CN1194091C

CN1194091C - 棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA及其克隆方法与重组应用

Info

Publication number: CN1194091C
Application number: CNB021357684A
Authority: CN
Inventors: 赵小凡; 王金星
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2002-11-08
Filing date: 2002-11-08
Publication date: 2005-03-23
Anticipated expiration: 2022-11-08
Also published as: CN1448398A

Abstract

棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA及其克隆方法与重组应用，属于生物基因工程技术领域。棉铃虫蜕皮调节转录因子具有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO.2所示的序列。本发明的克隆方法是，从棉铃虫中提取总RNA或mRNA，反转录合成cDNA；根据蜕皮调节转录因子的保守序列设计引物，通过链式聚合酶反应扩增到一个DNA片段；将扩增产物纯化，取纯化产物克隆到pGEM-T Easy载体，转化DH5α细胞，平板过夜培养。本发明棉铃虫蜕皮调节转录因子，通过基因重组技术在昆虫核型多角体病毒中进行表达，获得有杀虫活性的基因重组病毒，用于害虫防治；或者通过基因工程方法将棉铃虫蜕皮调节转录因子专入作物，获得具有抗虫能力的作物。

Description

棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA及其克隆方法与重组应用

(一)技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域中的克隆、表达技术，具体涉及棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA及克隆、表达技术。

(二)背景技术

自有机合成农药在40年代问世以来，在保证农业丰收方面起了巨大作用，但它对人类的危害也日趋明显，对环境造成严重污染、危害人类健康已成为不争的事实，因使用农药而中毒的事件时有发生。大量使用广普性杀虫剂使害虫天敌及有益生物也一同被消灭，打破了自然界的生态平衡，引起新的害虫猖獗。大量使用有机合成农药还使害虫产生抗药性，形成无药可治的害虫，目前合成新药剂的速度往往赶不上害虫产生抗性的速度。化学农药带来的种种问题已引起全世界注意，减少和合理使用化学农药、从耕作制度、作物栽培及生物防治等人手，对害虫实行综合防治势在必行，利用分子生物学和基因工程技术控制害虫是当今生物学领域的研究热点和前沿。本发明旨在克隆棉铃虫蜕皮过程中关键因子-蜕皮调节转录因子基因，将该基因重组到目前已经在田间害虫防治中使用的核型多角体病毒，构建基因重组核型多角体病毒，通过对人及环境安全的昆虫核型多角体病毒载体使棉铃虫蜕皮调节转录因子在害虫体内表达，干扰害虫的正常生长和发育，导致害虫非正常蜕皮而死亡，从而达到控制害虫的目的，减少害虫防治中对化学农药的依赖，保护人类生存环境和人类健康。

昆虫幼虫要经过多次蜕皮才能变为成虫，蜕皮过程是由体内的蜕皮激素引起的，在昆虫生长发育过程中，蜕皮激素(Ecdysteroid)的滴度呈现出周期性的变化，在蜕皮激素滴度升高时，昆虫停止取食，行动迟缓，最后蜕皮，在体内则引发一系列级联反应，蜕皮激素与蜕皮激素结合蛋白(Ecdysteroid receptor，EcR)及ultraspiracle(USP)结合成为三聚体，然后结合在DNA上，诱导产生蜕皮调节转录因子(molt regulatingtranscription factor，又称为激素结合子，Hormone Receptor，HR3)。蜕皮调节转录因子(HR3)有多种功能，它结合于DNA，启动蜕皮早期必需的蛋白酶和几丁质酶表达，使旧表皮中的蛋白质和几丁质被分解吸收，同时阻遏幼虫表皮蛋白表达，并结合蜕皮激素使蜕皮激素水平下降，随着蜕皮激素水平下降，不再产生蜕皮调节转录因子，表皮蛋白得以表达，形成新的表皮，同时，在蜕皮激素下降后，蜕壳激素(EclosionHormone)释放，使旧表皮脱落，多巴脱羧酶也在蜕皮激素下降后出现，合成表皮硬化必需的前体物一多巴胺，使表皮完成鞣化和硬化。如果人为使虫体内持续产生蜕皮调节转录因子，它可结合于DNA，启动蜕皮早期反应，同时它的持续存在又抑制表皮蛋白表达，使新表皮不能产生，蜕皮晚期基因不能表达，从而导致虫体死亡。

国外已对烟草天蛾、枞色卷蛾、蜡螟、果蝇的蜕皮调节转录因子进行了分子克隆和作用机理研究，基因库(GenBank)检索结果证明目前尚无棉铃虫蜕皮调节转录因子的研究报道。昆虫核多角体病毒具有种属特异性，不感染人及其它脊椎动物，国内外均已经用做生物杀虫剂并在大田应用，但野生型核型多角体病毒杀虫速度较慢，在自然界使用达不到理想的防虫效果。通过基因工程方法，将棉铃虫蜕皮调节转录因子基因转入核型多角体病毒，可以使害虫提前进入蜕皮，从而增加核型多角体病毒的杀虫速度。通过基因工程方法，将棉铃虫蜕皮调节转录因子基因转入作物体内，可以引起取食的害虫进入非正常的提前蜕皮导致死亡，达到控制害虫的目的。由于棉铃虫属于鳞翅目夜蛾科，因此该项发明对其它鳞翅目害虫、特别是夜蛾科害虫的防治具有参考意义。

(三)发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种从棉铃虫提取的棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA，并提供棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法以及重组技术。

本发明从棉铃虫中克隆到棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA，它具有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO.2所示的序列：

(1)SEQ ID NO 1的信息

(a)序列特征：

*长度：1668碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：棉铃虫(Helicoverpa armigera)

(f)序列描述：SEQ ID NO.1

atgaacaaca accagttcca cgatttattt gggtcccagt ggcctccgga ccagcacgga 60

ggtcactcgt cggcatcgac gatgctgcac cagtcccagg gcctgcccca gggtatgcag 120

ctgaagagag aacctcatac ggatgtgcag ccggtgatgc acaaccagat gggcacggac 180

atcacgtcag ggtccgtggc ggacagcaca tcccccccgc ctggcagcag tgacgggatg 240

ttcggctcgt ctatatctgg catgtttatg gataagaaag ccgctaattc tataagagct 300

caaatcgaaa taataccatg caaggtgtgt ggggataaat catctggagt ccactatggc 360

gtcatcacct gcgaggggtg caagggtttc ttcaggcgat cacagagtac agtggtgaac 420

taccagtgtc cacggaataa agcctgcgtg gtcgaccggg tcaacagaaa tcgttgtcag 480

tattgcagat tgcagaaatg cctcaaactt ggaatgagcc gtgatgcggt gaagtttgga 540

cggatgtcga aaaagcaacg tgagaaggtg gaagatgagg tgagattcca tcgcgcacag 600

atgagagctc agactgacac ggcgcccgac tcagtatacg acgctcaaca acaaacgccg 660

agctcaagcg accagttcca tggtcactac aatggctacc cgggctacgg gtcgccgttg 720

tcctcatatg ggtacaacaa cgcagggccg gcgctacagt ccaacatggg aggcatacag 780

cctcaagcac ctcaacagca gccctatgac gtgtcggctg attacgtgga ctccaccacg 840

gcttacgagc cgaaacagac cgagggattc ttggatcctg attttattag tcatgcggag 900

ggtgacatca gcaaagtcct ggtgaagagt ttggcagaag cacacgcaaa taccaacccc 960

aaactggagt tcattcatga gatgttcaga aagccacagg atgtctccaa gcttctatac 1020

tatagttcaa tgacgtacga ggaaatgtgg ctggattgtg cagacaaatt aactgggatg 1080

attcagaata ttatcgagtt cgctaaactt atacccgggt tcatgaaact gactcaggat 1140

gatcagattt tgctcttgaa atctggctcg ttcgagctcg ccatagtccg gctgtcgcga 1200

ctgatagacg tcaaccgtga ccaagtgcta tacggtgatg cggtgctgtc catcagagaa 1260

tgtgtgcatg cacgtgaccc ccgcgacgtg gcgctggtgg ttggtatctt cgacgcggca 1320

aagacgatcg ctcgactcaa actcactgag actgaactgg cgctatacca gagccttgtg 1380

ctattgtggc cagagcggca cggcgtccgc ggcaaccctg agatccagtg cctgttcaac 1440

atgtcgatgg cggcgatgcg gcacgagatc gagaccaacc acgcccccct caagggagac 1500

gtcactgttc tggacacgct gctcgccaag atacccacct tcagagaact atcactgatg 1560

cacctggaag ctttgtgccg cttcaaggcc gcccaccccc accacgtatt cccggccctc 1620

tacaaggagc tgttctcact cgacagcgtc ctggactaca cccacggt 1668

(2)SEQ ID NO.2的信息

(a)序列特征

*长度：556氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述

Met Asn Asn Asn Gln Phe His Asp Leu Phe Gly Ser Gln Trp Pro

l 5 10 15

Pro Asp Gln His Gly Gly His Ser Ser Ala Ser Thr Met Leu His

16 20 25 30

Gln Ser Gln Gly Leu Pro Gln Gly Met Gln Leu Lys Arg Glu Pro

31 35 40 45

His Thr Asp Val Gln Pro Val Met His Asn Gln Met Gly Thr Asp

46 50 55 60

Ile Thr Ser Gly Ser Val Ala Asp Ser Thr Ser Pro Pro Pro Gly

61 65 70 75

Ser Ser Asp Gly Met Phe Gly Ser Ser Ile Ser Gly Met Phe Met

76 80 85 90

Asp Lys Lys Ala Ala Asn Ser Ile Arg Ala Gln Ile Glu Ile Ile

91 95 100 105

Pro Cys Lys Val Cys Gly Asp Lys Ser Ser Gly Val His Tyr Gly

106 110 115 120

Val Ile Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Gln

121 125 130 135

Ser Thr Val Val Asn Tyr Gln Cys Pro Arg Asn Lys Ala Cys Val

136 140 145 150

Val Asp Arg Val Asn Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Leu Gln

151 155 160 165

Lys Cys Leu Lys Leu Gly Met Ser Arg Asp Ala Val Lys Phe Gly

166 170 175 180

Arg Met Ser Lys Lys Gln Arg Glu Lys Val Glu Asp Glu Val Arg

181 185 190 195

Phe His Arg Ala Gln Met Arg Ala Gln Thr Asp Thr Ala Pro Asp

196 200 205 210

Ser Val Tyr Asp Ala Gln Gln Gln Thr Pro Ser Ser Ser Asp Gln

211 215 220 225

Phe His Gly His Tyr Asn Gly Tyr Pro Gly Tyr Gly Ser Pro Leu

226 230 235 240

Ser Ser Tyr Gly Tyr Asn Asn Ala Gly Pro Ala Leu Gln Ser Asn

241 245 250 255

Met Gly Gly Ile Gln Pro Gln Ala Pro Gln Gln Gln Pro Tyr Asp

256 260 265 270

Val Ser Ala Asp Tyr Val Asp Ser Thr Thr Ala Tyr Glu Pro Lys

271 275 280 285

Gln Thr Glu Gly Phe Leu Asp Pro Asp Phe Ile Ser His Ala Glu

286 290 295 300

Gly Asp Ile Ser Lys Val Leu Val Lys Ser Leu Ala Glu Ala His

301 305 310 315

Ala Asn Thr Asn Pro Lys Leu Glu Phe Ile His Glu Met Phe Arg

316 320 325 330

Lys Pro Gln Asp Val Ser Lys Leu Leu Tyr Tyr Ser Ser Met Thr

331 335 340 345

Tyr Glu Glu Met Trp Leu Asp Cys Ala Asp Lys Leu Thr Gly Met

346 350 355 360

Ile Gln Asn Ile Ile Glu Phe Ala Lys Leu Ile Pro Gly Phe Met

361 365 370 375

Lys Leu Thr Gln Asp Asp Gln Ile Leu Leu Leu Lys Ser Gly Ser

376 380 385 390

Phe Glu Leu Ala Ile Val Arg Leu Ser Arg Leu Ile Asp Val Asn

391 395 400 405

Arg Asp Gln Val Leu Tyr Gly Asp Ala Val Leu Ser Ile Arg Glu

406 410 415 420

Cys Val His Ala Arg Asp Pro Arg Asp Val Ala Leu Val Val Gly

421 425 430 435

Ile Phe Asp Ala Ala Lys Thr Ile Ala Arg Leu Lys Leu Thr Glu

436 440 445 450

Thr Glu Leu Ala Leu Tyr Gln Ser Leu Val Leu Leu Trp Pro Glu

451 455 460 465

Arg His Gly Val Arg Gly Asn Pro Glu Ile Gln Cys Leu Phe Asn

466 470 475 480

Met Ser Met Ala Ala Met Arg His Glu Ile Glu Thr Asn His Ala

481 485 490 495

Pro Leu Lys Gly Asp Val Thr Val Leu Asp Thr Leu Leu Ala Lys

496 500 505 510

Ile Pro Thr Phe Arg Glu Leu Ser Leu Met His Leu Glu Ala Leu

511 515 520 525

Cys Arg Phe Lys Ala Ala His Pro His His Val Phe Pro Ala Leu

526 530 535 540

Tyr Lys Glu Leu Phe Ser Leu Asp Ser Val Leu Asp Tyr Thr His

541 545 550 555

Gly

556

本发明的棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法如下：

(1)从棉铃虫提取总RNA或mRNA，然后反转录合成cDNA；

(2)根据蜕皮调节转录因子的保守序列设计引物：

正向引物：5’-ATGAACAACAACCAGTTCCAC-3’

反向引物：5’-GTCCTGGACTACACCCACGGT-3’

(3)通过链式聚合酶反应扩增到一个DNA片段；

(4)将扩增产物纯化，取纯化产物克隆到pGEM-T Easy载体，转化DH5α细胞，平板过夜培养。

上述棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法具体操作如下：

从田间采集或人工饲养的棉铃虫中，采用一步法或RNA kit提取总RNA，或者用mRNAkit分离提取mRNA。

然后利用5～10微克总RNA或mRNA反转录合成cDNA。cDNA第一链合成：5～10微克总RNA或mRNA，加反应液20微升，反应液是50毫摩尔氯化钾和3毫摩尔氯化镁混合液，10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)pH8.3，1毫摩尔二硫苏糖醇(DTT)，5微摩尔寡聚脱氧胸腺核苷酸(Oligod(T)₁₇)，500微摩尔脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP)，25单位RNA酶抑制剂，8单位AMV逆转录酶)42℃反应90分钟。70℃10分钟终止反应。

链式聚合酶反应(PCR)试剂与条件如下：首先将下列试剂混在一起：

10xTaq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)

模板cDNA 1μl

正向引物(1.25μg/μl) 1μl

反向引物(1.25μg/μl) 1μl

脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl

Taq DNA聚合酶 0.25μl

灭菌水 37.75μl

总体积 50μl

链式聚合酶(PCR)反应条件为：首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环：94℃30秒，53℃45秒，72℃45秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。

结果扩增到一个DNA片段。将扩增产物纯化，取3μl纯化产物克隆到pGEM-T Easy载体(Promega公司产品)，转化DH5α细胞(常用载体宿主细胞)，平板过夜培养。挑取3个白斑，提取质粒，用于序列测定。

测序得到一个开放阅读框部分，1668bp，由此推得具556个氨基酸的一段序列，将此序列放入国际基因库中检索，与已发表的埃及伊蚊、家蚕、果蝇等动物的蜕皮调节转录因子的序列比较，结果显示一致性为70％左右，因此可以确定该基因为一种新的蜕皮调节转录因子。

上述棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA的重组应用，通过基因重组技术在昆虫核型多角体病毒中进行表达，获得有杀虫活性的基因重组病毒，用于害虫防治；或者通过基因工程方法将棉铃虫蜕皮调节转录因子转入作物，获得具有抗虫能力的作物。

根据棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA序列，设计表达引物，通过基因重组技术将该蜕皮调节转录因子重组到昆虫核型多角体病毒，产生有杀虫活性的蜕皮调节转录因子基因重组核型多角体病毒，获得具有生产价值的基因重组病毒杀虫剂；或者通过基因工程方法将棉铃虫蜕皮调节转录因子重组到作物，增加作物抗虫性，获得具有抗虫能力的作物，利于害虫的防治。

本发明克隆到棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA，通过在昆虫核型多角体病毒中进行表达，可获得有杀虫活性的基因重组病毒，用于害虫防治；通过基因工程方法将棉铃虫蜕皮调节转录因子转入作物，可获得具有抗虫能力的作物。

(四)具体实施方式

实施例1：棉铃虫(Helicoverpa armigera)，田间采集。

1.总RNA的提取：采用现有技术一步法提取总RNA。

2.cDNA第一链合成：6微克总RNA，加反应液20微升，反应液是50毫摩尔氯化钾和3毫摩尔氯化镁混合液，10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)pH8.3，1毫摩尔二硫苏糖醇(DTT)，5微摩尔寡聚脱氧胸腺核苷酸(Oligod(T)17)，500微摩尔脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP)，25单位RNA酶抑制剂，8单位AMV逆转录酶)42℃反应90分钟。70℃10分钟终止反应。

3.PCR反应：链式聚合酶反应(PCR)试剂与条件：

首先将下列试剂混在一起：

●10xTaq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)

●模板cDNA 1μl

●正向引物(1.25μg/μl) 1μl

●反向引物(1.25μg/μl) 1μl

●脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl

●Taq DNA聚合酶 0.25μl

●灭菌水 37.75μl

●总体积 50μl

正向引物：5’-ATGAACAACAACCAGTTCCAC-3’

反向引物：5’-GTCCTGGACTACACCCACGGT-3’

PCR反应条件为：首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环：9-4℃ 30秒，53℃45秒，72℃45秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。

4.反应产物纯化：利用德国奎因(QIAGEN)公司产品QIAquick Gel Extraction Kit，操作步骤按产品说明书进行。

5.棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA克隆：取纯化产物3微升，连接于pGEM-T Easy载体(Promega公司产品)。转化到大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄青霉素(100微克/毫升)、5-溴-4-氯-3-引哚-β-D-半乳糖苷(X-gal 0.2微克/毫升)和异丙基硫代半乳糖苷(IPTG0.1摩尔/毫升)的平板生长过夜，挑取3个白斑，在LB液体培养基(5毫升，含100微克/毫升安苄青霉素)中培养过夜。

6.质粒纯化：收取过夜培养菌液2毫升，离心(10000转，1分钟)收集细胞。用微量DNA纯化试剂盒(Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System，美国普洛麦Promega公司)纯化质粒，纯化步骤按说明书进行。

7.序列测定与同源检索：取纯化质粒4微升，用载体引物T7进行全自动测序(本工作在上海生工公司完成)。将所得序列与基因库序列比较。

所得基因具有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO.2所示的序列。

实施例2：

如实施例1所述，所不同的是棉铃虫是人工饲养的，采用RNA kit提取总RNA。然后用8微克总RNA进行cDNA第一链合成。

实施例3：

如实施例1所述，所不同的是用mRNA kit分离提取mRNA。然后用10微克mRNA进行cDNA第一链合成。质粒纯化中收取过夜培养菌液1毫升进行质粒纯化。

实施例4：

将实施例1获得的棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA通过现有技术基因工程方法，转入昆虫核型多角体病毒中，在昆虫细胞或昆虫体内表达，生产具有杀虫功能的基因重组病毒

实施例5：

将实施例2获得的棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA通过现有技术基因工程方法，转入植物体内，如棉花，增加其抗虫性，在大田中应用。

按照本发明的方法可以通过现有基因工程技术，修饰棉铃虫蜕皮调节转录因子基因并用于所述研究和生产。

HHR3-序列表

序列表

<110>山东大学

<120>棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA及其克隆方法与重组应用

<140>

<141>

<160>2

<170>Patent In3.1

<210>1

<211>1668

<212>cDNA

<213>棉铃虫(Helicoverpa armigera)

<400>1

atgaacaaca accagttcca cgatttattt gggtcccagt ggcctccgga ccagcacgga 60

ggtcactcgt cggcatcgac gatgctgcac cagtcccagg gcctgcccca gggtatgcag 120

ctgaagagag aacctcatac ggatgtgcag ccggtgatgc acaaccagat gggcacggac 180

atcacgtcag ggtccgtggc ggacagcaca tcccccccgc ctggcagcag tgacgggatg 240

ttcggctcgt ctatatctgg catgtttatg gataagaaag ccgctaattc tataagagct 300

caaatcgaaa taataccatg caaggtgtgt ggggataaat catctggagt ccactatggc 36O

gtcatcacct gcgaggggtg caagggtttc ttcaggcgat cacagagtac agtggtgaac 420

taccagtgtc cacggaataa agcctgcgtg gtcgaccggg tcaacagaaa tcgttgtcag 480

tattgcagat tgcagaaatg cctcaaactt ggaatgagcc gtgatgcggt gaagtttgga 540

cggatgtcga aaaagcaacg tgagaaggtg gaagatgagg tgagattcca tcgcgcacag 600

atgagagctc agactgacac ggcgcccgac tcagtatacg acgctcaaca acaaacgccg 660

agctcaagcg accagttcca tggtcactac aatggctacc cgggctacgg gtcgccgttg 720

tcctcatatg ggtacaacaa cgcagggccg gcgctacagt ccaacatggg aggcatacag 780

cctcaagcac ctcaacagca gccctatgac gtgtcggctg attacgtgga ctccaccacg 840

gcttacgagc cgaaacagac cgagggattc ttggatcctg attttattag tcatgcggag 900

ggtgacatca gcaaagtcct ggtgaagagt ttggcagaag cacacgcaaa taccaacccc 960

aaactggagt tcattcatga gatgttcaga aagccacagg atgtctccaa gcttctatac 1020

tatagttcaa tgacgtacga ggaaatgtgg ctggattgtg cagacaaatt aactgggatg 1080

attcagaata ttatcgagtt cgctaaactt atacccgggt tcatgaaact gactcaggat 1140

gatcagattt tgctcttgaa atctggctcg ttcgagctcg ccatagtccg gctgtcgcga 1200

ctgatagacg tcaaccgtga ccaagtgcta tacggtgatg cggtgctgtc catcagagaa 1260

tgtgtgcatg cacgtgaccc ccgcgacgtg gcgctggtgg ttggtatctt cgacgcggca 1320

aagacgatcg ctcgactcaa actcactgag actgaactgg cgctatacca gagccttgtg 1380

ctattgtggc cagagcggca cggcgtccgc ggcaaccctg agatccagtg cctgttcaac 1440

atgtcgatgg cggcgatgcg gcacgagatc gagaccaacc acgcccccct caagggagac 1500

gtcactgttc tggacacgct gctcgccaag atacccacct tcagagaact atcactgatg 1560

cacctggaag ctttgtgccg cttcaaggcc gcccaccccc accacgtatt cccggccctc 1620

tacaaggagc tgttctcact cgacagcgtc ctggactaca cccacggt 1668

<210>2

<211>556

<212>PRT

<213>棉铃虫(Helicoverpa armigera)

HER3-序列表

<400>2

Met Asn Asn Asn Gln Phe His Asp Leu Phe Gly Ser Gln Trp Pro

1 5 10 15

Pro Asp Gln His Gly Gly His Ser Ser Ala Ser Thr Met Leu His

20 25 30

Gln Ser Gln Gly Leu Pro Gln Gly Met Gln Leu Lys Arg Glu Pro

35 40 45

His Thr Asp Val Gln Pro Val Met His Asn Gln Met Gly Thr Asp

50 55 60

Ile Thr Ser Gly Ser Val Ala Asp Ser Thr Ser Pro Pro Pro Gly

65 70 75

Ser Ser Asp Gly Met Phe Gly Ser Ser Ile Ser Gly Met Phe Met

80 85 90

Asp Lys Lys Ala Ala Asn Ser Ile Arg Ala Gln Ile Glu Ile Ile

95 100 105

Pro Cys Lys Val Cys Gly Asp Lys Ser Ser Gly Val His Tyr Gly

110 115 120

Val Ile Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Gln

125 130 135

Ser Thr Val Val Asn Tyr Gln Cys Pro Arg Asn Lys Ala Cys Val

140 145 150

Val Asp Arg Val Asn Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Leu Gln

155 160 165

Lys Cys Leu Lys Leu Gly Met Ser Arg Asp Ala Val Lys Phe Gly

170 175 180

Arg Met Ser Lys Lys Gln Arg Glu Lys Val Glu Asp Glu Val Arg

185 190 195

Phe His Arg Ala Gln Met Arg Ala Gln Thr Asp Thr Ala Pro Asp

200 205 210

Ser Val Tyr Asp Ala Gln Gln Gln Thr Pro Ser Ser Ser Asp Gln

215 220 225

Phe His Gly His Tyr Asn Gly Tyr Pro Gly Tyr Gly Ser Pro Leu

230 235 240

Ser Ser Tyr Gly Tyr Asn Asn Ala Gly Pro Ala Leu Gln Ser Asn

245 250 255

Met Gly Gly Ile Gln Pro Gln Ala Pro Gln Gln Gln Pro Tyr Asp

260 265 270

Val Ser Ala Asp Tyr Val Asp Ser Thr Thr Ala Tyr Glu Pro Lys

275 280 285

Gln Thr Glu Gly Phe Leu Asp Pro Asp Phe Ile Ser His Ala Glu

290 295 300

Gly Asp Ile Ser Lys Val Leu Val Lys Ser Leu Ala Glu Ala His

305 310 315

Ala Asn Thr Asn Pro Lys Leu Glu Phe Ile His Glu Met Phe Arg

320 325 330

Lys Pro Gln Asp Val Ser Lys Leu Leu Tyr Tyr Ser Ser Met Thr

335 340 345

Tyr Glu Glu Met Trp Leu Asp Cys Ala Asp Lys Leu Thr Gly Met

350 355 360

HHR3-序列表

Ile Gln Asn Ile Ile Glu Phe Ala Lys Leu Ile Pro Gly Phe Met

365 370 375

Lys Leu Thr Gln Asp Asp Gln Ile Leu Leu Leu Lys Ser Gly Ser

380 385 390

Phe Glu Leu Ala Ile Val Arg Leu Ser Arg Leu Ile Asp Val Asn

395 400 405

Arg Asp Gln Val Leu Tyr Gly Asp Ala Val Leu Ser Ile Arg Glu

4l0 415 420

Cys Val His Ala Arg Asp Pro Arg Asp Val Ala Leu Val Val Gly

425 430 435

Ile Phe Asp Ala Ala Lys Thr Ile Ala Arg Leu Lys Leu Thr Glu

440 445 450

Thr Glu Leu Ala Leu Tyr Gln Ser Leu Val Leu Leu Trp Pro Glu

455 460 465

Arg His Gly Val Arg Gly Asn Pro Glu Ile Gln Cys Leu Phe Asn

470 475 480

Met Ser Met Ala Ala Met Arg His Glu Ile Glu Thr Asn His Ala

485 490 495

Pro Leu Lys Gly Asp Val Thr Val Leu Asp Thr Leu Leu Ala Lys

500 505 510

Ile Pro Thr Phe Arg Glu Leu Ser Leu Met His Leu Glu Ala Leu

515 520 525

Cys Arg Phe Lys Ala Ala His Pro His His Val Phe Pro Ala Leu

530 535 540

Tyr Lys Glu Leu Phe Ser Leu Asp Ser Val Leu Asp Tyr Thr His

545 550 555

Gly

556

Claims

1.棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA，其特征在于，具有如下序列：

(1)SEQ ID NO 1的信息

(a)序列特征：

*长度：1668碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：棉铃虫(Helicoverpa armigera)

(f)序列描述：SEQ ID NO.1

atgaacaaca accagttcca cgatttattt gggtcccagt ggcctccgga ccagcacgga 60

ggtcactcgt cggcatcgac gatgctgcac cagtcccagg gcctgcccca gggtatgcag 120

ctgaagagag aacctcatac ggatgtgcag ccggtgatgc acaaccagat gggcacggac 180

atcacgtcag ggtccgtggc ggacagcaca tcccccccgc ctggcagcag tgacgggatg 240

ttcggctcgt ctatatctgg catgtttatg gataagaaag ccgctaattc tataagagct 300

caaatcgaaa taataccatg caaggtgtgt ggggataaat catctggagt ccactatggc 360

gtcatcacct gcgaggggtg caagggtttc ttcaggcgat cacagagtac agtggtgaac 420

taccagtgtc cacggaataa agcctgcgtg gtcgaccggg tcaacagaaa tcgttgtcag 480

tattgcagat tgcagaaatg cctcaaactt ggaatgagcc gtgatgcggt gaagtttgga 540

cggatgtcga aaaagcaacg tgagaaggtg gaagatgagg tgagattcca tcgcgcacag 600

atgagagctc agactgacac ggcgcccgac tcagtatacg acgctcaaca acaaacgccg 660

agctcaagcg accagttcca tggtcactac aatggctacc cgggctacgg gtcgccgttg 720

tcctcatatg ggtacaacaa cgcagggccg gcgctacagt ccaacatggg aggcatacag 780

cctcaagcac ctcaacagca gccctatgac gtgtcggctg attacgtgga ctccaccacg 840

gcttacgagc cgaaacagac cgagggattc ttggatcctg attttattag tcatgcggag 900

ggtgacatca gcaaagtcct ggtgaagagt ttggcagaag cacacgcaaa taccaacccc 960

aaactggagt tcattcatga gatgttcaga aagccacagg atgtctccaa gcttctatac 1020

tatagttcaa tgacgtacga ggaaatgtgg ctggattgtg cagacaaatt aactgggatg 1080

attcagaata ttatcgagtt cgctaaactt atacccgggt tcatgaaact gactcaggat 1140

gatcagattt tgctcttgaa atctggctcg ttcgagctcg ccatagtccg gctgtcgcga 1200

ctgatagacg tcaaccgtga ccaagtgcta tacggtgatg cggtgctgtc catcagagaa 1260

tgtgtgcatg cacgtgaccc ccgcgacgtg gcgctggtgg ttggtatctt cgacgcggca 1320

aagacgatcg ctcgactcaa actcactgag actgaactgg cgctatacca gagccttgtg 1380

ctattgtggc cagagcggca cggcgtccgc ggcaaccctg agatccagtg cctgttcaac 1440

atgtcgatgg cggcgatgcg gcacgagatc gagaccaacc acgcccccct caagggagac 1500

gtcactgttc tggacacgct gctcgccaag atacccacct tcagagaact atcactgatg 1560

cacctggaag ctttgtgccg cttcaaggcc gcccaccccc accacgtatt cccggccctc 1620

tacaaggagc tgttctcact cgacagcgtc ctggactaca cccacggt 1668。

2.一种权利要求1所述棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法，包括如下步骤：

(1)从棉铃虫提取总RNA或mRNA，然后反转录合成cDNA；

(2)根据蜕皮调节转录因子的保守序列设计引物：

正向引物：5’-ATGAACAACAACCAGTTCCAC-3’

反向引物：5’-GTCCTGGACTACACCCACGGT-3’

(3)通过链式聚合酶反应扩增到一个DNA片段；

3.如权利要求2所述棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法，其特征在于，所述步骤(1)中反转录合成cDNA是第一链合成cDNA，取5～10微克总RNA或mRNA，加反应液20微升，反应液是50毫摩尔氯化钾和3毫摩尔氯化镁混合液，10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲pH8.3，1毫摩尔二硫苏糖醇，5微摩尔寡聚脱氧胸腺核苷酸，500微摩尔脱氧核糖核苷酸混合物，25单位RNA酶抑制剂，8单位AMV逆转录酶，42℃反应90分钟，70℃反应10分钟终止反应。

4.如权利要求2所述棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法，其特征在于，链式聚合酶反应试剂与条件如下：

首先将下列试剂混在一起：

10×Taq DNA聚合酶缓冲液 5微升

模板cDNA 1μl

正向引物1.25μg/μl 1μl

反向引物1.25μg/μl 1μl

脱氧核苷酸混合物 4μl

Taq DNA聚合酶 0.25μl

灭菌水 37.75μl

总体积 50μtl

链式聚合酶反应条件为：首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环：94℃30秒，53℃45秒，72℃45秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。

5.一种权利要求1所述棉铃虫蜕皮调节转录因子cDNA的重组应用，通过基因重组技术在昆虫核型多角体病毒中进行表达，获得有杀虫活性的基因重组病毒，用于害虫防治；或者通过基因工程方法将棉铃虫蜕皮调节转录因子专入作物，获得具有抗虫能力的作物。

6.棉铃虫蜕皮调节转录因子，其特征在于，具有如下序列：

(2)SEQ ID NO.2的信息

(a)序列特征

*长度：556氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述

Met Asn Asn Asn Gln phe His Asp Leu Phe Gly Ser Gln Trp Pro

1 5 10 15

Pro Asp Gln His Gly Gly His Ser Ser Ala Ser Thr Met Leu His

16 20 25 30

Gln Ser Gln Gly Leu Pro Gln Gly Met Gln Leu Lys Arg Glu Pro

31 35 40 45

His Thr Asp Val Gln Pro Val Met His Asn Gln Met Gly Thr Asp

46 50 55 60

Ile Thr Ser Gly Ser Val Ala Asp Ser Thr Ser Pro Pro Pro Gly

61 65 70 75

Ser Ser Asp Gly Met phe Gly Ser Ser Ile Ser Gly Met Phe Met

76 80 85 90

Asp Lys Lys Ala Ala Asn Ser Ile Arg Ala Gln Ile Glu Ile Ile

91 95 100 105

Pro Cys Lys Val Cys Gly Asp Lys Ser Ser Gly Val His Tyr Gly

106 110 115 120

Val Ile Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Gln

121 125 130 135

Ser Thr Val Val Asn Tyr Gln Cys Pro Arg Asn Lys Ala Cys Val

136 140 145 150

Val Asp Arg Val Asn Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Leu Gln

151 155 160 165

Lys Cys Leu Lys Leu Gly Met Ser Arg Asp Ala Val Lys Phe Gly

166 170 175 180

Arg Met Ser Lys Lys Gln Arg Glu Lys Val Glu Asp Glu Val Arg

181 185 190 195

Phe His Arg Ala Gln Met Arg Ala Gln Thr Asp Thr Ala Pro Asp

196 200 205 210

Ser Val Tyr Asp Ala Gln Gln Gln Thr Pro Ser Ser Ser Asp Gln

211 215 220 225

Phe His Gly His Tyr Asn Gly Tyr Pro Gly Tyr Gly Ser Pro Leu

226 230 235 240

Ser Ser Tyr Gly Tyr Asn Asn Ala Gly Pro Ala Leu Gln Ser Asn

241 245 250 255

Met Gly Gly Ile Gln Pro Gln Ala Pro Gln Gln Gln Pro Tyr Asp

256 260 265 270

Val Ser Ala Asp Tyr Val Asp Ser Thr Thr Ala Tyr Glu Pro Lys

271 275 280 285

Gln Thr Glu Gly Phe Leu Asp Pro Asp Phe Ile Ser His Ala Glu

286 290 295 300

Gly Asp Ile Ser Lys Val Leu Val Lys Ser Leu Ala Glu Ala His

301 305 310 315

Ala Asn Thr Asn Pro Lys Leu Glu phe Ile His Glu Met Phe Arg

316 320 325 330

Lys pro Gln Asp Val Ser Lys Leu Leu Tyr Tyr Ser Ser Met Thr

331 335 340 345

Tyr Glu Glu Met Trp Leu Asp Cys Ala Asp Lys Leu Thr Gly Met

346 350 355 360

Ile Gln Asn Ile Ile Glu Phe Ala Lys Leu Ile Pro Gly Phe Met

361 365 370 375

Lys Leu Thr Gln Asp Asp Gln Ile Leu Leu Leu Lys Ser Gly Ser

376 380 385 390

Phe Glu Leu Ala Ile Val Arg Leu Ser Arg Leu Ile Asp Val Asn

391 395 400 405

Arg Asp Gln Val Leu Tyr Gly Asp Ala Val Leu Ser Ile Arg Glu

406 410 415 420

Cys Val His Ala Arg Asp Pro Arg Asp Val Ala Leu Val Val Gly

421 425 430 435

Ile phe Asp Ala Ala Lys Thr Ile Ala Arg Leu Lys Leu Thr Glu

436 440 445 450

Thr Glu Leu Ala Leu Tyr Gln Ser Leu Val Leu Leu Trp Pro Glu

451 455 460 465

Arg His Gly Val Arg Gly Asn Pro Glu Ile Gln Cys Leu Phe Asn

466 470 475 480

Met Ser Met Ala Ala Met Arg His Glu Ile Glu Thr Asn His Ala

481 485 490 495

Pro Leu Lys Gly Asp Val Thr Val Leu Asp Thr Leu Leu Ala Lys

496 500 505 510

Ile Pro Thr Phe Arg Glu Leu Ser Leu Met His Leu Glu Ala Leu

511 515 520 525

Cys Arg Phe Lys Ala Ala His pro His His Val Phe Pro Ala Leu

526 530 535 540

Tyr Lys Glu Leu Phe Ser Leu Asp Ser Val Leu Asp Tyr Thr His

541 545 550 555

Gly

556。