CN105885049B - 一种α-鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种α‑鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法，涉及分离材料领域看，包括以下步骤：S1将模板分子与功能单体、交联剂、溶剂混匀；S2将载体表面进行巯基化处理；S3将S2处理得到的载体加入S1制得的混合溶液中，与功能单体交联聚合；S4将模板分子从聚合后的载体表面洗脱；S5将S4处理得到分子印迹材料真空干燥。本发明实验操作简便，无须通氮、除氧，且用三乙胺调节反应体系pH值即可引发反应，反应条件温和，时间短，此方法较传统制备分子印迹方法表现出极大的优越性。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离材料，尤其涉及一种α-鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法。
背景技术
鹅膏毒肽又名鹅膏毒素，英文名为amanitin，是从剧毒磨菇中分离出来的一种多肽物质，也是一类重要生化试剂，鹅膏毒素在分子生物学、发育生物学、遗传学、生物化学、医学、生物防治等领域具有广泛的应用价值。鹅膏毒肽是一类双环八肽，已分离纯化的天然鹅膏毒肽毒素有9种，它们是α-amanitin，β-amanitin，γ-amanitin，ε-amanitin，amanin，amaninamide，amanullin，amanullinic acid，和proamanullin。其中α-amanitin的结构式如下：
分子印迹是集分析化学、高分子材料及仿生生物工程等多学科发展起来的新型“人工受体”合成技术。目前分子印迹技术最成功的应用是识别有机小分子，用于识别多肽及蛋白质的成功实例非常有限，其原因是生物大分子结构复杂及热力学因素等，另一主要原因是多肽和蛋白质价格昂贵，通常难以获得足够量用于制备分子印迹聚合物。
MIP分子印迹材料，相对于NIP分子印迹材料，有更高的吸附容量和更好的选择性，但传统的聚合方式实验操作复杂，条件苛刻，需无氧环境，并且后续处理过程相对冗长、费时费力、颗粒均一性较差、原料利用率较低。因此，寻求一种简单高效制备α-鹅膏毒肽分子印迹材料(α-amanitin-MIP)的制备方法至关重要。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种α-鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法，包括以下步骤：
S1：将模板分子与功能单体、交联剂、溶剂混匀；
S2：将载体表面进行巯基化处理；
S3：将S2处理得到的载体加入S1制得的混合溶液中，通过功能单体与模板分子交联聚合；
S4：用洗脱液将模板分子从聚合后的载体表面洗脱，得到分子印迹材料；
S5：将S4处理得到分子印迹材料真空干燥；
其中，S3步骤中的聚合条件为：用碱将聚合反应液pH调至7～9，40℃～50℃下反应6～12h；所述模板分子为N-乙酰色氨酸丙酰胺。
以α-鹅膏毒肽分子的一个作用位点，设计合成了α-鹅膏毒肽的特异性识别决定区作为模板，利用表面印迹法，在二氧化硅载体上修饰制备了专一性吸附鹅膏毒肽的印迹材料。
具体地，所述S1中功能单体为3-巯基丙酸；所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述溶剂为二甲基亚砜。
具体地，所述S1中模板分子与功能单体的摩尔比例为0.15:1～0.25:1，所述功能单体与交联剂的摩尔比例为1:2。
具体地，所述S1中模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比例为0.2:1:2。
具体地，所述S1中还包括辅助交联剂，所述辅助交联剂为季戊四醇四-3-巯基丙酸酯，，所述辅助交联剂与交联剂的摩尔比例为9:4。
具体地，所述S2中的巯基化处理方法包括如下步骤：
S2a：取载体，溶于水中，加甲醇超声使其分散；
S2b：向S2a得到的反应液中加入甘油，再超声，超声后通入氮气；
S2c：取(3-巯丙基)-三乙氧基硅烷与甲醇混合均匀，加入S2b得到的反应液中，搅拌使其混合均匀；
S2d：向S2c得到的反应液中加入氨水，85℃氮气保护下反应1h后，停止氮气，再反应5h；
S2e：反应结束后离心收集载体，用无水乙醇和去离子水分别洗涤，40℃下真空干燥即得。
具体地，所述S3中的碱为三乙胺。
具体地，步骤S4中所述洗脱液分为第一洗脱液和第二洗脱液，第一洗脱液为甲醇与乙酸的体积比为9:1的混合溶液，第二洗脱液为甲醇。
具体地，所述S5中的真空干燥温度为40～50℃。
本发明采用藉配体识别决定区印迹策略，利用抗原决定基(短肽片段)印迹，制备识别多肽和蛋白质的MIPs。利用硫醇-烯点击反应制备分子印迹聚合物，实验操作简便，无须通氮、除氧，且用三乙胺调节反应体系pH值即可引发反应，反应条件温和，时间短，此方法较传统制备分子印迹方法表现出极大的优越性。
本发明解决MIPs识别生物大分子过程中的传质速率慢和吸附容量较低等问题，拟采用硅小球表面印迹法和沉淀聚合印迹法等，研制具有纳米结构的表面印迹微球和MIPs纳米粒子，制备性能优异的新型分离材料。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明旨在选择鹅膏毒肽的一个识别位点，设计合成鹅膏毒肽的特异性识别决定区作为模板，采用巯基化二氧化硅微球，并利用表面印迹的方法，通过巯基与双键之间的点击反应在二氧化硅表面合成了α-鹅膏毒肽-MIP分子印迹材料。
为了更好地理解和实施，下面详细说明本发明。
具体实施方式
实施例1：模板分子的制备
本发明的模板分子为N-乙酰色氨酸丙酰胺，其制备方法包括以下步骤：
a、称取4.0g的N-乙酰色氨酸，量取100ml甲醇加入250ml的三颈烧瓶中在超声环境下溶解充分；
b、在上述步骤的混合溶液中加入5.0ml的浓硫酸作为催化剂，于60℃的水浴环境下回流3个小时，使N-乙酰色氨酸和甲醇酯化充分；
c、待装置完全冷却至室温后，利用1.0mol/L的K2CO3溶液调节混合液的pH为7，然后加入饱和NaCl溶液使之静置分层；
d、30min后，用120ml的二氯甲烷分三次萃取该混合液；
e、再把得到的二氯甲烷有机层分别用50ml 1.0mol/L K2CO3溶液和60ml的去离子水各洗一次；
f、最后把分液后得到的有机溶液里的二氯甲烷在30℃旋转蒸干，得到白色固体；
g、接着，再把所得的白色固体溶于50ml的丙胺和50ml的甲醇组成的混合液中，常温搅拌48h；
h、然后在55℃下把未反应的丙胺旋转蒸干，得到橙黄色粗品；
i、最后用三氯甲烷重结晶三次后，在40℃的烘箱中烘干，得到白色固体产物。
实施例2：表面巯基化的二氧化硅的制备
本发明的载体为表面巯基化的二氧化硅，其制备方法包括以下步骤：
a、取4.0g二氧化硅微球，超声分散于5ml的去离子水中，加入120ml甲醇，超声分散30min；
b、向本实施例步骤a处理得到反应液中加入120ml的甘油，再超声10min，将混合液转入500ml的三口烧瓶中，通20min氮气，得到混合溶液一；
c、取4ml的(3-巯丙基)-三乙氧基硅烷与40ml甲醇混合均匀，并倒入混合溶液一中，开始搅拌反应，得到混合溶液二；
d、在混合溶液二中加入10ml的氨水，于85℃、氮气保护下反应1h后，停止氮气保护后再反应5h；
e、待反应完毕，离心收集巯基功能化的二氧化硅微球后，用无水乙醇和去离子水分别洗涤3次；将清洗后的二氧化硅微球置于40℃、真空环境下进行干燥；即完成二氧化硅微球表面巯基化。
实施例3：α-鹅膏毒肽表面分子印迹材料(α-amanitin-MIP)的制备
本发明的α-鹅膏毒肽表面分子印迹材料的制备方法如下：
S1：将实施例1制得的模板分子与3-巯基丙酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇四-3-巯基丙酸酯加入到二甲基亚砜的溶液中搅拌均匀；模板分子、3-巯基丙酸与乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔比为0.2:1:2；所述辅助交联剂季戊四醇四-3-巯基丙酸酯与交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔比为9:4；
S2：将实施例2处理得到的巯基化二氧化硅微球加入本实施例S1步骤制得的混合溶液中，用三乙胺调节反应液pH约为8，在40℃下聚合反应6小时；
S3：将S2处理得到的二氧化硅微球从混合溶液中取出，依次用甲醇-乙酸(9:1，v/v)混合溶液和甲醇作洗脱剂进行冲洗；
S4：将冲洗后的二氧化硅微球置于40℃的真空环境下进行干燥处理，制得α-amanitin-MIP分子印迹材料。
实施例4：α-鹅膏毒肽表面分子印迹材料(α-amanitin-MIP)的制备
本发明的α-鹅膏毒肽表面分子印迹材料的制备方法如下：
S1：将实施例1制得的模板分子与3-巯基丙酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇四-3-巯基丙酸酯加入到二甲基亚砜的溶液中搅拌均匀；模板分子、3-巯基丙酸与乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔比为0.15:1:2；所述辅助交联剂季戊四醇四-3-巯基丙酸酯与交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔比为9:4；
S2：将实施例2处理得到的巯基化二氧化硅微球加入本实施例S1步骤制得的混合溶液中，用三乙胺调节反应液pH约为8，在40℃下聚合反应9小时；
S3：将S2处理得到的二氧化硅微球从混合溶液中取出，依次用甲醇-乙酸(9:1，v/v)混合溶液和甲醇作洗脱剂进行冲洗；
S4：将冲洗后的二氧化硅微球置于45℃的真空环境下进行干燥处理，制得α-amanitin-MIP分子印迹材料。
实施例5：α-鹅膏毒肽表面分子印迹材料(α-amanitin-MIP)的制备
本发明的α-鹅膏毒肽表面分子印迹材料的制备方法如下：
S1：将实施例1制得的模板分子与3-巯基丙酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇四-3-巯基丙酸酯加入到二甲基亚砜的溶液中搅拌均匀；模板分子、3-巯基丙酸与乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔比为0.25:1:2；所述辅助交联剂季戊四醇四-3-巯基丙酸酯与交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩尔比为9:4；
S2：将实施例2处理得到的巯基化二氧化硅微球加入本实施例S1步骤制得的混合溶液中，用三乙胺调节反应液pH约为8，在40℃下聚合反应12小时；
S3：将S2处理得到的二氧化硅微球从混合溶液中取出，依次用甲醇-乙酸(9:1，v/v)混合溶液和甲醇作洗脱剂进行冲洗；
S4：将冲洗后的二氧化硅微球置于50℃的真空环境下进行干燥处理，制得α-amanitin-MIP分子印迹材料。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。
Claims (3)
1.一种α-鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法，其特征在于包括以下步骤：
S1：将模板分子与功能单体、交联剂、辅助交联剂、溶剂混匀；所述模板分子为N-乙酰色氨酸丙酰胺，所述功能单体为3-巯基丙酸，所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯，所述辅助交联剂为季戊四醇四-3-巯基丙酸酯，所述溶剂为二甲基亚砜；模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比例为0.15～0.25:1:2，辅助交联剂与交联剂的摩尔比例为9:4；
S2：将载体表面进行巯基化处理；所述载体为二氧化硅微球；
S3：将S2处理得到的载体加入S1制得的混合溶液中，通过功能单体与模板分子交联聚合；
S4：用洗脱液将模板分子从聚合后的载体表面洗脱，得到分子印迹材料；所述洗脱液分为第一洗脱液和第二洗脱液，第一洗脱液为甲醇与乙酸的体积比为9:1的混合溶液，第二洗脱液为甲醇；
S5：将S4处理得到分子印迹材料在温度40～50℃下真空干燥；
其中，S3步骤中的聚合条件为：用三乙胺将聚合反应液pH调至7～9，40℃～50℃下反应6～12h。
2.根据权利要求1所述的α-鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法，其特征在于：所述S1中模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比例为0.2:1:2。
3.根据权利要求1所述的α-鹅膏毒肽分子印迹材料制备方法，其特征在于所述S2中的巯基化处理方法包括如下步骤：
S2a：取载体，溶于水中，加甲醇超声使其分散；
S2b：向S2a得到的反应液中加入甘油，再超声，超声后通入氮气；
S2c：取(3-巯丙基)-三乙氧基硅烷与甲醇混合均匀，加入S2b得到的反应液中，搅拌使其混合均匀；
S2d：向S2c得到的反应液中加入氨水，85℃氮气保护下反应1h后，停止氮气，再反应5h；
S2e：反应结束后离心收集载体，用无水乙醇和去离子水分别洗涤，40℃下真空干燥即得。
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