CN118240722A - 一种副干酪乳酪杆菌及其防治牙周炎的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种副干酪乳酪杆菌及其防治牙周炎的应用。所述副干酪乳酪杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.27587。本发明提供的副干酪乳酪杆菌显著逆转了牙周炎导致的上颌骨骨密度下降、骨小梁微结构形态指标下降、皮质形态指标升高，且治疗效果与抗生素组相当。除此之外，该副干酪乳酪杆菌还显著改善了牙周组织病变，明显降低血清中促炎因子含量和提高抗炎因子的含量，同时显著降低了牙周组织中促炎基因mRNA表达水平。因此，本发明提供的副干酪乳酪杆菌TMPC 44111为工业化生产保健食品、护理产品以及临床治疗牙周炎的药物研发提供了新的方向。

Description

一种副干酪乳酪杆菌及其防治牙周炎的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种副干酪乳酪杆菌及其防治牙周炎的应用。

背景技术

牙周炎（periodontitis，PD）是一种常见的由革兰氏阴性菌斑膜引起的复杂牙周组织慢性炎症性疾病。牙周病原体不仅导致牙周支持组织的破坏和牙齿松动脱落等不可逆转的损伤，还可能通过多种机制产生系统性影响，比如由牙周病原体转移到体循环中引起的菌血症，由牙周病原菌的脂多糖引起的内毒素血症等，此外由于慢性炎症产生的白细胞介素与炎症性肠病、糖尿病、动脉粥样硬化性血管性疾病以及心脑血管疾病等多种系统性疾病密切相关。

牙周炎的主要临床表现包括牙龈出血、牙周袋、牙槽骨吸收和牙齿活动。目前慢性牙周炎通的标准治疗方法是牙周袋机械清创术，同时采用抗生素作为常规辅助治疗来清除牙周病原体促进组织恢复。但抗生素细菌耐药性的不断增加及其副作用问题使临床及众多研究者开始寻找可行的替代治疗方法。宏基因组研究表明，牙周相关微生物群可能参与了疾病过程，牙菌斑中的微生物生态失调会引发炎症和免疫反应，最终，牙周病原体和毒力因素会直接或间接损害牙周组织。牙龈卟啉单胞菌、牙密螺旋体、连翘丹尼氏菌和放线菌聚集杆菌都被认为是牙周炎的主要致病参与者。

现有证据表明，肠道菌群及其代谢物被认为不仅影响肠道屏障功能、机体炎症反应，而且与宿主免疫系统密切相关，在口腔疾病与肠道疾病的互作中起关键作用。肠道微生物是参与整个机体的核心调控机制，因此调控肠道菌群的益生菌有望成为慢性牙周炎辅助治疗的一种可行方法从而替代传统抗生素。并且与基础机械牙周治疗相比，益生菌对口腔病原体和牙周组织的长期影响有可能获得更好的治疗效果。

中国专利申请CN114621898A公开了一种具有潜在口腔益生功能的肠膜明串珠菌及其在制备抑制口腔牙龈卟啉单胞菌的口腔护理用品、药品、的应用，属于微生物技术领域。所述菌株和菌剂可以抑制牙龈卟啉单胞菌的生长，抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成，降低细胞中肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-1β、前列腺素E2、一氧化氮的含量，可以作为功能性益生菌应用于口腔护理用品、药品等领域，具有非常好的产业前景。

中国专利申请CN116622548A公开了一株能够预防和或治疗牙周炎的嵴链球菌及其应用。所述嵴链球菌被命名为嵴链球菌 (Streptococcus cristatus) CA119。该菌生长速率快、环境耐受性良好、能产多种消化酶、糖发酵能力强、安全性较高且能抑制牙周炎主要病原菌牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌，该菌株抗牙周炎效果良好，并对牙周炎病原菌引起的结肠炎症具有保护作用，为牙周炎的防治提供了新思路。

目前本领域需要更多用于预防和/或治疗牙周炎的益生菌。

发明内容

本发明以实验性牙周炎小鼠（PD）模型为对象，对比研究了副干酪乳酪杆菌TMPC44111与抗生素的抗炎效果及对牙周组织的改善作用。

为了实现上述技术目的，本发明特此提出了以下技术方案：

在一个方面，本发明提供了一种副干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus paracasei），所述副干酪乳酪杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No. 27587。

在一些实施方式中，所述副干酪乳酪杆菌用于缓解、改善、预防、治疗和/或辅助治疗牙周炎。

在一些优选的实施方式中，所述牙周炎包括，但不限于：慢性牙周炎、侵袭性牙周炎或全身疾病相关牙周炎。

在另一方面，本发明提供了一种培养物，所述培养物包含前述任一副干酪乳酪杆菌经培养基培养而得。

本发明所述的培养基包括微生物增殖、存活或生长必需的碳源、氮源和/或磷源，任选的，还可包含对微生物增殖、存活或生长有所助益的微量元素等生长添加剂。

本领域技术人员可以使用本领域中已知的任何标准或已知的静态干燥或液体发酵技术制备本发明所述的“培养物”或“微生物培养物”，以用于本文中的组合物或产品中。微生物培养的最佳条件可以取决于具体菌株。本领域的技术人员将能够确定合适的营养素和条件。微生物可以在培养基上的好氧、厌氧或兼性厌氧的液体培养物中生长。

在一些实施方式中，所述培养基为用于培养乳酸菌的培养基。

在一些优选的实施方式中，所述培养基为用于培养乳酸杆菌的培养基。

在一些优选的实施方式中，所述培养基为MRS培养基或MRS改良培养基。

在又一方面，本发明提供了一种菌剂，所述菌剂包含前述任一副干酪乳酪杆菌或培养物。

在一些实施方式中，所述菌剂还包括增强所述副干酪乳酪杆菌或培养物稳定性、或有助于所述副干酪乳酪杆菌或培养物发挥生物学功能的助剂，例如：食品、保健品（保健食品）或药物生产标准中规定的防腐剂、增稠剂等以安全剂量添加也是允许的。

在一些实施方式中，所述菌剂还包括无菌或灭菌的包装或容器。

在又一方面，本发明提供了前述任一副干酪乳酪杆菌、培养物或菌剂在制备预防、治疗和/或辅助治疗牙周炎的产品中的应用。

在一些实施方式中，所述牙周炎包括，但不限于：慢性牙周炎、侵袭性牙周炎或全身疾病相关牙周炎。

在一些实施方式中，所述产品包括药物、食品或护理产品。

在一些优选的实施方式中，所述食品为保健食品（保健品）。

在一些优选的实施方式中，所述保健食品为功能性保健食品。

在一些优选的实施方式中，所述护理产品包括牙膏、洁牙粉、漱口水、牙贴、牙周啫喱、牙齿凝胶、漱口粒、糊剂或牙蜡等。

在又一方面，本发明提供了一种预防、治疗和/或辅助治疗牙周炎的产品，所述产品包含前述任一副干酪乳酪杆菌、培养物或菌剂。

在一些实施方式中，所述产品的每单位至少包含1×10⁸CFU所述副干酪乳酪杆菌。

在一些实施方式中，所述产品的每单位至少包含1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²CFU所述副干酪乳酪杆菌。

所述每单位取决于产品的剂型或包装形式，例如每片、每罐、每颗、每粒、每包等，具体以生产实践或商品包装为准。

在一些实施方式中，所述产品包括药物、食品或护理产品。

在一些实施方式中，所述产品还包含至少一种生理上可接受的辅料、或药学上可接受的赋形剂。

在一些实施方式中，所述生理上可接受的辅料包括，但不限于：赤藓糖醇、D-甘露糖醇、富马酸、甘油、果胶、海藻酸钾、海藻酸钠、滑石粉、焦磷酸钠、聚葡萄糖、卡拉胶、抗坏血酸钠、抗坏血酸棕榈酸酯、L-苹果酸、L(+)-酒石酸、麦芽糖醇、明胶、木糖醇、柠檬酸、柠檬酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸脂肪酸甘油酯、琼脂、乳酸、乳酸钠、山梨酸及其钾盐、山梨糖醇、酸性红、碳酸钙、碳酸钠、碳酸氢钠、甜菜红、维生素C、维生素E、氧化淀粉、乙醇、乙酸钠、硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸镁和/或糊精。

在一些实施方式中，所述药学上可接受的赋形剂包括，但不限于：溶剂、稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂和/或抗氧化剂。

在一些实施方式中，所述产品为固体制剂、半固体制剂、液体制剂或气体制剂。

在一些实施方式中，所述食品，包括，但不限于：糖果制品、饮料、巧克力、乳制品、冷冻制品、膨化食品、烘焙（烘烤）食品、酒类、可可制品或罐装食品等。

在一些实施方式中，所述食品为保健食品，包括功能性保健食品。

在一些实施方式中，所述保健食品的剂型包括，但不限于：片剂、胶囊、软胶囊、颗粒剂、丸剂、凝胶糖果、粉剂、口服液或滴剂。

在一些实施方式中，所述护理产品包括，但不限于：牙膏、洁牙粉、漱口水、牙贴、牙周啫喱、牙齿凝胶、漱口粒、糊剂或牙蜡等。

在一些实施方式中，所述产品为药物。

在一些实施方式中，所述药物还包括用于预防和/或治疗牙周炎的第二治疗剂。

在一些优选的实施方式中，所述第二治疗及包括，但不限于：硝基咪唑类药物、四环素类药物、青霉素类药物、大环内酯类药物、米诺环素凝胶或醋酸氯己定溶液。

本发明采用灌胃方式将CGMCC No. 27587副干酪乳酪杆菌施用于实验性牙周炎小鼠体内，以探究TMPC 44111对牙周炎的干预效果。结果显示，相比于PD模型组，PD+TMPC组的骨密度（BMD）、骨小梁微结构形态指标（BV/TV、TB.Th、TB.Sp、TB.N）等指标显著增高，皮质形态指标（Po(tot)、Po.V(tot)）显著下降，表明PD+TMPC组小鼠牙槽骨强度更高，牙槽骨吸收显著缓解，效果接近于PD+抗生素组，病理切片结果与micro-CT结果一致；除此之外，血清中促炎因子（IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ）显著降低，抗炎因子（IL-10）显著上升，表明灌胃TMPC 44111减轻PD小鼠全身性炎症；同时PD+TMPC组小鼠的牙周组织中促炎基因（IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-1β、INF-γ）表达量与PD模型组相比显著降低，表明灌胃TMPC 44111对PD小鼠的局部炎症也具有缓解的作用。以上结果表明TMPC 44111具有较好的抗炎活性，能够经过胃肠道发挥对实验性牙周炎的抗炎及缓解牙周组织病变的效果。

综上所述，本发明提供的副干酪乳酪杆菌显著逆转了牙周炎导致的上颌骨骨密度下降、骨小梁微结构形态指标下降、皮质形态指标升高，且治疗效果与抗生素组相当。除此之外，该副干酪乳酪杆菌还显著改善了牙周组织病变，明显降低血清中促炎因子含量和提高抗炎因子的含量，同时显著降低了牙周组织中促炎基因mRNA表达水平，不仅减轻了全身性炎症，还缓解了牙周炎导致的局部炎症。因此，本发明提供的副干酪乳酪杆菌TMPC 44111为工业化生产保健食品、护理产品以及临床治疗牙周炎的药物研发提供了新的方向。

保藏信息：

生物材料：TMPC 44111；

分类命名：副干酪乳酪杆菌Lacticaseibacillus paracasei；

保藏编号：CGMCC No. 27587；

保藏时间：2023年06月08日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：CGMCC ；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1示出了不同实验组小鼠上颌骨的micro-CT扫描结果。

图2示出了不同实验组小鼠上颌牙周骨的骨密度（BMD）情况。

图3示出了不同实验组小鼠上颌牙周骨的骨体积分数（BV/TV）情况。

图4示出了不同实验组小鼠上颌牙周骨的骨小梁数（Tb.N）的情况。

图5示出了不同实验组小鼠上颌牙周骨的骨小梁厚度（Tb.Th）的情况。

图6示出了不同实验组小鼠上颌牙周骨的骨小梁分离度（Tb.Sp）的情况。

图7示出了不同实验组小鼠上颌牙周骨的结构模式指数（SMI）的情况。

图8示出了不同实验组小鼠上颌牙周骨的骨小梁连接密度（Conn.Dn）的情况。

图9示出了不同实验组小鼠皮质骨的总孔隙率（Po(tot)）的情况。

图10示出了不同实验组小鼠皮质骨的孔隙总体积（Po.V(tot)）的情况。

图11示出了不同实验组小鼠牙周骨组织病理切片HE染色结果。其中a，b，c，d分别为A，B，C，D的局部放大图。

图12示出了不同实验组小鼠血清中IL-6的水平。其中各实验组标注的小写字母不同代表存在显著性差异，p<0.05。

图13示出了不同实验组小鼠血清中TNF-α的水平。其中各实验组标注的小写字母不同代表存在显著性差异，p<0.05。

图14示出了不同实验组小鼠血清中IL-12的水平。其中各实验组标注的小写字母不同代表存在显著性差异，p<0.05。

图15示出了不同实验组小鼠血清中IFN-γ的水平。其中各实验组标注的小写字母不同代表存在显著性差异，p<0.05。

图16示出了不同实验组小鼠血清中IL-10的水平。其中各实验组标注的小写字母不同代表存在显著性差异，p<0.05。

图17示出了不同实验组小鼠上颌牙周组织炎性因子基因IL-6的mRNA表达水平。其中各实验组标注的小写字母不同代表存在显著性差异，p<0.05。

图18示出了不同实验组小鼠上颌牙周组织炎性因子基因IL-17A的mRNA表达水平。其中各实验组标注的小写字母不同代表存在显著性差异，p<0.05。

图19示出了不同实验组小鼠上颌牙周组织炎性因子基因IFN-γ的mRNA表达水平。其中各实验组标注的小写字母不同代表存在显著性差异，p<0.05。

图20示出了不同实验组小鼠上颌牙周组织炎性因子基因TNF-α的mRNA表达水平。其中各实验组标注的小写字母不同代表存在显著性差异，p<0.05。

图21示出了不同实验组小鼠上颌牙周组织炎性因子基因IL-1β的mRNA表达水平。其中各实验组标注的小写字母不同代表存在显著性差异，p<0.05。

具体实施方式

除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。

除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。

本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20%的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10%的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5%的范围。

本文所使用的数值范围应被理解为已经列举了对该范围内的所有数字。例如，1至20的 范围应当理解为包括来自下组的任何数字、数字组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

本文所用的术语“包括（comprises）”或“包含（comprising）”是指“包括但不限于”。该术语旨在是开放式的，以指定任何所述特征、要素、整数、步骤或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、要素，整数、步骤、组件或其组的存在或添加。因此，术语“包含”包括更具限制性的术语“由……组成”和“基本上由……组成”。在一个实施方式中，在整个申请中特别是在权利要求书中使用的术语“包含”可以被术语“由……组成”代替。

本文所用的术语“任选”、“任一”、“任意”或“任一项”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。本发明所用，“一个”和“一种”在本发明中用来指的一个或多于一个的语法对象。

本文所用的术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项的组合。

本文所用的术语“培养物”，是指一定时间一定空间内微生物的活细胞群或活生长物。如微生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。在一些实例中，是指在人为规定的条件下培养、繁殖得到的活的微生物群体。

本文所用的术语“培养基”，是指含有可以被微生物吸收并且支持有效的细胞生长的碳源、氮源和无机盐来源。碳源可以包括己糖，如葡萄糖，并且可以使用其他易于吸收的来源，如氨基酸。许多无机和蛋白质材料可以用作生长过程中的氮源。氮源可以包括氨基酸和尿素，以及氨、无机硝酸盐和铵、维生素、嘌呤、嘧啶、酵母提取物、牛肉提取物、朊蛋白胨、大豆粉、酪蛋白的水解产物、烧酒糟残液等。可以并入营养培养基中的无机矿物质为能够产生钙、锌、铁、锰、镁、铜、钴、钾、钠、钼酸根、磷酸根、硫酸根、氯离子、硼酸根和类似离子的盐。

本文所用的术语“牙周炎”，又被称为破坏性牙周病，是由于牙菌斑中的细菌侵犯牙周组织而引起的慢性炎症，可导致牙周支持组织（牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质）的破坏，牙周袋（牙齿和牙龈之间缝隙加宽形成的小口袋）形成、附着丧失和牙槽骨的吸收，随着病程进展牙齿会慢慢松动，牙龈退缩最终可导致牙齿丧失。

本文所用的术语“牙齿护理产品”，也可以被称为口腔护理产品，是指用于清洁牙齿或口腔，清新口气，保持口腔（包括牙齿和牙龈）的美观和/或健康的组合物。在一些特定的语境中，也可以指用于预防和/或治疗牙齿疾病，尤其是牙周炎的组合物。在一些实例中，所述组合物还包括氟化物盐、过氧化物、研磨剂和风味剂中的至少一种，也可以包括用于改善组合物流变性和稳定性的凝胶或改性凝胶。

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

本发明涉及的主要材料和设备：

培养基（MRS培养基，Thermo）；RNA提取试剂盒（索莱宝）；cDNA反转录试剂盒（Thermo）；RT-PCR试剂盒（Thermo）；抗生素粉剂（氨苄青霉素、万古霉素、新霉素和甲硝唑等，Sigma-Aldrich）；脂多糖LPS（阿拉丁）；所有（IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ以及IL-10）ELISA试剂盒（Invitrogen）；其他普通试剂均为分析纯；

酶标仪（Thermo）；注射器（BD）；荧光定量PCR仪（Thermo，SepOne Plus）；正置光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；离心机（白洋，BY-160C）；生物样品均质器（杭州奥盛，Bioprep-24）。

实施例1 副干酪乳酪杆菌TMPC 44111的菌液制备

采用MRS培养基将菌活化并置于37℃及厌氧条件下培养48 h至细菌对数生长期，用测量光密度（波长为600 nm）的方法来标准化菌落形成单位（CFU）的数量，离心后按照2×10⁹CFU/kg浓度用PBS制备副干酪乳酪杆菌TMPC 44111混悬菌液备用。

实施例2 小鼠实验性牙周炎模型建立

2.1 动物分组

选用SPF级C57BL/6J小鼠24只，雄性，周龄为8周-10周，体重为30 g-35 g（购买自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物合格证编号：No.430727230100796624）。实验方案得到重庆第二师范学院儿童营养与健康发展协同创新中心伦理委员会批准（批准号：2023032701B），操作均按照实验动物伦理委员会的要求进行。实验分为4组，每组6只：正常对照组（NC组）、牙周炎模型组（PD组）、灌胃多种混合广谱抗生素阳性对照组（PD+Antibiotic组）以及灌胃适当浓度的副干酪乳酪杆菌TMPC 44111菌液实验组（PD+TMPC组）。

2.2 造模及干预

除NC正常组小鼠喂养正常维持饲料外，其他各组均用Keyes 2000配方饲料（果糖56%，脱质奶粉28%，面粉6%，酵母4%，苜蓿粉3%，动物肝粉1%，食盐2%）及少量蔬菜喂养5周，联合口腔注射一次0.1 mL LPS（2 mg/mL浓度）建立模型。在此期间，NC组及PD模型组小鼠每隔1天灌胃200 μL PBS，其他组分别灌胃200 μL对应的抗生素混合液（氨苄青霉素：1mg/mL、万古霉素：0.5 mg/mL、新霉素：1 mg/mL和甲硝唑：1 mg/mL）或TMPC 44111活菌液（灌胃浓度为2×10⁹CFU/kg），直到实验结束。

实施例3 副干酪乳酪杆菌TMPC 44111缓解实验性牙周炎

动物模型和分组均同实施例2。

取材后将小鼠上颌骨放在组织固定液中固定，之后骨组织样本采用德国Bruker公司SkyScan 1176小动物Micro-CT扫描影像系统上机扫描，扫描分辨率18 μm；样本micro-CT扫描主要参数为：电压50 kV，电流455 μA，曝光时间265 ms；利用仪器配套的重建分析软件进行ROI区域分析，CTvox3D软件进行重建，CTan软件进行参数分析。

3.1 副干酪乳酪杆菌TMPC 44111对上颌牙周骨骨密度的影响

结果显示，与NC正常组相比，PD模型组的骨密度（bone mineral density，BMD）显著下降，与之相比，PD+Antibiotic组及PD+TMPC干预组的BMD显著升高，且与NC组没有显著差异（图1和图2）。结果表明，副干酪乳酪杆菌TMPC 44111有助于缓解牙周炎导致的上颌牙周骨骨密度下降，明显提高上颌牙周骨骨密度，使其恢复正常水平。

3.2 副干酪乳酪杆菌TMPC 44111对上颌牙周骨的骨小梁微结构形态的影响

3.2.1 副干酪乳酪杆菌TMPC 44111对上颌牙周骨的骨小梁数、骨小梁厚度和骨小梁分离度的影响

骨小梁数（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）和骨小梁分离度（trabecular separation，Tb.Sp），可以评价骨小梁空间形态结构。

结果显示：

与NC正常组相比，PD模型组的骨体积分数（BV/TV）明显下降（P＜0.05），说明模型组的骨小梁骨量下降，骨分解增强，骨代谢开始失衡；PD+Antibiotic组与PD+TMPC组干预组与正常组相比没有差异，能够抑制牙周炎模型导致的骨体积分数（BV/TV）下降（图3）。

与NC正常组相比，PD模型组的骨小梁数（Tb.N）显著降低（P＜0.05），提示骨分解大于骨合成，而PD+Antibiotic组及PD+TMPC干预组骨小梁数（Tb.N）与NC组差异不大，且PD+TMPC组效果稍好（图4）。

骨小梁厚度（Tb.Th）在PD组明显下降，在其余三组没有明显差异（P>0.05）（图5）；另外骨小梁分离度（Tb.Sp）在PD模型组明显增加，PD+Antibiotic组及PD+TMPC 干预组虽有所下降，但是下降幅度不是很显著（图6）。

上述结果表明，TMPC 44111与抗生素均可以预防和延缓牙周骨组织的分解流失。

3.2.2 副干酪乳酪杆菌TMPC 44111对上颌牙周骨的结构模式指数和骨小梁连接密度的影响

结构模式指数（structure model index，SMI），是描述小梁结构组成结构中板层结构和杆状结构比例的参数，发生骨质疏松时，骨小梁从板状向杆状转变，该值增大。骨小梁连接密度（connectivity density，Conn.Dn），表示每立方毫米体积中骨小梁网状结构之间的连接数。

结果显示：

与NC组相比，PD模型组SMI明显增大，PD+Antibiotic组SMI略微增大，PD+TMPC组次之（图7）。

与NC组相比，PD组Conn.Dn显著降低（P＜0.05），但是PD+Antibiotic组和PD+TMPC组却与NC组没有显著差异，表明TMPC 44111与抗生素一样具有抑制和缓解骨小梁连接数减少的作用（图8）。

3.3 副干酪乳酪杆菌TMPC 44111对皮质骨的影响

与NC正常组相比，PD模型组的总孔隙率[total porosity (percent)，Po(tot)]以及孔隙总体积[total volume of pore space，Po.V(tot)]显著增大，而抗生素可以明显抑制牙周炎导致的皮质骨这两个参数的增大，PD+TMPC组效果次之，两个干预组均与NC组无显著差异（图9和图10）。

实施例4 副干酪乳酪杆菌TMPC 44111对牙周组织病理学改变的影响

动物模型和分组均同实施例2。

小鼠取血后采用颈椎脱臼法处死，取上颌骨标本于多聚甲醛中固定48 h以上，修整标本，仅保留磨牙区段牙齿及牙周组织。采用混合脱钙液脱钙，后采用纵切方式切5 μm厚度的牙体牙周组织联合切片，进行HE染色，光学显微镜下观察结合上皮、上皮下炎症细胞浸润及牙槽骨的吸收情况。

各组小鼠牙周组织病理切片HE结果如图11所示。结果表明，NC正常组的牙龈上皮及结合上皮完整，牙周膜胶原纤维排列整齐，牙槽骨部位少量炎性细胞；PD牙周炎模型组可见牙龈结合上皮丢失，胶原纤维排列紊乱，牙龈组织附近和牙槽骨内部大量慢性炎细胞浸润，牙髓内部充血及骨小梁稀疏空隙变大，骨吸收明显；抗生素和PD+TMPC干预组结合上皮水肿、增生、上皮下方及结缔组织均有轻度的淋巴炎细胞浸润，牙周膜纤维排列规则，牙槽骨内部炎性细胞与PD组相比明显减少，骨吸收陷窝消失，牙槽骨新生迹象。

实施例5 副干酪乳酪杆菌TMPC 44111对血清中炎性因子水平的调节

动物模型和分组均同实施例2。

实验结束采用摘眼球法收集小鼠外周血液于1.5 mL无菌离心管中，室温静置2 h放置4℃过夜，后3000 r/min离心10 min，分离收集上层血清，于-20℃冷冻保存待检。采用ELISA法分别检测小鼠血清中相关炎症因子IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ以及IL-10的含量；按照商品试剂盒说明书步骤操作，具体方法是：用待测指标的抗小鼠单抗包被于酶标板上，复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与生物素结合，加入酶底物四甲基联苯胺，经酶作用后显天蓝色，加终止液硫酸反应后变黄色，反应体系置于酶标仪内，将空白孔调零后，在波长为450 nm处测吸光度（absorbance，A）值，通过绘制标准曲线得出所测指标的含量。

为评估灌胃TMPC 44111对PD小鼠的整体炎症水平的影响，本实施例检测了血清中促炎因子及抗炎因子的表达水平。结果显示，PD模型组血清中的炎症因子IL-6、IL-12、TNF-α以及IFN-γ的含量显著升高，高于NC正常组（p<0.05）；与PD组相比，TMPC 44111干预可以显著预防这几个指标的升高，效果与抗生素干预相似，且两个干预组血清中IFN-γ及IL-12的含量与正常组无差异（图12-图15）。对于抗炎因子IL-10，NC正常组的IL-10含量显著高于PD模型组（p<0.05），而TMPC 44111可以提高小鼠模型血清中IL-10水平，其作用效果与抗生素组没有明显差异（p>0.05）（图16）。以上结果表明灌胃益生菌TMPC 44111能够下调PD小鼠的全身性促炎症因子水平，提高抗炎因子水平从而起到炎症调节的作用。

实施例6 副干酪乳酪杆菌TMPC 44111对牙龈内炎性因子基因表达的调节

动物模型和分组均同实施例2。

取材后立即将新鲜的小鼠牙龈组织放入-80℃冷冻保存待用，后提取组织RNA时取出并剪取一定量组织按照RNA提取及反转录试剂盒的说明书步骤操作提取出全基因组RNA，测浓度后将RNA反转录成cDNA，检测cDNA纯度后作为样本待用。RT-qPCR过程及参数按照试剂说明书进行，加入反转录酶等反应物，加入引物以及SYBR Green上机运行qPCR。以β- actin为内参基因，所有检测基因的引物序列如表1所示。

表1

为评估灌胃TMPC 44111对 PD 小鼠的牙周局部炎症水平的影响，采用 RT-qPCR检测牙龈内炎性因子的基因表达。

结果显示，与NC正常组相比，PD模型组小鼠上颌牙周组织IL-6、IL-17A、TNF-α、IFN-γ以及IL-1β的mRNA表达显著升高（P<0.05），全部高于其余各组（P<0.05）（图17-图21）。相对PD模型组小鼠，PD+TMPC干预组及抗生素组可以明显降低小鼠上颌牙周组织中IL- 6、IL-17A、TNF-α、IFN-γ以及IL-1β的mRNA表达（P<0.05），其中对于IL-6基因的抑制作用最为显著，IL-17A和TNF-α，对IFN-γ抑制作用稍弱，表达最为接近正常组小鼠（P<0.05）（图17-图21）。上述结果表明，灌胃TMPC 44111能够下调PD小鼠的牙周组织内炎症水平，与前文血清炎性因子结果相吻合，具有很好的抗炎作用。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1. 一种副干酪乳酪杆菌，其特征在于，所述副干酪乳酪杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No. 27587。

2.一种培养物，其特征在于，所述培养物为权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌经培养基培养而得。

3.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌或权利要求2所述的培养物。

4.根据权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌、权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的菌剂在制备预防、治疗和/或辅助治疗牙周炎的产品中的应用。

5.一种预防、治疗和/或辅助治疗牙周炎的产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1所述的副干酪乳酪杆菌、权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的菌剂。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括药物、食品或护理产品；

和/或，所述产品还包含至少一种生理上可接受的辅料、或药学上可接受的赋形剂；

和/或，所述产品为固体制剂、半固体制剂、液体制剂或气体制剂。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述食品包括糖果制品、饮料、巧克力、乳制品、冷冻制品、膨化食品、烘焙食品、酒类、可可制品或罐装食品。

8.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述食品为保健食品。

9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述保健食品的剂型包括片剂、胶囊、软胶囊、颗粒剂、丸剂、凝胶糖果、粉剂、口服液或滴剂。

10.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述护理产品包括牙膏、洁牙粉、漱口水、牙贴、牙周啫喱、牙齿凝胶、漱口粒、糊剂或牙蜡。