CN118240661A - 电喷单乳液高通量筛选微生物菌株的方法及其应用 - Google Patents

电喷单乳液高通量筛选微生物菌株的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物筛选技术，公开了一种电喷单乳液高通量筛选微生物菌株的方法及其应用。该方法包括：建立微生物突变体库，获得所述微生物突变体库的培养液；将所述培养液与含有凝胶剂的溶液混合得到分散液，将所述分散液进行电喷形成单分散液滴；将所述单分散液滴与含交联剂的收集液接触固化形成微球，将所述微球经培养后进行微流控分选；其中，所述凝胶剂与所述交联剂相接触能够发生交联固化反应。该方法无需使用油相生成单包裹液滴，荧光染色和筛选过程更加简便，有效提高对菌株筛选的有效性和准确性。

Description

电喷单乳液高通量筛选微生物菌株的方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物筛选技术，具体地，涉及一种电喷单乳液高通量筛选微生物菌株的方法及其应用。
背景技术
裂殖壶菌是典型的生物制造的细胞工厂，其油脂含量占细胞干重可达55重量%，它生产的油脂可以被用来作为生物柴油，食品或营养品等。其中，DHA是人体所必需的一种多不饱和脂肪酸，早期从深海鱼油中提取。裂殖壶菌的DHA含量占细胞干重的20重量%左右，其被认为是一种极具实现工业化生产DHA潜力的微生物。
为了快速获得更高产油脂的裂殖壶菌，对裂殖壶突变菌库的高通量筛选至关重要。目前较为先进的方法是微流控高通量筛选策略，但是由于微流控法需要使用油相，在用尼罗红染色时清洗液滴较为繁琐，且液滴在清洗过程中损失较多，对菌株筛选的有效性和准确性形成不利的影响。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种电喷单乳液高通量筛选微生物菌株的方法及其应用，该方法无需使用油相生成单包裹液滴，荧光染色和筛选过程更加简便，有效提高对菌株筛选的有效性和准确性。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种电喷单乳液高通量筛选微生物菌株的方法，该方法包括以下步骤：
S1、建立微生物突变体库，获得所述微生物突变体库的培养液；
S2、将所述培养液与含有凝胶剂的溶液混合得到分散液，将所述分散液进行电喷形成单分散液滴；
S3、将所述单分散液滴与含交联剂的收集液接触固化形成微球，将所述微球经培养后进行微流控分选；
其中，所述凝胶剂与所述交联剂相接触能够发生交联固化反应。
优选地，步骤S1中所述建立微生物突变体库采用紫外辐照、等离子体诱变和化学诱变中的至少一种。
优选地，步骤S1中所述培养液的OD600为0.5-0.7，步骤S2中所述培养液与所述含有凝胶剂的溶液的体积比为1:800-1200。
优选地，所述含有凝胶剂的溶液中凝胶剂的浓度为1-3重量%，所述收集液中交联剂的浓度为2-5重量%。
优选地，所述凝胶剂为海藻酸钠和/或壳聚糖，所述交联剂为氯化钙和/或氯化铁。
优选地，步骤S2中所述分散液的通道管径为40-100μm。
优选地，所述电喷的条件包括：电压为4-20kV，所述分散液的流速小于或等于5mL/h，通道的液滴出口与所述收集液之间的距离为0-5cm。
优选地，步骤S3中所述培养的条件包括：温度为25-35℃，时间为3-100天。
优选地，步骤S3中所述微流控分选采用的筛选信号选自荧光、吸光度、拉曼光谱和质谱中的至少一种。
优选地，所述微流控分选的过程包括：将培养后的所述微球进行荧光染色后，检测其荧光强度并设置荧光筛选阈值，利用分选芯片将荧光强度高于所述荧光筛选阈值的微粒分选出来。
优选地，所述荧光染色的染料采用含有尼罗红的二甲基亚砜溶液；所述分选芯片设计为载体油物理分选芯片或者电动响应阀门分选芯片。
优选地，所述载体油物理分选芯片包括物理分选芯片主体、位于所述物理分选芯片主体上的物理分选通道、与所述物理分选通道的侧壁连通的载体油注射通道以及与所述物理分选通道的侧壁连通的物理收集通道，所述载体油注射通道与所述物理收集通道设置在所述物理分选通道的两侧且位于同一直线上，以能够在所述物理分选芯片主体检测到所述微球的荧光强度高于所述荧光筛选阈值时，将额外的载油从所述载体油注射通道注入所述物理分选通道，以将该微球推入所述物理收集通道内。
优选地，所述电动响应阀门分选芯片包括电动分选芯片主体、位于所述电动分选芯片主体上的电动分选通道、与所述电动分选通道的侧壁连通的电动收集通道以及位于所述电动分选通道内的电动响应阀门，所述电动响应阀门位于所述电动收集通道与所述电动分选通道的连接处，以能够在所述电动分选芯片主体检测到所述微球的荧光强度高于所述荧光筛选阈值时，将所述电动响应阀门打开，以将该微球推入所述电动收集通道内。
本发明第二方面提供上述的方法在筛选高产油脂的裂殖壶菌中的应用。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明依托于电喷技术，利用电场力拉拽生成单分散液滴，制备方法简单、易行；相对于传统菌株筛选方法，本发明提供的筛选方法将菌株单包裹在凝胶微球中，利用凝胶剂的保水性和支撑力，为菌株生长提供稳定空间，保证单一菌株的独立生长环境，进一步增加了筛选的精确性；本发明在利用电喷技术生成单包裹液滴时，无需使用油相，使得筛选过程中对液滴进行荧光染色的步骤操作更加简便，有效提高对菌株筛选的有效性和准确性。
进一步地，本发明创新性地提出载体油物理分选芯片或电动响应阀门分选芯片，可适配于多种检测信号如荧光、拉曼、质谱等，几乎可覆盖所有类型产物的分选，适用范围更广、筛选精准性更高。
附图说明
图1是实施例1中电喷单乳液高通量筛选裂殖壶菌的流程图；
图2是本发明中载体油物理分选芯片的一种具体实施例的结构示意图；
图3是本发明中电动响应阀门分选芯片的一种具体实施例的结构示意图；
图4为实施例1中裂殖壶菌在单分散液滴中生长0天和72天后的表征图；
图5为不同条件下电喷形成的单分散液滴的平均粒径图，其中，（a）为分散液的流速不同，（b）为电压不同，（c）为分散液的通道管径不同，（d）为分散液通道的液滴出口与收集液之间的距离不同。
附图标记说明
1载体油物理分选芯片；11物理分选芯片主体；
12物理分选通道；13载体油注射通道；
14物理收集通道；2电动响应阀门分选芯片；
21电动分选芯片主体；22电动分选通道；
23电动收集通道；24电动响应阀门。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供一种电喷单乳液高通量筛选微生物菌株的方法，该方法包括以下步骤：
S1、建立微生物突变体库，获得所述微生物突变体库的培养液；
S2、将所述培养液与含有凝胶剂的溶液混合得到分散液，将所述分散液进行电喷形成单分散液滴；
S3、将所述单分散液滴与含交联剂的收集液接触固化形成微球，将所述微球经培养后进行微流控分选；
其中，所述凝胶剂与所述交联剂相接触能够发生交联固化反应。
本发明的发明人在研究过程中，创造性地发现，在微生物高通量筛选时，将微生物菌株与凝胶剂混合后，应用电喷雾技术实现对菌株进行单包裹形成单分散液滴，可通过调节分散液的通道管径、流速和电场参数，可精确控制液滴的尺寸，生成大小均一的球形微粒，使得单分散液滴具有尺寸可控、形貌可调等优点，制备液滴的过程简单且无需使用油相，使得筛选过程中对液滴进行荧光染色的步骤操作更加简便，有效提高对菌株筛选的有效性和准确性；单分散液滴中含有凝胶剂、收集液中含有交联剂，使得带电的液滴进入含有交联剂的收集液中，固化成凝胶微粒，将菌株单包裹在凝胶微球中，利用凝胶剂的保水性和支撑力，为菌株生长提供稳定空间，保证单一菌株的独立生长环境，进一步增加了筛选的精确性。
本发明提供的高通量筛选微生物菌株的方法可以适用于任意一种微生物菌种的筛选，可以根据筛选的目的设置步骤S3中所述微流控分选的检测信号及参数，例如，筛选的目的是筛得高产某产物的菌株，则所述微流控分选的检测信号可以根据该产物的检测方法确定，示例性地，需要筛选高产油脂的菌株，可以将检测油脂的荧光、吸光度、拉曼光谱、质谱等信号作为微流控分选的信号检测策略，通过信号比对实现高产油脂的菌株筛选。
本发明中，在筛选高产油脂的微生物菌株时，可以采用任意一种能够在生长代谢过程中合成油脂的微生物进行筛选，例如，裂殖壶菌、破囊壶菌、小球藻等。优选地，所述微生物为裂殖壶菌，所述微流控分选通过筛选信号获得高产油脂的裂殖壶菌菌株。
本发明中，步骤S1中建立微生物突变体库可以采用常规的微生物诱变方法对某微生物菌种进行诱变，以获得包含多个该微生物菌株的突变体库。优选地，步骤S1中所述建立微生物突变体库采用紫外辐照、等离子体诱变和化学诱变中的至少一种。其中，紫外辐照、等离子体诱变和化学诱变可以采用市售的多功能等离子体诱变系统进行。
本发明中，获得所述微生物突变体库的培养液可以根据微生物的菌种类别选择适宜的培养基和培养条件。例如，所述微生物为裂殖壶菌时，需先在种子培养基中传代2-4次，每次培养20-30h，再接种至发酵培养基中培养40-60h，每隔20-30h补糖，培养在25-30℃恒温摇床中进行。
其中，种子培养基的配方优选为：硫酸钠15-25g/L，七水硫酸镁3-6g/L，硫酸铵4-6g/L，氯化钠1-1.5g/L，氯化钾0.5-1.5g/L，谷氨酸钠15-25g/L，葡萄糖40-60g/L，磷酸氢二钾3-5g/L，酵母粉3-5g/L，维生素B10.5-1.5mL，维生素B60.5-1.5mL，维生素B120.5-1.5mL。
发酵培养基的配方优选为硫酸钠10-15g/L，七水硫酸镁1-3g/L，硫酸铵3-5g/L，硫酸钾0.5-1g/L，氯化钾0.3-0.8g/L，氯化钙0.1-0.2g/L，谷氨酸钠15-25g/L，葡萄糖80-120g/L，磷酸氢二钾3-5g/L，酵母粉3-5g/L，维生素B10.5-1.5mL，维生素B60.5-1.5mL，维生素B120.5-1.5mL。
根据本发明，所述培养液可进行镜检，并根据细胞的数目，选择合适体积的菌液与含有凝胶剂的溶液混合后用于进行电喷。优选地，步骤S1中所述培养液的OD600为0.5-0.7，如培养液的OD600过高，可利用水进行稀释至合适的OD600；步骤S2中所述培养液与所述含有凝胶剂的溶液的体积比为1:800-1200。例如，培养液中的细胞浓度一般选OD600=0.6，取1μL培养液加到1mL含有凝胶剂的溶液体系中，用于进行电喷。
本发明中，所述含有凝胶剂的溶液可采用凝胶剂的水溶液，所述收集液采用交联剂的水溶液。优选地，所述含有凝胶剂的溶液中凝胶剂的浓度为1-3重量%，具体可以为1重量%、1.5重量%、2重量%、2.5重量%、3重量%，或者上述两个数值之间的任意值；所述收集液中交联剂的浓度为2-5重量%，具体可以为2重量%、3重量%、4重量%、5重量%，或者上述两个数值之间的任意值。在该优选的实施方式下，有利于液滴通过离子交联完全固化成微球，提高对微生物菌株筛选的精准性。
根据本发明，所述凝胶剂可以采用水凝胶，并依据水凝胶选用相应的交联剂，所述交联剂可以采用氯盐。优选地，所述凝胶剂为海藻酸钠和/或壳聚糖，更优选为海藻酸钠；所述交联剂为氯化钙和/或氯化铁，更优选为氯化钙。在该优选的实施方式下，凝胶剂与交联剂通过离子交联方式固化，对包封的菌株损伤更小，为菌株生长提供稳定空间，保证单一菌株的独立生长环境，进一步增加了筛选的精确性。
本发明中，凝胶剂、交联剂均可以采用本领域常规的制备方法，也可以商购获得。
本发明中，分散液进行电喷可以采用由蠕动泵、固定在蠕动泵上的注射器以及与注射器的针头连接的毛细管形成电喷装置，其中，注射器的针头可用PE管与毛细管连接，电喷装置的高压电源的电线连接在注射器的针头处，地线放置于液滴的收集处（即，收集液的液面处）。
本发明中，所述单分散液滴的粒径和形貌通过改变分散液的通道管径、分散液的流速、电喷的电压、分散液通道的液滴出口与收集液之间的距离四者中的至少一者进行调节，以生成大小均一的球形微粒。
根据本发明，优选地，步骤S2中所述分散液的通道管径为40-100μm，分散液的通道管径具体为上述电喷装置中的毛细管内径，示例性地，毛细管内径可以为40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm，或者上述两个数值之间的任意值。
根据本发明，优选地，所述电喷的条件包括：电压为4-20kV，具体可以为4kV、8kV、12kV、16kV、20kV，或者上述两个数值之间的任意值；更优选为4-9kV。所述分散液的流速小于或等于3mL/h，具体可以为1mL/h、1.5mL/h、2mL/h、2.5mL/h、3mL/h，或者上述两个数值之间的任意值；分散液通道的液滴出口（具体为上述电喷装置中毛细管的出口）与收集液（具体指的是收集液的液面）之间的距离为0-5cm，具体可以为0cm、1cm、2cm、3cm、4cm、5cm，或者上述两个数值之间的任意值。
本发明中，分散液的流速通过上述电喷装置中的蠕动泵进行控制；一般情况下，毛细管的出口设置为位于盛有收集液的开口玻璃瓶上方，使得毛细管的液滴出口与收集液的距离方便调节且满足要求。
根据本发明，步骤S3中所述培养的条件可根据所筛选的微生物菌株类别选择适宜的培养条件，包括温度、时间等。例如，所述微生物为裂殖壶菌时，优选地，步骤S3中所述培养的条件包括：温度为25-35℃，时间为3-100天。所述液滴培养可以在所述收集液中进行，采用静置培养，在液滴中菌株能够正常生长，且具有良好的保水性能和形态稳定性，以使得单一菌株能够相互独立地在液滴中培养，为后续的高通量筛选带来很大的便利。
本发明中，步骤S3中液滴培养一般培养至第3天能够形成相应的信号差，以进行微流控筛选，优选情况下，液滴培养延续至100天左右，使得高产和低产的荧光差异更强，更利于分选。
根据本发明，优选地，步骤S3中所述微流控分选采用的筛选信号选自荧光、吸光度、拉曼光谱和质谱中的至少一种；具体可根据油脂的检测方案进行选择设计，以提高检测筛选的精确性。
根据本发明，优选地，所述微流控分选的过程包括：将培养后的所述微球进行荧光染色后，检测其荧光强度并设置荧光筛选阈值，利用分选芯片将荧光强度高于所述荧光筛选阈值的微粒分选出来。
根据本发明，荧光染色可以采用本领域常规的染色方法，优选地，所述荧光染色的染料采用含有尼罗红的二甲基亚砜（DMSO）溶液。示例性地，在微球培养一段时间后，取出一部分放入培养皿中，加入1-3μL尼罗红浓度为1-2wt%的DMSO溶液，避光孵育10-20min后观察液滴，检测其荧光强度。
根据本发明，优选地，所述分选芯片设计为载体油物理分选芯片或者电动响应阀门分选芯片。
根据本发明，优选地，参见图2，载体油物理分选芯片1包括物理分选芯片主体11、位于物理分选芯片主体11上的物理分选通道12、与物理分选通道12的侧壁连通的载体油注射通道13以及与物理分选通道12的侧壁连通的物理收集通道14，载体油注射通道13与物理收集通道14设置在物理分选通道12的两侧且位于同一直线上，以能够在物理分选芯片主体11检测到微球的荧光强度高于荧光筛选阈值时，将额外的载油从载体油注射通道13注入物理分选通道12，以将该微球推入物理收集通道14内。其中，载体油注射通道13与相应的载体油供应装置连接，且载体油注入物理分选通道12时具有一定的速度，以实现将微球推入对应的物理收集通道14内。
根据本发明，优选地，参见图3，电动响应阀门分选芯片2包括电动分选芯片主体21、位于电动分选芯片主体21上的电动分选通道22、与电动分选通道22的侧壁连通的电动收集通道23以及位于电动分选通道22内的电动响应阀门24，电动响应阀门24位于电动收集通道23与电动分选通道22的连接处，以能够在电动分选芯片主体21检测到微球的荧光强度高于荧光筛选阈值时，将电动响应阀门24打开，以将该微球推入电动收集通道23内。电动响应阀门24一般处于封堵电动收集通道23的状态，在检测到微球的荧光强度高于荧光筛选阈值时，电动响应阀门24翻转至封堵电动分选通道22、打开电动收集通道23，以使得该微球流入电动收集通道23内进行收集。
本发明第二方面提供上述的方法在筛选高产油脂的裂殖壶菌中的应用。本发明提供的高通量筛选微生物菌株的方法特别适用于对高产油脂的菌株（例如裂殖壶菌等）进行筛选。
作为本发明中高通量筛选微生物菌株的方法一种相对优选的具体实施方式，以裂殖壶菌为例，参见图1，包括以下步骤：
S1、采用紫外辐照、等离子体诱变和化学诱变中的至少一种方式诱变裂殖壶菌获得裂殖壶菌突变体库，将裂殖壶菌突变体库的菌株置于液体培养基中，在温度为25-35℃的条件下培养2-5天得到微生物突变体库菌株的培养液（计算理想生物量以确保后续的菌株单包裹，OD600为0.6左右）；构建电喷装置，电喷装置包括蠕动泵、固定在蠕动泵上的注射器以及与注射器的针头通过PE管连接的毛细管，毛细管的内径为40-100μm；
S2、将1μL步骤S1中OD600为0.6左右的培养液与1mL凝胶剂浓度为1-3重量%的凝胶剂溶液混合均匀得到分散液，将分散液装入电喷装置的注射器中，电喷装置的高压电源的电线连接在注射器的针头处，地线放置于液滴的收集处，设置注射器内分散液的流速小于或等于5mL/h，电压为4-20kV，毛细管的出口尖端到收集液液面的距离为0-5cm，进行电喷形成单分散液滴；
S3、将单分散液滴收集于盛有过量收集液（交联剂浓度为2-5重量%）的玻璃瓶中，凝胶剂与交联剂发生交联固化，液滴固化形成微球，在温度为25-35℃下进行液滴培养3-100天，再采用荧光染色法对微球进行染色，检测其荧光强度并设置荧光筛选阈值，利用分选芯片将荧光强度高于荧光筛选阈值的微粒分选出来，实现高产油脂的菌株筛选。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，裂殖壶菌野生型菌株购自上海名劲生物科技有限公司、编号为ATCC20888，海藻酸钠购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、编号为9005-38-3，氯化钙购自西陇化工股份有限公司、编号为10043-52-4。
在没有特殊说明的情况下，其他原料及试剂均为常规的市售品，检测方法采用本领域常规的方法。
以下实施例中，在没有特殊说明的情况下，室温为25±2℃；
种子液的配方为：硫酸钠20g/L，七水硫酸镁4.6g/L，硫酸铵4.8g/L，氯化钠1.25g/L，氯化钾1g/L，谷氨酸钠20g/L，葡萄糖50g/L，磷酸氢二钾4g/L，酵母粉4g/L，维生素B11mL，维生素B61mL ，维生素B121mL。
发酵液的配方为硫酸钠12g/L，七水硫酸镁2g/L，硫酸铵4g/L，硫酸钾0.7g/L，氯化钾0.5g/L，氯化钙0.15g/L，谷氨酸钠20g/L，葡萄糖100g/L，磷酸氢二钾4g/L，酵母粉4g/L，维生素B11mL，维生素B61mL ，维生素B121mL。
以下实施例中，载体油物理分选芯片1的结构参见图2，包括物理分选芯片主体11、位于物理分选芯片主体11上的物理分选通道12、与物理分选通道12的侧壁连通的载体油注射通道13以及与物理分选通道12的侧壁连通的物理收集通道14，载体油注射通道13与物理收集通道14设置在物理分选通道12的两侧且位于同一直线上，以能够在物理分选芯片主体11检测到微球的荧光强度高于荧光筛选阈值时，将额外的载油从载体油注射通道13注入物理分选通道12，以将该微球推入物理收集通道14内。
电动响应阀门分选芯片2的结构参见图3，包括电动分选芯片主体21、位于电动分选芯片主体21上的电动分选通道22、与电动分选通道22的侧壁连通的电动收集通道23以及位于电动分选通道22内的电动响应阀门24，电动响应阀门24位于电动收集通道23与电动分选通道22的连接处，以能够在电动分选芯片主体21检测到微球的荧光强度高于荧光筛选阈值时，将电动响应阀门24打开，以将该微球推入电动收集通道23内。
实施例1
S1、将裂殖壶菌野生型菌株于液体培养基中在30℃条件下培养3天后，取OD600=0.6的菌液进行常压室温等离子体（ARTP）诱变，具体地，将菌液与5%甘油溶液混合，取10μL涂布在铁片上，设置ARTP诱变仪功率为120W，气流为10SLM，梯度时间为10s进行诱变，将诱变后的突变菌株接种至液体培养基中，在温度为30℃下培养2-5天得到裂殖壶菌突变体库菌株的培养液，取1mL培养液进行镜检，获得OD600=0.6左右的培养液；构建电喷装置，电喷装置包括蠕动泵、固定在蠕动泵上的注射器以及与注射器的针头通过PE管连接的毛细管，毛细管的内径为50μm；
S2、将1μL步骤S1中OD600为0.6左右的培养液与1mL海藻酸钠浓度为2重量%的溶液混合均匀得到分散液，将分散液装入电喷装置的注射器中，电喷装置的高压电源的电线连接在注射器的针头处，地线放置于液滴的收集处，设置注射器内分散液的流速为0.2mL/h，电压为7kV，毛细管的出口尖端到收集液液面的距离为2cm，进行电喷形成单分散液滴；
S3、将单分散液滴收集于盛有过量收集液（氯化钙浓度为3重量%）的玻璃瓶中，海藻酸钠与氯化钙发生交联固化，液滴固化形成微球，在温度为30℃下进行液滴长时间培养100天，液滴培养第0天以及第72天的形态如图4所示；每隔9天取出一部分放入培养皿中，加入2μL浓度为1重量%的尼罗红染料，避光孵育15min后观察微球，检测其荧光强度，选择荧光强度差异适中的同一批次微球（培养72天）并设置荧光筛选阈值（具体为36000RFU）；将液滴注入载体油物理分选芯片1中，将激光对准物理分选通道12的检测点，并采集每个微球的荧光信号，当荧光强度高于荧光筛选阈值的微球被检测到时，系统立即从载体油注射通道13注入物理分选通道12，以将该微球推入物理收集通道14内。
筛选出物理收集通道14内荧光信号强度较高的一个或几个液滴，分别进行摇瓶发酵筛选出油脂高产菌株，筛选出的油脂高产菌株中油脂的产量最高为19.49g/L，比野生型菌株提高约1.45倍。
实施例2
按照实施例1的方法进行裂殖壶菌高产DHA的高通量筛选，不同的是，将步骤S3中载体油物理分选芯片1替换为电动响应阀门分选芯片2，将激光对准电动分选通道22的检测点，并采集每个微球的荧光信号，当荧光强度高于荧光筛选阈值的微球被检测到时，系统立即打开电动响应阀门24，以将该微球推入电动收集通道23内。
筛选出电动收集通道23内荧光信号强度较高的一个或几个液滴，分别进行摇瓶发酵筛选出DHA高产菌株，筛选出的DHA高产菌株中DHA的产量最高为16.13g/L，比野生型菌株提高约1.2倍。
实施例3
按照实施例1的方法进行裂殖壶菌高产DHA的高通量筛选，不同的是，步骤S1中毛细管的内径替换为75μm，步骤S2中电压替换为5kV，设定注射器内分散液的流速分别为0.2mL/h，0.4mL/h，0.6mL/h，0.8mL/h，1.0mL/h，1.2mL/h，1.4mL/h，1.6mL/h，1.8mL/h，2.0mL/h，2.2mL/h，不同流速的条件对液滴粒径的影响如图5中（a）所示，可见，随着分散液的流速变大，聚集在管口的液滴越多，因此液滴的粒径整体趋势呈增长状态。
实施例4
按照实施例1的方法进行裂殖壶菌高产DHA的高通量筛选，不同的是，步骤S1中毛细管的内径替换为75μm，步骤S2中电压分别设定为4kV，5kV，6kV，7kV，8kV，9kV，不同电压的条件对液滴粒径的影响如图5中（b）所示，随着电场强度增强，泰勒锥上液面的静电斥力变强，液滴的粒径逐渐变小。
实施例5
按照实施例1的方法进行裂殖壶菌高产DHA的高通量筛选，不同的是，步骤S2中电压替换为5kV，步骤S1中毛细管的内径（即，分散液的通道管径）分别设置为40μm，50μm，60μm，70μm，80μm，90μm，100μm，不同毛细管内径的条件对液滴粒径的影响如图5中（c）所示，随着毛细管内径的增大，液滴粒径整体趋势呈增长状态。
实施例6
按照实施例1的方法进行裂殖壶菌高产DHA的高通量筛选，不同的是，步骤S1中毛细管的内径替换为44μm，步骤S2中电压替换为5kV，设定毛细管的出口尖端到收集液液面的距离分别为0.5cm，1.0cm，1.5cm，2.0cm，2.5cm，3.0cm，3.5cm，4.0cm，4.5cm，5.0cm，不同电压的条件对液滴粒径的影响如图5中（d）所示，随着毛细管的出口尖端到收集液液面的距离增加，液滴粒径先增加后减小，这是由于在一定距离范围内，液滴主要受电场力作用，距离越远、电场力作用越小，进而液滴粒径越大；毛细管的出口尖端到收集液液面的距离超出某一限定范围后，液滴主要受到重力作用，距离越远，液滴受力越大，进而液滴粒径越小。
实施例7
按照实施例1的方法进行裂殖壶菌高产油脂的高通量筛选，不同的是，将步骤S2中海藻酸钠浓度为2重量%的溶液替换为海藻酸钠浓度为4重量%的溶液。
筛选出电动收集通道23内荧光信号强度较高的一个或几个液滴，分别进行摇瓶发酵筛选出油脂高产菌株，筛选出的油脂高产菌株中油脂的产量最高为15.05g/L，比野生型菌株提高约1.12倍。
实施例8
按照实施例1的方法进行裂殖壶菌高产油脂的高通量筛选，不同的是，将步骤S2中海藻酸钠浓度为2重量%的溶液替换为壳聚糖浓度为2重量%的溶液，相应地，步骤S3中收集液替换为浓度为3重量%的FeCl3水溶液。
筛选出电动收集通道23内荧光信号强度较高的一个或几个液滴，分别进行摇瓶发酵筛选出油脂高产菌株，筛选出的油脂高产菌株中油脂的产量最高为16.40g/L，比野生型菌株提高约1.22倍。
实施例9
按照实施例1的方法进行裂殖壶菌高产油脂的高通量筛选，不同的是，将步骤S3中载体油物理分选芯片1替换为介电泳分选芯片（具体参见Wen N, Zhao Z, Fan B,et al.Development of droplet microfluidics enabling high-throughput single-cellanalysis [J]. Molecules, 2016, 21(7): 881）。
筛选出荧光信号强度较高的一个或几个液滴，分别进行摇瓶发酵筛选出油脂高产菌株，筛选出的油脂高产菌株中油脂的产量最高为15.45g/L，比野生型菌株提高约1.15倍。
对比例1
S1、将裂殖壶菌野生型菌株于液体培养基中在30℃条件下培养3天后，取OD600=0.6的菌液进行常压室温等离子体（ARTP）诱变，具体地，将菌液与5%甘油溶液混合，取10μL涂布在铁片上，设置ARTP诱变仪功率为120W，气流为10SLM，梯度时间为10s进行诱变，将诱变后的突变菌株接种至液体培养基中，在温度为25℃下培养2-5天得到裂殖壶菌突变体库菌株的培养液；组装微流控芯片：利用乙炔喷灯拉制两种不同尺寸的玻璃毛细管，内相玻璃毛细管的管径为100μm，外相玻璃毛细管的管径500μm，将外相玻璃毛细管置于载玻片上合适的位置，然后将内相玻璃毛细管套嵌在外相玻璃毛细管中，使内相玻璃毛细管的尖端深入外相玻璃毛细管的尖端但不要超出外相玻璃毛细管的尖端，然后在显微镜下对两毛细管的相对位置进行调整使其中轴线相互重合呈现共轴的排列模式，利用速干胶将其固定，形成微流控芯片；
S2、选择添加表面活性剂Span 80的大豆油（大豆油中Span 80的含量为2wt%）作为外相，将步骤S1得到的培养液与荧光素混合作为内相；将内相抽取至5mL注射器中、外相抽取至10mL注射器中，然后将它们分别装载至两台蠕动泵上，5mL注射器通过聚乙烯管与内相玻璃毛细管的侧壁连接、10mL注射器通过聚乙烯管与外相玻璃毛细管的侧壁连接，设定内相流速为0.3mL/h、外相流速为3mL/h，启动两台蠕动泵，对裂殖壶菌突变体库中的菌株进行包埋形成核壳结构液滴；
S3、将步骤S2中的液滴收集于盛有过量上述外相的玻璃瓶中，将玻璃瓶置于紫外灯照射液滴40s，液滴完全固化成微球；随后在温度为30℃下静置培养72天得到微球培养液，将微球培养液泵入介电泳分选芯片（具体参见Wen N, Zhao Z, Fan B,et al.Development of droplet microfluidics enabling high-throughput single-cellanalysis [J]. Molecules, 2016, 21(7): 881）对应的入口，将激光对准分选装置的检测点，并采集每个液滴的荧光信号，针对荧光信号强度最高的液滴进行加电压分选，使其流入收集通道。
筛选出信号强度较高的一个或几个液滴，分别进行摇瓶发酵筛选出油脂高产菌株，筛选出的油脂高产菌株中油脂的产量最高为14.51g/L，比野生型菌株提高约1.08倍。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种电喷单乳液高通量筛选微生物菌株的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、建立微生物突变体库，获得所述微生物突变体库的培养液；
S2、将所述培养液与含有凝胶剂的溶液混合得到分散液，将所述分散液进行电喷形成单分散液滴；
S3、将所述单分散液滴与含交联剂的收集液接触固化形成微球，将所述微球经培养后进行微流控分选；
其中，所述凝胶剂与所述交联剂相接触能够发生交联固化反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述建立微生物突变体库采用紫外辐照、等离子体诱变和化学诱变中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述培养液的OD600为0.5-0.7，步骤S2中所述培养液与所述含有凝胶剂的溶液的体积比为1:800-1200。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含有凝胶剂的溶液中凝胶剂的浓度为1-3重量%，所述收集液中交联剂的浓度为2-5重量%；
所述凝胶剂为海藻酸钠和/或壳聚糖，所述交联剂为氯化钙和/或氯化铁。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述分散液的通道管径为40-100μm；
所述电喷的条件包括：电压为4-20kV，所述分散液的流速小于或等于3mL/h，通道的液滴出口与所述收集液之间的距离为0-5cm。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其特征在于，步骤S3中所述培养的条件包括：温度为25-35℃，时间为3-100天。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述微流控分选采用的筛选信号选自荧光、吸光度、拉曼光谱和质谱中的至少一种。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述微流控分选的过程包括：将培养后的所述微球进行荧光染色后，检测其荧光强度并设置荧光筛选阈值，利用分选芯片将荧光强度高于所述荧光筛选阈值的微粒分选出来。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光染色的染料采用含有尼罗红的二甲基亚砜溶液；
所述分选芯片设计为载体油物理分选芯片或者电动响应阀门分选芯片；
其中，所述载体油物理分选芯片包括物理分选芯片主体、位于所述物理分选芯片主体上的物理分选通道、与所述物理分选通道的侧壁连通的载体油注射通道以及与所述物理分选通道的侧壁连通的物理收集通道，所述载体油注射通道与所述物理收集通道设置在所述物理分选通道的两侧且位于同一直线上，以能够在所述物理分选芯片主体检测到所述微球的荧光强度高于所述荧光筛选阈值时，将额外的载油从所述载体油注射通道注入所述物理分选通道，以将该微球推入所述物理收集通道内；
所述电动响应阀门分选芯片包括电动分选芯片主体、位于所述电动分选芯片主体上的电动分选通道、与所述电动分选通道的侧壁连通的电动收集通道以及位于所述电动分选通道内的电动响应阀门，所述电动响应阀门位于所述电动收集通道与所述电动分选通道的连接处，以能够在所述电动分选芯片主体检测到所述微球的荧光强度高于所述荧光筛选阈值时，将所述电动响应阀门打开，以将该微球推入所述电动收集通道内。
10.根据权利要求1至9中任意一项所述的方法在筛选高产油脂的裂殖壶菌中的应用。
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Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120196288A1 (en) * 2011-01-27 2012-08-02 Lawrence Livermore National Security, Llc Chip-Based Droplet Sorting
CN104830664A (zh) * 2015-05-07 2015-08-12 清华大学 一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统
CN107238719A (zh) * 2016-03-28 2017-10-10 李木 液滴多路分选、原滴上浮、注物平走或下沉式微流控芯片
CN111500523A (zh) * 2020-04-17 2020-08-07 南京鼓楼医院 一种生物质核壳结构细胞微载体的制备方法
CN114062679A (zh) * 2021-11-16 2022-02-18 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 一种基于液滴微流控的单细胞分泌物高通量检测方法和系统
CN114602397A (zh) * 2022-03-11 2022-06-10 江南大学 一种基于电喷法的多腔室微球及其制备方法
CN114907960A (zh) * 2022-05-20 2022-08-16 中国科学院深圳先进技术研究院 一种基于液滴微流控的无标记活细胞筛选系统和方法
CN217901570U (zh) * 2022-06-30 2022-11-25 浙江扬清芯片技术有限公司 一种基于频闪原理的微液滴监控系统
CN115646567A (zh) * 2022-12-26 2023-01-31 南京师范大学 集成液滴在线培养和高通量筛选功能的微流控芯片及其应用
CN115651926A (zh) * 2022-12-26 2023-01-31 南京师范大学 高通量筛选微生物菌株的方法
CN116334169A (zh) * 2023-03-22 2023-06-27 江南大学 一种基于液滴微流控和流式细胞仪联用的丝状真菌高通量筛选方法及应用
CN117187153A (zh) * 2022-05-30 2023-12-08 香港城市大学 基于水凝胶的细胞包裹方法、细胞或包裹有细胞的水凝胶颗粒及其体系、其用途及试剂盒
CN117420105A (zh) * 2023-09-25 2024-01-19 墨卓生物科技(浙江)有限公司 一种基于微流控的高通量单b细胞筛选方法和应用
CN117587094A (zh) * 2023-11-14 2024-02-23 南京师范大学 利用单包埋光敏性凝胶微球高通量筛选微生物菌株的方法和应用
CN117983334A (zh) * 2024-01-23 2024-05-07 华中科技大学 一种微流控芯片、微流控流式细胞分选系统及方法

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120196288A1 (en) * 2011-01-27 2012-08-02 Lawrence Livermore National Security, Llc Chip-Based Droplet Sorting
CN104830664A (zh) * 2015-05-07 2015-08-12 清华大学 一种基于外置压电陶瓷驱动的微流体细胞分选系统
CN107238719A (zh) * 2016-03-28 2017-10-10 李木 液滴多路分选、原滴上浮、注物平走或下沉式微流控芯片
CN111500523A (zh) * 2020-04-17 2020-08-07 南京鼓楼医院 一种生物质核壳结构细胞微载体的制备方法
CN114062679A (zh) * 2021-11-16 2022-02-18 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 一种基于液滴微流控的单细胞分泌物高通量检测方法和系统
CN114602397A (zh) * 2022-03-11 2022-06-10 江南大学 一种基于电喷法的多腔室微球及其制备方法
CN114907960A (zh) * 2022-05-20 2022-08-16 中国科学院深圳先进技术研究院 一种基于液滴微流控的无标记活细胞筛选系统和方法
CN117187153A (zh) * 2022-05-30 2023-12-08 香港城市大学 基于水凝胶的细胞包裹方法、细胞或包裹有细胞的水凝胶颗粒及其体系、其用途及试剂盒
CN217901570U (zh) * 2022-06-30 2022-11-25 浙江扬清芯片技术有限公司 一种基于频闪原理的微液滴监控系统
CN115646567A (zh) * 2022-12-26 2023-01-31 南京师范大学 集成液滴在线培养和高通量筛选功能的微流控芯片及其应用
CN115651926A (zh) * 2022-12-26 2023-01-31 南京师范大学 高通量筛选微生物菌株的方法
CN116334169A (zh) * 2023-03-22 2023-06-27 江南大学 一种基于液滴微流控和流式细胞仪联用的丝状真菌高通量筛选方法及应用
CN117420105A (zh) * 2023-09-25 2024-01-19 墨卓生物科技(浙江)有限公司 一种基于微流控的高通量单b细胞筛选方法和应用
CN117587094A (zh) * 2023-11-14 2024-02-23 南京师范大学 利用单包埋光敏性凝胶微球高通量筛选微生物菌株的方法和应用
CN117983334A (zh) * 2024-01-23 2024-05-07 华中科技大学 一种微流控芯片、微流控流式细胞分选系统及方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SLAVEN JURIĆ1 ET AL.: "Physicochemical properties and release characteristics of calcium alginate microspheres loaded with Trichoderma viride spores", 《JOURNAL OF INTEGRATIVE AGRICULTURE》, vol. 18, no. 11, 31 December 2019 (2019-12-31), pages 2, XP085895127, DOI: 10.1016/S2095-3119(19)62634-1 *

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