的pmpH基因的探针可以用供体荧光部分(例如，荧光染料)和对应的受体荧光部分(例如，猝灭剂)标记。在一个实施例中，探针包含荧光部分或由其组成，并且核酸序列包含SEQ ID NO：5或由其组成。在另一个实施例中，探针包含荧光部分或由其组成，并且核酸序列包含SEQ ID NO：11或由其组成。

设计用作探针的寡核苷酸可以以类似于引物设计的方式进行。实施例可以使用单个探针或一对探针来检测扩增产物。根据实施例，使用的探针可包含至少一种标记和/或至少一种猝灭剂部分。与引物一样，探针通常具有相似的解链温度，并且每个探针的长度必须足以发生序列特异性杂交，但不能太长以至于在合成过程中保真度降低。寡核苷酸探针的长度通常为15至30(例如，16、18、20、21、22、23、24或25)个核苷酸。

含有靶基因核酸分子的构建体可在宿主细胞中繁殖。如本文所用，术语宿主细胞意在包括原核生物和真核生物，诸如酵母、植物和动物细胞。原核宿主可包括大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括酵母(诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris))、哺乳动物细胞(诸如COS细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)、昆虫细胞和植物细胞(诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum))。可使用本领域普通技术人员公知的任何技术将构建体引入宿主细胞中。例如，磷酸钙沉淀、电穿孔、热激、脂质转染、显微注射和病毒介导的核酸转移是将核酸引入宿主细胞中的常用方法。另外，可以将裸DNA直接递送到细胞(参见例如美国专利号5,580,859和5,589,466)。

美国专利号4,683,202、4,683，195、4,800,159和4,965,188公开了常规的PCR技术。PCR典型地采用与所选的核酸模板(例如，DNA或RNA)结合的两种寡核苷酸引物。在一些实施例中有用的引物包括能够充当所描述的靶核酸序列(例如，SEQ ID NO：1-4)内的核酸合成的起始点的寡核苷酸。引物可以通过常规方法从限制性消化物中纯化，或它可以合成产生。为了扩增中的最大效率，引物优先为单股的，但引物可以是双股的。首先使双股引物变性(即对其进行处理)以分离链。使双股核酸变性的一种方法是通过加热。

如果模板核酸是双股的，则必须在它可以用作PCR中的模板前分离两条股。股分离可以通过任何合适的变性方法完成，包括物理、化学或酶促方法。分离核酸链的一种方法涉及加热核酸直到它大多数变性(例如，大于50％、60％、70％、80％、90％或95％变性)。使模板核酸变性所需的加热条件将取决于例如缓冲盐浓度以及被变性的核酸的长度和核苷酸组成，但通常在约90℃至约105℃的范围内持续一段时间，这取决于反应的特征诸如温度和核酸长度。变性典型地进行约30秒至4分钟(例如，1分钟至2分钟30秒，或1.5分钟)。

如果通过加热使双链模板核酸变性，则使反应混合物冷却至促进每个引物与所描述的靶基因核酸分子上的靶序列退火的温度。用于退火的温度通常为约35℃至约65℃(例如，约40℃至约60℃；约45℃至约50℃)。退火时间可以为约10秒至约1分钟(例如，约20秒至约50秒；约30秒至约40秒)。然后将反应混合物调节至促进或优化聚合酶活性的温度，即，足以从退火的引物发生延伸以生成与模板核酸互补的产物的温度。温度应足以从与核酸模板退火的每个引物合成延伸产物，但不应高到使延伸产物从其互补模板中变性(例如，用于延伸的温度通常范围为约40℃至约80℃(例如，约50℃至约70℃；约60℃)。延伸时间可以为约10秒至约5分钟(例如，约30秒至约4分钟；约1分钟至约3分钟；约1分钟30秒至约2分钟)。

PCR测定可以采用模板核酸，诸如RNA或DNA(cDNA)。模板核酸不需要纯化；它可以是复杂混合物的一小部分，诸如人类细胞中包含的沙眼衣原体核酸。沙眼衣原体核酸分子可以通过常规技术从生物学样品中提取，诸如Diagnostic Molecular Microbiology：Principles and Applications(Persing等人(编)，1993，American Society forMicrobiology，WashingtonD.C.)中的那些技术。核酸可以从许多来源获得，例如质粒，或天然来源，包括细菌、酵母、病毒、细胞器或高等生物，例如植物或动物。

寡核苷酸引物(例如，SEQ ID NO：1-4和6-9)在诱导引物延伸的反应条件下与PCR试剂组合。例如，链延伸反应通常包括50mM KCl、10mMMTris-HCl(pH 8.3)、15mM MgCl₂、0.001％(w/v)明胶、0.5-1.0μg变性模板DNA、每个寡核苷酸引物50pmol、2.5U Taq聚合酶和10％DMSO)。反应通常包含150至320μM dATP、dCTP、dTTP、dGTP中的每一种或者其一种或多种类似物。

新合成的链形成可用于后续反应步骤的双链分子。可以根据需要经常重复链分离、退火和延伸的步骤，以产生所需量的对应于靶核酸分子的扩增产物。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定酶和核苷三磷酸的量。优选地重复至少一次循环步骤(即，变性、退火和延伸)。为了用于检测，循环步骤的次数将取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多循环步骤以扩增足以进行检测的靶序列。通常，循环步骤重复至少约20次，但可以重复多达40、60或甚至100次。

FRET技术(参见例如美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489和6，162,603)基于这样的概念：当供体荧光部分和对应的受体荧光部分位于彼此相距一定距离内时，两个荧光部分之间会发生能量转移，该能量转移可被可视化或以其他方式检测和/或定量。当供体被具有合适波长的光辐射激发时，供体通常将能量转移至受体。受体通常以具有不同的波长的光辐射的形式重新发射转移的能量。在某些系统中，非荧光能量可通过包括基本上非荧光供体部分的生物分子在供体与受体部分之间转移(参见例如美国专利号7,741,467)。

在一个示例中，寡核苷酸探针可含有供体荧光部分和对应的猝灭剂，该猝灭剂可以是或不是荧光的，并且以不同于光的形式耗散转移的能量。当探针完整时，能量转移通常发生在两种荧光部分之间，使得来自供体荧光部分的荧光发射被猝灭。在聚合酶链反应的延伸步骤期间，与扩增产物结合的探针被例如Taq聚合酶的5′至3′核酸酶活性裂解，使得供体荧光部分的荧光发射不再被猝灭。用于此目的的示例性探针在例如美国专利号5,210,015、5,994,056和6，171,785中描述。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的黑暗猝灭剂包括BlackHole Quenchers^TM(BHQ)(BiosearchTechnologies，Inc.，Novato，Cal.)、Iowa Black^TM(Integrated DNATech.，Inc.，Coralville，Iowa)、BlackBerry^TM Quencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.，Dexter，Mich.)。

在另一个实例中，两个寡核苷酸探针(各自包含荧光部分)可以在由寡核苷酸探针与沙眼衣原体靶核酸序列的互补性决定的特定位置与扩增产物杂交。在寡核苷酸探针在适当位置与扩增产物核酸杂交后，产生FRET信号。杂交温度可在约35℃至约65℃的范围内，持续约10秒至约1分钟。

荧光分析可以使用例如光子计数落射荧光显微镜系统(含有适当的二向色镜和用于监测特定范围的荧光发射的滤光片)、光子计数光电倍增管系统或荧光计来进行。可利用氩离子激光器、高强度汞(Hg)弧光灯、光纤光源或其他经适当过滤以在所需范围内激发的高强度光源来进行激发以启动能量转移或允许直接检测荧光团。

如本文关于供体和对应的受体荧光部分所用，“对应的”是指具有与供体荧光部分的发射光谱重叠的吸收光谱的受体荧光部分或黑暗猝灭剂。受体荧光部分的发射光谱的最大波长应比供体荧光部分的激发光谱的最大波长至少大100nm。因此，可以在它们之间产生有效的非辐射能量传递。

通常针对以下项选择荧光供体和对应的受体部分：(a)高效率的Forster能量转移；(b)较大的最终Stokes位移(>100nm)；(c)尽可能将发射偏移到可见光谱的红色部分(>600nm)；以及(d)将发射偏移到比在供体激发波长下激发所产生的Raman水荧光发射高的波长。例如，可选择以下供体荧光部分：其在激光线附近具有其激发最大值(例如，氦-镉442nm或氩488nm)，具有高消光系数、高量子产率，并且其荧光发射与对应的受体荧光部分的激发光谱良好重叠。可选择具有高消光系数、高量子产率、其激发与供体荧光部分的发射的良好重叠以及在可见光谱的红色部分(>600nm)中的发射的对应的受体荧光部分。

可在FRET技术中与各种受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素、荧光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、荧光黄VS、4-乙酰氨基-4′-异硫基-氰酸芪-2,2'--二磺酸、7--二-乙基氨基-3-(4′-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺1-芘丁酸酯和4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸芪-2,2′-二磺酸衍生物。代表性的受体荧光部分，取决于所用的供体荧光部分，包括LC Red 640、LC Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明x异硫氰酸酯、异硫氰酸赤藓红、荧光素、二亚乙基三胺五乙酸盐或其他镧系离子(例如，铕或铽)的螯合物。供体和受体荧光部分可以从例如MolecularProbes(Junction City，Oreg.)或Sigma Chemical Co.(St.Louis，Mo.)获得。

供体和受体荧光部分可以通过接头臂连接到合适的探针寡核苷酸上。每个接头臂的长度很重要，因为接头臂会影响供体和受体荧光部分之间的距离。接头臂的长度是以埃为单位的从核苷酸碱基到荧光部分的距离。通常，接头臂为约至约接头臂可以是WO 84/03285中所述的种类。WO 84/03285还公开用于将接头臂连接至特定核苷酸碱基，以及用于将荧光部分连接至接头臂的方法。

受体荧光部分(诸如LC Red 640)可与含有氨基接头的寡核苷酸(例如，可从ABI(Foster City，Calif.)或Glen Research(Sterling，VA)获得的C6-氨基亚磷酰胺)组合，以产生例如LC Red 640标记的寡核苷酸。经常使用的将供体荧光部分(诸如荧光素)偶联至寡核苷酸的接头包括硫脲接头(FITC-衍生的，例如来自Glen Research或ChemGene(Ashland，Mass.)的荧光素-CPG's)、酰胺接头(荧光素-NHS-酯衍生的，诸如来自BioGenex(SanRamon，Calif.)的CX-荧光素-CPG)、或需要在寡核苷酸合成后偶联荧光素-NHS-酯的3′-氨基-CPGs。

沙眼衣原体的L血清型的检测

本发明提供了用于检测在生物学样品或非生物学样品中存在或不存在沙眼衣原体的L血清型的方法。提供的方法避免了样品污染、假阴性和假阳性的问题。这些方法包括进行至少一个循环步骤和FRET检测步骤，该循环步骤包括使用至少一对引物从样品扩增来自L血清型靶核酸分子的pmpH基因的一部分。进行多个循环步骤，优选在热循环仪中进行。这些方法可以使用基因引物和探针来执行以检测来自L血清型的pmpH基因的存在，并且这表明在样品中存在一种或多种L血清型。

如本文所述，可以使用利用FRET技术的经标记杂交探针来检测扩增产物。一种FRET形式利用技术来检测扩增产物的存在或不存在，并且因此检测一种或多种L血清型的存在或不存在。技术利用一种单股杂交探针，该探针用例如一种荧光染料和一种猝灭剂标记，该猝灭剂可以是或可以不是荧光的。当第一荧光部分用合适波长的光激发时，吸收的能量根据FRET原理转移至第二荧光部分。第二荧光部分通常是猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤期间，标记的杂交探针与靶DNA(即，扩增产物)结合并在随后的延伸阶段期间被例如Taq聚合酶的5’至3’核酸酶活性降解。因此，荧光部分和猝灭剂部分变得彼此空间上分离。因此，在不存在猝灭剂的情况下激发第一荧光部分后，可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。举例来说，ABI7700Sequence Detection System(Applied Biosystems)使用技术，并且适用于执行本文所述的用于检测样品中L血清型的存在或不存在的方法。

也可以使用与FRET结合的分子信标来检测使用实时PCR方法的扩增产物的存在。分子信标技术使用被第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分通常是猝灭剂，且荧光标记一般位于探针的每个末端处。分子信标技术使用具有允许形成二级结构(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。作为在探针内的二级结构形成的结果，当探针在溶液中时，两个荧光部分空间接近。在与靶核酸(即扩增产物)杂交以后，探针的二级结构被破坏，并且荧光部分变得彼此分离，从而使得在用合适波长的光激发后，可以检测第一荧光部分的发射。

FRET技术的另一种常见形式是使用两个杂交探针。每个探针都可以用不同的荧光部分标记，并且通常设计为在靶标DNA分子(例如，扩增产物)中彼此非常接近地杂交。供体荧光部分，例如荧光素，在470nm处被仪器的光源激发。在FRET期间，荧光素将其能量转移到受体荧光部分，例如640(LC Red 640)或705(LC Red 705)。然后受体荧光部分发出更长波长的光，由仪器的光学检测系统检测。只有当荧光部分直接局部接近，并且当供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时，有效的FRET才发生。发射信号的强度可与原始靶DNA分子的数量相关。如果发生靶核酸的扩增并产生扩增产物，则杂交步骤产生基于探针对成员之间的FRET的可检测信号。

通常，存在FRET指示在样品中存在一种或多种L血清型，并且不存在FRET指示在样品中不存在L血清型。然而，样本采集不足、运输延迟、运输条件不当或使用某些采集拭子(海藻酸钙或铝轴)都是可能会影响测试结果的成功和/或准确性的条件。使用本文所公开的方法，在例如45个循环步骤内检测到FRET指示沙眼衣原体的L血清型的感染。

可用于实践这些方法的代表性生物学样品包括但不限于血液、血浆、血清、肝脏样品、皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤和软组织感染物。生物学样品的收集和储存方法是本领域技术人员已知的。可以对生物学样品进行加工(例如，通过本领域中已知的核酸提取方法和/或试剂盒)以释放核酸，或者在一些情况下，可以使生物学样品直接与PCR反应组分和合适的寡核苷酸接触。

解链曲线分析是可包含在循环曲线中的附加步骤。解链曲线分析基于DNA在称为解链温度(Tm)的特征温度下解链的事实，该解链温度被定义为一半DNA双链体分离成单链时的温度。DNA的解链温度主要取决于其核苷酸组成。因此，富含G和C核苷酸的DNA分子比具有丰富的A和T核苷酸的DNA分子具有更高的Tm。通过检测信号丢失的温度，可以确定探针的解链温度。类似地，通过检测产生信号的温度，可以确定探针的退火温度。来自相应的扩增产物的探针的解链温度可以确认样品中靶核酸的存在或不存在。

在每个热循环仪运行中，也可以循环对照样品。阳性对照样品可以使用例如对照引物和对照探针扩增靶核酸对照模板(不同于所述靶标基因的扩增产物)。阳性对照样品也可以扩增，例如，含有靶核酸分子的质粒构建体。这种质粒对照可在内部扩增(例如，在样品内)或在与患者样品并行的单独样品运行中使用与用于检测预期靶标相同的引物和探针扩增。此类对照是扩增、杂交和/或FRET反应成功或失败的指标。每个热循环仪运行还可以包括一个阴性对照，例如，缺少靶标模板DNA。阴性对照可以测量污染。这确保系统和试剂不会产生假阳性信号。因此，对照反应可以很容易地确定，例如，引物以序列特异性退火和启动延伸的能力，以及探针以序列特异性杂交和发生FRET的能力。

在一个实施例中，该方法包括避免污染的步骤。例如，在美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述了利用尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶促方法，以减少或消除一个热循环仪运行与下一个之间的污染。

可以使用结合FRET技术的常规PCR方法来实践这些方法。在一个实施例中，使用仪器。以下专利申请描述了如技术中使用的实时PCR：WO97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。

可以使用PC工作站进行操作，并且可以使用Windows NT操作系统。当机器将毛细管按顺序放置在光学单元上时，可以获得来自样品的信号。软件可以在每次测量后立即实时显示荧光信号。荧光采集时间为10-100毫秒(msec)。在每个循环步骤之后，荧光与循环次数的定量显示可以针对所有样品不断更新。生成的数据可以存储以供进一步分析。

作为FRET的替代，使用双股DNA结合染料诸如荧光DNA结合染料(例如，Green或Gold(Molecular Probes))，可以检测扩增产物。在与双股核酸相互作用时，这样的荧光DNA结合染料在用合适波长的光激发后发射荧光信号。还可以使用双股DNA结合染料(诸如核酸)嵌入染料。当使用双股DNA结合染料时，通常进行解链曲线分析用于证实扩增产物的存在。

应当理解，本公开的实施例不受一种或多种市售仪器的配置的限制。

制品/试剂盒

本公开的实施例进一步提供了用于检测L血清型的制品或试剂盒。制品可以包括用于检测L血清型的引物和探针，以及合适的包装材料。用于检测L血清型的pmpH基因的代表性引物和探针能够与靶核酸分子杂交。此外，试剂盒还可包括适当包装的DNA固定、杂交和检测所需的试剂和材料，诸如固体支持物、缓冲剂、酶和DNA标准品。本文公开了设计引物和探针的方法，并且提供了扩增靶核酸分子并与之杂交的引物和探针的代表性实例。

制品还可以包括一种或多种用于标记探针的荧光部分，或者可替代地，可以标记随试剂盒提供的探针。例如，制品可以包括用于标记靶基因探针的供体和/或受体荧光部分。上文提供了合适的FRET供体荧光部分和对应的受体荧光部分的实例。

制品还可以包含包装插页或包装标签，其上具有使用针对来自L血清型的pmpH基因的引物和探针来检测样品中L血清型的说明。制品可以另外包括用于实施本文公开的方法的试剂(例如，缓冲剂、聚合酶、辅因子、或防止污染的药剂)。此类试剂可以专用于本文所述的市售仪器之一。

本公开的实施例将进一步在以下实例中描述，这些实例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

值得注意的是，根据本公开的方法的实施例可以包括一个或多个附加步骤或者省略该方法的一个或多个所描述的步骤。一般而言，可以以任何合适的方式修改该方法，该方式仍然能够实现选择性地和特异性地检测样品中沙眼衣原体的一种或多种L血清型的结果。落入本公开的范围内的方法的其他变型将从本文所包括的附加实例和描述中变得明显。

实例

以下实例旨在说明性的并且不旨在以任何方式进行限制。

实例1：

本实例描述了用于pmpH基因靶标的RT-PCR检测的PCR实验条件。使用6800/8800系统(Roche Molecular Systems，Inc.，Pleasanton，CA)通过RT-PCR检测pmpH基因靶标。用于PCR扩增反应的扩增试剂的终浓度和热概况在表2中示出：

表2：PCR试剂和热概况Mg试剂(R1)

主混合物(R2)-通用

PCR热循环参数

如表2所示，Test Conc＝测试浓度；rxn＝反应；Temp＝温度；mm＝分钟；ss＝秒；sec＝秒。

制备型PCR程序包括初始变性以及在55℃、60℃和65℃下温育，用于对RNA模板进行逆转录。在三种温度下温育同时具有以下有利效果：在较低温度下，轻微错配的靶序列(诸如生物体的遗传变体)也被转录，而在较高温度下，RNA二级结构的形成受到抑制，从而使转录更有效。将PCR循环分成两次测量，其中两次测量应用一步设置(结合退火和延伸)。55℃下的前5个循环允许通过预扩增轻微错配的靶序列来增加包容性，而第二次测量的45个循环通过使用58℃的退火/延伸温度提供了增加的特异性。

实例2：

使用一组引物和探针检测沙眼衣原体的L血清型的PCR测定的结果在表3中示出。主混合物(MMx)1使用SEQ ID NO：1的正向引物、SEQ ID NO：3的反向引物和SEQ ID NO：5的探针。MMx 2使用SEQ ID NO：2的正向引物、SEQ ID NO：4的反向引物和SEQ ID NO：5的探针。MMx 3使用SEQ ID NO：7的正向引物、SEQ ID NO：9的反向引物和SEQ ID NO：11的探针。携带血清型L1、L2和L3或血清型A、B和C、血清型D、E、F、G、H和I以及血清型J和K的共有核酸序列的模板质粒在1.00E+01拷贝/反应至1.00E+07拷贝/反应的浓度下进行测试。初步测试表明，这些引物/探针配对在L血清型(即，血清型L1、L2和L3)的敏感性和特异性方面产生了良好的结果。

表3：PCR测定结果

参考表3，NaN＝非数字；Conc＝浓度；Avg＝平均值；cp/rxn＝拷贝数/反应；Ct＝循环阈值；RFI＝相对荧光强度。

在下面参考附图的描述中以若干个不同的实施例呈现本发明，其中相同的标号表示相同或相似的元件。在整个本说明书中提及“一个实施例”、“实施例”及类似语言意指结合该实施例描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施例中。因此，在整个本说明书中出现的短语“在一个实施例中”、“在实施例中”及类似语言可以但不一定都是指同一个实施例。

在一个或多个实施例中，本发明的所描述的特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合。在下面的描述中，列举了许多具体细节以提供对系统的实施例的透彻理解。然而，相关领域的技术人员将认识到，该系统和方法都可以在没有一个或多个具体细节的情况下或者利用其他方法、部件、材料等来实践。在其他情况下，未详细示出或描述熟知的结构、材料或操作，以避免模糊本发明的方面。因此，前述描述旨在是示例性的，并且不限制本发明概念的范围。

在本申请中确定的每篇参考文献通过援引以其全文并入本文。

Claims

1.一种用于检测样品中引起性病淋巴肉芽肿的沙眼衣原体(Chlamydia

trachomatis)血清变型(L血清变型)的方法，所述方法包括：

(a)执行扩增步骤，所述扩增步骤包括使所述样品与被设计为靶向所述L血清变型的多态性膜蛋白H(pmpH)基因的至少一组引物接触，以在所述样品中存在所述L血清变型的情况下产生扩增产物；

(b)执行杂交步骤，所述杂交步骤包括使在所述样品中存在所述L血清变型的情况下的所述扩增产物与靶向所述L血清变型的所述pmpH基因的至少一种可检测探针接触；以及

(c)执行检测步骤，所述检测步骤包括检测存在或不存在所述扩增产物，其中存在所述扩增产物指示所述样品中存在所述L血清变型，并且其中不存在所述扩增产物指示所述样品中不存在所述L血清变型，

其中所述至少一组引物和所述至少一种可检测探针包括：

正向引物，其包含选自由以下项组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:1、2、6和7，或其组合；

反向引物，其包含选自由以下项组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:3、4、8和9，或其组合；和

探针，其包含选自由以下项组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:

5、10和11，或其互补序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述杂交步骤包括使所述扩增产物与所述可检测探针接触，所述可检测探针用供体荧光部分和对应的受体部分进行标记；并且所述检测步骤包括检测存在或不存在所述探针的所述供体荧光部分与所述受体部分之间的荧光共振能量转移(FRET)，其中存在或不存在荧光指示所述样品中存在或不存在所述L血清变型。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述扩增步骤采用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述样品为生物学样品。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述生物学样品为阴道拭子样本、临床医生收集的阴道拭子样本、宫颈内拭子样本、口咽(咽喉)拭子样本或肛门直肠拭子样本。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述正向引物包含选自由以下项组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:1和2，或其组合；所述反向引物包含选自由以下项组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:3和4，或其组合；并且所述探针包含SEQ ID NO:5或其互补序列的核酸序列。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述正向引物包含选自由以下项组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:6和7，或其组合；所述反向引物包含选自由以下项组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:8和9，或其组合；并且所述探针包含选自由以下项组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:10和11，或其互补序列。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述正向引物包含SEQ ID NO:7的核酸序列；所述反向引物包含SEQ ID NO:9的核酸序列；并且所述探针包含SEQ ID NO:11或其互补序列的核酸序列。

9.一种用于检测样品中引起性病淋巴肉芽肿的沙眼衣原体血清变型(L血清变型)的方法，所述方法包括：

(a)执行扩增步骤，所述扩增步骤包括使所述样品与被设计为靶向所述L血清变型的多态性膜蛋白H(pmpH)基因的3'端的至少一组引物接触，以在所述样品中存在所述L血清变型的情况下产生扩增产物；

其中所述至少一组引物被设计为靶向包含所述L血清变型的所述pmpH基因的3'端的最后1000个核苷酸的至少一部分的区。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一组引物被设计为靶向包含所述L血清变型的所述pmpH基因的3'端的最后500个核苷酸的至少一部分的区。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述至少一组引物被设计为靶向包含L1血清变型的所述pmpH基因的核苷酸2600至2900的至少一部分的区或不同L血清变型的对应区；或者

其中所述至少一组引物被设计为靶向由L1血清变型的所述pmpH基因的核苷酸2600至2800的至少一部分组成的区或不同L血清变型的对应区。

12.一种用于检测样品中引起性病淋巴肉芽肿的沙眼衣原体血清变型(L血清变型)的pmpH基因的试剂盒，所述试剂盒包括扩增试剂，所述扩增试剂包括：

(a)具有5'至3'核酸酶活性的DNA聚合酶；

(b)核苷酸单体；

(c)至少一对引物和至少一种可检测探针，所述至少一对引物和所述至少一种可检测探针包括：

i.正向引物，其包含选自由以下项组成的组的核酸序列：

SEQ ID NO:1、2、6和7，或其任意组合；

ii.反向引物，其包含选自由以下项组成的组的核酸序列：

SEQ ID NO:3、4、8和9，或其组合；和

iii.可检测探针，其包含选自由以下项组成的组的核酸序列：

SEQ ID NO:5、10和11，或其互补序列。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述可检测探针用供体荧光部分和对应的受体部分进行标记。

14.根据权利要求12至13中任一项所述的试剂盒，其中所述正向引物包含选自由以下项组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:1和2，或其组合；所述反向引物包含选自由以下项组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:3和4，或其组合；并且所述探针包含SEQ ID NO:5或其互补序列的核酸序列。

15.根据权利要求12至13中任一项所述的试剂盒，其中所述正向引物包含选自由以下项组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:6和7，或其组合；所述反向引物包含选自由以下项组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:8和9，或其组合；并且所述探针包含选自由以下项组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:10和11，或其互补序列。

16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述正向引物包含SEQ ID NO:7的核酸序列；所述反向引物包含SEQ ID NO:9的核酸序列；

并且所述探针包含SEQ ID NO:11或其互补序列的核酸序列。

17.一种寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO:1至11或其互补序列的核苷酸序列或者由其组成。