CN118638166A - 含有三氮唑结构的GalNAc化合物及其寡核苷酸缀合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含有三氮唑结构的GalNAc化合物及其寡核苷酸缀合物，具体公开了一种如式（I）所示的GalNAc化合物或其药学上可接受的盐。本发明中的GalNAc化合物能与寡核苷酸形成缀合物，该缀合物能实现寡核苷酸的高效肝靶向递送，调控基因表达，能够用于预防和/或治疗由肝细胞中特定基因的表达而引起的疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种具有三氮唑环结构的GalNAc化合物和由其制备的GalNAc寡核苷酸缀合物。
背景技术
近些年，继小分子和抗体药物之后，寡核苷酸药物正逐渐成为新药研发的第三次浪潮。寡核苷酸药物主要与致病蛋白的上游mRNA相结合，能在基因层面进行调控，因此可为一些无药可用的、急需的临床需求提供治疗可能，并已经在神经病变以及心血管疾病的治疗方面展现出巨大的潜力。
小核酸药物（寡核苷酸）凭借其自身独特的性质正逐步发展成为传统小分子药物的替代物，用以调控与疾病相关蛋白的功能。寡核苷酸可用于沉默或激活特定疾病的基因表达，从而防止或促进特定蛋白的形成，起到治疗疾病的作用。寡核苷酸包括但不限于反义寡核苷酸（ASO），小干扰RNA（siRNA）、小激活RNA（saRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）。由于寡核苷酸药物疗效较好，技术取得突破，成为当前最受关注的一类技术，目前全球已有数款药物获批上市。
目前，已上市的寡核苷酸药物使用的递送系统有：脂质纳米颗粒（LipidNanoparticle，LNP）递送系统和N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）递送系统，其中GalNAc递送系统应用最为广泛。GalNAc能与肝细胞表面特异性表达的一种内吞型受体ASGPR（脱唾液酸糖蛋白受体）相结合，可实现寡核苷酸药物的肝靶向递送。因此，对于GalNAc的改进，可以提高寡核苷酸药物的递送效率。
半乳糖（Gal）和N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalgactosamine，GalNAc），是一种能够与肝表面的ASGPR结合的配体。GalNAc与ASGPR结合的亲和性比Gal高约50倍，研究发现，带有不同触角结构的GalNAc的亲和力的次序为：四触角>三触角>>双触角>>单触角半乳糖胺。近年来，利用ASGPR的高亲和性配体N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）作为靶向分子，在核酸药物的肝靶向递送方面取得了一定的进展。多种GalNAc可以实现与siRNA和ASO的缀合，利用这种技术已经开展了淀粉样病变、血友病、高胆固醇血症、乙型肝炎等疾病的药物开发。
不同的GalNAc结构，对核酸递送效率差别很大。为了提高对肝靶向药物，例如补体抑制剂类药物的递送效率，本领域有开发新的GalNAc化合物的需求。
发明内容
本发明提供了一种含有三氮唑结构的新型GalNAc化合物，将三氮唑引入GalNAc化合物的连接子中，凭借点击化学(click chemistry)的优势，可以模块化、简便快速地构筑一系列新型含三氮唑结构的GalNAc化合物。通过使用亚磷酰胺固相合成法，将GalNAc配体偶联到寡核苷酸的3'端。与现有技术相比，本发明GalNAc化合物将寡核苷酸递送至肝脏的效率显著提高，可用于开发治疗肝组织相关疾病的药物。
本发明提供了一种如式（I）所示的GalNAc化合物或其药学上可接受的盐：
其中，L1为-HNC(O)-或-C(O)NH-；
L2为-(CH2)n1-或-(CH2CH2O)n2CH2-，其中n1和n2为1-7的整数；
Z1为-(CH2)n3-，其中n3为1-7的整数；
L3为-HNC(O)-或-C(O)NH-；
n为0-10的整数；
L4为-(CH2)n4-，其中n4为0-7的整数；
A为，R1为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基或卤素；R2为4, 4'-二甲氧基三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基或异丙基二甲基甲硅烷基；R3为氢、羟基保护基、含磷活性反应基团、-CO(CH2)xCONH-E或-CO(CH2)xCOOH，其中x是1-10的整数，E为可控孔玻璃(CPG)或聚苯乙烯；
B为氧或硫；
G为；
其中，
X1为-(CH2)a-或-(CH2CH2O)aCH2-，a是1-5的整数；
X2为-HNC(O)-或-C(O)NH-；
X3为-(CH2)b-，b是1-6的整数；
X4为，其中c，d为0-5的整数；
Y1为0或1；
Y2为0或1；
Y3为1，2或3；
当Y3为1时，K为CH2；Y3为2时，K为CH；Y3为3时，K为碳。
在本发明的一些实施方案中，L1为-C(O)NH-*，*端与G连接。
在本发明的一些实施方案中，L2为-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-或-(CH2CH2O)3CH2-。
在本发明的一些实施方案中，L2为-(CH2)5-或-(CH2CH2O)3CH2-。
在本发明的一些实施方案中，n为0。
在本发明的一些实施方案中，L4为不存在、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-或-(CH2)7-。
在本发明的一些实施方案中，L4为不存在、-(CH2)3-或-(CH2)5-。
在本发明的一些实施方案中，R1为氢或甲氧基。
在本发明的一些实施方案中，R2为4, 4'-二甲氧基三苯甲基（DMTr）。
在本发明的一些实施方案中，R3为-CO(CH2)2CONH-E，E为可控孔玻璃。
在本发明的一些实施方案中，B为氧。
在本发明的一些实施方案中，X1为-(CH2)3-。
在本发明的一些实施方案中，X2为-HNC(O)-**，**端与X3连接。
在本发明的一些实施方案中，X3为-(CH2)2-、-(CH2)4-或-(CH2)5-。
在本发明的一些实施方案中，X4为，***端与X3连接。
在本发明的一些实施方案中，Y1为1。
在本发明的一些实施方案中，Y2为1。
在本发明的一些实施方案中，Y3为3，K为碳。
在本发明的一些实施方案中，A为或，E为可控孔玻璃。
在本发明的一些实施方案中，G为：
、
或
。
在本发明的一些实施方案中，所述如式（I）所示的化合物具有如式(IA)所示的结构：
,
其中，L1、L2、L4、B、A、X1、X2、X3、X4、Y1和Y2的定义如上所述。
在本发明的一些实施方案中，所述如式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐能够结合脱唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）。
在本发明的一些实施方案中，所述如式（I）所示的化合物为如下任一化合物：
、
、、、或。
本发明还提供了一种如式（IIA）或（IIB）所示的缀合物或其药学上可接受的盐，
或
其中，Oligo代表寡核苷酸，X代表羟基或巯基，G1为；
L1、L2、Z1、L3、L4、n、R1、R2、R3、X1、X2、X3、X4、Y1、Y2、Y3和K的定义如上所述。
本领域技术人员可以理解的是，所述如式（IIA）或（IIB）所示的缀合物中，结构单元是所述寡核苷酸在固相合成中，通过单体与五元糖环（即或）中的羟基连接后形成的。
所述的如式（IIA）所示的缀合物中，R3优选为氢。
所述的如式（IIB）所示的缀合物中，R2优选为氢。
在本发明的一些实施方案中，所述寡核苷酸选自由小干扰核苷酸（siRNA）、DNA、微小RNA（miRNA）、小激活RNA（saRNA）、小向导RNA（small guide RNA, sgRNA）、转运RNA（tRNA）、反义寡核苷酸（ASO）和适配体（Aptamer）组成的组中的任一者或至少两者的组合，优选为反义寡核苷酸（ASO）或小干扰核苷酸（siRNA）。
在本发明的一些实施方案中，所述反义寡核苷酸（ASO）或小干扰核苷酸（siRNA）中每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，所述寡核苷酸调节靶基因的表达。
在本发明的一些实施方案中，所述寡核苷酸为双链RNAi剂。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂为抑制PCSK9基因表达的双链RNAi剂。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂至少一个链包含至少1个核苷酸的3'突出端。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂至少一个链包含至少2个核苷酸的3'突出端。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂双链区为15-30对核苷酸的长度。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂双链区为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30对核苷酸的长度。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂双链区为17-25对核苷酸的长度。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂双链区为19-23对核苷酸的长度。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂双链区为21对核苷酸的长度。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂各链具有15-30个核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂的正义链和/或反义链的核苷酸个数各自选自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30中的任一者。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂各链具有19-25个核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂正义链具有21个核苷酸，反义链具有23个核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂为包含选自由如下表中所列无修饰正义链和无修饰反义链配对形成的寡核苷酸双链体组成的组中的任一者或至少两者的组合（序列出自CN117210468A说明书表8）：
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂的正义链与SEQ ID NO. 1-12中任一序列相比具有1~3个核苷酸的替换、增加或删除。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂的反义链与SEQ ID NO. 13-24中任一序列相比具有1~3个核苷酸的替换、增加或删除。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂包含至少一个修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸选自由脱氧-核苷酸、3'-末端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、解锁核苷酸、构型限制性核苷酸、限制性乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基-修饰的核苷酸、2'-C-烷基-修饰的核苷酸、2'-羟基-修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基-修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基的核苷酸、包含甲基磷酸酯基的核苷酸、包含5'-磷酸酯的核苷酸和包含5'-磷酸酯模拟物的核苷酸组成的组中的任一者或至少两者的组合。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂正义链及反义链的核苷酸修饰方式为核苷酸核糖的2'位的化学修饰。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂核苷酸核糖的2'位的化学修饰选自由2'-甲氧基修饰、2'-O-甲氧基乙基修饰、2'-氟代修饰、2'-苄氧基修饰、2'-甲基羰基氨基修饰和2'-吡啶甲氧基修饰组成的组中的任一者或至少两者的组合。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂各核苷酸核糖的2'位的化学修饰选自2'-甲氧基和2'-氟代的组合。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂各核苷酸核糖的2'位的化学修饰方式为：正义链奇数位均为2'-氟代修饰，且偶数位均为2'-甲氧基修饰；反义链奇数位均为2'-甲氧基修饰，且偶数位均为2'-氟代修饰。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂核苷酸单体之间通过3',5'-磷酸二酯键连接。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂核苷酸单体之间通过硫代修饰的3',5'-磷酸二酯键连接。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂具有以下修饰：
反义链具有以下A、B、C修饰方式中的任一种：
正义链具有以下a、b修饰方式中的任一种：
表中2'-OMe为2'-甲氧基；2'-F为2'-氟代；PS为硫代磷酸骨架。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂的反义链具有以下（I）~（X）修饰方式中的任一者：
（I）自5’-3’方向，第2、3、4、6、14、16位均为2'位氟代修饰，第7位为GNA修饰，其它位均为2'位甲氧基修饰；第1、2位核苷酸之间、第2、3位核苷酸之间、倒数第1、2位核苷酸之间、倒数第2、3位核苷酸之间均为硫代磷酸酯键连接；
（II）自5’-3’方向，第2、3、4、6、14、16位均为2'位氟代修饰，其它位均为2'位甲氧基修饰；第1、2位核苷酸之间、第2、3位核苷酸之间、倒数第1、2位核苷酸之间、倒数第2、3位核苷酸之间均为硫代磷酸酯键连接；
（III）自5’-3’方向，第2、3、4、6、14、16位均为2'位氟代修饰，其它位均为2'位甲氧基修饰；第1、2位核苷酸之间、第2、3位核苷酸之间、倒数第1、2位核苷酸之间、倒数第2、3位核苷酸之间均为硫代磷酸酯键连接；第1位为5'-反式乙烯基磷酸核苷酸；
（IV）自5’-3’方向，第2、4、5、6、14、16位均为2'位氟代修饰，第7位为GNA修饰，其它位均为2'位甲氧基修饰；第1、2位核苷酸之间、第2、3位核苷酸之间、倒数第1、2位核苷酸之间、倒数第2、3位核苷酸之间均为硫代磷酸酯键连接；第1位为5'-反式乙烯基磷酸核苷酸；
（V）自5’-3’方向，第2、4、5、6、14、16位均为2'位氟代修饰，其它位均为2'位甲氧基修饰；第1、2位核苷酸之间、第2、3位核苷酸之间、倒数第1、2位核苷酸之间、倒数第2、3位核苷酸之间均为硫代磷酸酯键连接；
（VI）自5’-3’方向，第2、4、5、6、14、16位均为2'位氟代修饰，其它位均为2'位甲氧基修饰；第1、2位核苷酸之间、第2、3位核苷酸之间、倒数第1、2位核苷酸之间、倒数第2、3位核苷酸之间均为硫代磷酸酯键连接；第1位为5'-反式乙烯基磷酸核苷酸；
（VII）自5’-3’方向，第2、6、14、16位均为2'位氟代修饰，第7位为GNA修饰，其它位均为2'位甲氧基修饰；第1、2位核苷酸之间、第2、3位核苷酸之间、倒数第1、2位核苷酸之间、倒数第2、3位核苷酸之间均为硫代磷酸酯键连接；
（VIII）自5’-3’方向，第2、6、14、16位均为2'位氟代修饰，其它位均为2'位甲氧基修饰；第1、2位核苷酸之间、第2、3位核苷酸之间、倒数第1、2位核苷酸之间、倒数第2、3位核苷酸之间均为硫代磷酸酯键连接；
（IX）自5’-3’方向，第2、6、14、16位均为2'位氟代修饰，其它位均为2'位甲氧基修饰；第1、2位核苷酸之间、第2、3位核苷酸之间、倒数第1、2位核苷酸之间、倒数第2、3位核苷酸之间均为硫代磷酸酯键连接；第1位为5'-反式乙烯基磷酸核苷酸；
（X）自5’-3’方向，第2、4、5、6、8、10、12、14、16、18位均为2'位氟代修饰，其它位均为2'位甲氧基修饰；第1、2位核苷酸之间、第2、3位核苷酸之间、倒数第1、2位核苷酸之间、倒数第2、3位核苷酸之间均为硫代磷酸酯键连接。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂的正义链具有以下（1）~（3）修饰方式中的任一者：
（1）自5’-3’方向，第7、9、10、11、17位均为2'位氟代修饰，其它位均为2'位甲氧基修饰；第1、2位核苷酸之间、第2、3位核苷酸之间均为硫代磷酸酯键连接；
（2）自5’-3’方向，第7、9、11、17位均为2'位氟代修饰，其它位均为2'位甲氧基修饰；第1、2位核苷酸之间、第2、3位核苷酸之间均为硫代磷酸酯键连接；
（3）自5’-3’方向，第7、9位均为2'位氟代修饰，其它位均为2'位甲氧基修饰；第1、2位核苷酸之间、第2、3位核苷酸之间均为硫代磷酸酯键连接，第11位为胸腺嘧啶核苷。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂具有以下修饰中的任一者：
反义链具有上述修饰方式A，且正义链具有上述修饰方式a；
反义链具有上述修饰方式B，且正义链具有上述修饰方式a；
反义链具有上述修饰方式C，且正义链具有上述修饰方式a；
反义链具有上述修饰方式B，且正义链具有上述修饰方式b；
反义链具有上述修饰方式C，且正义链具有上述修饰方式b。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂反义链自5'端起第二至第八位中具有修饰基团，其中所述修饰基团为UNA、GNA或DNA，其中UNA和GNA结构如下：
；碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
在本发明的一些实施方案中，所述的双链RNAi剂修饰的反义链5'末端核苷酸糖苷的5'位碳原子的磷酸化，包括但不限于以下5'位磷酸化基团：5'-乙烯基膦酸酯基团(5'-E-VP)；5'-甲基膦酸酯基团(5'-MP)；5'-C-甲基磷酸酯基团；5'-硫代磷酸酯基团(5'-PS)；5'-磷酸酯基团(5'-P），其结构示意如下：
；
其中，R为氢、羟基、胺基、C1-4烷基、芳香基、C1-4烷氧基、C1-4烷基羰基氨基或卤素；
碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
在本发明的一些实施方案中，所述双链RNAi剂为包含如下表中所列修饰的正义链和修饰的反义链配对组成的任一寡核苷酸双链体（序列出自CN117210468A说明书表38）：
在本发明的一些实施方案中，所述如式（IIA）或（IIB）所示的缀合物由双链RNAi剂与如前所述的YK-GAL-401、YK-GAL-402、YK-GAL-403、YK-GAL-404、YK-GAL-405或YK-GAL-406缀合，所述双链RNAi剂包含以下正义链和反义链配对组成的任一寡核苷酸双链体：
（1）所述正义链具有如SEQ ID NO. 29所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 41所示的序列；
（2）所述正义链具有如SEQ ID NO. 30所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 42所示的序列；和
（3）所述正义链具有如SEQ ID NO. 30所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 41所示的序列。
在本发明的一些实施方案中，所述缀合物由双链RNAi剂与如前所述的YK-GAL-401、YK-GAL-402、YK-GAL-403、YK-GAL-404、YK-GAL-405或YK-GAL-406缀合，所述双链RNAi剂包含由SEQ ID NO. 30所示的正义链和SEQ ID NO. 41所示反义链配对组成的寡核苷酸双链体。
在本发明的一些实施方案中，所述如式（IIA）或（IIB）所示的缀合物由双链RNAi剂与如前所述的YK-GAL-401、YK-GAL-402、YK-GAL-403、YK-GAL-404、YK-GAL-405或YK-GAL-406缀合，所述双链RNAi剂序列如下：
正义链：5’-Cms-Ums-Am-Gm-Am-Cm-Cf-Um-Gf-Um-dT-Um-Um-Gm-Cm-Um-Um-Um-Um-Gm-Um-3’ (SEQ ID NO. 46)；
反义链：5’-Ams-Cfs-Am-Af-Af-Af-Gm-Cf-Am-Af-Am-Af-Cm-Af-Gm-Gf-Um-Cf-Um-Am-Gms-Ams-Am-3’ (SEQ ID NO. 47)。
在本发明的一些实施方案中，所述如式（IIA）所示的缀合物为如下任一缀合物：
、
、
、
、
或
；
其中，siRNA的正义链具有如SEQ ID NO. 46所示的序列；siRNA的反义链具有如SEQ ID NO. 47所示的序列。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含如上所述的如式（IIA）或（IIB）所示的缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。
本发明还提供了一种如上所述的如式（IIA）或（IIB）所示的缀合物或如上所述的药物组合物在制备治疗和/或预防由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
在本发明的一些实施方案中，所述由肝细胞中特定基因的表达而引起的疾病选自慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病、肝增生性疾病、血脂异常和补体相关疾病。
本发明还提供了一种抑制肝细胞中特定基因表达的方法，其中，所述方法包括将有效量的如上所述的如式（IIA）或（IIB）所示的缀合物与所述肝细胞进行接触。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的如式（IIA）或（IIB）所示的缀合物。
本发明中提及的所有出版物和专利在此通过引用以它们的全部内容纳入本发明。如果通过引用纳入的任何出版物和专利中使用的用途或术语与本发明中使用的用途或术语冲突，那么以本发明的用途和术语为准。
本文所用的章节标题仅用于组织文章的目的，而不应被解释为对所述主题的限制。
除非另有规定，本文使用的所有技术术语和科学术语具有要求保护主题所属领域的通常含义。倘若对于某术语存在多个定义，则以本文定义为准。
除了在工作实施例中或另外指出之外，在说明书和权利要求中陈述的定量性质例如剂量的所有数字应理解为在所有情况中被术语“约”修饰。还应理解的是，本发明列举的任何数字范围意在包括该范围内的所有的子范围和该范围或子范围的各个端点的任何组合。
本发明中使用的“包括”、“含有”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的要素涵盖出现在该词后面列举的要素及其等同，而不排除未记载的要素。本文所用的术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…组成”、或“由…组成”。
本发明中“羟基保护基”是指在RNA或其衍生物的合成中通常被用于保护核糖结构的羟基的保护基团，例如乙酰基、苯氧乙酰基、新戊酰基、苄基、4-甲氧基苄基、苯甲酰基、三苯基甲基、4, 4’-二甲氧基三苯甲基(DMr, 4 ,4 '-dimethoxytrityl)、单甲氧基三苯甲基(MMTr，monomethoxytrityl)、9-苯基-呫吨-9-基(9-phenylxanthen-9-yl)、9-对甲苯基-呫吨-9-基(9-(p-tolyl)-xanthen-9-yl)、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、氰基甲氧基甲基、2-(氰基乙氧基)乙基、氰基乙氧基甲基等，优选4 ,4’-二甲氧基三苯甲基。
本发明中“含磷活性反应基团”是指能够通过亲核攻击反应，与包含在另一个分子中、尤其是另一个核苷酸单元中或另一个核苷酸类似物中的羟基或胺基发生反应的含磷基团。通常，这样的反应产生核苷酸单元或核苷酸类似物单元与另一个核苷酸单元或核苷酸类似物单元连接的酯型核苷间键。这些含磷活性反应基团是本领域已知的并且包含PIII或PV价态的磷原子，所述含磷活性反应基团包括但不限于亚磷酰胺、H-膦酸酯、磷酸三酯和含磷手性助剂，例如。
本发明中可控孔玻璃(CPG)和聚苯乙烯(高度交联的聚苯乙烯微珠)是用于寡核苷酸合成的固体载体，是在合成过程中与寡核苷酸结合的不溶性颗粒，是可商购的。
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
术语“烷基”是指具有指定的碳原子数（例如C1~C6）的直链或支链烷基。烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。
术语“烷氧基”是指基团RX-O-，其中，RX为上文所定义的烷基。
术语“药学上可接受的盐”是指化合物与药学上可接受的（相对无毒、安全、适合于患者使用）酸或碱反应得到的盐。当化合物中含有相对酸性的官能团时，可以通过在合适的惰性溶剂中用足量的药学上可接受的碱与化合物的游离形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括但不限于钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、镁盐、铋盐、铵盐等。当化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在合适的惰性溶剂中用足量的药学上可接受的酸与化合物的游离形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐包括但不限于盐酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐等。
本发明中术语“药学上可接受的赋形剂”是指除活性成分以外，包含在药物制剂中的所有物质。
术语“治疗”是指下述任一情形：（1）缓解疾病的一种或多种生物学表现；（2）干扰引发疾病的生物级联中的一个或多个点；（3）减缓疾病的一种或多种生物学表现发展。
术语“预防”是指降低发生疾病的风险。
本发明中的寡核苷酸包括单链寡核苷酸（例如反义寡核苷酸，简称ASO）和双链寡核苷酸（例如小干扰核苷酸，简称siRNA）。
本发明中的寡核苷酸包括天然的寡核苷酸和化学修饰的寡核苷酸。此处的化学修饰包括核苷修饰(包括糖部分修饰和核碱基修饰)和核苷间键联修饰。寡核苷酸的化学修饰不包括仅在核碱基序列上有差异的情形。此处的天然是指天然存在的RNA或DNA对应的情形。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明设计了一系列新型GalNAc化合物，与现有技术GalNAc化合物相比，化学结构完全不同。本发明设计的GalNAc化合物，在连接臂中引入了三氮唑结构，凭借点击化学的优势，可以快速构筑一系列新型含三氮唑结构的GalNAc化合物。由本发明GalNAc化合物制备的GalNAc寡核苷酸缀合物，可以实现高效肝靶向递送，相比于现有技术代表性GalNAc化合物活性显著提升。
1. 本发明GalNAc化合物YK-Gal-401~YK-Gal-403制备的寡核苷酸缀合物与现有技术GalNAc相比，对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率显著提升。例如，inc-YK-Gal-401第7天抑制率比inc-YK-Gal-301、inc-GalNAc 1b和inc-NAG0052提高了21.5%、14.5%和12.7%，第14天抑制率分别提高了17.3%、10.4%和10.8%。
1）由本发明GalNAc化合物缀合的siRNA，对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率具有显著差异，YK-Gal-401~YK-Gal-403显著高于YK-Gal-404~406。例如，inc-YK-Gal-401在第7天和第14天分别比inc-YK-Gal-404提高了20.7%和16.0%。
2）本发明GalNAc化合物YK-Gal-401~YK-Gal-403与现有技术GalNAc化合物相比，缀合的siRNA对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率显著提高。例如，inc-YK-Gal-401在第7天和第14天分别比inc-YK-Gal-301提高了21.5%和17.3%。
3）结构相近的GalNAc化合物与siRNA的缀合物，对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率具有显著差异。因此，并不是化学结构相近的GalNAc化合物对寡核苷酸递送效率就一定接近，其制备的GalNAc寡核苷酸缀合物对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率并不一致，可能具有非常大的差异。
2. 本发明GalNAc化合物YK-Gal-401~YK-Gal-403制备的寡核苷酸缀合物与现有技术GalNAc相比，对小鼠肝脏中PCSK9基因表达抑制率显著提升。例如，inc-YK-Gal-401抑制率分别比inc-YK-Gal-301和inc-GalNAc 1b提高了21.1%和9.8%，显著提升。
1）由本发明GalNAc化合物缀合的siRNA，对小鼠肝脏中PCSK9基因表达抑制率具有显著差异，YK-Gal-401~YK-Gal-403显著高于YK-Gal-404~YK-Gal-406。例如，inc-YK-Gal-401比inc-YK-Gal-404提高了19.4%。
2）本发明GalNAc化合物YK-Gal-401~ YK-Gal-403与现有技术GalNAc化合物相比，缀合的siRNA对小鼠肝脏中PCSK9基因表达抑制率显著提高。例如，inc-YK-Gal-401比inc-YK-Gal-301提高了21.1%。
3）结构相近的GalNAc化合物与siRNA的缀合物，对小鼠肝脏中PCSK9基因表达抑制率具有显著差异。因此，并不是化学结构相近的GalNAc化合物对寡核苷酸递送效率就一定接近，其制备的GalNAc寡核苷酸缀合物对小鼠肝脏中PCSK9基因达抑制率并不一致，可能具有非常大的差异。
3. 本发明GalNAc化合物YK-Gal-401~YK-Gal-403制备的寡核苷酸缀合物与现有技术GalNAc相比，对小鼠血清中LDL-C降低水平显著提升。例如，inc-YK-Gal-401组小鼠第14天LDL-C降低水平，分别比inc-YK-Gal-301、inc-GalNAc 1b和NAG0052组提高了36.4%、20.6%和17.8%，显著提升。
1）由本发明GalNAc化合物缀合的siRNA，对小鼠血清中LDL-C水平的降低具有显著差异，YK-Gal-401~YK-Gal-403降低水平显著高于YK-Gal-404~406。例如，inc-YK-Gal-401在第7天和第14天分别比inc-YK-Gal-404提高了33.0%和36.0%，显著提升。
2）本发明GalNAc化合物YK-Gal-401~YK-Gal-403与现有技术GalNAc化合物相比，缀合的siRNA对小鼠血清中LDL-C降低水平显著提高。例如，inc-YK-Gal-401在第7天和第14天分别比inc-YK-Gal-301提高了33.4%和36.4%。
3）结构相近的GalNAc化合物与siRNA的缀合物，对小鼠血清中LDL-C降低水平具有显著差异。因此，并不是化学结构相近的GalNAc化合物对寡核苷酸递送效率就一定接近，其制备的GalNAc寡核苷酸缀合物对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率并不一致，可能具有非常大的差异。
4. 本发明设计化合物可将寡核苷酸高效递送至肝脏。
例如，inc-YK-Gal-401、inc-YK-Gal-402和inc-YK-Gal-403组在4小时肝脏荧光强度分别可达9.03E+09、8.79E+09和8.92E+09，在8小时分别可达9.11E+09、8.95E+09和9.01E+09，表明本发明设计的GalNAc化合物可将寡核苷酸高效递送至动物肝脏。
附图说明
图1为各受试药组（inc-YK-Gal-401、inc-YK-Gal-402、inc-YK-Gal-403、inc-YK-Gal-404、inc-YK-Gal-405、inc-YK-Gal-406、inc-YK-Gal-301、inc-GalNAc 1b和inc-NAG0052）给药后7天和给药后14天对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率。
图2为各受试药组（inc-YK-Gal-401、inc-YK-Gal-402、inc-YK-Gal-403、inc-YK-Gal-404、inc-YK-Gal-405、inc-YK-Gal-406、inc-YK-Gal-301、inc-GalNAc 1b和inc-NAG0052）给药后14天对小鼠肝脏中PCSK9基因表达抑制率。
图3为各受试药组（inc-YK-Gal-401、inc-YK-Gal-402、inc-YK-Gal-403、inc-YK-Gal-404、inc-YK-Gal-405、inc-YK-Gal-406、inc-YK-Gal-301、inc-GalNAc 1b和inc-NAG0052）给药后7天和给药后14天对小鼠血清中LDL-C降低水平。
图4为各受试药组（inc-YK-Gal-401、inc-YK-Gal-402、inc-YK-Gal-403、inc-YK-Gal-404、inc-YK-Gal-405、inc-YK-Gal-406、inc-YK-Gal-301、inc-GalNAc 1b和inc-NAG0052）给药后4小时和8小时，小鼠肝脏及肾脏中荧光强度。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明可在不偏离本发明基本属性的情况下以其它具体形式来实施。应该理解的是，在不冲突的前提下，本发明的任一和所有实施方案都可与任一其它实施方案或多个其它实施方案中的技术特征进行组合以得到另外的实施方案。本发明包括这样的组合得到的另外的实施方案。
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明中具体实施例中，所使用的原料均可通过市售获得。除非另有说明，所有的温度以摄氏度给出。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
以下缩写字母分别代表如下试剂：DCM：二氯甲烷；PE：石油醚；EA：乙酸乙酯；THF：四氢呋喃；DMF：N, N-二甲基甲酰胺；ACN：乙腈；KOH：氢氧化钾；DCE：1,2-二氯乙烷；TsOH·H2O：一水合对甲苯磺酸；EDCI：1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐；HOBt：1-羟基苯并三唑； THPTA：三(3-羟丙基三唑甲基)胺；VC Na：抗坏血酸钠；TFA：三氟乙酸；TEAB：三乙胺碳酸氢铵水溶液；HBTU：O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐；DIPEA：N, N-二异丙基乙胺；DMAP：4-二甲氨基吡啶；TMSOTf：三甲硅烷基三氟甲磺酸酯；Py：吡啶；Ac2O：乙酸酐；CPG-NH2：氨基修饰的可控孔玻璃（来自药明康德）。
实施例1：GalNAc化合物的合成
1. YK-GAL-401的合成
合成路线如下：
步骤1：G1-2的合成
将化合物G1-1（5.0 g, 22.6 mmol, 1.0 eq）溶解在无水DMF（60.0 mL）中，0 °C搅拌。随后加入炔丙基溴（40.3 g, 271 mmol, 29.2 mL, 12.0 eq），15分钟内将研磨细的KOH（15.2 g, 271 mmol, 12.0 eq）分批加入反应液中。升温至35 °C搅拌24 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失。反应液中加入乙酸乙酯（300 mL），用水洗（50 mL × 3）。有机相用Na2SO4干燥，过滤后经减压浓缩除去溶剂，粗产物经硅胶柱纯化（石油醚/乙酸乙酯），得黄色油状物G1-2（5.30 g, 15.8 mmol, 69.9 % yield）。MS (ESI) m/z [M - H]- : 334.2；1H NMR:δ ppm 4.90 (s, 1 H), 4.14 (d, J = 2.4, 6 H), 3.77 (s, 6 H), 2.43-2.41 (m, 3H), 1.41 (s, 9 H)。
步骤2：G1-4的合成
将化合物G1-3（22.3 g, 57.3 mmol, 1.2 eq）溶解在DCE（200 mL）中，加入3Å分子筛（20.0 g），降至0 °C。接着，在0 °C下先后加入TMSOTf（21.2 g, 95.6 mmol, 17.3 mL,2.0 eq）和3-(苄氧羰基氨基)-1-丙醇（10.0 g, 47.8 mmol, 1.0 eq）。升温至15 °C继续搅拌10 min。取样用LC/MS检测，显示原料消失。反应液中加入饱和碳酸氢钠溶液（200 mL），用二氯甲烷萃取（200 mL × 3）。有机相用Na2SO4干燥，过滤后经减压浓缩除去溶剂，粗产物经硅胶柱纯化（石油醚/乙酸乙酯），得白色固体G1-4（13.4 g, 24.9 mmol, 52.1% yield）。MS(ESI) m/z [M + H]+: 539.1；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.38 - 7.29 (m, 5 H),6.31 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 5.33 - 5.28 (m, 1 H), 5.14 - 5.02 (m, 3 H), 4.98(dd, J = 11.1, 3.3 Hz, 1 H), 4.32 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 4.16 - 4.09 (m, 3 H),3.98 - 3.93 (m, 1 H), 3.76 (t, J = 6.7 Hz, 1 H), 3.57 - 3.48 (m, 1 H), 3.39(td, J = 9.9, 3.1 Hz, 1 H), 3.12 - 3.05 (m, 1 H), 2.13 (s, 3 H), 2.04 (s, 3H), 1.99 (s, 3 H), 1.93 (s, 3 H), 1.83 - 1.76 (m, 1 H), 1.65 - 1.57 (m, 1 H)。
步骤3：G1-5的合成
将化合物G1-4（13.0 g, 24.1 mmol, 1.0 eq）和TsOH·H2O（4.59 g, 24.1 mmol,1.0 eq）加入到钯碳（6.50 g, 26.4 mmol, 1.09 eq）的四氢呋喃（130 mL）溶液中。在氢气（15 psi）条件下，反应液25 °C搅拌2 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失。反应液过滤后经减压浓缩除去溶剂，得白色固体粗产物G1-5（15.0 g）。MS (ESI) m/z [M - H]- : 403.2。
步骤4：G1-6的合成
将EDCI（7.47 g, 38.9 mmol, 1.05 eq），HOBt（5.51 g, 40.8 mmol, 1.1 eq）加入到5-叠氮戊酸（5.31 g, 37.1 mmol, 1.0 eq）的二氯甲烷溶液（150 mL）中，降至0 °C。接着，将DIPEA（9.59 g, 74.2 mmol, 12.9 mL, 2.0 eq）和化合物G1-5（15.0 g, 37.1 mmol,1.0 eq）先后加入到上述溶液中。升温至20 °C继续搅拌1 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失。反应液用二氯甲烷稀释（150 mL），饱和NaHCO3（150 mL × 3）洗涤。有机相用Na2SO4干燥，过滤后经减压浓缩除去溶剂，得无色液体粗产物G1-6（18.0 g）。MS (ESI) m/z [M -H]- : 528.3；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 6.30 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 6.17 (dd,J = 7.1, 4.6 Hz, 1 H), 5.34 (dd, J = 3.4, 1.1 Hz, 1 H), 5.03 (dd, J = 11.2,3.4 Hz, 1 H), 4.44 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.29 - 4.08 (m, 3 H), 4.03 -3.98 (m,1 H), 3.88 (td, J = 6.7, 1.2 Hz, 1 H), 3.71 -3.57 (m, 1 H), 3.45 (td, J =9.2, 3.5 Hz, 1 H), 3.31 (t, J = 6.7 Hz, 2 H), 3.14 -3.02 (m, 1 H), 2.27 (t, J= 7.2 Hz, 2 H), 2.16 (s, 3 H), 2.04 (s, 3 H), 2.00 (s, 3 H), 1.96 (s, 3 H),1.84 - 1.58 (m, 6 H)。
步骤5：G1-7的合成
将G1-2（400 mg, 1.19 mmol, 1.0 eq）加入到G1-6（2.53 g, 4.77 mmol, 4.0eq）的DMSO溶液（50.0 mL）中。接着，将CuSO4（1.71 g, 10.7 mmol, 1.65 mL, 9.0 eq）和THPTA（3.11 g, 7.16 mmol, 6.0 eq）加入到水中（15.0 mL）, 随后加入VC Na（3.54 g,17.89 mmol, 15.0 eq）配置成水溶液，将该水溶液加入到上述DMSO溶液中，25 °C搅拌2 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失。反应液用二氯甲烷稀释（100 mL），用水洗（100 mL ×2）。有机相用Na2SO4干燥，过滤后经减压浓缩除去溶剂，粗产物经硅胶柱纯化（石油醚/乙酸乙酯，二氯甲烷/甲醇），得白色固体G1-7（1.90 g, 987.5 μmol, 82.8% yield）。MS (ESI)m/z [M – 2 H]2- : 960.8；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.62 (s, 3 H), 6.99 (d, J= 9.0 Hz, 3 H), 6.73 (t, J = 6.2 Hz, 3 H), 5.32 (d, J = 3.3 Hz, 3 H), 5.28(s, 3 H), 5.05 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 3 H), 4.55- 4.49 (m, 10 H), 4.37 (t, J= 7.0 Hz, 6 H), 4.27- 4.06 (m, 10 H), 4.00- 3.95 (m, 3 H), 3.92- 3.85 (m, 3H), 3.67 (s, 6 H), 3.54- 3.42 (m, 6 H), 3.13 - 3.08 (m, 3 H), 2.32 - 2.23 (m,7 H), 2.13 (s, 10 H), 2.01 (s, 10 H), 1.96 (s, 10 H), 1.88 (s, 9 H), 1.70-1.61 (m, 9 H), 1.38 (s, 10 H)。
步骤6：G1-8的合成
将三氟乙酸（9.21 g, 80.7 mmol, 6.00 mL, 81.7 eq）加入到G1-7（1.90 g, 988μmol, 1.0 eq）的二氯甲烷溶液（18.0 mL）中，25 °C搅拌0.5 h。取样用TLC（二氯甲烷/甲醇）检测，显示原料消失。反应液直接经减压浓缩除去溶剂，粗产物与甲苯（50.0 mL）共旋蒸三次，得黄色油状物G1-8（1.80 g, 967 μmol, 97.8% yield, 98.0% purity）。LC/MS(ESI) m/z [M – 2 H]2- : 910.7。
步骤7：G1-10的合成
将HBTU（174 mg, 460 μmol, 1.5 eq）和DIPEA（79.4 mg, 614 μmol, 107 μL,2.0 eq）加入到G1-9（制备方法参考CN116854754B）（200 mg, 307 μmol, 1.0 eq）的DMF溶液（3.0 mL）中。接着，将粗产物G1-8（955 mg, 491 μmol, 1.6 eq, TFA）（用DIPEA调节pH ~7）加入到上述反应液中，25 °C搅拌6 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失。反应液直接用于下一步。MS (ESI) m/z [M – 2 H]2-: 1227.0。
步骤8：G1-11的合成
将G1-10（750 mg, 305 μmol, 1.0 eq）加入到DMF（4.0 mL）中。随后再加入DIPEA（118 mg, 915 μmol, 159 μL, 3.0 eq），丁二酸酐（244 mg, 2.44 mmol, 8.00 eq）和DMAP（37.3 mg, 305 μmol, 1.0 eq），该反应液在25 °C搅拌40 h。取样用LC/MS检测，主峰为目标产物。将反应液过滤，滤液用制备色谱纯化，得白色固体G1-11（120.0 mg, 46.0 μmol）。MS (ESI) m/z [M – 2 H]2-: 1276.8；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.55 (s, 2H), 7.43-7.36 (m, 2H), 7.26 (dd, J = 9.1, 2.8 Hz, 3H), 7.21- 7.17 (m, 6H), 7.11 (dd, J= 8.3, 6.2 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.76 - 6.70 (m, 3H), 6.68 (t, J= 6.0 Hz, 2H), 5.28 (d, J = 3.3 Hz, 2H), 5.09 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 5.00 (dd,J = 11.2, 3.4 Hz, 2H), 4.93 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 4.57 - 4.41 (m, 7H), 4.32(t, J = 6.9 Hz, 4H), 4.24 - 4.00 (m, 8H), 3.95- 3.90 (m, 2H), 3.86- 3.82 (m,3H), 3.71- 3.61 (m, 10H), 3.48 - 3.37 (m, 5H), 3.34 - 3.29 (m, 3H), 3.18 -3.02 (m, 5H), 2.73 (q, J = 7.3 Hz, 7H), 2.64- 2.57 (m, 2H), 2.47 (t, J = 6.9Hz, 2H), 2.32 - 1.75 (m, 54H), 1.72- 1.58 (m, 11H), 1.50- 1.41 (m, 4H), 1.19- 1.09 (m, 20H)。
步骤9：YK-GAL-401的合成
将G1-11（160 mg, 62.5 μmol, 1.0 eq）加入到DMF（10.0 mL）中。随后再加入DIPEA（64.7 mg, 500 μmol, 87.20 μL, 8.0 eq），HBTU（118 mg, 312 μmol, 5.0 eq），DMAP（37.3 mg, 305 μmol, 1.0 eq）和CPG-NH2（1.1 g），该反应液在40 °C搅拌16 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失。将反应液过滤，滤饼先后用MeOH（20 mL × 4）和DCM（20 mL× 4）洗涤，在氮气条件下干燥，得淡黄色固体，直接用于下一步。
将粗产物（1.2 g）溶于吡啶（10.0 mL）中。随后再加入乙酸酐（2.17 g, 21.3mmol, 2.0 mL, 45.3 eq），该反应液在40 °C搅拌1 h，随后将反应液过滤，滤饼先后用MeOH（20 mL × 4）和DCM（20 mL × 4）洗涤，在氮气条件下干燥，得淡黄色固体YK-GAL-401（1.0g，载量：37.1 μmol/g）。
载体载量通用测定方法：在 1.5 mL 离心管中称取YK-GAL-401, 然后在离心管中加入 1.0 mL PTSA（CAS：104-15-4）（0.1 M 的 ACN 溶液）。密封试管并混合均匀。溶液呈橙色，静置 1 小时。取 100 uL 溶液，加入 4.0 mL 离心管。在离心管中加入 3.0 mL PTSA（0.1 M 的 ACN 溶液）。密封试管并混合均匀，用PTSA（0.1 M在ACN中）填充参考比色皿。测量空白溶液在411nm处的吸光度。用样品溶液填充比色皿，测量样品溶液在411nm处的吸光度，通过计算可得载量。
2. YK-GAL-402的合成
合成路线如下：
步骤1：G2-3的合成
将化合物G2-1（1.30 g, 11.3 mmol, 1.04 eq）和G2-2（2.00 g, 10.9 mmol, 1.0eq）溶解在无水乙酸乙酯（20.0 mL）中，冷却至0 °C。随后分批加入EDCI（2.17 g, 11.3mmol, 1.04 eq），0 °C继续搅拌1 h。随后缓慢升温至25 °C搅拌4 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失。反应液依次用水洗（20 mL × 3）、10%NaHCO3水溶液洗（20 mL × 3）、水洗（20mL × 2）、5%KHSO4水溶液洗（20 mL × 2）和水洗（20 mL × 3）。有机相用Na2SO4干燥，过滤后经减压浓缩除去溶剂，得褐色油状物G2-3（2.50 g, 8.89 mmol, 81.8% yield）。1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ ppm 3.72 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 2.94 (t, J = 6.4 Hz, 2 H)；19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ -152.54 - -152.63 (m, 2 F), -157.46 (t, J = 21.8Hz, 1 F), -161.98 - -162.13 (m, 2 F)。
步骤2：G2-4的合成
将DIPEA（1.54 g, 11.9 mmol, 2.08 mL, 2.0 eq）加入到化合物G1-5（3.55 g,5.97 mmol, 1.0 eq）和化合物G2-3（1.68 g, 5.97 mmol, 1.0 eq）的二氯甲烷溶液（30.0mL）中。25 °C搅拌2 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失。反应液先后用NaHCO3水溶液洗（30.0 mL × 1）、水洗（30 mL × 3）。有机相用Na2SO4干燥，过滤后经减压浓缩除去溶剂，粗产物用制备色谱纯化，得白色固体G2-4（710 mg, 1.42 mmol, 23.7% yield）。MS (ESI) m/z [M - H]- : 500.2；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 6.37 - 6.28 (m, 1 H), 6.14(d, J = 8.8 Hz, 1 H), 5.35 (d, J = 3.3 Hz, 1 H), 5.02 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz,1 H), 4.43 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.30 - 4.23 (m, 1 H), 4.20 - 4.10 (m, 2 H),4.06 - 4.01 (m, 1 H), 3.92 - 3.84 (m, 1 H), 3.71 - 3.57 (m, 3 H), 3.46 (td, J= 9.1, 3.3 Hz, 1 H), 3.21 - 3.09 (m, 1 H), 2.62 - 2.44 (m, 2 H), 2.17 (s, 3H), 2.04 (s, 3 H), 2.01 (s, 3 H), 1.98 (s, 3 H), 1.71 - 1.66 (m, 2 H)。
步骤3：G2-5的合成
将G1-2（110 mg, 328 μmol, 1.0 eq）加入到G2-4（575 mg, 1.15 mmol, 3.5 eq）的DMSO溶液（20.0 mL）中。接着，将CuSO4（471 mg, 2.95 mmol, 453 μL, 9.0 eq）和THPTA（855 mg, 1.97 mmol, 6.0 eq）加入到水中（4.0 mL）, 随后加入VC Na（974 mg, 4.92mmol, 15.0 eq）配置成水溶液，将该水溶液加入到上述DMSO溶液中，25 °C搅拌2 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失。往反应液中加入水（2.0 mL），用二氯甲烷萃取（3 mL × 3），水洗（2 mL × 3）。有机相用Na2SO4干燥，过滤后经减压浓缩除去溶剂，粗产物用制备色谱纯化，得白色固体G2-5（350 mg, 190 μmol, 58.0% yield）。MS (ESI) m/z [M – 2 H]2-:918.6；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.69 (s, 3 H), 7.09 (t, J = 5.7 Hz, 3 H),6.97 (d, J = 9.0 Hz, 3 H), 5.35 (d, J = 3.2 Hz, 3 H), 5.08 (dd, J = 11.3, 3.4Hz, 3 H), 4.77 - 4.66 (m, 6 H), 4.52 (s, 6 H), 4.47 (d, J = 8.5 Hz, 3 H),4.26 - 4.11 (m, 9 H), 3.96 - 3.91 (m, 6 H), 3.60 (s, 6 H), 3.52 - 3.47 (m, 2H), 3.42 - 3.36 (m, 3 H), 3.16 - 3.11 (m, 3 H), 3.04 - 2.97 (m, 3 H), 2.86 -2.80 (m, 3 H), 2.15 (s, 9 H), 2.04 (s, 9 H), 2.00 (s, 9 H), 1.85 (s, 9 H),1.78 (s, 8 H), 1.42 (s, 9 H)。
步骤4：G2-6的合成
将三氟乙酸（1.07 g, 9.42 mmol, 700 μL, 49.5 eq）加入到G2-5（350 mg, 190μmol, 1.0 eq）的二氯甲烷溶液（2.8 mL）中，25 °C搅拌0.5 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失。反应液直接经减压浓缩除去溶剂，粗产物与甲苯（10.0 mL）共旋蒸三次，得红色油状物G2-6（523 mg）。MS (ESI) m/z [M – 2 H]2-: 868.6。
步骤5：G2-7的合成
将HBTU（65.6 mg, 173 μmol, 1.5 eq）和DIPEA（29.8 mg, 230 μmol, 40.2 μL,2.0 eq）加入到G1-9（75.0 mg, 115 μmol, 1.0 eq）的DMF溶液（1.5 mL）中。接着，将粗产物G2-6（200 mg, 115 μmol, 1.0 eq, TFA）（用DIPEA调节pH ~ 7）加入到上述反应液中，25 °C搅拌2 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失。反应液直接用于下一步。MS (ESI) m/z [M –2 H]2-: 1184.8。
步骤6：G2-8的合成
将G2-7（273 mg, 115 μmol, 1.0 eq）加入到DMF（3.0 mL）中。随后再加入DIPEA（44.7 mg, 345 μmol, 60.2 μL, 3.0 eq），丁二酸酐（104 mg, 1.04 mmol, 9.0 eq）和DMAP（56.3 mg, 461 μmol, 4.0 eq），该反应液在30 °C搅拌24 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失。将反应液过滤，滤液用制备色谱纯化，得白色固体G2-8（110 mg, 44.5 μmol,38.6% yield）。MS (ESI) m/z [M – 2 H]2-: 1234.9；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm7.66 (s, 3 H), 7.45 (d, J = 7.7 Hz, 2 H), 7.33 (d, J = 8.8 Hz, 4 H), 7.28 (s,1 H), 7.24 (s, 1 H), 7.20 - 7.13 (m, 4 H), 7.02 (d, J = 9.0 Hz, 2 H), 6.81(d, J = 8.7 Hz, 3 H), 5.35 (d, J = 3.3 Hz, 3 H), 5.08 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz,3 H), 4.73 - 4.69 (m, 5 H), 4.53 - 4.47 (m, 8 H), 4.26 - 4.10 (m, 11 H), 3.97- 3.89 (m, 7 H), 3.78 (s, 6 H), 3.65 (s, 5 H), 3.56 - 3.44 (m, 4 H), 3.40 -3.37 (m, 5 H), 3.24 - 3.21 (m, 2 H), 3.16 - 3.09 (m, 4 H), 3.01 - 2.94 (m, 4H), 2.82 - 2.78 (m, 2 H), 2.69 -2.64 (m, 2 H), 2.56 -2.53 (m, 2 H), 2.15 (s,9 H), 2.04 (s, 9 H), 2.00 (s, 9 H), 1.93 - 1.76 (m, 32 H), 1.27 (br, 10 H)。
步骤7：YK-GAL-402的合成
将G2-8（110 mg, 42.74 μmol, 1.0 eq, TEA）加入到DMF（8.0 mL）中，随后再加入DIPEA（44.2 mg, 342 μmol, 59.5 μL, 8.0 eq），HBTU（81.0 mg, 213 μmol, 5.0 eq），DMAP（5.22 mg, 42.7 μmol, 1.0 eq）和CPG-NH2（713 mg, 1.21 mmol, 28.4 eq），该反应液在40 °C搅拌16 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失。将反应液过滤，滤饼先后用MeOH（10mL × 4）和DCM（10 mL × 4）洗涤，在氮气条件下干燥，得淡黄色固体，直接用于下一步。
将粗产物溶于吡啶和乙酸酐溶液中（Py/Ac2O = 5/1, 9.0 mL），该反应液在40 °C搅拌40 min，随后将反应液过滤，滤饼先后用DCM（5.0 mL × 4）和MeOH（5.0 mL × 4）洗涤，在氮气条件下干燥，得淡黄色固体YK-GAL-402（726 mg，载量：33.15 μmol/g）。载体载量依照上述载体载量通用测定方法。
3. YK-GAL-403的合成
合成路线如下：
步骤1：G3-1的合成
将EDCI（1.92 g, 10.0 mmol, 1.05 eq），HOBt（1.42 g, 10.50 mmol, 1.1 eq）加入到6-叠氮己酸（1.50 g, 9.54 mmol, 1.0 eq）的二氯甲烷溶液（40.0 mL）中，降至0 °C。接着，将DIPEA（2.47 g, 19.1 mmol, 3.32 mL, 2.0 eq）和化合物G1-5（3.86 g, 9.54mmol, 1.0 eq）先后加入到上述溶液中。升温至25 °C继续搅拌2 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失。反应液用二氯甲烷稀释（20.0 mL），先用饱和NaHCO3（40.0 mL）洗涤，后用水洗（40.0 mL）。有机相用Na2SO4干燥，过滤后经减压浓缩除去溶剂，得黄色油状粗产物G3-1（1.42 g, 2.61 mmol, 32.7% yield）。MS (ESI) m/z [M – H]-: 542.2；1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ ppm 6.32 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 6.09 - 6.01 (m, 1 H), 5.34 (d, J =2.7 Hz, 1 H), 5.04 (dd, J = 11.2, 3.3 Hz, 1 H), 4.45 (d, J = 8.4 Hz, 1 H),4.28 - 4.09 (m, 3 H), 4.03 - 3.98 (m, 1 H), 3.88 (td, J = 6.7, 1.2 Hz, 1 H),3.71 - 3.62 (m, 1 H), 3.44 (td, J = 9.3, 3.4 Hz, 1 H), 3.28 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.10 - 3.03 (m, 1 H), 2.24 (t, J = 7.5 Hz, 2 H), 2.16 (s, 3 H), 2.04 (s,3 H), 2.01 (s, 3 H), 1.96 (s, 3 H), 1.76 - 1.63 (m, 6 H), 1.46 - 1.38 (m, 2H)。
步骤2：G3-2的合成
将G1-2（230 mg, 686 μmol, 1.0 eq）加入到G3-1（1.30 g, 2.40 mmol, 3.5 eq）的DMSO溶液（50.0 mL）中。接着，将CuSO4（985 mg, 6.17 mmol, 947 μL, 9.0 eq）和THPTA（1.79 g, 4.11 mmol, 6.0 eq）加入到水中（6.0 mL）, 随后加入VC Na（2.04 g, 10.3mmol, 15.0 eq）配置成水溶液，将该水溶液加入到上述DMSO溶液中，25 °C搅拌2 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失。反应液用水稀释（30.0 mL），用二氯甲烷萃取（30.0 mL × 3），再用水洗（30.0 mL × 3）。有机相用Na2SO4干燥，过滤后经减压浓缩除去溶剂，粗产物用制备色谱纯化，得白色固体G3-2（1.0 g, 508 μmol, 74.2% yield）。MS (ESI) m/z [M - 2H]2-: 981.8；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.60 (s, 3 H), 6.84 (d, J = 8.9 Hz, 3H), 6.62 - 6.54 (m, 3 H), 5.34 (d, J = 3.3 Hz, 3 H), 5.06 (dd, J = 11.2, 3.4Hz, 3 H), 4.57 (s, 6 H), 4.50 (d, J = 8.5 Hz, 3 H), 4.36 (t, J = 6.9 Hz, 6H), 4.28 - 4.07 (m, 10 H), 4.00 - 3.95 (dt, J = 9.9, 5.0 Hz, 3 H), 3.90 (t, J= 6.7 Hz, 3 H), 3.69 (s, 6 H), 3.59 - 3.55 (m, 3 H), 3.51 - 3.41 (m, 3 H),3.11 - 3.06 (m, 3 H), 2.21 (t, J = 7.4 Hz, 6 H), 2.15 (s, 9 H), 2.03 (s, 9H), 1.99 (s, 9 H), 1.93 (s, 9 H), 1.82 (s, 9 H), 1.72 - 1.61 (m, 9 H), 1.40(s, 9 H), 1.37 - 1.29 (m, 6 H)。
步骤3：G3-3的合成
将三氟乙酸（3.07 g, 26.9 mmol, 2.0 mL, 52.9 eq）加入到G3-2（1.00 g, 508μmol, 1.00 eq）的二氯甲烷溶液（10.0 mL）中，25 °C搅拌1 h。取样用TLC（二氯甲烷/甲醇）检测，显示原料消失。反应液直接经减压浓缩除去溶剂，粗产物与甲苯（20.0 × 3 mL）共旋蒸三次，得黄色油状物G3-3（950 mg, 458.21 μmol, 90.09% yield, 90% purity）。MS(ESI) m/z [M - 2H]2-: 931.7。
步骤4：G3-4的合成
将HBTU（174 mg, 460 μmol, 1.5 eq）和DIPEA（79.4 mg, 614 μmol, 107 μL,2.0 eq）加入到G1-9（200 mg, 307 μmol, 1.0 eq）的DMF溶液（3.0 mL）中。接着，将粗产物G3-3（837 mg, 430 μmol, 1.4 eq, TFA）（用DIPEA调节pH ~ 7）加入到上述反应液中，25 °C搅拌4 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失。反应液直接用于下一步。MS (ESI) m/z [M -2H]2-: 1247.8。
步骤5：G3-5的合成
将G3-4（760 mg, 304 μmol, 1.0 eq）加入到DMF（4.0 mL）中。随后再加入DIPEA（112 mg, 912 μmol, 158 μL, 3.0 eq），丁二酸酐（243 mg, 2.43 mmol, 8.0 eq）和DMAP（37.1 mg, 304 μmol, 1.0 eq），该反应液在35 °C搅拌24 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失，检测到目标产物。将反应液过滤，滤液用制备色谱纯化，得白色固体G3-5（400 mg,142 μmol, 46.7% yield, 96.0% purity, TEA）。MS (ESI) m/z [M - 2H]2-: 1298.2；1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.53 (s, 3 H), 7.40 - 7.36 (m, 2 H), 7.31 - 7.24(m, 4 H), 7.22 - 7.07 (m, 6 H), 6.84 (d, J = 8.9 Hz, 2 H), 6.77 - 6.70 (m, 4H), 6.59 (t, J = 6.1 Hz, 3 H), 6.08 (s, 1 H), 5.28 (d, J = 3.3 Hz, 3 H), 5.09(t, J = 5.1 Hz, 1 H), 5.04 - 4.90 (m, 4 H), 4.50 (s, 6 H), 4.45 (d, J = 8.4Hz, 3 H), 4.30 (t, J = 6.9 Hz, 6 H), 4.21 - 4.02 (m, 10 H), 3.93 - 3.88 (m, 3H), 3.87 - 3.81 (m, 4 H), 3.70 (d, J = 9.3 Hz, 12 H), 3.50 (d, J = 7.8 Hz, 3H), 3.39 (td, J = 9.2, 3.7 Hz, 3 H), 3.32 (s, 3 H), 3.16 (dd, J = 9.8, 4.3Hz, 2 H), 3.08 - 2.99 (m, 4 H), 2.76 (q, J = 7.3 Hz, 9 H), 2.63 - 2.57 (m, 2H), 2.47 - 2.44 (m, 2 H), 2.15 (t, J = 7.3 Hz, 6 H), 2.09 (s, 9 H), 1.97 (s,9 H), 1.92 (s, 9 H), 1.87 (s, 9 H), 1.71 - 1.67 (m, 3 H), 1.66 - 1.56 (m, 9H), 1.51 - 1.40 (m, 4 H), 1.29 - 1.24 (m, 6 H), 1.10 (t, J = 7.2 Hz, 11 H)。
步骤6：YK-GAL-403的合成
将G3-5（400 mg, 154 μmol, 1.0 eq）加入到DMF（10.0 mL）中。随后再加入DIPEA（159 mg, 1.23 mmol, 214 μL, 8.0 eq），HBTU（291 mg, 769 μmol, 5.0 eq），DMAP（18.8mg, 154 μmol, 1.00 eq）和CPG-NH2（2.25 g），该反应液在40 °C搅拌16 h。取样用LC/MS检测，显示原料消失。将反应液过滤，滤饼先后用MeOH（20 mL × 4）和DCM（20 mL × 4）洗涤，在氮气条件下干燥，得淡黄色固体，直接用于下一步。
将粗产物（2.4 g）溶于吡啶（15.0 mL）中。随后再加入乙酸酐（3.26 g, 31.9mmol, 3.0 mL, 34.5 eq），该反应液在40 °C搅拌1 h，随后将反应液过滤，滤饼先后用MeOH（30 mL × 4）和DCM（30 mL × 4）洗涤，在氮气条件下干燥，得淡黄色固体YK-GAL-403（2.2g，载量：32.8 μmol/g）。载体载量依照上述载体载量通用测定方法。
4. YK-GAL-404的合成
合成路线如下：
步骤1：G4-1的合成
以粗产物G1-8（537 mg, 280 μmol, 1.4 eq, TFA）和G1-9A（制备方法参考CN116854754B）（124 mg, 200 μmol, 1.0 eq）为原料，按照合成G1-10的方法进行反应，取样用LC/MS检测，显示原料消失。反应液直接用于下一步。MS (ESI) m/z [M – 2 H]2-:1212.0。
步骤2：G4-2的合成
以G4-1（485 mg，200 umol，1.0 eq）为原料，按照合成G1-11的方法进行反应，得到白色固体G4-2 (187 mg，74.2 umol，37.1%）。MS (ESI) m/z [M – 2 H]2-: 1262.1；1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 7.63 (s, 2H), 7.53 - 7.45 (m, 2H), 7.36 - 7.33 (m, 3H),7.29 - 7.11 (m, 7H) , 6.92 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 6.79 - 6.68 (m, 5H), 5.12 -5.05 (m, 3H), 5.06 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.01 - 4.97 (m, 2H), 4.79 - 4.61 (m,8H), 4.53 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 4.34 - 4.20 (m, 3H), 4.14 - 4.09 (m, 4H), 3.98- 3.86 (m, 5H), 3.80 (s, 6H), 3.77 - 3.65 (m, 2H), 3.47 - 3.32 (m, 10H), 3.25- 3.12 (m, 3H), 2.85 - 2.61 (s, 9H), 2.53 - 2.44 (m, 2H), 2.39 - 1.89 (m,52H), 1.82 - 1.49 (m, 19H), 1.19 - 1.09 (m, 18H)。
步骤3：YK-GAL-404的合成
以G4-2（126 mg，50.0 umol，1.0 eq）为原料，按照合成YK-GAL-401的方法进行反应，得淡黄色固体YK-GAL-404（783 mg，载量：35.9 μmol/g）。载体载量依照上述载体载量通用测定方法。
5. YK-GAL-405的合成
合成路线如下：
步骤1：G5-1的合成
以粗产物G1-8（537 mg, 280 μmol, 1.4 eq, TFA）和G1-9B（制备方法参考CN116854754B）（125 mg, 200 μmol, 1.0 eq）为原料，按照合成G1-10的方法进行反应，取样用LC/MS检测，显示原料消失。反应液直接用于下一步。MS (ESI) m/z [M – 2 H]2-:1215.2。
步骤2：G5-2的合成
以G5-1（481 mg，198 umol，1.0 eq）为原料，按照合成G1-11的方法进行反应，得到白色固体G5-2 (173 mg，68.4 umol）。MS (ESI) m/z [M – 2 H]2-: 1265.2; 1HNMR (400MHz, CDCl3) δ ppm 7.53 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.44 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.25- 7.16 (m, 4H), 7.05 - 6.91 (m, 4H), 6.85 - 6.72 (m, 6H), 6.85 - 6.72 (m,2H), 5.48 - 5.45 (m, 4H), 5.39 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 5.12 - 4.99 (m, 3H), 4.57- 4.32 (m, 11H), 4.19 - 4.06 (m, 6H), 3.96 - 3.87 (m, 4H), 3.85 - 3.79 (m,14H), 3.68 (s, 6H), 3.63 - 3.56 (m, 12H), 3.37 - 3.25 (m, 11H), 3.15 (t, J =5.9 Hz, 5H), 3.11 - 2.89 (m, 4H), 2.48 - 2.34 (m, 12H), 2.21 - 1.98 (m, 25H),1.82 - 1.61 (m, 14H), 1.28 - 1.08 (m, 13H)。
步骤3：YK-GAL-405的合成
以G5-2（171 mg，67.5 umol，1.0 eq）为原料，按照合成YK-GAL-401的方法进行反应，得淡黄色固体YK-GAL-405（1.1 g，载量：35.9 μmol/g）。载体载量依照上述载体载量通用测定方法。
6. YK-GAL-406的合成
合成路线如下：
步骤1：G6-1的合成
以粗产物G1-8（402 mg, 210 μmol, 1.4 eq, TFA）和G1-9C（制备方法参考CN116854754B）（88 mg, 150 μmol, 1.0 eq）为原料，按照合成G1-10的方法进行反应，取样用LC/MS检测，显示原料消失。反应液直接用于下一步。MS (ESI) m/z [M – 2 H]2-:1198.0。
步骤2：G6-2的合成
以G6-1（479 mg，150 umol，1.0 eq）为原料，按照合成G1-11的方法进行反应，得到白色固体G6-2 (146 mg，58.8 umol）。MS (ESI) m/z [M – 2 H]2-: 1247.8; 1HNMR (400MHz, CDCl3) δ ppm 7.47 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 7.36 - 7.31 (m, 3H), 7.27 - 7.23(m, 4H), 7.20 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.15 - 7.08 (m, 2H), 7.04 - 6.97 (m, 4H),6.90 - 6.83 (m, 3H), 5.54 - 5.51 (m, 2H), 5.42 (d, J = 3.9 Hz, 2H), 5.36 (t,J = 4.0 Hz, 2H), 4.89 - 4.81 (m, 1H), 4.55 - 4.47 (m, 5H), 4.38 - 4.24 (m,7H), 4.16 - 4.04 (m, 4H), 3.80 (s, 6H), 3.74 - 3.65 (m, 11H), 3.59 - 3.52 (m,4H), 3.46 - 3.28 (m, 15H), 2.83 - 2.78 (m, 7H), 2.64 (t, J = 6.5 Hz, 4H),2.59 - 2.50 (m, 4H), 2.47 - 2.41 (m, 4H), 2.33 - 1.97 (m, 33H), 1.86 - 1.62(m, 20H), 1.37 - 1.29 (m, 5H), 1.16 - 1.13 (m, 13H)。
步骤3：YK-GAL-406的合成
以G6-2（146 mg，58.8 umol，1.0 eq）为原料，按照合成YK-GAL-401的方法进行反应，得淡黄色固体YK-GAL-406（832 mg，载量：34.1 μmol/g）。载体载量依照上述载体载量通用测定方法。
7. 对照品YK-GAL-301的合成
按照CN116854754B说明书第35页中YK-GAL-301的合成方法，得到目标产物。
8. 对照品GalNAc 1b的合成
按照WO2023014938A1说明书第145页中GalNAc 1b的合成方法，得到产物377.2mg，总收率0.58%，MS (ESI) m/z [M + H]+ = 1137.9。
9. 对照品NAG0052的合成
按照WO2023109938A1说明书第100页中NAG0052的合成方法，得到产物288 mg，总收率1.26%，载量31.5 μmol/g。
实施例2：GalNAc化合物与寡核苷酸的偶联
本实施例中使用同一个siRNA序列进行合成，缀合的siRNA序列为编号为inc的序列，inc序列如下：
正义链（inc-SS）：5’-Cms-Ums-Am-Gm-Am-Cm-Cf-Um-Gf-Um-dT-Um-Um-Gm-Cm-Um-Um-Um-Um-Gm-Um-3’（SEQ ID NO. 46）
反义链（inc-AS）：5’-Ams-Cfs-Am-Af-Af-Af-Gm-Cf-Am-Af-Am-Af-Cm-Af-Gm-Gf-Um-Cf-Um-Am-Gms-Ams-Am-3’（SEQ ID NO. 47）
其中，A、U、C、G代表核苷酸的碱基组成；dT表示脱氧胸腺嘧啶核苷酸；m代表m左侧相邻的核苷酸为2’-OMe修饰；f代表f左侧相邻的核苷酸为2’-F修饰；s代表s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。
序列来自于公开序列，为国外已上市siRNA药物inclisiran的寡核苷酸序列。
Inclisiran序列是一种合成的化学修饰的双链小干扰核糖核酸（siRNA），通过靶向结合编码PCSK9蛋白的mRNA，通过RNA干扰机制抑制PCSK9蛋白的生成，从而调控LDL受体的回收和再利用，增强其与LDL的结合，达到降低血液中LDL水平的目的。
1. 制备GalNAc缀合的siRNA正义链
根据亚磷酰胺化学法在固相载体上合成寡核苷酸GalNAc缀合物。合成inc-YK-Gal-401、inc-YK-Gal-402、inc-YK-Gal-403、inc-YK-Gal-404、inc-YK-Gal-405、inc-YK-Gal-406、inc-YK-Gal-301和inc-NAG0052缀合物时，使用实施例1中所合成的GalNAc-CPG化合物作为固相载体。合成inc-GalNAc 1b缀合物时，使用通用CPG作为固相载体，对照品inc-GalNAc 1b单体作为第一个单体进行偶联。其中，GalNAc均缀合到siRNA正义链的3’端，所用GalNAc化合物的具体结构见表1。
表1 与siRNA正义链缀合的GalNAc化合物
实验过程：
（1）试剂和单体准备
通过采用单体的乙腈溶液（1/20，w/v），0.25M的5-苄巯基四氮唑的乙腈溶液作为活化剂，0.2M的氢化黄原素的乙腈/吡啶（1/4，v/v）溶液作为硫代试剂，0.05M的碘的水/吡啶（1/9，v/v）溶液作为氧化试剂，20%的乙酸酐在乙腈中（v/v）作为盖帽剂A，20/30/50（1-甲基咪唑/吡啶/乙腈，v/v/v）作为盖帽剂B，20%的二乙胺在乙腈中（v/v）作为脱氰乙基试剂，3%的二氯乙酸在甲苯中（v/v）作为脱DMT试剂，选择相应的CPG载体，装入192 P型号DNA/RNA自动合成仪中指定的试剂位置中。
（2）粗品合成
输入指定的寡核苷酸序列，并设定好合成程序，检查无误后，开始循环寡核苷酸的合成。单体偶合时间约1分钟，其中氧代时间约30-45秒，硫代时间约2分钟。循环结束后，完成寡核苷酸的固相合成。
（3）脱保护
在合成结束后，将固相载体转移至反应器中，在50-60 ℃条件下用浓氨水（25-28%）从固相载体上裂解寡核苷酸16-24 小时，体系降至室温，然后过滤，用纯化水与乙醇的混合溶液进行淋洗，合并滤液，滤液低温浓缩，得粗品残留物。
（4）纯化
将脱保护后的粗品残留物用纯化水溶解，进行HPLC纯化，收集产物峰溶液并用酶标仪测含量，并且通过ESI MS证实分子量。
2. 制备无GalNAc缀合的siRNA反义链
按照合成siRNA正义链的方法合成siRNA反义链，其中使用通用CPG固相载体，每个与正义链互补反义链的合成规模为1 μmol。
3. 制备缀合的双链siRNA
将siRNA正义链和互补反义链按照紫外吸收含量1: 1混合，加热至95°C，3分钟后冷却至室温，形成双链。将所得双链溶液用HPLC表征产品纯度合格后用酶标仪测定含量，冻干得到固体粉末保存备用。
表1中GalNAc化合物分别与编号为inc的siRNA缀合，得到的缀合物分别命名为inc-YK-Gal-401、inc-YK-Gal-402、inc-YK-Gal-403、inc-YK-Gal-404、inc-YK-Gal-405、inc-YK-Gal-406、inc-YK-Gal-301、inc-GalNAc 1b和inc-NAG0052。
实施例3：GalNAc缀合siRNA对小鼠血清及肝脏中PCSK9基因的抑制作用及对LDL-C水平的影响
GalNAc缀合的inclisiran siRNA序列进入血液后，通过GalNAc与肝细胞膜上的ASGPR进行结合，从而进入肝细胞内。Inclisiran siRNA序列进入肝细胞后，与RNA诱导沉默复合体（RISC）结合，并在反义链的介导下与编码PCSK9蛋白的mRNA结合，会抑制PCSK9蛋白的产生。肝脏中PCSK9蛋白的减少促进LDL-R的循环，增加肝细胞表面LDL-R受体数量，进一步能够降低血浆LDL-C水平。因此递送至肝脏的Inclisiran siRNA序列量越高，即GalNAc递送效率越高，则肝脏中和血清中PCSK9蛋白量越低，肝脏中LDL-C的水平也越低。
结果显示，与现有技术GalNAc寡核苷酸缀合物相比，inc-YK-Gal-401、inc-YK-Gal-402和inc-YK-Gal-403实验组，小鼠血清及肝脏中PCSK9基因表达抑制率和LDL-C降低水平均显著提升。例如，inc-YK-Gal-401对血清中PCSK9蛋白抑制率，与inc-YK-Gal-301、inc-GalNAc 1b、inc-NAG0052相比，第7天分别提高了21.5%、14.5%和12.7%，第14天分别提高了17.3%、10.4%和10.8%；对小鼠肝脏中PCSK9基因抑制率，第14天分别提高了21.1%、9.8%和5.1%；LDL-C降低水平，第7天分别提高了33.4%、19.1%和16.7%，第14天分别提高了36.4%、20.6%和17.8%，显著提升。
动物准备：
首先将hPCSK9转基因小鼠（等级SPF，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司）适应性饲养后，按血清PSCK9蛋白含量随机分为阴性对照组（不给药）、siRNA受试药组，每组5只，均为雄性。
给药方式及给药剂量：
通过皮下单次注射给药，给药剂量为6 mg/kg，给药体积为1 mL/kg，给药浓度为6mg/mL，给药当天记为第0天。
1. 不同GalNAc缀合的siRNA对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制效率
本发明GalNAc化合物制备的寡核苷酸缀合物与现有技术GalNAc相比，对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率显著提升。例如，inc-YK-Gal-401第7天抑制率比inc-YK-Gal-301、inc-GalNAc 1b和inc-NAG0052提高了21.5%、14.5%和12.7%，第14天抑制率分别提高了17.3%、10.4%和10.8%。
实验过程：
实验动物给药前（D0）、给药后7天（D7）和给药后14天（D14），眼眶静脉丛取血约200μL（不抗凝）。全血样品离心前冰盒中暂存，于4℃条件下4000 r/min离心10 min分离血清，采用 ELISA kit（Sino Biological公司）检测血清中PCSK9蛋白水平。
实验结果：
阴性对照组和各受试药组给药后7天和给药后14天对血清中PCSK9蛋白抑制率如表3和图1所示。利用GraphPad Prism 9软件进行数据统计及分析。
1. GalNAc化合物结构区别
表2 GalNAc化合物结构比较
1）本发明设计的GalNAc化合物YK-GAL-401~YK-Gal-406化学结构非常接近。
从表1和表2可以看出，本发明设计的GalNAc化合物YK-GAL-401、YK-GAL-402、YK-GAL-403、YK-GAL-404、YK-GAL-405和YK-GAL-406化学结构非常接近，例如核糖1’位均是氧，触角个数均是3，触角中均含有三氮唑结构。
这些化合物只是个别基团稍有不同，例如YK-GAL-401、YK-GAL-402和YK-GAL-403核糖2’取代基为甲氧基，YK-GAL-404、YK-GAL-405和YK-GAL-406为氢，YK-GAL-401~YK-Gal-404的主链结构均为-(CH2)10C(O)NH-，YK-GAL-405为-(CH2CH2O)3CH2C(O)NH-，YK-GAL-406为-(CH2)8C(O)NH-，此外触角中链的长度稍有不同，其它结构完全相同。
2）本发明设计的GalNAc化合物YK-GAL-401~YK-GAL-406与现有技术GalNAc化合物相比，化学结构有的非常接近，有的差异巨大。
本发明设计的GalNAc化合物YK-GAL-401、YK-GAL-402、YK-GAL-403、YK-GAL-404、YK-GAL-405和YK-GAL-406与现有技术GalNAc化合物YK-GAL-301和NAG0052相比，化学结构非常接近，例如YK-GAL-301和NAG0052也含有3个触角，主链结构含有脂肪链和酰胺键，只是YK-GAL-301和NAG0052触角中不含有三氮唑结构。
本发明设计的GalNAc化合物与GalNAc 1b化学结构差异巨大，例如GalNAc 1b仅有一个触角，链非常短，并且链中不含有三氮唑结构。
2. 不同GalNAc缀合的siRNA对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率
表3 小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率
1）由本发明GalNAc化合物缀合的siRNA，对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率具有显著差异，YK-GAL-401~YK-Gal-403显著高于YK-GAL-404~406。例如，inc-YK-Gal-401在第7天和第14天分别比inc-YK-Gal-404提高了20.7%和16.0%。
从表3可以看出，本发明GalNAc化合物缀合的siRNA，均可抑制小鼠血清中PCSK9蛋白表达。不同的GalNAc缀合物，对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率具有显著差异。inc-YK-Gal-401、inc-YK-Gal-402、inc-YK-Gal-403、inc-YK-Gal-404、inc-YK-Gal-405和inc-YK-Gal-406第7天抑制率分别为94.2%、92.4%、93.1%、73.5%、84.3%和85.0%，第14天抑制率分别为95.4%、92.8%、94.3%、79.4%、88.7%和90.2%。
inc-YK-Gal-401、inc-YK-Gal-402和inc-YK-Gal-403的抑制率均超过了90%，而inc-YK-Gal-404抑制率在70%-80%之间，抑制率最高的inc-YK-Gal-401在第7天和第14天分别比最低的inc-YK-Gal-404分别提高了20.7%和16.0%，显著提高。
2）本发明GalNAc化合物YK-GAL-401~YK-GAL-403与现有技术GalNAc化合物相比，缀合的siRNA对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率显著提高。例如，inc-YK-Gal-401在第7天和第14天分别比inc-YK-Gal-301提高了21.5%和17.3%。
由现有技术GalNAc化合物制备的siRNA缀合物inc-YK-Gal-301、inc-GalNAc 1b和inc-NAG0052第7天的抑制率分别为72.7%、79.7%和81.5%，第14天的抑制率分别为78.1%、85.0%和84.6%。
本发明GalNAc化合物与现有技术GalNAc化合物相比，缀合的siRNA对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率显著提高。例如，inc-YK-Gal-401、inc-YK-Gal-402和inc-YK-Gal-403第7天抑制率，分别比inc-YK-Gal-301提高了21.5%、19.7%和20.4%，比inc-GalNAc 1b提高了14.5%、11.9%和13.4%，比inc-NAG0052提高了12.7%、10.9%和11.6%，显著提高；第14天抑制率，分别比inc-YK-Gal-301提高了17.3%、14.7%和16.2%，比inc-GalNAc 1b提高了10.4%、7.8%和9.3%，比inc-NAG0052提高了10.8%、8.2%和9.7%，显著提高。
3）结构相近的GalNAc化合物与siRNA的缀合物，对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率具有显著差异。
本发明设计的GalNAc化合物结构非常接近，但是siRNA缀合物活性却差异非常显著。例如，YK-GAL-401与YK-GAL-404相比，仅是核糖环2’位不同，YK-GAL-401是甲氧基，YK-GAL-404是氢，其它结构完全相同，但是inc-YK-Gal-401对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率可比inc-YK-Gal-404提高20%以上，显著提升。
YK-GAL-406与YK-GAL-301相比，仅是主链和触角链部不同，YK-GAL-406的主链比YK-GAL-301少2个亚甲基，YK-GAL-406触角链部有三氮唑结构，YK-GAL-301没有，但是inc-YK-Gal-406第7天抑制率比inc-YK-Gal-301提高了12.3%，显著提升。
YK-GAL-401与inc-NAG0052相比，仅是个别基团稍有不同，但是inc-YK-Gal-401第7天抑制率比inc-NAG0052提高了12.7%，显著提升。
因此，并不是化学结构相近的GalNAc化合物对寡核苷酸递送效率就一定接近，其制备的GalNAc寡核苷酸缀合物对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率并不一致，可能具有非常大的差异。
3. 不同GalNAc缀合的siRNA对小鼠肝脏中PCSK9抑制效率
本发明GalNAc化合物制备的寡核苷酸缀合物与现有技术GalNAc相比，对小鼠肝脏中PCSK9基因表达抑制率显著提升。例如，inc-YK-Gal-401抑制率分别比inc-YK-Gal-301和inc-GalNAc 1b提高了21.1%和9.8%，显著提升。
实验过程：
实验动物给药后第14天（D14）将试验动物麻醉处死后进行灌流，收集肝脏。
按组织重量：RNA裂解液（trizol，Ambion公司）=100 mg：1 mL，快速放入准备好盛有1 mL RNA裂解液（trizol）的1.5 mL无RNA酶的EP管中，向管中加入3颗3 mm钢珠（经无RNA处理），放入组织匀浆仪中，50 Hz运行30秒，间停10秒，运行3次，可以制备成组织匀浆。
4 ℃离心，12,000 × g 3 分钟，将400 μL匀浆上清转移至1.5 mL无RNA酶的EP管中，置于冰上。每管加入80 μL氯仿，剧烈振荡15秒 ，室温静置5分钟。4 ℃离心，12,000 ×g 15分钟，取上清150 μL至新EP管中。
加入等体积异丙醇，将管中液体上下颠倒轻轻混匀，-20 ℃静置10分钟，4 ℃离心，12,000 × g 15分钟，弃上清。
加入1 mL 75%乙醇，轻轻洗涤RNA沉淀，4 ℃ 7,500 × g离心5分钟，吸去上清。重复漂洗一次，4 ℃ 7,500 × g 5分钟，用微量枪头将残留乙醇去除干净。
室温晾干残留乙醇10分钟，加入150 μL RNase-free ddH2O，溶解。使用微量紫外分光光度计对RNA浓度进行检测。通过qPCR检测PCSK9基因表达情况。
实验结果：
通过对qPCR结果（Mean±SD）统计，利用GraphPad Prism 9软件进行绘图及数据分析，具体结果见表4和图2。
表4 小鼠肝脏中PCSK9基因表达抑制率
1）由本发明GalNAc化合物缀合的siRNA，对小鼠肝脏中PCSK9基因表达抑制率具有显著差异，YK-GAL-401~YK-GAL-403显著高于YK-GAL-404~YK-GAL-406。例如，inc-YK-Gal-401比inc-YK-Gal-404提高了19.4%。
从表4可以看出，本发明GalNAc化合物缀合的siRNA，均可抑制小鼠肝脏中PCSK9基因表达。不同的GalNAc缀合物，对小鼠肝脏中PCSK9基因表达抑制率具有显著差异。inc-YK-Gal-401、inc-YK-Gal-402、inc-YK-Gal-403、inc-YK-Gal-404、inc-YK-Gal-405和inc-YK-Gal-406抑制率分别为90.9%、89.3%、90.1%、71.5%、83.2%和81.6%。
inc-YK-Gal-401和inc-YK-Gal-403的抑制率均超过了90%，inc-YK-Gal-402也达到了89.3%，而inc-YK-Gal-404抑制率仅为71.5%，抑制率最高的inc-YK-Gal-401在比最低的inc-YK-Gal-404提高了19.4%，显著提高。
2）本发明GalNAc化合物YK-GAL-401~YK-GAL-403与现有技术GalNAc化合物相比，缀合的siRNA对小鼠肝脏中PCSK9基因表达抑制率显著提高。例如，inc-YK-Gal-401比inc-YK-Gal-301提高了21.1%。
由现有技术GalNAc化合物制备的siRNA缀合物inc-YK-Gal-301、inc-GalNAc 1b和inc-NAG0052抑制率分别为69.8%、81.1%和85.8%。
本发明GalNAc化合物与现有技术GalNAc化合物相比，缀合的siRNA对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率显著提高。例如，inc-YK-Gal-401、inc-YK-Gal-402和inc-YK-Gal-403抑制率，分别比inc-YK-Gal-301提高了21.1%、19.5%和20.3%，比inc-GalNAc 1b提高了9.8%、8.2%和9.0%，显著提高。
3）结构相近的GalNAc化合物与siRNA的缀合物，对小鼠肝脏中PCSK9基因表达抑制率具有显著差异。
本发明设计的GalNAc化合物结构非常接近，但是siRNA缀合物活性却差异非常显著。例如，YK-GAL-401与YK-GAL-404相比，仅是核糖环2’位不同，YK-GAL-401是甲氧基，YK-GAL-404是氢，其它结构完全相同，但是inc-YK-Gal-401对小鼠肝脏中PCSK9基因表达抑制率可比inc-YK-Gal-404提高19.4%，显著提升。
YK-GAL-406与YK-GAL-301相比，仅是主链和触角链部不同，YK-GAL-406的主链比YK-GAL-301少2个亚甲基，YK-GAL-406触角链部有三氮唑结构，YK-GAL-301没有，但是inc-YK-Gal-406抑制率比inc-YK-Gal-301提高了11.8%，显著提升。
因此，并不是化学结构相近的GalNAc化合物对寡核苷酸递送效率就一定接近，其制备的GalNAc寡核苷酸缀合物对小鼠肝脏中PCSK9基因达抑制率并不一致，可能具有非常大的差异。
4. 不同GalNAc缀合的siRNA对小鼠血清中LDL-C水平的影响
本发明GalNAc化合物制备的寡核苷酸缀合物与现有技术GalNAc相比，对小鼠血清中LDL-C降低水平显著提升。例如，inc-YK-Gal-401组小鼠第14天LDL-C降低水平，分别比inc-YK-Gal-301、inc-GalNAc 1b和NAG0052组提高了36.4%、20.6%和17.8%，显著提升。
实验过程：
实验动物给药前（D0）、给药后第7天（D7)、给药后14天（D14），眼眶静脉丛取血约200 μL（不抗凝）。全血样品离心前冰盒中暂存，于4 ℃条件下4000 r/min离心10分钟分离血清，对血清LDL-C的水平进行检测。
实验结果：
通过对血清LDL-C（Mean±SD）统计，利用GraphPad Prism 9软件进行绘图及数据分析，具体结果见表5和图3。
表5 小鼠血清中LDL-C降低水平
1）由本发明GalNAc化合物缀合的siRNA，对小鼠血清中LDL-C水平的降低具有显著差异，YK-GAL-401~YK-GAL-403降低水平显著高于YK-GAL-404~406。例如，inc-YK-Gal-401在第7天和第14天分别比inc-YK-Gal-404提高了33.0%和36.0%，显著提升。
从表5可以看出，本发明GalNAc化合物缀合的siRNA，均可降低小鼠血清中LDL-C水平。不同的GalNAc缀合物，对小鼠血清中LDL-C降低水平具有显著差异。inc-YK-Gal-401、inc-YK-Gal-402、inc-YK-Gal-403、inc-YK-Gal-404、inc-YK-Gal-405和inc-YK-Gal-406第7天降低水平分别为49.2%、39.6%、44.5%、16.2%、33.7%和30.3%，第14天降低水平分别为53.5%、41.3%、50.4%、17.5%、35.0%和32.2%。
inc-YK-Gal-401和inc-YK-Gal-403第7天降低水平均均超过了40%，第14天降低水平均超过了50%，inc-YK-Gal-402第7天降低水平也达到了39.6%，第14天降低水平达到了41.3%，而inc-YK-Gal-404第7天降低水平仅16.2%，第14天降低水平仅17.5%，inc-YK-Gal-401、inc-YK-Gal-402和inc-YK-Gal-403的第7天降低水平分别比inc-YK-Gal-404提高了33.0%、23.4%和28.3%，第14天降低水平分别提高了36.0%、23.8%和32.9%，显著提高。
2）本发明GalNAc化合物YK-GAL-401~YK-GAL-403与现有技术GalNAc化合物相比，缀合的siRNA对小鼠血清中LDL-C降低水平显著提高。例如，inc-YK-Gal-401在第7天和第14天分别比inc-YK-Gal-301提高了33.4%和36.4%。
由现有技术GalNAc化合物制备的siRNA缀合物inc-YK-Gal-301、inc-GalNAc 1b和inc-NAG0052第7天LDL-C降低水平分别为15.8%、30.1%和32.5%，第14天LDL-C降低水平分别为17.1%、32.9%和35.7%。
本发明GalNAc化合物与现有技术GalNAc化合物相比，缀合的siRNA对小鼠血清中LDL-C降低水平显著提高。例如，inc-YK-Gal-401、inc-YK-Gal-402和inc-YK-Gal-403第7天降低水平，分别比inc-YK-Gal-301提高了33.4%、23.8%和28.7%，比inc-GalNAc 1b提高了19.1%、9.5%和14.4%，比inc-NAG0052提高了16.7%、7.1%和12.0%，显著提高；第14天降低水平，分别比inc-YK-Gal-301提高了36.4%、24.2%和33.3%，比inc-GalNAc 1b提高了20.6%、8.4%和17.5%，比inc-NAG0052提高了17.8%、5.6%和14.7%，显著提高。
3）结构相近的GalNAc化合物与siRNA的缀合物，对小鼠血清中LDL-C降低水平具有显著差异。
本发明设计的GalNAc化合物结构非常接近，但是siRNA缀合物活性却差异非常显著。例如，YK-GAL-401与YK-GAL-404相比，仅是核糖环2’位不同，YK-GAL-401是甲氧基，YK-GAL-404是氢，其它结构完全相同，但是inc-YK-Gal-401对小鼠血清中LDL-C降低水平可比inc-YK-Gal-404提高30%以上，显著提升。
YK-GAL-406与YK-GAL-301相比，仅是主链和触角链部不同，YK-GAL-406的主链比YK-GAL-301少2个亚甲基，YK-GAL-406触角链部有三氮唑结构，YK-GAL-301没有，但是inc-YK-Gal-406小鼠血清中LDL-C降低水平可比inc-YK-Gal-301提高15.1%，显著提升。
YK-GAL-401与inc-NAG0052相比，仅是个别基团稍有不同，但是inc-YK-Gal-401小鼠血清中LDL-C降低水平可比inc-NAG0052提高17.8%，显著提升。
因此，并不是化学结构相近的GalNAc化合物对寡核苷酸递送效率就一定接近，其制备的GalNAc寡核苷酸缀合物对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率并不一致，可能具有非常大的差异。
实施例4：不同GalNAc缀合的siRNA在小鼠体内不同组织器官的分布情况
结果表明，本发明设计的GalNAc化合物可以高效将核酸递送至动物肝脏。
实验过程：
使用6-8周野生型C57BL/6小鼠，每组6只小鼠。每组分别给予带Cy5荧光基团的siRNA缀合物inc-YK-GAL-401，inc-YK-GAL-402，inc-YK-GAL-403，inc-YK-GAL-404，inc-YK-GAL-405，inc-YK-GAL-406，inc-YK-GAL-301，inc-GalNAc 1b和inc-NAG0052。阴性对照组不给药。小鼠称重后按照6 mg/kg剂量给药，皮下注射给药，根据给药体积确定，注射量不超过0.1- 0.2 mL。
给药后将小鼠腹部毛推净，异氟烷麻醉后以仰式将小鼠置于小动物活体成像系统中，Cy5通道下观察给药后4小时和8小时后小鼠成像情况。利用活体成像软件Living Image统计小鼠发光强度，比较不同受试组间差异。
实验结果：
小鼠肝脏及肾脏中荧光强度（可以代表寡核酸相对含量）检测结果见表6和图4。结果表明，本发明设计的GalNAc化合物可以高效将核酸递送至动物肝脏。
表6 小鼠肝脏及肾脏中荧光强度
从表6可以看出，采用Cy5荧光标记的寡核苷酸在小鼠肝脏和肾脏中均分布，其中inc-YK-Gal-401在小鼠肝脏中荧光强度最高（即寡核苷酸相对含量最高），在4小时和8小时肝脏荧光强度分别可达9.03E+09和9.11E+09，inc-YK-Gal-402和inc-YK-Gal-403肝脏荧光强度也非常高，在4小时分别为8.79E+09和8.92E+09，在8小时分别为8.95E+09和9.01E+09。表明本发明设计GalNAc化合物可将寡核苷酸高效递送至肝脏。
综上所述，本发明设计了一系列新型GalNAc化合物，与现有技术GalNAc化合物相比，化学结构完全不同。本发明设计的GalNAc化合物，在连接臂中引入了三氮唑结构，凭借点击化学的优势，可以快速构筑一系列新型含三氮唑结构的GalNAc化合物。由本发明GalNAc化合物制备的GalNAc寡核苷酸缀合物，可以实现高效肝靶向递送，相比于现有技术代表性GalNAc化合物活性显著提升。
1. 本发明GalNAc化合物YK-GAL-401~YK-GAL-403制备的寡核苷酸缀合物与现有技术GalNAc相比，对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率显著提升。例如，inc-YK-Gal-401第7天抑制率比inc-YK-Gal-301、inc-GalNAc 1b和inc-NAG0052提高了21.5%、14.5%和12.7%，第14天抑制率分别提高了17.3%、10.4%和10.8%。
1）由本发明GalNAc化合物缀合的siRNA，对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率具有显著差异，YK-Gal-401~YK-Gal-403显著高于YK-Gal-404~406。例如，inc-YK-Gal-401在第7天和第14天分别比inc-YK-Gal-404提高了20.7%和16.0%。
2）本发明GalNAc化合物YK-Gal-401~YK-Gal-403与现有技术GalNAc化合物相比，缀合的siRNA对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率显著提高。例如，inc-YK-Gal-401在第7天和第14天分别比inc-YK-Gal-301提高了21.5%和17.3%。
3）结构相近的GalNAc化合物与siRNA的缀合物，对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率具有显著差异。因此，并不是化学结构相近的GalNAc化合物对寡核苷酸递送效率就一定接近，其制备的GalNAc寡核苷酸缀合物对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率并不一致，可能具有非常大的差异。
2. 本发明GalNAc化合物YK-GAL-401~YK-GAL-403制备的寡核苷酸缀合物与现有技术GalNAc相比，对小鼠肝脏中PCSK9基因表达抑制率显著提升。例如，inc-YK-Gal-401抑制率分别比inc-YK-Gal-301和inc-GalNAc 1b提高了21.1%和9.8%，显著提升。
1）由本发明GalNAc化合物缀合的siRNA，对小鼠肝脏中PCSK9基因表达抑制率具有显著差异，YK-Gal-401~YK-Gal-403显著高于YK-Gal-404~406。例如，inc-YK-Gal-401比inc-YK-Gal-404提高了19.4%。
2）本发明GalNAc化合物YK-Gal-401~YK-Gal-403与现有技术GalNAc化合物相比，缀合的siRNA对小鼠肝脏中PCSK9基因表达抑制率显著提高。例如，inc-YK-Gal-401比inc-YK-Gal-301提高了21.1%。
3）结构相近的GalNAc化合物与siRNA的缀合物，对小鼠肝脏中PCSK9基因表达抑制率具有显著差异。因此，并不是化学结构相近的GalNAc化合物对寡核苷酸递送效率就一定接近，其制备的GalNAc寡核苷酸缀合物对小鼠肝脏中PCSK9基因达抑制率并不一致，可能具有非常大的差异。
3. 本发明GalNAc化合物YK-GAL-401~YK-GAL-403制备的寡核苷酸缀合物与现有技术GalNAc相比，对小鼠血清中LDL-C降低水平显著提升。例如，inc-YK-Gal-401组小鼠第14天LDL-C降低水平，分别比inc-YK-Gal-301、inc-GalNAc 1b和NAG0052组提高了36.4%、20.6%和17.8%，显著提升。
1）由本发明GalNAc化合物缀合的siRNA，对小鼠血清中LDL-C水平的降低具有显著差异，YK-Gal-401~YK-Gal-403降低水平显著高于YK-Gal-404~YK-Gal-406。例如，inc-YK-Gal-401在第7天和第14天分别比inc-YK-Gal-404提高了33.0%和36.0%，显著提升。
2）本发明GalNAc化合物YK-Gal-401~YK-Gal-403与现有技术GalNAc化合物相比，缀合的siRNA对小鼠血清中LDL-C降低水平显著提高。例如，inc-YK-Gal-401在第7天和第14天分别比inc-YK-Gal-301提高了33.4%和36.4%。
3）结构相近的GalNAc化合物与siRNA的缀合物，对小鼠血清中LDL-C降低水平具有显著差异。因此，并不是化学结构相近的GalNAc化合物对寡核苷酸递送效率就一定接近，其制备的GalNAc寡核苷酸缀合物对小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率并不一致，可能具有非常大的差异。
4. 本发明设计化合物可将寡核苷酸高效递送至肝脏。
例如，inc-YK-Gal-401、inc-YK-Gal-402和inc-YK-Gal-403组在4小时肝脏荧光强度分别可达9.03E+09、8.79E+09和8.92E+09，在8小时分别可达9.11E+09、8.95E+09和9.01E+09，表明本发明设计的GalNAc化合物可将寡核苷酸高效递送至动物肝脏。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的GalNAc化合物及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (39)
1.一种如式（I）所示的GalNAc化合物或其药学上可接受的盐，
，
其中，
L1为-HNC(O)-或-C(O)NH-；
L2为-(CH2)n1-或-(CH2CH2O)n2CH2-，其中n1和n2为1-7的整数；
Z1为-(CH2)n3-，其中n3为1-7的整数；
L3为-HNC(O)-或-C(O)NH-；
n为0-10的整数；
L4为-(CH2)n4-，其中n4为0-7的整数；
A为，R1为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基或卤素；R2为4, 4'-二甲氧基三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基或异丙基二甲基甲硅烷基；R3为氢、羟基保护基、含磷活性反应基团、-CO(CH2)xCONH-E或-CO(CH2)xCOOH，其中x是1-10的整数，E为可控孔玻璃或聚苯乙烯；
B为氧或硫；
G为；
其中，
X1为-(CH2)a-或-(CH2CH2O)aCH2-，a是1-5的整数；
X2为-HNC(O)-或-C(O)NH-；
X3为-(CH2)b-，b是1-6的整数；
X4为，其中c，d为0-5的整数；
Y1为0或1；
Y2为0或1；
Y3为1，2或3；
当Y3为1时，K为CH2；Y3为2时，K为CH；Y3为3时，K为碳。
2.根据权利要求1所述的式（I）化合物或其药学上可接受的盐，其中所述的式（I）化合物满足下述条件中的一种或多种：
（1）L1为-C(O)NH-*，*端与G连接；
（2）L2为-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-或-(CH2)7-；
（3）n为0；
（4）L4为不存在、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-或-(CH2)7-；
（5）R1为氢或甲氧基；
（6）R2为4, 4'-二甲氧基三苯甲基；
（7）R3为-CO(CH2)2CONH-E；
（8）B为氧；
（9）X1为-(CH2)3-；
（10）X2为-HNC(O)-**，**端与X3连接；
（11）X3为-(CH2)2-、-(CH2)4-或-(CH2)5-；
（12）X4为，***端与X3连接；
（13）Y1为1；
（14）Y2为1；
（15）Y3为3，K为碳。
3.根据权利要求1所述的式（I）化合物或其药学上可接受的盐，其中L2为-(CH2CH2O)3CH2-。
4.根据权利要求1所述的式（I）化合物或其药学上可接受的盐，其中G为：
、
或
。
5.根据权利要求1所述的式（I）化合物或其药学上可接受的盐，所述如式（I）所示的化合物具有如式(IA)所示的结构：
，
其中，L1、L2、L4、B、A、X1、X2、X3、X4、Y1和Y2的定义如权利要求1所述。
6.根据权利要求1所述的式（I）化合物或其药学上可接受的盐，其为具有以下结构的化合物YK-GAL-401、YK-GAL-402、YK-GAL-403、YK-GAL-404、YK-GAL-405或YK-GAL-406，其中E为可控孔玻璃；
、
、、、或。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的式（I）化合物或其药学上可接受的盐，其能够结合脱唾液酸糖蛋白受体。
8.一种如式（IIA）或（IIB）所示的缀合物或其药学上可接受的盐，
或，
其中，Oligo代表寡核苷酸，X代表羟基或巯基，G1为；L1、L2、Z1、L3、L4、n、R1、R2、R3、X1、X2、X3、X4、Y1、Y2、Y3和K的定义如权利要求1所述。
9.根据权利要求8所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述寡核苷酸选自由小干扰核苷酸、DNA、微小RNA、小激活RNA、小向导RNA、转运RNA、反义寡核苷酸和适配体组成的组中的任一者或至少两者的组合。
10.根据权利要求9所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述寡核苷酸为反义寡核苷酸或小干扰核苷酸，所述反义寡核苷酸或小干扰核苷酸中每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸。
11.根据权利要求8所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述寡核苷酸调节靶基因的表达。
12.根据权利要求8所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述寡核苷酸为降低PCSK9的表达的双链RNAi剂，其包含选自由以下正义链和反义链配对形成的寡核苷酸双链体组成的组中的任一者或两者以上的组合：
（1）所述正义链具有如SEQ ID NO. 1所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 13所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（2）所述正义链具有如SEQ ID NO. 2所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 14所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（3）所述正义链具有如SEQ ID NO. 3所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 15所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（4）所述正义链具有如SEQ ID NO. 4所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 16所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（5）所述正义链具有如SEQ ID NO. 5所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 17所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（6）所述正义链具有如SEQ ID NO. 6所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 18所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（7）所述正义链具有如SEQ ID NO. 7所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 19所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（8）所述正义链具有如SEQ ID NO. 8所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 20所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（9）所述正义链具有如SEQ ID NO. 9所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 21所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（10）所述正义链具有如SEQ ID NO. 10所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 22所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（11）所述正义链具有如SEQ ID NO. 11所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 23所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（12）所述正义链具有如SEQ ID NO. 12所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 24所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列。
13.根据权利要求12所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂的正义链及反义链上核苷酸为修饰的核苷酸。
14.根据权利要求12所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂为抑制PCSK9基因表达的RNAi剂。
15.根据权利要求12所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂的正义链与SEQ ID NO. 1-12中任一序列相比具有1~3个核苷酸的替换、增加或删除；
或，所述双链RNAi剂的反义链与SEQ ID NO. 13-24中任一序列相比具有1~3个核苷酸的替换、增加或删除。
16.根据权利要求12所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂包含至少一个修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸选自由脱氧-核苷酸、3'-末端脱氧-胸腺嘧啶核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、解锁核苷酸、构型限制性核苷酸、限制性乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基-修饰的核苷酸、2'-C-烷基-修饰的核苷酸、2'-羟基-修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基-修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基的核苷酸、包含甲基磷酸酯基的核苷酸、包含5'-磷酸酯的核苷酸和包含5'-磷酸酯模拟物的核苷酸组成的组中的任一者或至少两者的组合。
17.根据权利要求12所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂至少一个链包含至少1个核苷酸的3'突出端；
或，所述双链RNAi剂至少一个链包含至少2个核苷酸的3'突出端。
18.根据权利要求12所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂双链区为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30对核苷酸的长度。
19.根据权利要求12所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂的正义链和/或反义链的核苷酸个数各自选自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30中的任一者。
20.根据权利要求19所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂正义链具有21个核苷酸，反义链具有23个核苷酸。
21.根据权利要求12所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂正义链及反义链的核苷酸修饰方式为核苷酸核糖的2'位的化学修饰。
22.根据权利要求21所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂核苷酸核糖的2'位的化学修饰选自由2'-甲氧基修饰、2'-O-甲氧基乙基修饰、2'-氟代修饰、2'-苄氧基修饰、2'-甲基羰基氨基修饰和2'-吡啶甲氧基修饰组成的组中的任一者或至少两者的组合。
23.根据权利要求22所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂各核苷酸核糖的2'位的化学修饰选自2'-甲氧基和2'-氟代的组合。
24.根据权利要求23所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂各核苷酸核糖的2'位的化学修饰选自2'-甲氧基和2'-氟代的交替组合。
25.根据权利要求24所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂各核苷酸核糖的2'位的化学修饰方式为：正义链奇数位均为2'-氟代修饰，且偶数位均为2'-甲氧基修饰；反义链奇数位均为2'-甲氧基修饰，且偶数位均为2'-氟代修饰。
26.根据权利要求12所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂核苷酸单体之间通过3',5'-磷酸二酯键连接。
27.根据权利要求26所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂核苷酸单体之间通过硫代修饰的3',5'-磷酸二酯键连接。
28.根据权利要求12所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂进一步具有以下修饰：
反义链具有以下A、B、C修饰方式中的任一种：
；
正义链具有以下a、b修饰方式中的任一种：
；
表中2'-OMe为2'-甲氧基；2'-F为2'-氟代；PS为硫代磷酸骨架；
其中反义链具有修饰方式A，正义链具有修饰方式a；
其中反义链具有修饰方式B，正义链具有修饰方式a；
其中反义链具有修饰方式C，正义链具有修饰方式a；
其中反义链具有修饰方式B，正义链具有修饰方式b；或
其中反义链具有修饰方式C，正义链具有修饰方式b。
29.根据权利要求12所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂反义链自5'端起第二至第八位中具有修饰基团，其中所述修饰基团为UNA、GNA或DNA，其中UNA和GNA结构分别如下：
；
其中，碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
30.根据权利要求12所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述双链RNAi剂中修饰的反义链5'末端核苷酸的糖苷包含5'位磷酸化基团，所述5'位磷酸化基团选自5'-乙烯基膦酸酯基团、5'-甲基膦酸酯基团、5'-C-甲基磷酸酯基团、5'-硫代磷酸酯基团或5'-磷酸酯基团，其结构示意如下：
；
其中，R为氢、羟基、胺基、C1-4烷基、芳香基、C1-4烷氧基、C1-4烷基羰基氨基或卤素；
碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶以及尿嘧啶。
31.根据权利要求12所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述缀合物由双链RNAi剂与如权利要求6所述的YK-GAL-401、YK-GAL-402、YK-GAL-403、YK-GAL-404、YK-GAL-405或YK-GAL-406缀合；所述双链RNAi剂包含选自由以下正义链和反义链配对组成的任一寡核苷酸双链体：
（1）所述正义链具有如SEQ ID NO. 25所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.32所示的序列；
（2）所述正义链具有如SEQ ID NO. 25所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.33所示的序列；
（3）所述正义链具有如SEQ ID NO. 26所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.34所示的序列；
（4）所述正义链具有如SEQ ID NO. 26所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.35所示的序列；
（5）所述正义链具有如SEQ ID NO. 26所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.36所示的序列；
（6）所述正义链具有如SEQ ID NO. 27所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.37所示的序列；
（7）所述正义链具有如SEQ ID NO. 27所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.38所示的序列；
（8）所述正义链具有如SEQ ID NO. 27所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.39所示的序列；
（9）所述正义链具有如SEQ ID NO. 28所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.40所示的序列；
（10）所述正义链具有如SEQ ID NO. 29所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.41所示的序列；
（11）所述正义链具有如SEQ ID NO. 30所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.42所示的序列；
（12）所述正义链具有如SEQ ID NO. 30所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.41所示的序列；
（13）所述正义链具有如SEQ ID NO. 31所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.43所示的序列；
（14）所述正义链具有如SEQ ID NO. 31所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.44所示的序列；和
（15）所述正义链具有如SEQ ID NO. 31所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.45所示的序列。
32.根据权利要求31所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述缀合物由双链RNAi剂与如权利要求6所述的YK-GAL-401、YK-GAL-402、YK-GAL-403、YK-GAL-404、YK-GAL-405或YK-GAL-406缀合；所述双链RNAi剂包含选自由以下正义链和反义链配对组成的任一寡核苷酸双链体：
（1）所述正义链具有如SEQ ID NO. 29所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.41所示的序列；
（2）所述正义链具有如SEQ ID NO. 30所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.42所示的序列；和
（3）所述正义链具有如SEQ ID NO. 30所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.41所示的序列。
33.根据权利要求8所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述缀合物由双链RNAi剂与如权利要求6所述的YK-GAL-401、YK-GAL-402、YK-GAL-403、YK-GAL-404、YK-GAL-405或YK-GAL-406缀合；所述双链RNAi剂包含由SEQ ID NO. 30所示的正义链和SEQ ID NO. 41所示反义链配对组成的寡核苷酸双链体；
或，所述缀合物由双链RNAi剂与如权利要求6所述的YK-GAL-401、YK-GAL-402、YK-GAL-403、YK-GAL-404、YK-GAL-405或YK-GAL-406缀合；所述双链RNAi剂的正义链具有如SEQ IDNO. 46所示的序列；所述双链RNAi剂的反义链具有如SEQ ID NO. 47所示的序列。
34.根据权利要求8所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述缀合物为如下任一缀合物：
、
、
、
、
或
；
其中，siRNA的正义链具有如SEQ ID NO. 46所示的序列；siRNA的反义链具有如SEQ IDNO. 47所示的序列。
35.一种药物组合物，其包含权利要求8-34中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂。
36.根据权利要求8-34中任一项所述的缀合物、其异构体或它们的药学上可接受的盐，或根据权利要求35所述的药物组合物，在制备用于治疗和/或预防由肝细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
37.根据权利要求36所述的用途，其中，所述疾病选自慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病、肝增生性疾病、血脂异常和补体相关疾病。
38.一种抑制肝细胞中特定基因表达的方法，其中，所述方法包括将有效量的权利要求8-34中任意一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐与所述肝细胞进行接触。
39.一种试剂盒，该试剂盒包括权利要求8-34中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐。
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| CN116854754A (zh) * | 2023-09-01 | 2023-10-10 | 北京悦康科创医药科技股份有限公司 | 一种含有核糖环或其衍生结构的GalNAc化合物及其寡核苷酸缀合物 |
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