CN118497018A - 一种以fad为辅基的葡萄糖脱氢酶的生产、纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的生产、纯化方法，该方法将来源于黄曲霉(Aspergillus flavus)的葡萄糖脱氢酶整合到宿主菌中，获得一株表达FAD‑GDH的重组菌，利用该重组菌生产葡萄糖脱氢酶，具有产量高、纯度高，底物专一性好，酶活高等特点。因此本发明提供的生产以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的方法具有较好的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的生产、纯化方法。
背景技术
血糖水平作为糖尿病临床诊断的主要和常规检测指标。葡萄糖氧化酶是葡萄糖检测试剂盒或葡萄糖传感器中应用最广泛的原料用酶，但其催化活性易受溶解氧的限制，会造成测量误差。目前发现葡萄糖脱氢酶具有替代葡萄糖氧化酶的潜力，因其不以氧气为电子受体，不受溶解氧的限制，检测结果误差更小。
葡萄糖脱氢酶按照辅基或辅酶类型可分为四类：(1)以NADP+为辅酶的葡萄糖六磷酸脱氢酶(EC1.1.1.49简称G6PDH)；(2)以NAD+为辅酶的葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.47简称NAD-GDH)；(3)以PQQ为辅基的葡萄糖脱氢酶(EC1.1.5.2简称PQQ-GDH)；(4)以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(EC1.1.99.10简称FAD-GDH)。FAD辅酶的葡萄糖脱氢酶想比于NAD辅酶，不受氧气干扰，底物专一性更好等优势，因此FAD-GDH可作为替代目前诊断用葡萄糖氧化酶的首选。
然而，FAD-GDH产能比较低，酶活不高，因此在工业化生产中仍存在很多问题。现有的技术公开的数据较少，可参考的数据不多，比如表达来源于洋葱伯克霍尔德菌的葡萄糖脱氢酶，过分批补料，分阶段温度控制，进行葡萄糖脱氢酶表达，酶活达到22200.0U/L等。但是很少有重组菌株能进行工业化大生产。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的生产、纯化方法，该方法将来源于黄曲霉(Aspergillus flavus)的葡萄糖脱氢酶整合到宿主菌中，获得一株表达FAD-GDH的重组菌，利用该重组菌生产葡萄糖脱氢酶，具有产量高、纯度高，底物专一性好，酶活高等特点。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种高表达以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的重组菌，其包括重组质粒和表达宿主；重组质粒包含目的基因以及表达载体；目的基因为以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因；葡萄糖脱氢酶来源于黄曲霉(Aspergillus flavus)。
为了获得产量更高的以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶，发明人在经过大量筛选发现以黄曲霉(Aspergillus flavus)来源的FAD-GDH基因构建的重组菌能够获得较高产量的FAD-GDH。
具体地，葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如为SEQ ID NO.1所示：
MLFSLAFLSALSLATASPAGRAKNTTTYDYIVVGGGTSGLVVANRLSENPDVSVLLLEAGASVFNNPDVTNANGYGLAFGSAIDWQYQSINQSYAGGKQQVLRAGKALGGTSTINGMAYTRAEDVQIDVWQKLGNEGWTWKDLLPYYLKSENLTAPTSSQVAAGAAYNPAVNGKEGPLKVGWSGSLASGNLSVALNRTFQAAGVPWVEDVNGGKMRGFNIYPSTLDVDLNVREDAARAYYFPYDDRKNLHLLENTTANRLFWKNGSAEEAIADGVEITSADGKVTRVHAKKEVIISAGALRSPLILELSGVGNPTILKKNNITPRVDLPTVGENLQDQFNNGMAGEGYGVLAGASTVTYPSISDVFGNETDSIVASLRSQLSDYAAATVKVSNGHMKQEDLERLYQLQFDLIVKDKVPIAEILFHPGGGNAVSSEFWGLLPFARGNIHISSNDPTAPAAINPNYFMFEWDGKSQAGIAKYIRKILRSAPLNKLIAKETKPGLSEIPATAADEKWVEWLKANYRSNFHPVGTAAMMPRSIGGVVDNRLRVYGTSNVRVVDASVLPFQVCGHLVSTLYAVAERASDLIKEDAKSA。
由于不同的物种、细胞具有密码子偏向性，为了让宿主细胞能够利用其密码子的偏好性获得稳定且高表达的FAD-GDH，本发明对上述来源的FAD-GDH还进行了密码子优化，在一些实施例中，葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列为如SEQ ID NO.2所示：
ATGCTTTTTTCTCTTGCTTTTTTGTCTGCTCTTAGTCTAGCTACTGCCTCTCCAGCTGGCCGTGCTAAAAACACAACCACTTATGACTACATAGTTGTTGGTGGTGGTACATCTGGTCTGGTTGTTGCTAATAGATTAAGTGAAAATCCTGATGTGTCTGTATTGCTGTTGGAGGCTGGAGCAAGTGTTTTTAATAATCCCGATGTTACAAACGCTAACGGTTACGGTCTAGCCTTTGGTTCCGCCATAGATTGGCAATACCAATCTATCAATCAATCATACGCTGGTGGTAAACAGCAGGTTCTTAGGGCAGGAAAGGCCCTGGGCGGTACTTCTACTATTAACGGAATGGCTTATACGCGTGCTGAAGACGTTCAAATAGACGTTTGGCAGAAGTTGGGTAACGAAGGATGGACCTGGAAGGACTTATTACCATACTATCTAAAAAGTGAGAATCTTACCGCCCCTACTTCCTCACAAGTTGCAGCAGGAGCTGCTTACAATCCTGCTGTTAATGGCAAGGAGGGTCCTCTTAAAGTGGGCTGGTCCGGAAGTTTGGCCTCAGGCAATCTGTCTGTTGCCTTAAACAGAACATTCCAGGCTGCCGGAGTACCATGGGTAGAGGACGTTAATGGTGGCAAGATGAGAGGATTCAACATTTATCCTTCTACTTTGGACGTCGATCTGAACGTCAGAGAGGACGCAGCAAGAGCCTATTACTTCCCATATGATGACCGAAAGAATTTACACTTGCTTGAAAACACAACTGCAAATAGACTGTTTTGGAAAAATGGCTCCGCTGAAGAGGCTATAGCTGACGGTGTCGAAATCACATCAGCTGACGGTAAAGTTACCAGAGTGCACGCTAAGAAAGAGGTGATCATATCAGCTGGTGCTCTTAGATCTCCTTTAATTCTTGAGCTGTCTGGAGTCGGAAATCCAACTATTTTAAAGAAGAACAATATCACCCCCAGAGTTGATCTTCCCACTGTGGGTGAGAACCTGCAAGACCAGTTCAACAATGGTATGGCTGGTGAAGGCTATGGTGTCCTAGCAGGAGCATCTACAGTAACTTACCCTAGTATCTCTGATGTATTCGGTAATGAGACCGATAGTATCGTTGCCTCTCTTCGAAGTCAATTGTCAGATTACGCTGCCGCCACTGTTAAGGTCTCCAACGGTCACATGAAGCAAGAAGATTTGGAAAGGTTGTACCAGTTGCAGTTCGACCTTATTGTGAAGGACAAGGTTCCCATAGCAGAAATTCTGTTTCACCCTGGTGGAGGTAACGCTGTTAGTAGTGAATTTTGGGGACTTTTGCCTTTTGCACGAGGAAACATACATATATCTTCCAATGATCCTACAGCCCCTGCCGCTATCAACCCAAACTACTTTATGTTCGAGTGGGATGGTAAATCTCAGGCAGGAATCGCCAAGTACATCCGAAAGATTCTGAGAAGTGCCCCTTTGAACAAGCTGATCGCAAAAGAGACAAAGCCAGGATTGAGTGAAATCCCTGCAACAGCAGCTGACGAAAAATGGGTGGAGTGGCTGAAAGCAAACTACAGGTCTAACTTCCATCCCGTCGGTACTGCTGCAATGATGCCAAGAAGTATAGGTGGTGTCGTTGATAACCGACTAAGGGTATACGGAACATCTAATGTGCGTGTTGTTGATGCTAGTGTTTTACCCTTTCAAGTTTGTGGACACCTGGTTTCTACACTGTACGCAGTTGCTGAGAGAGCCTCTGATTTGATTAAGGAGGACGCTAAGAGTGCTTAG。
在一些实施例中，表达宿主包括毕赤酵母菌。
在一些实施例中，表达宿主为毕赤酵母X33。
在一些实施例中，表达载体包括pPICZa A。
第二方面，本发明提供了上述重组菌的构建方法，其包括：将目的基因连接到表达载体上获得重组质粒，然后将重组质粒转化到表达宿主中，获得重组菌。
在一些实施例中，重组质粒为pPICZa A-FAD-GDH，表达宿主为毕赤酵母X33。
第三方面，本发明提供了上述重组菌在生产以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶中的应用。
第四方面，本发明还提供了一种生产以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的方法，其包括构建上述重组菌，然后将重组菌接种至BSM培养基中进行发酵，得到发酵液，离心收集菌体，将菌体进行细胞破碎，离心得上清，上清即为粗酶液。
在一些实施例中，重组菌在BSM培养基中发酵的条件为：pH＝5.0，发酵时间为70h。
在一些实施例中，方法还包括对粗酶液进行纯化和透析。
在一些实施例中，纯化包括：将粗酶液分别通过镍柱、脱盐柱和阴离子交换柱层析柱。
在一些实施例中，镍柱包括HisTrap HP。
在一些实施例中，脱盐柱包括HiPre TM 26/10Desalting。
在一些实施例中，阴离子交换柱层析柱包括DEAE FF。
在一些实施例中，透析的透析液的组分为10mM Tris、5mM NaCl，pH＝8.0。
本发明具有以下有益效果：
本发明将来源于黄曲霉(Aspergillus flavus)的葡萄糖脱氢酶整合到宿主菌中，获得一株表达FAD-GDH的重组菌，利用该重组菌生产葡萄糖脱氢酶，具有产量高、纯度高，底物专一性好，酶活高等特点。因此本发明提供的生产以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的方法具有较好的工业化应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中重组毕赤酵母合成表达FAD-GDH的质粒图pPICZa A-FAD-GDH；
图2为实施例1质粒pPICZa A-FAD-GDH分子构建DNA鉴定图；
图3为实施例2重组毕赤酵母X33/pPICZa A-FAD-GDH表达蛋白SDS-PAGE图；
图4为实施例2的FAD-GDH镍柱纯化SDS-PAGE图谱；
图5为实验例1的FAD-GDH纯酶的热稳定性探究；
图6为实验例2的纯化后的FAD-GDH酶的酶活反应测试。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下实施例中所用的大肠杆菌DH5α购买于生工生物工程(上海)股份有限公司；毕赤酵母X33购买于淼灵质粒平台。
下述实施例中所涉及的培养基：酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)购买于生工生物工程(上海)股份有限公司；BMGY培养基购买于生工生物工程(上海)股份有限公司；BMMY培养基购买于生工生物工程(上海)股份有限公司；BSM培养基购买于生工生物工程(上海)股份有限公司。
下述实施例中所涉及的：限制性内切酶、连接酶购买于New England Bioland。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例为高表达以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的重组菌的构建方法，步骤如下：
(1)通过EcoRI以及NotI酶切，将合成基因(如SEQ ID NO.2所示)连接在载体pPICZa A上，形成pPICZa A-FAD-GDH；
(2)将pPICZa A-FAD-GDH转入大肠杆菌DH5α中，扩增得到大量的pPICZa A-FAD-GDH，经过筛选从阳性转化子中提取质粒，然后对提取的质粒进行电泳验证；
(3)再将pPICZa A-FAD-GDH进行线性化，线性化酶为Sac I；
(4)将线性化的pPICZa A-FAD-GDH转入毕赤酵母X33中，从添加300mg/ml的zeocin的YPD平板上挑选阳性克隆，得到重组菌。
其中图1为重组质粒pPICZa A-FAD-GDH的构建示意图；图2为重组质粒pPICZa A-FAD-GDH的构建结果验证图，该图中的第2泳道为重组质粒pPICZa A-FAD-GDH的电泳结果，从图中可以看出，电泳条带与目的基因大小一致；然后将其送到苏州金唯智生物科技有限公司基因测序验证，经过序列比对可以证明构建成功。
实施例2
本实施例为一种生产以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的方法，其步骤如下：
(1)通过EcoRI以及NotI酶切，将合成基因(如SEQ ID NO.2所示)连接在载体pPICZa A上，形成pPICZa A-FAD-GDH；
(2)将pPICZa A-FAD-GDH转入大肠杆菌DH5α中，扩增得到大量的pPICZa A-FAD-GDH，经过筛选从阳性转化子中提取质粒，然后对提取的质粒进行电泳验证；
(3)再将pPICZa A-FAD-GDH进行线性化，线性化酶为Sac I；
(4)将线性化的pPICZa A-FAD-GDH转入毕赤酵母X33中，从添加300mg/ml的zeocin的YPD平板上挑选阳性克隆，得到重组菌。
(5)将从含有300mg/ml的zeocin的YPD平板上筛选出的菌落进行发酵，发酵的培养基为BMGY，培养24h后用甲醇诱导改为BMMY培养基；
(6)甲醇诱导5天之后，收集上清，通过SDS-PAGE来检测蛋白表达量，选择蛋白条带最粗所对应的菌，从而筛选出最高表达量的菌种(编号为：A1)；
(7)将构建的重组菌进行中试发酵，发酵培养基为BSM，发酵pH值控制为5.0，发酵时间为70h；
(8)发酵完后，将发酵液离心，10000r·min-1离心30min收集上清，上清即为粗酶液；
(9)由于蛋白带有6xhis标签，纯化方式为镍柱纯化。将粗酶液分别过HisTrap HP(镍柱)，HiPre TM 26/10Desalting(脱盐柱)和DEAE FF(阴离子交换柱层析柱)，获得纯酶；
(10)纯化后拿到的样品进行透析，透析液的组分为10mM Tris、5mM NaCl，pH＝8.0。
(11)获得纯化后的以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的酶液。
图3为重组毕赤酵母X33/pPICZa A-FAD-GDH表达蛋白SDS-PAGE图；图中显示，目的蛋白显示在不小于65kDa的弥散条带；
图4为FAD-GDH镍柱纯化SDS-PAGE图谱。图中显示目的蛋白主要在P1峰，杂蛋白在P2,P3和P4中；其中，M：Marker(3μL)；S：发酵上清原液(10μL)；FT：流穿液(10μL)；EbufferA:bufferA洗脱液(10μL)；
E20：20mM咪唑洗脱液(5μL)；P1：90mM咪唑洗脱液，P2:150mM咪唑洗脱液,P3-P5:300mM咪唑洗脱液。
实验例1
将实施例2中的纯化后的酶液进行热稳定测试，测试方法如下：
将纯化后的酶液放置在室温下和4度冰箱里，25h后检测葡萄糖脱氢酶的酶活。
如图5的结果显示，FAD-GDH酶液的热稳定性较好，在室温25度左右和4度放置25h，不会降解。
实验例2
将实施例2中的纯化后的样品进行酶活测试，测试所用试剂盒为葡萄糖脱氢酶(GCDH)活性检测试剂盒(solarbio，BC2695)，测试方法请见产品说明书。
将纯化后的样品进行冻干，冻干后样品再次SDS-PAGE测定以及酶活检测，测试方法同上。
检测结果如表1所示：
表1冻干样品的酶活检测结果
| 样品αF13测试次数 | 液体酶活(U/mL) | 酶活(U/mg冻干粉末) |
| 测试1 | 7827.64 | 313.11 |
| 测试2 | 9232.20 | 369.29 |
| 测试3 | 9121.80 | 364.87 |
| 测试4 | 9361.00 | 374.44 |
| 测试5 | 9213.80 | 368.55 |
液体酶活检测中受酶浓度的影响有所差异，因此将其制备为粉末酶进行检测获得的检测结果更为准确，经检测，本发明中粉末酶的酶活高于本领域中已有的FAD-GDH酶。
对比例1
与实施例2的区别在于，重组菌中GDH的来源不同，其来源于Thermoplasmaacidophilum，利用该来源的基因构建获得重组菌，其SDS-PAGE检测结果如图6所示，从中可以看出SDS-PAGE显示条带很弱，表达量很低。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种高表达以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌包括重组质粒和表达宿主；
所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)基因；
所述葡萄糖脱氢酶来源于黄曲霉(Aspergillus flavus)。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如为SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列如为SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述表达宿主包括毕赤酵母菌；
优选地，所述表达宿主为毕赤酵母X33。
5.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述表达载体包括pPICZa A。
6.如权利要求1-5任一项所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括：将目的基因连接到表达载体上获得重组质粒，然后将重组质粒转化到表达宿主中，获得所述重组菌。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒为pPICZa A-FAD-GDH，所述表达宿主为毕赤酵母X33。
8.如权利要求1-5任一项所述的重组菌在生产以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶中的应用。
9.一种生产以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的方法，其特征在于，包括构建权利要求1-5任一项所述的重组菌，然后将所述重组菌接种至BSM培养基中进行发酵，得到发酵液，离心收集菌体，将菌体进行细胞破碎，离心得上清，上清即为粗酶液；
所述重组菌在BSM培养基中发酵的条件为：pH＝5.0，发酵时间为70h。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对粗酶液进行纯化和透析；
优选地，所述纯化包括：将粗酶液分别通过镍柱、脱盐柱和阴离子交换柱层析柱；
优选地，所述镍柱包括HisTrap HP；
优选地，所述脱盐柱包括HiPre TM 26/10Desalting；
优选地，所述阴离子交换柱层析柱包括DEAE FF；
优选地，所述透析的透析液的组分为10mM Tris、5mM NaCl，pH＝8.0。
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