CN119285727A - 酰基载体蛋白acp65-74及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酰基载体蛋白ACP65‑74及其制备方法。其中，制备方法包括：对树脂进行脱保护及第一洗涤，以如SEQ ID NO:1所示的酰基载体蛋白ACP65‑74的氨基酸序列的顺序，以1个氨基酸为单位依次在树脂上进行原位活化反应；原位活化反应包括：S1，将单一氨基酸溶液、活化剂、缩合剂与树脂进行偶联反应，待反应溶液的电导率变化＜1%时，过滤并进行第二洗涤；S2，对完成S1步骤的树脂依次进行脱保护和第三洗涤。对多肽固相合成ACP65‑74的过程进行在线监测，能够提高反应效率，提高了产物的纯度的同时，减少了反应过程中不必要的浪费，节约了酰基载体蛋白ACP65‑74合成成本。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白合成技术领域，具体而言，涉及一种酰基载体蛋白ACP65-74及其制备方法。
背景技术
近年来，随着多肽合成技术的发展和成熟，多肽药物已成为药物研发的热点之一，其因适应证广、安全性高、疗效显著，其药物临床治疗地位不断提升，许多品种被纳入到国际和国内的相关疾病治疗指南和专家共识中，已广泛应用于肿瘤、心脑血管疾病、肝炎、糖尿病、艾滋病等疾病的预防、诊断和治疗，具有广阔的开发前景。随着与多肽合成相关的技术（如固相多肽合成技术的产生）、设备和工艺等方面得以迅速发展，多肽药物研发成本和生产成本大幅度下降，多肽药物的开发持续升温。
酰基载体蛋白(acyl carrier protein，ACP)是脂肪酸合成中的关键蛋白质，位于脂肪酸合成酶系的中央，作为脂酰基的载体将脂酰基从一个酶反应转移到另一个酶反应。ACP不仅参与脂肪酸合成，还参与甲羟戊酸合成及脂肪酸的不饱和反应。植物贮藏脂肪酸中不饱和脂肪酸的含量、组成以及它们在总脂肪酸中所占比例，与ACP异构体的种类及差异表达有密切关系。因此，酰基载体蛋白是高等植物脂肪酸生物合成的一个重要辅助因子。
Acyl Carrier Protein (ACP65-74)是一种有活性的酰基载体蛋白ACP片段。ACP65-74是世界上公认的较难合成的肽。这种蛋白质片段已被广泛接受为模型肽，用于说明试剂、聚合物支持或合成条件的效率。虽然这种十肽的合成看似简单，但早期尝试用标准程序合成这种肽的结果却令人沮丧，产量和纯度都很低。添加天冬酰胺、异亮氨酸和酪氨酸后，肽的产量会逐渐减少，这可能是由于氨基酸的立体阻碍作用。肽的构象是导致肽产量低的另一个重要因素。
目前困难肽合成的关键在于破坏困难序列导致的β折叠结构。通过使用混合溶剂、高效率的活化剂和非常昂贵的新型树脂等改变反应体系的方法，或延长反应时间、加大氨基酸用量、提高反应温度、调节反应体系的pH值和使用高离盐液等改变反应条件的方法，以及片段缩合、引入取代基等新型合成策略，为实现“困难序列”多肽的合成提供了解决思路。但是各种措施有些可操作性强，有些工艺较为复杂，而有些成本高昂以致不适于大工业生产，有些策略仍只能处在实验室研究阶段，无法实现大规模生产。
因而，如何同一种反应效率高且产物纯度较高的制备方法，对于酰基载体蛋白ACP65-74的制备有着重要的意义。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种酰基载体蛋白ACP65-74及其制备方法，以解决现有技术中制备得到的酰基载体蛋白ACP65-74的反应效率较低的问题。
为了实现上述目的，根本发明的第一个方面，提供了一种酰基载体蛋白ACP65-74的制备方法，制备方法包括：对树脂依次进行脱保护及第一洗涤，以SEQ ID NO:1所示的酰基载体蛋白ACP65-74的氨基酸序列的顺序，以1个氨基酸为单位依次在树脂上进行原位活化反应，每完成一次原位活化反应，树脂上连接的氨基酸多一个，待全部氨基酸连接完成后，得到酰基载体蛋白ACP65-74；原位活化反应包括：S1，将单一氨基酸溶液、活化剂、缩合剂与树脂进行偶联反应，待反应溶液的电导率变化＜1%时，过滤并进行第二洗涤；S2，对完成S1步骤的树脂依次进行脱保护和第三洗涤。
进一步地，树脂包括：Rink amide树脂；利用脱保护剂进行脱保护，脱保护剂包括：质量分数为20-30%的哌啶溶液。
进一步地，活化剂包括：1-羟基苯并三氮唑、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸或O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯；缩合剂包括：二异丙基碳二亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺或N,N-二异丙基乙二胺。
进一步地，对树脂进行脱保护的完成的标志为：完成第一洗涤后，对树脂进行二次脱保护，对二次脱保护后得到的洗脱液进行紫外检测，若没有出现峰，则脱保护完成。
进一步地，利用多肽固相合成装置进行酰基载体蛋白ACP65-74的制备，多肽固相合成装置包括脱保护循环和氨基酸偶联循环；其中，脱保护循环包括：由上游至下游依次设置的合成柱、第三切换阀、第一泵体、第一切换阀、第二切换阀，合成柱的出口与第三切换阀的第一入口a1相连，第三切换阀的第一出口a2与第一泵体的入口相连，第一泵体的出口与第一切换阀的第一入口b1相连，第一切换阀的第一出口b2与第二切换阀的第一入口c1相连，第二切换阀的第一出口c2与合成柱的入口相连；氨基酸偶联循环包括：由上游至下游依次设置的第四切换阀、第二泵体、第一切换阀、激活反应器、第二切换阀、合成柱、第三切换阀、第一泵体，第四切换阀的第一出口d2与第二泵体的入口相连，第三切换阀的第一出口a2与第一泵体的入口相连，第二泵体的出口和第一泵体的出口分别与第一切换阀的第一进口b1相连，第一切换阀的第二出口b3与激活反应器的入口相连，激活反应器的出口与第二切换阀的第二入口c3相连，合成柱的出口与第三切换阀的第一入口a1相连；树脂设置于合成柱中；制备方法包括：S1’，脱保护试剂和洗涤剂依次通过第三切换阀的第二入口a3进入脱保护循环，分别完成对树脂的脱保护和第一洗涤；S2’，单一氨基酸溶液从第四切换阀的第一入口d1，活化剂和缩合剂从第三切换阀的第二入口a3，分别通入第二泵体和第一泵体，进入氨基酸偶联循环，完成偶联反应；S3’，洗涤剂分别从第四切换阀的第一入口d1和第三切换阀的第二入口a3，通入第二泵体和第一泵体，进入氨基酸偶联循环，完成第二洗涤；S4’，脱保护试剂和洗涤剂依次通过第三切换阀的第二入口a3进入脱保护循环，分别完成对树脂的脱保护和第三洗涤；原位活化反应包括步骤S2’-S4’的过程。
进一步地，脱保护循环和氨基酸偶联循环还分别包括：电导率检测器，电导率检测器位于第一泵体与第一切换阀之间，用于检测S2’中偶联反应溶液的电导率。
进一步地，脱保护循环和氨基酸偶联循环还分别包括：UV检测器，UV检测器位于合成柱与第三切换阀之间，用于检测S1’中的树脂的脱保护是否完全。
进一步地，在S1’之后，S2’之前，制备方法还包括：在树脂的第一洗涤之后，脱保护试剂通过第三切换阀的第二入口a3进入脱保护循环，利用UV检测器对脱保护液进行紫外检测。
进一步地，脱保护循环和氨基酸偶联循环还分别包括：第五切换阀，第五切换阀具有第一入口e1和第一出口e2，合成柱的出口与第五切换阀的第一入口e1相连，第五切换阀的第一出口e2与第三切换阀的第一入口a1相连。
为了实现上述目的，根本发明的第二个方面，提供了一种利用上述的制备方法制备得到的酰基载体蛋白ACP65-74。
应用本发明的技术方案，对多肽固相合成ACP65-74的过程进行在线监测，能够提高反应效率，进一步提高了反应的完成程度，提高了产物的纯度的同时，减少了反应过程中不必要的浪费，节约了酰基载体蛋白ACP65-74合成成本。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了本申请进行酰基载体蛋白ACP65-74制备所利用的多肽固相合成装置；
图2示出了本申请实施例1酰基载体蛋白ACP65-74制备过程中溶液的电导率监测结果图；
图3示出了本申请实施例1酰基载体蛋白ACP65-74制备过程中溶液的UV值监测结果图；
其中，图1包括以下附图标记：
1、第一进样阀；2、第四切换阀；3、电导率检测器；4、第二进样阀；5、第三切换阀；6、第一切换阀；7、第五切换阀；8、激活反应器；9、合成柱；10、第二切换阀；11、UV检测器；13、限流器；14、废液出口阀；PB、第一泵体；PA、第二泵体。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，现有的酰基载体蛋白ACP65-74的制备过程存在合成困难、成本较高、耗时较长或纯度较低的问题，在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种酰基载体蛋白ACP65-74的制备方法，制备方法包括：对树脂依次进行脱保护及第一洗涤，以SEQ ID NO:1所示的酰基载体蛋白ACP65-74的氨基酸序列的顺序，以1个氨基酸为单位依次在树脂上进行原位活化反应，每完成一次原位活化反应，树脂上连接的氨基酸多一个，待全部氨基酸连接完成后，得到酰基载体蛋白ACP65-74；原位活化反应包括：S1，将单一氨基酸溶液、活化剂、缩合剂与树脂进行偶联反应，待反应溶液的电导率变化＜1%时，过滤并进行第二洗涤；S2，对完成S1步骤的树脂依次进行脱保护和第三洗涤。
SEQ ID NO:1：NH2-VQAAIDYING-CONH2。
本申请通过对酰基载体蛋白ACP65-74的原位活化的制备方法过程进行监测，能够及时得到反应完全程度，以达到对反应过程中的参数做出及时调整，进一步避免了副反应的生成，得到纯度较高的酰基载体蛋白ACP65-74。
任何适用于本申请的酰基载体蛋白ACP65-74合成的试剂种类均适用于本申请，在一种优选的实施例中，树脂包括：Rink amide树脂；优选地，利用脱保护剂进行脱保护，脱保护剂包括：质量分数为20-30%的哌啶溶液 ；优选地，活化剂包括：N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑（HOAT）、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸（TBTU）、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、1-羟基苯并三唑（HOBT）；优选地，缩合剂包括：二异丙基碳二亚胺、 N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)或N,N-二异丙基乙二胺(DIPEA)；任何能够适用于进行多肽合成清洗的试剂均适用于本申请，在一种优选的实施例中，利用洗涤剂进行第一洗涤、第二洗涤或第三洗涤，洗涤剂包括：二甲基乙酰胺DMF。
为进一步提高酰基载体蛋白ACP65-74的合成效率，在较短时间内能够得到纯度较高的酰基载体蛋白ACP65-74，在一种优选的实施例中，进行脱保护的时间为5-30min，具体的可以为5min、10min、15min、20min、25min；优选地，进行偶联反应的时间为45-120min，具体的可以为45min、55min、70min、80min、90min、110min、115min、120min。需要说明的是，为了能够更进一步提高酰基载体蛋白ACP65-74的合成效率，通过对脱保护反应液进行紫外检测及对偶联反应液进行电导率检测，能够及时得到反应程度，且通过对反应时间的及时调整能够进一步高效地完成酰基载体蛋白ACP65-74的合成，更优选地，进行脱保护的时间为5min；优选地，进行偶联反应的时间为45min。
为了进一步高效的得到纯度较高的酰基载体蛋白ACP65-74，在一种优选的实施例中，氨基酸包括：缬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或甘氨酸；优选地，单一氨基酸溶液的浓度为0.1-1.0mol/L，具体的可以为0.1 mol/L 、0.25 mol/L 、0.5 mol/L 、0.65 mol/L 、0.85 mol/L 、0.9 mol/L 、1.0mol/L。优选地，单一氨基酸溶液的用量与酰基载体蛋白ACP65-74的合成规模的摩尔比为1.5-10：1，具体的可以为1.5：1、3：1、10：1；优选地，活化剂的用量与酰基载体蛋白ACP65-74的合成规模的摩尔比为1.5-10：1，具体的可以为1.5：1、3：1、10：1；优选地，缩合剂的用量与酰基载体蛋白ACP65-74的合成规模的摩尔比为1.5-10：1，具体的可以为1.5：1、3：1、10：1；其中，酰基载体蛋白ACP65-74的合成规模为树脂的重量（g）与树脂的氨基酸载量（mol/g）的乘积。
需要说明的是，为了能够更进一步提高酰基载体蛋白ACP65-74的合成效率，通过对脱保护反应液进行紫外检测及对偶联反应液进行电导率检测，能够及时得到反应程度，且通过对各反应物用量的及时调整能够进一步高效地完成酰基载体蛋白ACP65-74的合成，更优选地，单一氨基酸溶液的用量与酰基载体蛋白ACP65-74的合成规模的摩尔比为1.5：1；优选地，活化剂的用量与酰基载体蛋白ACP65-74的合成规模的摩尔比为1.5：1；优选地，缩合剂的用量与酰基载体蛋白ACP65-74的合成规模的摩尔比为1.5：1。
为了进一步确定树脂是否脱保护洗涤完全，在一种优选的实施例中，对树脂进行脱保护的完成的标志为：完成第一洗涤后，对树脂进行二次脱保护，对二次脱保护后得到的洗脱液进行紫外检测，若没有出现峰，则脱保护完成。脱保护过程中，4-氨甲基（Fmoc基团）与脱保护试剂形成Fmoc-哌啶加合物，该物质在289nm和301nm具有紫外吸收，第二次加入脱保护试剂不起峰，表明没有Fmoc基团脱下，即脱保护已完成。优选地，还可以对原位活化反应中S1的第二洗涤和S2的第三洗涤得到的洗涤液进行UV检测，观察是否存在Fmoc基团的峰值，以判断洗脱完全程度。
为了进一步高效的控制脱保护反应的进行，在一种优选的实施例中，利用多肽固相合成装置进行酰基载体蛋白ACP65-74的制备，多肽固相合成装置包括脱保护循环和氨基酸偶联循环；其中，脱保护循环包括：由上游至下游依次设置的合成柱9、第三切换阀5、第一泵体PB、第一切换阀6、第二切换阀10，合成柱9的出口与第三切换阀5的第一入口a1相连，第三切换阀5的第一出口a2与第一泵体PB的入口相连，第一泵体PB的出口与第一切换阀6的第一入口b1相连，第一切换阀6的第一出口b2与第二切换阀10的第一入口c1相连，第二切换阀10的第一出口c2与合成柱9的入口相连。
上述装置中脱保护循环能够更为便捷的控制脱保护反应进行，且使得树脂更彻底完全的与反应液进行接触，进一步提高反应效率。
为了进一步高效的控制氨基酸偶联反应，在一种优选的实施例中，氨基酸偶联循环包括：由上游至下游依次设置的第四切换阀2、第二泵体PA、第一切换阀6、激活反应器8、第二切换阀10、合成柱9、第三切换阀5、第一泵体PB，第四切换阀2的第一出口d2与第二泵体PA的入口相连，第三切换阀5的第一出口a2与第一泵体PB的入口相连，第二泵体PA的出口和第一泵体PB的出口分别与第一切换阀6的第一进口b1相连，第一切换阀6的第二出口b3与激活反应器8的入口相连，激活反应器8的出口与第二切换阀10的第二入口c3相连，合成柱9的出口与第三切换阀5的第一入口a1相连。
上述装置中的氨基酸偶联反应循环能够使得树脂与氨基酸完全接触，减少强烈的剪切力对载体和已连接的肽链造成的破坏的同时，避免了树脂粘在合成釜的测壁上导致合成效率低下的问题。
利用上述装置进行酰基载体蛋白ACP65-74的制备，能够提高反应的自动化程度，更易实现对酰基载体蛋白ACP65-74产物的纯度及反应效率的控制，且进一步提高反应的可重复性，更适用于工业化生产，在一种优选的实施例中，树脂设置于合成柱9中；制备方法包括：S1’，脱保护试剂和洗涤剂依次通过第三切换阀5的第二入口a3进入脱保护循环，分别完成对树脂的脱保护和第一洗涤；S2’，单一氨基酸溶液从第四切换阀2的第一入口d1，活化剂和缩合剂从第三切换阀5的第二入口a3，分别通入第二泵体PA和第一泵体PB，进入氨基酸偶联循环，完成偶联反应；S3’，洗涤剂分别从第四切换阀2的第一入口d1和第三切换阀5的第二入口a3，通入第二泵体PA和第一泵体PB，进入氨基酸偶联循环，完成第二洗涤；S4’，脱保护试剂和洗涤剂依次通过第三切换阀5的第二入口a3进入脱保护循环，分别完成对树脂的脱保护和第三洗涤；原位活化反应包括步骤S2’-S4’的过程。
为了进一步快捷的得到氨基酸偶联反应的完成程度，在一种优选的实施例中，脱保护循环和氨基酸偶联循环还分别包括：电导率检测器3，电导率检测器3位于第一泵体PB与第一切换阀6之间，用于检测S2’中偶联反应溶液的电导率。
为了进一步快捷的得到脱保护反应结束后的洗涤是否完全，在一种优选的实施例中，脱保护循环和氨基酸偶联循环还分别包括：UV检测器11，UV检测器11位于合成柱9与第三切换阀5之间，用于检测S1’和S4’中的树脂的脱保护及S3’中的偶联反应液洗涤是否完全。
为了进一步提高对脱保护反应结束后的洗涤是否完全的判断的准确性，在一种优选的实施例中，在S1’之后，S2’之前，制备方法还包括：在树脂的第一洗涤之后，脱保护试剂通过第三切换阀5的第二入口a3进入脱保护循环，利用UV检测器11对脱保护液进行紫外检测。
为了进一步精确地控制反应体系的流量速度，在一种优选的实施例中，脱保护循环和氨基酸偶联循环还分别包括：第五切换阀7，第五切换阀7具有第一入口e1和第一出口e2，合成柱9的出口与第五切换阀7的第一入口e1相连，第五切换阀7的第一出口e2与第三切换阀5的第一入口a1相连。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种利用上述的制备方法制备得到的酰基载体蛋白ACP65-74。
以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例1
本实施例利用如图1所示的多肽固相合成装置进行酰基载体蛋白ACP65-74的制备，酰基载体蛋白ACP65-74序列为NH2-VQAAIDYING-CONH2 (SEQ ID NO:1)，使用的树脂为Rink amide树脂，设置于多肽固相合成装置的合成柱9中，合成规模：2g树脂，树脂的氨基酸载量为0.69mmol/g。
本实施例中利用的试剂包括：20%的哌啶溶液（脱保护剂）、二甲基乙酰胺DMF（洗涤剂）、二异丙基碳二亚胺(DIC)（缩合剂）、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)（活化剂）以及SEQ IDNO:1所示的8种不同种类的单一氨基酸溶液（0.25mol/L）。
本实施例分别利用两种合成方式（预活化和原位活化）进行了酰基载体蛋白ACP65-74的制备合成。
其中，原位活化的具体步骤如下所述：
对如图1所示的多肽固相合成装置进行设备调试，确认设备可正常运行。
S1’，20%的哌啶溶液经第二进样阀4的入口通入多肽固相合成装置，通过第三切换阀5的第二入口a3进入脱保护循环，20%的哌啶溶液从第三切换阀5的第一出口a2进入第一泵体PB，依次通过电导率检测器3、第一切换阀6、第二切换阀10、合成柱9、第五切换阀7、UV检测器11和第三切换阀5，进行5-30min，完成树脂的脱保护。
而后通过第二进样阀4将二甲基乙酰胺DMF通入脱保护循环，二甲基乙酰胺从第三切换阀5的第一出口a2进入第一泵体PB，而后依次通过电导率检测器3、第一切换阀6、第二切换阀10、合成柱9、第五切换阀7、UV检测器11和第三切换阀5，完成树脂的第一洗涤。
对上述脱保护的洗涤是否完全进行检测，将20%的哌啶溶液再次通入脱保护循环，利用UV检测器11对流经的20%的哌啶溶液进行检测，若UV未起峰，即没有Fmoc保护基团，即脱保护完全，反之不完全。本申请制备过程中的UV值监测曲线图如图3所示。
以SEQ ID NO:1所示的顺序，以1种单一氨基酸溶液通入氨基酸偶联循环进行1次原位活化反应，而后按顺序依次通入后续的单一氨基酸溶液完成后续的原位活化反应。
S2’，单一氨基酸溶液经第一进样阀1的入口通入多肽固相合成装置，通过第四切换阀2的第一出口d2通入第二泵体PA，二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三氮唑经第二进样阀4的入口通入多肽固相合成装置，通过第三切换阀5的第二入口a3通入第一泵体PB，单一氨基酸溶液、二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三氮唑进入氨基酸偶联循环，依次流经电导率检测器3、第一切换阀6、激活反应器8、第二切换阀10、合成柱9、第五切换阀7、UV检测器11、第三切换阀5和第一泵体PB，进行45-120min，完成偶联反应。
其中，通入多肽固相合成装置的单一氨基酸溶液、二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三氮唑的摩尔用量分别为2.07 mmol、2.07 mmol和2.07 mmol。且利用电导率检测器3对上述S2’偶联反应过程中的反应液的电导率进行检测，当5min内电导率变化小于1%时，结束偶联反应。本申请制备过程中的电导率监测曲线图如图2所示。
S3’，二甲基乙酰胺分别经第一进样阀1的入口和第四切换阀2的第一出口d2通入多肽固相合成装置，通过第二泵体PA和第一泵体PB进入氨基酸偶联循环，完成第二洗涤。
S4’，20%的哌啶溶液经第二进样阀4的入口通入多肽固相合成装置，通过第三切换阀5的第二入口a3进入脱保护循环，20%的哌啶溶液从第三切换阀5的第一出口a2进入第一泵体PB，依次通过电导率检测器3、第一切换阀6、第二切换阀10、合成柱9、第五切换阀7、UV检测器11和第三切换阀5，进行5min，完成树脂的脱保护。
而后通过第二进样阀4将二甲基乙酰胺通入脱保护循环，二甲基乙酰胺从第三切换阀5的第一出口a2进入第一泵体PB，而后依次通过电导率检测器3、第一切换阀6、第二切换阀10、合成柱9、第五切换阀7、UV检测器11和第三切换阀5，完成树脂的第三洗涤。
上述步骤S2’-S4’的过程为1次原位活化反应，按酰基载体蛋白ACP65-74的氨基酸序列的下一位氨基酸作为下一次原位活化反应的单一氨基酸溶液进行后续的原位活化反应，直至酰基载体蛋白ACP65-74达到既定长度，共10次原位活化反应。
其中，上述第一洗涤、第二洗涤和第三洗涤过程中得到的废液，通过与第三切换阀5的第二出口a4连接的限流器13，从废液出口阀14排出多肽固相合成装置。
将经过上述10次原位活化反应的产物进行切割，将完整的多肽链从载体上剥离，进行后处理后，得到通过原位活化制备的酰基载体蛋白ACP65-74，送样检测纯度，原位活化合成产物的纯度为96.13%。
预活化反应与上述原位活化反应除了在S1’和S2’之间加入了S20’氨基酸预活化步骤外，其他操作均与原位活化反应相同，具体的S20’氨基酸预活化步骤如下所述：
S20’，单一氨基酸溶液经第一进样阀1的入口通入多肽固相合成装置，通过第四切换阀2的第一出口d2通入第二泵体PA，1-羟基苯并三氮唑、N,N-二异丙基碳二亚胺经第二进样阀4的入口通入多肽固相合成装置，通过第三切换阀5的第二入口a3通入第一泵体PB，单一氨基酸溶液和1-羟基苯并三氮唑依次流经电导率检测器3、第一切换阀6、激活反应器8、第二切换阀10、第四切换阀2和第二泵体PA，其中第二切换阀10的第二出口c4与第四切换阀2的第二入口d3相连，进行5min，完成氨基酸预活化反应。
其中，通入多肽固相合成装置的单一氨基酸溶液、1-羟基苯并三氮唑和N,N-二异丙基碳二亚胺的摩尔质量分别为2.07 mmol、2.07 mmol和2.07 mmol。
在氨基酸预活化反应结束之后，二甲基乙酰胺分别经第一进样阀1的入口和第四切换阀2的第一出口d2通入多肽固相合成装置，通过第二泵体PA和第一泵体PB依次流经电导率检测器3、第一切换阀6、激活反应器8、第二切换阀10、第四切换阀2和第二泵体PA，完成氨基酸预活化反应后的洗涤。
后续进行上述S2’-S4’，即S20’、S2’、S3’和S4’为1次预活化反应，能够完成酰基载体蛋白ACP65-74中1个氨基酸的合成，进行共10次的预活化反应。将经过S20’-S4’的10次预活化反应的产物进行切割，将完整的多肽链从载体上剥离，进行后处理后，得到通过预活化制备的酰基载体蛋白ACP65-74，送样检测纯度，预活化合成产物的纯度为94.67%。可以看出利用本申请的原位活化制备方法得到的酰基载体蛋白ACP65-74的纯度更高。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过优化了各个反应阶段的反应参数，利用多肽固相合成装置进行酰基载体蛋白ACP65-74的合成，减少了合成所需的试剂当量，降低了副产物的生成，提高了反应的效率和产品的纯度，同时节约了反应成本。
此外，本申请的多肽固相合成装置采用循环管路代替传统机械搅拌，减少强烈的剪切力对载体和已连接的肽链造成的破坏的同时，合成柱中的树脂完全浸泡在反应液中，避免了树脂粘在合成釜的测壁上导致合成效率低下的问题，进一步的提高了混合效率，缩短了合成所需的时间。且通过实时监测脱保护、洗涤以及氨基酸偶联等过程，能够及时自动调整反应参数，使得合成过程更加可控，降低了操作难度，提高了实验的重复性和可靠性。且本申请的方法不仅限于实验室研究，也适用于大规模的多肽生产，为制药、生物技术等领域提供了更加高效、经济的多肽合成方案。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种酰基载体蛋白ACP65-74的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
对树脂依次进行脱保护及第一洗涤，以SEQ ID NO:1所示的所述酰基载体蛋白ACP65-74的氨基酸序列的顺序，以1个氨基酸为单位依次在所述树脂上进行原位活化反应，每完成一次所述原位活化反应，所述树脂上连接的氨基酸多一个，待全部氨基酸连接完成后，得到所述酰基载体蛋白ACP65-74；
所述原位活化反应包括：
S1，将单一氨基酸溶液、活化剂、缩合剂与所述树脂进行偶联反应，待反应溶液的电导率变化＜1%时，过滤并进行第二洗涤；
S2，对完成所述S1步骤的树脂依次进行所述脱保护和第三洗涤。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述树脂包括：Rink amide树脂；
利用脱保护剂进行所述脱保护，所述脱保护剂包括：质量分数为20-30%的哌啶溶液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述活化剂包括：1-羟基苯并三氮唑、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸或O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯；
所述缩合剂包括：二异丙基碳二亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺或N,N-二异丙基乙二胺。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，对所述树脂进行所述脱保护的完成的标志为：
完成所述第一洗涤后，对所述树脂进行二次脱保护，对所述二次脱保护后得到的洗脱液进行紫外检测，若没有出现峰，则所述脱保护完成。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，利用多肽固相合成装置进行所述酰基载体蛋白ACP65-74的制备，
所述多肽固相合成装置包括脱保护循环和氨基酸偶联循环；
其中，所述脱保护循环包括：
由上游至下游依次设置的合成柱（9）、第三切换阀（5）、第一泵体（PB）、第一切换阀（6）、第二切换阀（10），所述合成柱（9）的出口与所述第三切换阀（5）的第一入口a1相连，所述第三切换阀（5）的第一出口a2与所述第一泵体（PB）的入口相连，所述第一泵体（PB）的出口与所述第一切换阀（6）的第一入口b1相连，所述第一切换阀（6）的第一出口b2与所述第二切换阀（10）的第一入口c1相连，所述第二切换阀（10）的第一出口c2与所述合成柱（9）的入口相连；
所述氨基酸偶联循环包括：
由上游至下游依次设置的第四切换阀（2）、第二泵体（PA）、第一切换阀（6）、激活反应器（8）、第二切换阀（10）、合成柱（9）、第三切换阀（5）、第一泵体（PB），所述第四切换阀（2）的第一出口d2与所述第二泵体（PA）的入口相连，所述第三切换阀（5）的第一出口a2与所述第一泵体（PB）的入口相连，所述第二泵体（PA）的出口和所述第一泵体（PB）的出口分别与所述第一切换阀（6）的第一进口b1相连，所述第一切换阀（6）的第二出口b3与所述激活反应器（8）的入口相连，所述激活反应器（8）的出口与所述第二切换阀（10）的第二入口c3相连，所述合成柱（9）的出口与所述第三切换阀（5）的第一入口a1相连；
所述树脂设置于所述合成柱（9）中；
所述制备方法包括：
S1’，脱保护试剂和洗涤剂依次通过所述第三切换阀（5）的第二入口a3进入所述脱保护循环，分别完成对所述树脂的所述脱保护和所述第一洗涤；
S2’，所述单一氨基酸溶液从所述第四切换阀（2）的第一入口d1，所述活化剂和所述缩合剂从所述第三切换阀（5）的第二入口a3，分别通入所述第二泵体（PA）和所述第一泵体（PB），进入所述氨基酸偶联循环，完成所述偶联反应；
S3’，所述洗涤剂分别从所述第四切换阀（2）的第一入口d1和所述第三切换阀（5）的第二入口a3，通入所述第二泵体（PA）和所述第一泵体（PB），进入所述氨基酸偶联循环，完成所述第二洗涤；
S4’，所述脱保护试剂和所述洗涤剂依次通过所述第三切换阀（5）的第二入口a3进入所述脱保护循环，分别完成对所述树脂的所述脱保护和所述第三洗涤；
所述原位活化反应包括步骤S2’-S4’的过程。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述脱保护循环和所述氨基酸偶联循环还分别包括：电导率检测器（3），所述电导率检测器（3）位于所述第一泵体（PB）与所述第一切换阀（6）之间，用于检测所述S2’中偶联反应溶液的电导率。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述脱保护循环和所述氨基酸偶联循环还分别包括：UV检测器（11），所述UV检测器（11）位于所述合成柱（9）与所述第三切换阀（5）之间，用于检测所述S1’中的所述树脂的所述脱保护是否完全。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在所述S1’之后，所述S2’之前，所述制备方法还包括：
在所述树脂的所述第一洗涤之后，所述脱保护试剂通过所述第三切换阀（5）的第二入口a3进入所述脱保护循环，利用所述UV检测器（11）对脱保护液进行紫外检测。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述脱保护循环和所述氨基酸偶联循环还分别包括：第五切换阀（7），所述第五切换阀（7）具有第一入口e1和第一出口e2，所述合成柱（9）的出口与所述第五切换阀（7）的第一入口e1相连，所述第五切换阀（7）的第一出口e2与所述第三切换阀（5）的第一入口a1相连。
10.利用权利要求1-9中任一项所述的制备方法制备得到的酰基载体蛋白ACP65-74。
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