CN114765958A - 牙周病的预防或改善剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抑制牙周病原菌所导致的感染并且对牙周病的预防或改善有用的材料。该牙周病原菌感染抑制剂以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。

Description

牙周病的预防或改善剂
技术领域
本发明涉及一种牙周病的预防或改善剂。
背景技术
牙周病的原因在存在于口腔内的600种以上的细菌中有引起慢性炎症疾病的牙周病原菌。牙周病原菌通过感染牙周组织并侵入细胞内，引起牙龈炎以及牙周组织破坏。
作为现有的牙周病的预防和改善技术，可以列举针对牙周病原菌的杀菌剂和抗生物质，这些技术具有强的杀菌效果、抑菌效果，因此有可能破坏正常的口腔菌群，此外还会导致耐性菌出现，从而可能导致重大的疾病。
另外，近年来报告了利用作为益生菌而备受瞩目的乳酸杆菌和双歧杆菌来抑制牙周病原菌增殖的技术。例如，有报告：乳酸乳球菌、鼠李糖乳杆菌、弯曲乳杆菌所属的特定菌株具有口腔内生物膜形成抑制作用、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的生长抑制作用(专利文献1)；屎肠球菌所属的乳酸菌具有牙龈卟啉单胞菌的增殖抑制效果(专利文献2)；肠膜明串珠菌具有牙龈卟啉单胞菌等生物膜的形成抑制作用(专利文献3)等。
另一方面，已知粘液奈瑟氏球菌、干燥奈瑟氏球菌、黄奈瑟氏球菌、微黄奈瑟氏球菌、浅黄奈瑟氏球菌、长奈瑟氏球菌等奈瑟氏球菌属细菌在口腔内作为非病原性的共生菌而存在，关于它们的功能尚不明确。
专利文献1：日本特开2010-124772号公报
专利文献2：日本特开2006-328052号公报
专利文献3：日本特开2010-53062号公报
发明内容
本发明涉及以下的1)～22)。
1)一种牙周病原菌感染抑制剂，其以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
2)一种牙槽骨吸收抑制剂，其以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
3)一种牙周病的预防或改善剂，其以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
4)一种牙周病原菌感染抑制用食品，其以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
5)一种牙槽骨吸收抑制用食品，其以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
6)一种牙周病的预防或改善用食品，其以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
7)粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙周病原菌感染抑制剂中的用途。
8)粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙槽骨吸收抑制剂中的用途。
9)粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙周病的预防或改善剂中的用途。
10)粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙周病原菌感染抑制用食品中的用途。
11)粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙槽骨吸收抑制用食品中的用途。
12)粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙周病的预防或改善用食品中的用途。
13)一种用于抑制牙周病原菌感染的粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物。
14)一种用于抑制牙槽骨吸收的粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物。
15)一种用于预防或改善牙周病的粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物。
16)粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物用于抑制牙周病原菌感染的非治疗用途。
17)粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物用于抑制牙槽骨吸收的非治疗用途。
18)粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物用于预防或改善牙周病的非治疗用途。
19)一种牙周病原菌感染抑制方法，其将有效量的粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物向需要它们的对象给药或使所述对象摄取。
20)一种牙槽骨吸收抑制方法，其将有效量的粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物向需要它们的对象给药或使所述对象摄取。
21)一种牙周病的预防或改善方法，其将有效量的粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物向需要它们的对象给药或使所述对象摄取。
22)一种粘液奈瑟氏球菌的含EPS培养物的制造方法，其向粘液奈瑟氏球菌的培养液中添加牙龈卟啉单胞菌的培养上清并进行培养，接着除去菌体和培养基成分后回收。
附图说明
图1是粘液奈瑟氏球菌的菌体数依赖性牙周病原菌感染抑制效果。MOI(Multiplicity of infection：感染复数)表示添加的菌体数。
图2是奈瑟氏球菌属细菌对牙周病原菌的感染抑制效果。
图3是粘液奈瑟氏球菌对各种牙周病原菌的感染抑制效果。
图4是通过添加牙龈卟啉单胞菌培养上清而产生的粘液奈瑟氏球菌菌体培养物的收量增加效果。
图5是通过添加牙龈卟啉单胞菌培养上清而增加的粘液奈瑟氏球菌所产生的EPS的照片。
图6是粘液奈瑟氏球菌菌体培养物的牙周病原菌感染抑制效果。
图7是粘液奈瑟氏球菌的牙槽骨吸收抑制效果(牙槽骨吸收量)。
图8的(A)是粘液奈瑟氏球菌的牙槽骨吸收抑制效果(试验后的小鼠上颌骨照片)，(B)是牙槽骨吸收量测定部位(箭头：测定部)。
具体实施方式
本发明提供一种抑制牙周病原菌所导致的感染并且对牙周病的预防或改善有用的材料。
对口腔内微生物进行深入研究后发现，作为非病原性的口腔共生菌已知的粘液奈瑟氏球菌的菌体或其培养物抑制牙周病原菌对牙龈细胞的感染，并且在动物模型中显示牙槽骨吸收抑制效果，作为牙周病的预防或治疗剂是有用的。
本发明的粘液奈瑟氏球菌是非病原性的口腔共生菌，因此可以提供一种健康人以及老年人和病后人群可以长期摄取的牙周病预防或改善剂。
本发明中所使用的粘液奈瑟氏球菌(Neisseria mucosa)是奈瑟氏球菌(Neisseria)科奈瑟氏球菌属所属的革兰氏阴性球菌，是非病原性的口腔共生菌。
粘液奈瑟氏球菌可以从人的唾液、齿垢等中分离。还可以通过JCM获得(粘液奈瑟氏球菌JCM12992株(ATCC19696株))。
在本发明中，作为粘液奈瑟氏球菌的“菌体”，可以是粘液奈瑟氏球菌的活菌体、湿润菌体、干燥菌体的任意种菌体。另外，既可以是活菌体，也可以是死菌体。另外，菌体也包含利用酶或物理方法对菌体进行处理而得到的细胞质、细胞壁部分等菌体成分。
作为粘液奈瑟氏球菌的“菌体培养物”，除了含有培养基成分、菌体和胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances；EPS)等培养物以外，还可以列举从培养物中除去培养基成分后的含有菌体和EPS的培养物、从培养物中除去菌体后的含有培养基成分和EPS的培养物、或者从培养物中除去培养基成分和菌体后的含有EPS的培养物等。
根据需要，可以根据使用目的以冻结干燥粉末、喷雾干燥粉末、液体中悬浮等任意的形态制备本发明的菌体或菌体培养物。
在本发明的培养粘液奈瑟氏球菌的培养基中，作为营养源只要含有蛋白胨等，就没有特别限定，例如可以例示BHI培养基(日本BD公司制造)等。
就培养方法而言，只要是粘液奈瑟氏球菌的菌体良好生长的条件，就没有特别限制，例如可以列举以20～40℃、优选35～38℃、在好氧条件下、优选5％CO2存在下培养16～72小时。
另外，在本发明中，在使用粘液奈瑟氏球菌的菌体培养物的情况下，从产生EPS的方面考虑，粘液奈瑟氏球菌优选在37℃、5％CO2存在下，在牙龈卟啉单胞菌等牙周病原菌的培养上清中培养24小时以上，该培养上清例如是在厌氧存在下培养牙龈卟啉单胞菌并将所得到的培养液离心分离，将得到的上清进行过滤器灭菌后进行添加。
如后述的实施例所示，粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物具有抑制以牙龈卟啉单胞菌为代表的牙周病原菌对牙龈上皮细胞感染的效果，并且抑制牙槽骨吸收。
因此，粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物能够制成牙周病原菌感染抑制剂、牙槽骨吸收抑制剂或牙周病的预防或改善剂，粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物能够用于制造牙周病原菌感染抑制剂、牙槽骨吸收抑制剂或牙周病的预防或改善剂。
另外，粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物能够用于抑制牙周病原菌的感染，进而用于抑制牙槽骨吸收，用于预防或改善牙周病。其中，该用途可以是对人或非人动物给药，或者用于来自这些人或非人动物的检测样本，另外，可以是治疗用途也可以是非治疗用途。其中，作为非人动物，可以列举非人哺乳动物、两栖类和软骨鱼类；作为非人哺乳动物，例如可以列举类人猿、其他灵长类、小鼠、大鼠、马、牛、猪、羊、狗、猫、仓鼠和伴生动物等。
在本发明中，“牙周病”是指牙龈被齿垢中的细菌引起炎症的炎症性疾病，包含牙龈炎和牙周炎。牙龈炎是齿垢中的牙周病菌感染牙周组织并引起牙龈的炎症的病态。该牙龈炎病态被搁置而炎症恶化时，不只是牙龈肿胀或出血，牙周袋还会变深，从而向牙周炎病态转变。随着该牙周炎加重，引起牙龈的萎缩、支撑牙根的牙槽骨的吸收，最终导致牙齿脱落。
另外，“牙周病原菌感染抑制”是指抑制牙周病原菌对牙龈细胞的感染，作为牙周病原菌，例如，除了牙龈卟啉单胞菌以外，还可以列举具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythia)、伴放线菌聚集杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、直肠弯曲杆菌(Campylobacter rectus)、生痰新月形单胞菌(Selenomonas sputigena)等。
另外，“牙槽骨吸收抑制”是指抑制作为支撑牙齿的骨骼的牙槽骨的破坏(吸收)。
在本说明书中，“预防”是指防止或延缓个体的疾病或症状发作、或者降低个体的疾病或症状发作的危险性。
另外，“改善”是指疾病、症状或状态好转、防止或延缓疾病、症状或状态恶化、或者逆转、防止或延缓疾病或症状加重，并且包含所谓“治疗”的概念。
本发明的牙周病原菌感染抑制剂、牙槽骨吸收抑制剂、牙周病的预防或改善剂可以由其自身制成用于牙周病原菌的感染抑制、用于牙槽骨的吸收抑制、用于牙周病的预防或改善的医药品、医药部外品、食品、口腔用组合物，还可以制成与该医药品、医药部外品、食品、口腔用组合物中配合使用的材料或制剂。
其中，食品包含以牙周病和口臭的预防或改善等为概念，根据需要标示其宗旨的食品、功能性标示食品、特定保健用食品、患者用食品、增补剂。
作为用作医药品时的形态，优选口服给药的形态，其剂型例如可以列举：液剂；锭剂、颗粒剂、细粒剂、粉剂、片剂等固体剂；或封入了该液剂或固体剂的胶囊剂、口腔用喷雾剂、含片等各种各样的形态。这样的各种剂型的医药制剂可以在不妨碍粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物的作用的范围内，适当组合其他药学上可接受的赋形剂、结合剂、增量剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、缓冲剂、保存剂、矫味剂、香料、被膜剂、载体、稀释剂等而制备。
作为用作食品时的形态，除了果汁或蔬菜汁饮料、碳酸饮料、茶系饮料、乳饮料、发酵乳、发酵果汁、发酵蔬菜汁、酒精饮料、清凉饮料等饮料、果冻状食品和各种零食类、烤制点心、蛋糕类、巧克力、果酱、面包、口香糖、糖、汤类、腌菜、佃煮等各种食品以外，还可以列举与上述的口服给药制剂相同形态(锭剂、胶囊剂、糖浆等)的增补剂等。该食品可以按照常规方法将粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物与任意的食品材料、或其他的有效成分、或食品可接受的添加物(例如溶剂、软化剂、油、乳化剂、防腐剂、酸味剂、甜味剂、苦味剂、pH调整剂、稳定剂、着色剂、紫外线吸收剂、抗氧化剂、保湿剂、增粘剂、凝固剂、分散剂、流动性改善剂、湿润剂、香科、调味料、风味调节剂等)等适当组合而制备。
作为用作口腔用组合物时的具体形态，可以列举洗口剂、漱口液、牙膏、牙粉、液体牙膏、口腔用软膏剂、凝胶剂、锭剂、颗粒剂、细粒剂、橡皮糖果冻、含片、片剂、胶囊、糖果、口香糖等，优选可以列举牙膏、洗口剂、橡皮糖果冻、含片。口腔用组合物例如可以按照常规方法适当配合粘结剂、湿润剂、研磨剂、甜味剂、防腐剂、表面活性剂、香料等而制备。
上述医药品、食品、口腔用组合物中的粘液奈瑟氏球菌的菌体的含量没有特别限定，只要根据一日给药量等适当调节即可，作为粘液奈瑟氏球菌的菌体，例如可以列举5×108个以上、优选1×1010个以上1×1013个以下、更优选1×1011个以上1×1012个以下。粘液奈瑟氏球菌的菌体培养物的含量没有特别限定，只要根据一日给药量等适当调节即可，例如可以列举0.1mg以上、优选100mg以上、更优选500mg以上，且为5000mg以下、优选2500mg以下、更优选1000mg以下。
在上述医药品、食品、口腔用组合物中，粘液奈瑟氏球菌的菌体给药量可以根据患者的体重、年龄、性别、症状等各种条件适当确定，例如用粘液奈瑟氏球菌的菌体数表示时，作为每一日的服用量，可以列举1×108个以上、优选1×1010个以上1×1013个以下、更优选1×1011个以上1×1012个以下。另外，粘液奈瑟氏球菌的菌体培养物的给药量相对于成人每一人、每一日，作为冻结干燥时的干燥重量，可以列举0.1mg以上、优选100mg以上、更优选500mg以上，且为5000mg以下、优选2500mg以下、更优选1000mg以下。
作为本发明的牙周病原菌感染抑制剂、牙周病原菌感染抑制用食品、牙槽骨吸收抑制剂、牙槽骨吸收抑制用食品、牙周病的预防或改善剂和牙周病的预防或改善用食品的给药或摄取对象，优选可以列举感染了牙周病原菌的人、出现牙龈炎和牙周炎这样的牙龈炎症以及牙槽骨吸收的症状的人、期望预防牙龈炎症和牙槽骨吸收发作的人等，例如可以列举有牙龈的肿胀或出血或者有其危险的人、引起牙龈萎缩或牙槽骨吸收或有其危险的人等。
关于上述的实施方式，在本发明中，进一步公开以下的方式。
＜1＞一种牙周病原菌感染抑制剂，其以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
＜2＞一种牙槽骨吸收抑制剂，其以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
＜3＞一种牙周病的预防或改善剂，其以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
＜4＞一种牙周病原菌感染抑制用食品，其以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
＜5＞一种牙槽骨吸收抑制用食品，其以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
＜6＞一种牙周病的预防或改善用食品，其以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
＜7＞粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙周病原菌感染抑制剂中的用途。
＜8＞粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙槽骨吸收抑制剂中的用途。
＜9＞粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙周病的预防或改善剂中的用途。
＜10＞粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙周病原菌感染抑制用食品中的用途。
＜11＞粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙槽骨吸收抑制用食品中的用途。
＜12＞粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙周病的预防或改善用食品中的用途。
＜13＞一种用于抑制牙周病原菌感染的粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物。
＜14＞一种用于抑制牙槽骨吸收的粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物。
＜15＞一种用于预防或改善牙周病的粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物。
＜16＞粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物用于抑制牙周病原菌感染的非治疗用途。
＜17＞粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物用于抑制牙槽骨的吸收的非治疗用途。
＜18＞粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物用于预防或改善牙周病的非治疗用途。
＜19＞一种牙周病原菌感染抑制方法，其将有效量的粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物向需要它们的对象给药或使所述对象摄取。
＜20＞一种牙槽骨吸收抑制方法，其将粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物以有效量向需要它们的对象给药或使所述对象摄取。
＜21＞一种牙周病的预防或改善方法，其将有效量的粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物向需要它们的对象给药或使所述对象摄取。
＜22＞在＜1＞、＜4＞、＜7＞、＜10＞、＜13＞、＜16＞或＜19＞中，牙周病原菌优选为选自牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普雷沃菌、齿垢密螺旋体、福赛斯坦纳菌、伴放线菌聚集杆菌、直肠弯曲杆菌和生痰新月形单胞菌中的1种以上。
＜23＞在＜1＞～＜22＞中，菌体培养物优选为向粘液奈瑟氏球菌的培养液中添加牙龈卟啉单胞菌的培养上清并进行培养而得到的培养物，或者为向粘液奈瑟氏球菌的培养液中添加牙龈卟啉单胞菌的培养上清并进行培养、除去菌体和培养基成分而得到的含EPS培养物。
＜24＞一种粘液奈瑟氏球菌的含EPS培养物的制造方法，其向粘液奈瑟氏球菌的培养液中添加牙龈卟啉单胞菌的培养上清并进行培养，接着除去菌体和培养基成分后回收。
实施例
实施例1粘液奈瑟氏球菌抑制牙周病原菌(牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、齿垢密螺旋体和中间普雷沃菌)感染的效果
(1)细胞培养条件
人牙龈上皮细胞(Ca9-22)从JCRB细胞库获得(JCRB0625)。
使用DMEM(Gibco，包含10％v/v FBS、1％v/v青霉素-链霉素)，以温度37℃、CO2浓度5％对Ca9-22进行培养。
(2)细菌培养条件
牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌从ATCC获得，齿垢密螺旋体和中间普雷沃菌从微生物材料开发室(JCM)获得(表1)。菌落培养使用厌氧哥伦比亚培养基(日本BectonDickinson(以下简称为日本BD))，液体培养使用GAM肉汤培养基(日水制药，含有5.0μg/mLHemin、17.4μg/mL K2HPO4、1.0μg/mL Vitamin K)，在温度37℃、使用了厌氧产气袋(AnaeroPack/Kenki，三菱瓦斯化学)的厌氧性条件下进行培养。
奈瑟氏球菌属的细菌从ATCC或JCM获得6个菌种(表1)。菌落培养使用脑心浸液(Brain Heart Infusion；BHI)琼脂(Agar)培养基(日本BD)，液体培养使用BHI培养基(日本BD)，以温度37℃进行培养。
牙龈卟啉单胞菌使用进行24小时前培养后以100倍稀释进一步进行24小时液体培养而得到的菌体，具核梭杆菌、齿垢密螺旋体和中间普雷沃菌使用进行24小时前培养后以1000倍稀释进一步进行24小时液体培养而得到的菌体。奈瑟氏球菌属的细菌使用进行24小时前培养后以100倍稀释进一步进行48小时液体培养而得到的菌体。
[表1]
Figure BDA0003674513700000101
(3)试剂
作为标记试剂的羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluoresceindiacetate succinimidyl ester；CFSE)从同仁化学购入，溶解于DMSO后，以终浓度10μM使用。
(4)菌体的荧光标记方法
将牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、齿垢密螺旋体和中间普雷沃菌培养液以4℃、3,500g进行10分钟的离心，回收沉淀的菌体。将所回收的菌体使用PBS(-)并接着使用DMEM(Gibco)以4℃、3,500g进行5分钟的离心而进行清洗，之后调整成OD600＝1.0，在10μM CFSE溶液(dissolving DMEM)中，以37℃在暗处下培养30分钟，进行荧光标记。将被荧光标记的菌体使用DMEM(Gibco)以4℃、3,500g进行5分钟的离心而清洗2次后，调整菌体悬浮液的浊度，从而制作了被CFSE标记的牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、齿垢密螺旋体和中间普雷沃菌。
(5)感染方法
从进行了24小时培养后的Ca9-22(以0.3×106细胞/孔接种在12孔板中)的培养板中除去培养基后，使用PBS(-)进行清洗，以MOI＝20～500添加悬浮于DMEM(Gibco)中的各种奈瑟氏球菌属细菌或粘液奈瑟氏球菌后，以MOI＝500添加被CFSE标记的牙龈卟啉单胞菌、或具核梭杆菌、齿垢密螺旋体和中间普雷沃菌，进行2小时培养，由此进行感染。
(6)感染细胞的分析方法
从感染了被CFSE标记的牙龈卟啉单胞菌或具核梭杆菌、齿垢密螺旋体、中间普雷沃菌的Ca9-22中除去培养基，使用PBS(-)清洗2次后，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)分离感染细胞，将细胞回收在1.5mL管中。对于所回收的细胞，添加400μL的4％多聚甲醛/磷酸缓冲液(Wako)并移液，以4℃进行30分钟固定处理。添加800μL PBS(包含2％的FBS)并移液后，以4℃、600g进行3分钟的离心，悬浮于400μL PBS(包含2％的FBS)中，由此制成分析样品。
分析使用流式细胞仪(Flow cytometry，BD，FACSVerse)。基于前向散射(Forwardscatter，FSC)、侧向散射(side scatter，SSC)设门(gating)，根据门内的细胞500,000个的FITC通道(channel)所得到的荧光强度，算出平均荧光强度(mean fluorescenceintensity；MFI)，对附着并感染了被荧光标记的牙龈卟啉单胞菌、或具核梭杆菌、齿垢密螺旋体和中间普雷沃菌的细胞进行检测，从而评价细胞感染能力。
(7)统计分析
所得到的结果由平均值±标准误差(Mean±standard error(SE))表示。平均值的差的检验使用统计分析软件SPSS(IBM)进行Dunnett检验(Dunnett’s test)或Tukey-Kramer检验，P值小于0.05(P＜0.05)时，统计学上有显著性差异。
(8)结果
1)将粘液奈瑟氏球菌对牙龈卟啉单胞菌的感染抑制效果示于图1。
根据图1能够确认，粘液奈瑟氏球菌以其菌体数依赖性的方式抑制了牙龈卟啉单胞菌对牙龈上皮细胞的感染。
2)将奈瑟氏球菌属细菌对牙龈卟啉单胞菌感染的抑制效果示于图2。
根据图2能够确认，在奈瑟氏球菌属细菌中，粘液奈瑟氏球菌特异性抑制了牙龈卟啉单胞菌的感染。
3)将粘液奈瑟氏球菌对具核梭杆菌、齿垢密螺旋体和中间普雷沃菌感染的抑制效果示于图3。
根据图3能够确认，粘液奈瑟氏球菌也抑制了牙龈卟啉单胞菌以外的牙周病原菌(具核梭杆菌、齿垢密螺旋体和中间普雷沃菌)的感染。
实施例2粘液奈瑟氏球菌的菌体培养物对牙周病原菌(牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、齿垢密螺旋体和中间普雷沃菌)感染的抑制效果(1)粘液奈瑟氏球菌菌体培养物的制备
对于粘液奈瑟氏球菌，使用BHI培养基300mL以温度37℃进行48小时培养，从而准备了粘液奈瑟氏球菌培养液。
关于牙龈卟啉单胞菌培养上清未添加组，向粘液奈瑟氏球菌培养液中添加GAM肉汤培养基，使得终浓度成为5％，以温度37℃进行48小时培养后，将粘液奈瑟氏球菌培养液20mL回收在50mL管中。关于牙龈卟啉单胞菌培养上清添加组，向粘液奈瑟氏球菌培养液中添加所制备的牙龈卟啉单胞菌培养上清，使得终浓度成为5％，以温度37℃进行48小时培养后，将粘液奈瑟氏球菌培养液20mL回收在50mL管中。其中，以终浓度1％向GAM肉汤培养基(日水制药株式会社制造)中添加牙龈卟啉单胞菌前培养液，在厌氧条件下以37℃培养24小时后，对所得到的培养液以13000g、4℃进行15分钟的离心分离，除去菌体，利用0.22μm的过滤器对其上清部分进行过滤灭菌，由此制备了牙龈卟啉单胞菌培养上清。
为了从粘液奈瑟氏球菌培养液中除去培养基成分，以16000g、4℃进行了30分钟的离心分离之后，舍去上清，添加超纯水20mL进行清洗。将该清洗重复6次。清洗后，同样进行离心分离，将沉淀后的含有菌体和EPS的菌体培养物分散在超纯水中，进行超声波破碎。
超声波破碎条件：利用BRANSON SONIFIER 150(功率4，将破碎20秒→冷却20秒设为5次)破碎后，以16000g、4℃离心30分钟使菌体沉淀，将上清回收在新的50mL管中。
为了完全除去菌体，对所回收的上清再次以16000g、4℃进行30分的离心分离，回收上清。
通过将所回收的上清冻结干燥，得到除去了菌体和培养基成分的粘液奈瑟氏球菌的菌体培养物(牙龈卟啉单胞菌培养上清添加组、牙龈卟啉单胞菌培养上清未添加组)。将菌体培养物的收量因添加牙龈卟啉单胞菌培养上清而增加的结果示于图4和图5。
(2)(1)中所制备的粘液奈瑟氏球菌的菌体培养物以终浓度0.1％溶解在DMEM(Gibco)中，按照与实施例1相同的方法，确认了对于牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、齿垢中间普雷沃菌和齿垢密螺旋体感染牙龈上皮细胞的抑制效果。将结果示于图6。
(3)结果
从图6可以证实，粘液奈瑟氏球菌的菌体培养物具有抑制包括牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、齿垢密螺旋体和中间普雷沃菌的牙周病原菌感染牙龈上皮细胞的作用。
实施例3粘液奈瑟氏球菌使用小鼠牙周病模型小鼠对牙槽骨吸收的抑制效果
(1)对象动物
对象动物使用4周龄的雌性BALB/c小鼠(日本SLC)。小鼠在室温23±2℃、55±10％、12小时的昼夜周期(昼间节律：AM7-PM7)条件下进行饲养。在1周的预饲养期间，小鼠自由饮用自来水，自由进食动物饲料CE-2固体食物(日本Clea)。
(2)细菌培养条件
使用与实施例1同株的牙龈卟啉单胞菌和粘液奈瑟氏球菌、浅黄奈瑟氏球菌，按照与实施例1相同的方法进行细菌培养。
(3)牙龈卟啉单胞菌感染小鼠牙周炎模型
参考kobayashi等的方法(R.Kobayashi,et al.J Dent Res(2011)90(5)：653-658)，利用牙龈卟啉单胞菌感染牙周炎模型进行评价。1周的预饲养后，饮用含有2mg/mL磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole)(富士胶片和光纯药株式会社)、0.4mg/mL甲氧苄啶(Trimethoprim)(Toronto Research Chemicals)的自来水10日进行饲养。之后，在自由饮用4日自来水后，以使平均体重在组间均等的方式将小鼠分配成(1)未感染组、(2)牙龈卟啉单胞菌单独感染组、(3)牙龈卟啉单胞菌、粘液奈瑟氏球菌共感染组、(4)牙龈卟啉单胞菌、浅黄奈瑟氏球菌共感染组。分配后，以牙龈卟啉单胞菌为109CFU并且粘液奈瑟氏球菌和浅黄奈瑟氏球菌各为108CFU的方式，悬浮在100μL的2％羧甲基纤维素钠(SIGMA)/PBS(富士胶片和光纯药株式会社)中，在异氟烷吸入麻醉下，向小鼠口腔内1日滴加1次、计15次(1周5次、计3周)，使其感染，从而诱发牙周炎。对于没有诱发牙周炎的假处理(Sham)组，也同样每日滴加100μL的2％CMC/PBS。从最终感染日开始27日后，在异氟烷吸入麻醉下，通过放血而使其安乐死后，采取小鼠上颌。
(4)牙槽骨吸收量的测定方法
牙槽骨吸收量的测定参考Jeong等的方法(Jeong SH,et al.Exp Mol Med(2018)23；50(3):e460)实施。从小鼠颌骨除去多余的组织，移至24孔板。之后，利用微波炉进行加热处理，从而对组织进行去肉(deflesh)处理。向加入了加热后的颌骨组织的24孔板中添加3％的过氧化氢(富士胶片和光纯药株式会社)1mL，在室温条件下浸渍一晩。用纯水进行清洗，利用1％亚甲蓝(Methylene Blue)溶液(富士胶片和光纯药株式会社)染色1分钟后，用纯水进行充分清洗。对于染色后的样品，利用立体显微镜进行拍摄，利用Image J对上颌骨第二臼齿的釉牙骨质界(Cementoenamel junction；CEJ)至牙槽嵴顶(alveolar bonecrest；ABC)的距离进行2点测定(图8(B)的箭头部)，算出其平均长度，从而评价牙槽骨吸收量。
(5)统计分析
所得到的结果由平均值±标准误差(Mean±standard error(SE))表示。平均值的差的检验使用统计分析软件SPSS(IBM)进行Tukey-Kramer检验，P值小于0.05(P＜0.05)时，统计学上有显著性差异。
(6)结果
将粘液奈瑟氏球菌的牙槽骨吸收抑制效果示于图7，将试验后的小鼠上颌骨照片示于图8(A)。
由图7能够确认，通过粘液奈瑟氏球菌共感染，抑制了牙龈卟啉单胞菌感染所诱发的牙槽骨吸收。另一方面，在作为相同的奈瑟氏球菌属细菌的浅黄奈瑟氏球菌共感染时，未能确认牙槽骨吸收抑制效果。

Claims (26)

1.一种牙周病原菌感染抑制剂，其特征在于：
以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
2.一种牙槽骨吸收抑制剂，其特征在于：
以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
3.一种牙周病的预防或改善剂，其特征在于：
以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
4.一种牙周病原菌感染抑制用食品，其特征在于：
以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
5.一种牙槽骨吸收抑制用食品，其特征在于：
以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
6.一种牙周病的预防或改善用食品，其特征在于：
以粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物为有效成分。
7.如权利要求1所述的剂或权利要求4所述的食品，其特征在于：
牙周病原菌为选自牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普雷沃菌、齿垢密螺旋体、福赛斯坦纳菌、伴放线菌聚集杆菌、直肠弯曲杆菌和生痰新月形单胞菌中的1种以上。
8.如权利要求1、2、3或7所述的剂或权利要求4、5、6或7所述的食品，其特征在于：
菌体培养物为向粘液奈瑟氏球菌的培养液中添加牙龈卟啉单胞菌的培养上清并进行培养而得到的培养物，或者为向粘液奈瑟氏球菌的培养液中添加牙龈卟啉单胞菌的培养上清并进行培养、除去菌体和培养基成分而得到的含EPS培养物。
9.一种粘液奈瑟氏球菌的含EPS培养物的制造方法，其特征在于：
向粘液奈瑟氏球菌的培养液中添加牙龈卟啉单胞菌的培养上清并进行培养，接着除去菌体和培养基成分后回收。
10.粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙周病原菌感染抑制剂中的用途。
11.粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙槽骨吸收抑制剂中的用途。
12.粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙周病的预防或改善剂中的用途。
13.粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙周病原菌感染抑制用食品中的用途。
14.粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙槽骨吸收抑制用食品中的用途。
15.粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物在制造牙周病的预防或改善用食品中的用途。
16.一种用于抑制牙周病原菌感染的粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物。
17.一种用于抑制牙槽骨吸收的粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物。
18.一种用于预防或改善牙周病的粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物。
19.粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物用于抑制牙周病原菌感染的非治疗用途。
20.粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物用于抑制牙槽骨吸收的非治疗用途。
21.粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物用于预防或改善牙周病的非治疗用途。
22.一种牙周病原菌感染抑制方法，其特征在于：
将有效量的粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物向需要它们的对象给药或使所述对象摄取。
23.一种牙槽骨吸收抑制方法，其特征在于：
将有效量的粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物向需要它们的对象给药或使所述对象摄取。
24.一种牙周病的预防或改善方法，其特征在于：
将有效量的粘液奈瑟氏球菌的菌体或菌体培养物向需要它们的对象给药或使所述对象摄取。
25.如权利要求10、13或19所述的用途、权利要求16所述的菌体或菌体培养物或权利要求22所述的方法，其特征在于：
牙周病原菌为选自牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普雷沃菌、齿垢密螺旋体、福赛斯坦纳菌、伴放线菌聚集杆菌、直肠弯曲杆菌和生痰新月形单胞菌中的1种以上。
26.如权利要求10～15和19～21中任一项所述的用途、权利要求16～18中任一项所述的菌体或菌体培养物或权利要求22～24中任一项所述的方法，其特征在于：
菌体培养物为向粘液奈瑟氏球菌的培养液中添加牙龈卟啉单胞菌的培养上清并进行培养而得到的培养物，或者为向粘液奈瑟氏球菌的培养液中添加牙龈卟啉单胞菌的培养上清并进行培养、除去菌体和培养基成分而得到的含EPS培养物。
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