CN118240228A - 一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架及制备方法与应用。通过在配体分子边臂上修饰聚乙二醇分子增加氢键有机框架的生理稳定性，并利用偶氮键作为乏氧响应元件，实现氢键有机框架对乏氧环境的响应和可控蛋白释放效果。同时提供了聚乙二醇修饰的偶氮苯‑4，4’‑二羧酸的制备方法和乏氧响应性载蛋白氢键有机框架在制备抗肿瘤药物中的应用。在上述乏氧响应性载蛋白氢键有机框架的制备过程中，将具有促凋亡作用的蛋白细胞色素C负载于氢键有机框架中，获得一种乏氧响应性载细胞色素C氢键有机框架，其作为抗肿瘤药物，在体外可以显著降低肿瘤细胞存活，在体内可以抑制肿瘤生长。

Description

一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架及制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别是涉及一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架及制备方法与应用。
背景技术
癌症是威胁人类健康的最致命的疾病之一。蛋白治疗被认为是通过恢复功能失调的内源性蛋白或诱导癌细胞凋亡来调控细胞功能的最直接的策略，在癌症治疗中具有很大的潜力。然而，蛋白药物进入机体后易降解、血浆清除速度快、细胞膜渗透性差和脱靶效应对治疗蛋白有效递送到肿瘤部位构成了重大挑战。因此，迫切需要一种简便、通用的载体，有效的介导治疗蛋白在体内的递送，并实现治疗蛋白在肿瘤部位的可控释放，在提高疗效的同时降低对正常组织的毒副作用。
依靠金属配位键和共价键形成的金属有机框架(MOFs)和共价有机框架(COFs)等多孔晶体材料具有高孔隙率、结构多样性和可调性等优势，已被广泛开发作为蛋白递送的潜在平台。然而，MOFs和COFs的制备过程中需要引入金属离子或有机溶剂，会给实际应用带来潜在毒性问题。氢键有机框架(HOFs)是由有机配体通过相对较弱的分子间氢键相互作用组装而成的一类多孔晶体材料，HOFs除了具有MOFs和COFs两类多孔晶体材料的优势以外，其制备条件更加温和，且无金属掺杂，具有良好的生物安全性和较低的毒性。
目前，HOFs在生物医用领域的应用主要集中在酶/蛋白质保护方面。例如，通过原位封装策略基于四(4-羧基苯基)甲烷和四(4-脒基苯基)甲烷构建的HOF/酶复合材料，可以在各种苛刻环境中保持天然酶的催化活性。然而，由于HOFs的晶体性质，在生理环境中易沉淀，尚不能满足体内蛋白递送需求；此外，现有HOFs缺乏智能响应性，不能实现治疗蛋白在肿瘤部位的有效释放。因此，有必要对其进行结构改造、表面修饰等方法来提供其性能。
在恶性肿瘤组织中，肿瘤细胞快速增殖消耗氧气，而血管异常又抑制了氧气供应，这使得肿瘤组织处于乏氧状态。基于肿瘤这一特性，在构筑HOF的配体分子单元中引入乏氧敏感的偶氮键，用于制备乏氧响应性HOF，其可在肿瘤乏氧微环境的刺激下解体，从而实现治疗蛋白的可控释放，发挥高效的抗肿瘤作用。聚乙二醇修饰是一种常用的药物递送体系修饰技术，不仅可以增加体系的稳定性，还可以增加其在体内血液循环中的滞留时间，从而提高药物到达肿瘤部位的效率。将聚乙二醇分子连接在配体分子单元的边臂上，不会影响分子间氢键的形成，而能使所构筑的HOF修饰上聚乙二醇，提高HOF的稳定性及体内相容性。
目前，尚未有聚乙二醇修饰的乏氧响应性载蛋白HOFs的报道。
发明内容
根据现有技术的不同，本发明提出如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架。基于该技术目的，本发明通过在配体分子边臂上修饰聚乙二醇分子增加氢键有机框架的生理稳定性，并利用偶氮键作为乏氧响应元件，实现氢键有机框架对乏氧环境的响应和可控蛋白释放效果。
本发明的第二个目的是提供一种构成乏氧响应性载蛋白氢键有机框架的配体分子聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸。
本发明的第三个目的是提供一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架的制备方法。
本发明的第四个目的是提供一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架的制备方法，其特征在于包括如下步骤:
1)将偶氮苯-4，4’-二羧酸和聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸溶于蒸馏水中，加入碱溶液去质子化，得到二羧酸配体溶液；所述二羧酸配体溶液中偶氮苯-4，4’-二羧酸和聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸的摩尔比为30:(1～3)；
2)将四(4-脒基苯基)甲烷和蛋白溶于蒸馏水中得四脒基配体溶液，所述二羧酸配体溶液中总二羧酸配体的摩尔浓度为四脒基配体溶液中四(4-脒基苯基)甲烷的摩尔浓度的2倍；
3)在1500～1800rpm搅拌条件下，将等体积的二羧酸配体溶液与四脒基配体溶液混合，
搅拌10～60min，离心，蒸馏水洗涤，得到乏氧响应性载蛋白氢键有机框架。
所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾或四丁基氢氧化铵。
所述四(4-脒基苯基)甲烷和蛋白的质量比为10:(1～3)。
所述蛋白为细胞色素C或RNA酶或具体的药物。
本发明的聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸，其特征是用下述方法制成：
1)将4-氨基水杨酸甲酯和碳酸钾加入反应容器中，在搅拌下，溶于有机溶剂中，加入3-溴丙炔，在氮气保护下反应，得到化合物(I)：4-氨基-2-(丙-2-炔基氧基)苯甲酸甲酯；
所述4-氨基水杨酸甲酯、碳酸钾和3-溴丙炔的摩尔比为1:(1～1.5):(1～1.5)；
所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮或乙腈；
2)将化合物(I)、NaI加入反应容器中，用四氢呋喃(THF)溶解，在氮气保护下加入次氯酸叔丁酯(t-BuOCl)，反应，得到化合物(II)：4,4'-(二氮烯-1,2-二基)(E)-双(2-(丙-2-炔基氧基)苯甲酸二甲酯；
所述化合物(I)、NaI和次氯酸叔丁酯的摩尔比为1:(2～3):(2～3)；
3)将化合物(II)、叠氮-聚乙二醇加入反应容器中，用THF溶解，再加入CuSO4·5H2O水溶液和抗坏血酸钠水溶液，在氮气保护下，反应，减压蒸馏去除溶剂，将残渣和NaOH用水溶解，搅拌，纯化，干燥得到聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸(III)：
(E)-4,4'-(二氮烯-1,2-二基)双(2-(1-(聚乙二醇2000)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)苯甲酸；
所述化合物(II)、叠氮-聚乙二醇、CuSO4·5H2O和抗坏血酸钠的摩尔比为1:(2～3):(1.2～1.5):(1.2～1.5)；
所述叠氮-聚乙二醇中聚乙二醇的重均分子量为2000～5000；
反应式为：
其中x＝45～114。
本发明提供一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架在制备抗肿瘤药物中的应用。在上述乏氧响应性载蛋白氢键有机框架的制备过程中，将具有促凋亡作用的蛋白细胞色素C负载于氢键有机框架中，获得一种乏氧响应性载细胞色素C氢键有机框架，其作为抗肿瘤药物，在体外可以显著降低肿瘤细胞存活，在体内可以抑制肿瘤生长。
本发明的优点：
本发明制备工艺简单，条件温和，易于操作，所用原料生物安全性高，具有良好的生物相容性。本发明通过引入聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸制备乏氧响应性载蛋白氢键有机框架，其呈棒状结构，长径约为200nm，具有良好的生理稳定性，能够在模拟乏氧环境还原剂存在的条件下降解，促进所负载蛋白的释放。本发明制备的乏氧响应性载细胞色素C氢键有机框架可以有效携载细胞色素C进入细胞，对4T1细胞产生明显的杀伤作用，在体内显著抑制肿瘤生长。
附图说明
图1为实施例5中乏氧响应性载蛋白氢键有机框架的组装示意图。
图2为实施例1的AZB-PEG2000的核磁氢谱图。
图3为实施例1的AZB-PEG2000的质谱图。
图4为实施例5的CC@PHRHOF和CC@HRHOF静置前后的照片
图5为实施例5的CC@PHRHOF经SDT处理前后的SEM照片。
图6为实施例5的CC@PHRHOF在正常及经SDT处理条件下体外释放CC的曲线。
图7为应用例1的AZB-PEG2000-FITC的核磁氢谱图。
图8为应用例1的AZB-PEG2000-FITC的质谱图。
图9为应用例1中CCCy5@PHRHOFFITC与4T1细胞孵育2h的CLSM照片。
图10为应用例2中PHRHOF的SEM照片。
图11为应用例2中不同样品在常氧或乏氧条件下对4T1细胞体外抑制作用评价。
图12为应用例3中不同样品治疗在荷4T1皮下肿瘤小鼠中的体内疗效评价。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸(AZB-PEG)的制备方法，包括如下步骤：
1)将4-氨基水杨酸甲酯(501mg,3.0mmol)和碳酸钾(498mg,3.6mmol)加入圆底烧瓶中，加50mL DMF，在80℃下搅拌30min，溶解；加入3-溴丙炔(0.31mL,3.6mmol)，在80℃氮气保护条件下搅拌反应12h，真空蒸发去除DMF；残渣用二氯甲烷溶解，经硅胶柱层析(PE:EA＝2:1,v/v)纯化，得到化合物I；
2)将化合物I(170mg,0.83mmol)、NaI(248mg,1.65mmol)加入圆底烧瓶中，加20mLTHF溶解，在氮气保护下加入t-BuOCl(0.187mL,1.65mmol)，室温条件下搅拌6h。加入Na2S2O3水溶液(1.0M,20mL)终止反应，用CH2Cl2萃取3次，收集有机相，真空蒸发去除溶剂，以CH2Cl2为洗脱液，经硅胶柱层析纯化得到化合物II。
3)将化合物II(25mg,0.062mmol)、叠氮-聚乙二醇2000(246mg,0.12mmol)加入圆底烧瓶中，加20mL THF溶解；将CuSO4·5H2O(18.4mg,0.074mmol)和抗坏血酸钠(14.6mg,0.074mmol)分别溶于1.0mL水中，同时加入到上述反应溶液中，在55℃氮气保护条件下搅拌反应12h，减压蒸馏去除溶剂，将残渣和NaOH用蒸馏水溶解，搅拌，在水中透析2天(截留分子量3500Da)纯化，冷冻干燥得到聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸(III)，简称AZB-PEG2000。
其中的x＝114
采用核磁氢谱及质谱对其结构进行确证，结果见图2-图3。如图2所示，核磁氢谱图显示了AZB-PEG2000的特征峰：δ3.53(360H,-O-CH2-CH2-O-),3.84(4H),4.58(4H),5.38(4H),7.59(2H),7.84(2H),7,87(2H),8.21(2H)；AZB-PEG2000[(M+4)/4]+)的理论特征峰计算为:1137.1406，实际检测到了1137.1133的特征峰(图3)；以上结果表明上述步骤可成功制备得到AZB-PEG2000。
实施例2
一种聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸(AZB-PEG)的制备方法，包括如下步骤：
1)将4-氨基水杨酸甲酯(501mg,3.0mmol)和碳酸钾(415mg,3.0mmol)加入圆底烧瓶中，加50mL丙酮，在80℃下搅拌30min，溶解；加入3-溴丙炔(0.26mL,3.0mmol)，在80℃氮气保护条件下搅拌反应12h，真空蒸发去除丙酮；残渣用二氯甲烷溶解，经硅胶柱层析(PE:EA＝2:1,v/v)纯化，得到化合物I；
2)将化合物I(170mg,0.83mmol)、NaI(313mg,2.08mmol)加入圆底烧瓶中，加20mLTHF溶解，在氮气保护下加入t-BuOCl(0.236mL,2.08mmol)，室温条件下搅拌6h。加入Na2S2O3水溶液(1.0M,20mL)终止反应，用CH2Cl2萃取3次，收集有机相，真空蒸发去除溶剂，以CH2Cl2为洗脱液，经硅胶柱层析纯化得到化合物II。
3)将化合物II(25mg,0.062mmol)、叠氮-聚乙二醇2000(308mg,0.16mmol)加入圆底烧瓶中，加20mL THF溶解；将CuSO4·5H2O(20.7mg,0.083mmol)和抗坏血酸钠(16.4mg,0.094mmol)分别溶于1.0mL水中，同时加入到上述反应溶液中，在55℃氮气保护条件下搅拌反应12h，减压蒸馏去除溶剂，将残渣和NaOH用蒸馏水溶解，搅拌，在水中透析2天(截留分子量3500Da)纯化，冷冻干燥得到聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸(III)，简称AZB-PEG2000。
实施例3
一种聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸(AZB-PEG)的制备方法，包括如下步骤：
1)将4-氨基水杨酸甲酯(500mg,3.0mmol)和碳酸钾(623mg,4.5mmol)加入圆底烧瓶中，加50mL乙腈，在80℃下搅拌30min，溶解；加入3-溴丙炔(0.39mL,4.5mmol)，在80℃氮气保护条件下搅拌反应12h，真空蒸发去除乙腈；残渣用二氯甲烷溶解，经硅胶柱层析(PE:EA＝2:1,v/v)纯化，得到化合物I；
2)将化合物I(170mg,0.83mmol)、NaI(374mg,2.49mmol)加入圆底烧瓶中，加20mLTHF溶解，在氮气保护下加入t-BuOCl(0.282mL,2.49mmol)，室温条件下搅拌6h。加入Na2S2O3水溶液(1.0M,20mL)终止反应，用CH2Cl2萃取3次，收集有机相，真空蒸发去除溶剂，以CH2Cl2为洗脱液，经硅胶柱层析纯化得到化合物II。
3)将化合物II(25mg,0.062mmol)、叠氮-聚乙二醇2000(369mg,0.19mmol)加入圆底烧瓶中，加20mL THF溶解；将CuSO4·5H2O(23mg,0.093mmol)和抗坏血酸钠(18.2mg,0.093mmol)分别溶于1.0mL水中，同时加入到上述反应溶液中，在55℃氮气保护条件下搅拌反应12h，减压蒸馏去除溶剂，将残渣和NaOH用蒸馏水溶解，搅拌，在水中透析2天(截留分子量3500Da)纯化，冷冻干燥得到聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸(III)，简称AZB-PEG2000。
实施例4
一种聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸(AZB-PEG)的制备方法，包括如下步骤：
1)将4-氨基水杨酸甲酯(501mg,3.0mmol)和碳酸钾(498mg,3.6mmol)加入圆底烧瓶中，加50mL DMF，在80℃下搅拌30min，溶解；加入3-溴丙炔(0.31mL,3.6mmol)，在80℃氮气保护条件下搅拌反应12h，真空蒸发去除DMF；残渣用二氯甲烷溶解，经硅胶柱层析(PE:EA＝2:1,v/v)纯化，得到化合物I；
2)将NaI(248mg,1.65mmol)、化合物I(170mg,0.83mmol)加入圆底烧瓶中，加20mLTHF溶解，在氮气保护下加入t-BuOCl(0.187mL,1.65mmol)，室温条件下搅拌6h。加入Na2S2O3水溶液(1.0M,20mL)终止反应，用CH2Cl2萃取3次，收集有机相，真空蒸发去除溶剂，以CH2Cl2为洗脱液，经硅胶柱层析纯化得到化合物II。
3)将化合物II(25mg,0.062mmol)、叠氮-聚乙二醇5000(606mg,0.12mmol)加入圆底烧瓶中，加20mL THF溶解；将CuSO4·5H2O(18.4mg,0.074mmol)和抗坏血酸钠(14.6mg,0.074mmol)分别溶于1.0mL水中，同时加入到上述反应溶液中，在55℃氮气保护条件下搅拌反应12h，减压蒸馏去除溶剂，将残渣和NaOH用蒸馏水溶解，搅拌，在水中透析2天(截留分子量3500Da)纯化，冷冻干燥得到聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸(III)，简称AZB-PEG5000。
其中的x＝114
也可以用叠氮-聚乙二醇2000-5000的任一个如叠氮-聚乙二醇3000或叠氮-聚乙二醇4000替换本实施例的叠氮-聚乙二醇5000，其它同本实施例，可以制备得到不同的聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸。
实施例5
一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架的制备方法，包含如下步骤：
以实施例1中合成的AZB-PEG2000为配体基元制备乏氧响应性载蛋白氢键有机框架
(1)将偶氮苯-4，4’-二羧酸(4.2mg,15.5μmol)、AZB-PEG2000(2.2mg,0.50μmol)加入0.5mL蒸馏水中，加入30μL NaOH(1.0M)去质子，加水稀释至1.0mL，得到总羧酸配体浓度为16.0mM的二羧酸配体溶液；
(2)将四(4-脒基苯基)甲烷(5.1mg,8.0μmol)和细胞色素C(CC)(1.0mg)溶于1.0mL蒸馏水中，配置成四(4-脒基苯基)甲烷浓度为8mM的四脒基配体溶液。
(3)将0.2mL步骤(1)中的二羧酸配体溶液在剧烈搅拌条件下加至0.2mL步骤(2)中的四脒基配体溶液中，继续搅拌20分钟后，以11000rpm离心5分钟分离得到产物，然后用水洗涤3次以去除未反应的配体，得到乏氧响应性载蛋白氢键有机框架，命名为CC@PHRHOF。
性能测试
①包封率测试
步骤(3)乏氧响应性载蛋白氢键有机框架制备过程中，收集离心后的上清，采用BCA检测上清液中的CC含量即为未包封的CC，经过计算得知，CC@PHRHOF中CC的载药量为10.21±0.31wt％。
②稳定性测试
制备边臂未采用聚乙二醇修饰的乏氧响应性载蛋白氢键有机框架作为对照，将步骤(1)中偶氮苯-4，4’-二羧酸(4.2mg,15.5μmol)和AZB-PEG2000(2.2mg,0.50μmol)替换为偶氮苯-4，4’-二羧酸(4.3mg,16.0μmol)，替他步骤相同，得到不含聚乙二醇修饰的乏氧响应性载蛋白氢键有机框架作为对照，命名为CC@HRHOF。
将CC@PHRHOF和CC@HRHOF分别分散于PBS中，将其转移至石英皿中，置于4℃静置三天，静置前后溶液的状态比较照片见图4。由图4可知，经聚乙二醇修饰的CC@PHRHOF的能较为稳定的分散PBS中。
③形态表征
将含有CC@PHRHOF的水溶液用过量的二亚硫酸钠(SDT)处理10min，将SDT处理前后的溶液分别滴在硅片上，自然风干，在扫描电在扫描电镜(SEM)下观测形态。CC@PHRHOF和经SDT处理后CC@PHRHOF的SEM照片见图5。由图5可以看出，CC@PHRHOF在正常条件下呈棒状，长径约为200nm；而在SDT处理之后，CC@PHRHOF降解为小片，由此说明，本发明制备的乏氧响应性载蛋白氢键有机框架能够在还原酶存在的条件下降解，有利于负载物的释放。
④体外释放研究
将CC@PHRHOF(CC浓度为25μg/mL)溶液通入氮气15分钟，然后加入过量的SDT(14.3mM,30.0eq AZB)。在37℃条件下搅拌，不同时间通过透析去除SDT(截留分子量3500Da)，用BCA法检测上清中释放的CC含量，绘制释放曲线见图6。由图6可以看出，24小时后，正常条件下CC@PNRHOF中CC的释放率仅为14.99％；而在SDT存在下，82.68％的CC能够从CC@PHRHOF释放出来。以上结果说明，本发明制备的乏氧响应性载蛋白氢键有机框架能够在还原剂的作用下，快速的释放CC。
实施例6
一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架的制备方法，包含如下步骤：
以实施例1中合成的AZB-PEG2000为配体基元制备乏氧响应性载蛋白氢键有机框架
(1)将偶氮苯-4，4’-二羧酸(8.4mg,31.0μmol)、AZB-PEG2000(4.4mg,1.0μmol)加入0.5mL蒸馏水中，加入60μL KOH(1.0M)去质子，加水稀释至1.0mL，得到总羧酸配体浓度为32.0mM的二羧酸配体溶液；
(2)将四(4-脒基苯基)甲烷(10.2mg,16.0μmol)和细胞色素C(1.0mg)溶于1.0mL蒸馏水中，配置成四(4-脒基苯基)甲烷浓度为16mM的四脒基配体溶液。
(3)将0.1mL步骤(1)中的二羧酸配体溶液在剧烈搅拌条件下加至0.1mL步骤(2)中的四脒基配体溶液中，继续搅拌30分钟后，以11000rpm离心5分钟分离得到产物，然后用水洗涤3次以去除未反应的配体，得到乏氧响应性载蛋白氢键有机框架。
实施例7
一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架的制备方法，包含如下步骤：
以实施例1中合成的AZB-PEG2000为配体基元制备乏氧响应性载蛋白氢键有机框架
(1)将偶氮苯-4，4’-二羧酸(4.2mg,15.5μmol)、AZB-PEG2000(2.2mg,0.50μmol)加入0.5mL蒸馏水中，加入30μL四丁基氢氧化铵(1.0M)去质子，加水稀释至1.0mL，得到总羧酸配体浓度为16.0mM的二羧酸配体溶液；
(2)将四(4-脒基苯基)甲烷(5.1mg,8.0μmol)和RNA酶(1.0mg)溶于1.0mL蒸馏水中，配置成四(4-脒基苯基)甲烷浓度为8mM的四脒基配体溶液。
(3)将0.2mL步骤(1)中的二羧酸配体溶液在剧烈搅拌条件下加至0.2mL步骤(2)中的四脒基配体溶液中，继续搅拌30分钟后，以11000rpm离心5分钟分离得到产物，然后用水洗涤3次以去除未反应的配体，得到乏氧响应性载蛋白氢键有机框架。
应用例1
细胞摄取及共定位研究
以荧光探针Cy5和FITC对实施例5中的CC@PHRHOF进行荧光标记，具体步骤如下。
首先参考实施例1合成荧光标记的聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸(AZB-PEG2000-FITC)。步骤(1)、(2)同实施例1步骤(1)、(2)。
(3)将N3-PEG2000-FITC(商品)(50mg,0.022mmol)、AZB-A(4.3mg,0.011mmol)加入圆底烧瓶中，加20mL THF溶解，将CuSO4·5H2O(3.17mg,0.013mmol)和抗坏血酸钠(2.52mg,0.013mmol)分别溶于1.0mL水中，同时加入到上述反应溶液中，在55℃氮气保护条件下搅拌反应12h；减压蒸馏去除溶剂，将残渣和NaOH用蒸馏水溶解，搅拌，在水中透析2天(截留分子量3500Da)纯化，冷冻干燥得到荧光标记聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸，简称AZB-PEG2000-FITC。
采用核磁氢谱及质谱对其结构进行确证，结果见图7-图8。如图7所示，核磁氢谱图显示了AZB-PEG2000-FITC的特征峰：δ3.53(360H,-O-CH2-CH2-O-),3.83(4H),4.54(4H),5.28(4H),6.09(4H),6.68(4H),6.90(4H),7.18(2H),7.34(2H),7.42(2H),7.65(2H),7,95(6H),8.21(2H)；AZB-PEG2000-FITC[([(M+2)/2]+)的理论特征峰计算为:2411.6981，实际检测到了2411.6339的特征峰(图8)；以上结果表明上述步骤可成功制备得到AZB-PEG2000-FITC。
(4)将偶氮苯-4，4’-二羧酸(4.2mg,15.5μmol)、AZB-PEG2000(2.0mg,0.46μmol)、AZB-PEG2000(0.2mg,0.05μmol)加入0.5mL蒸馏水中，加入30μL NaOH(1.0M)去质子，加水稀释至1.0mL，得到总羧酸配体浓度为16.0mM的二羧酸配体溶液；
(5)将四(4-脒基苯基)甲烷(5.1mg,8.0μmol)和Cy5标记的细胞色素C(CCCy5,1.0mg)溶于1.0mL蒸馏水中，配置成四(4-脒基苯基)甲烷浓度为8mM的四脒基配体溶液。
(6)将0.2mL步骤(4)中的二羧酸配体溶液在剧烈搅拌条件下加至0.2mL步骤(5)中的四脒基配体溶液中，继续搅拌30分钟后，以11000rpm离心5分钟分离得到产物，然后用水洗涤3次以去除未反应的配体，得到乏氧响应性载蛋白氢键有机框架，命名为CCCy5@PHRHOFFITC。
将4T1细胞接种于35mm共聚焦小皿上，培养24h，将实施例5制备的CCCy5@PHRHOFFITC加入培养基中。孵育2h后，PBS冲洗细胞，4％多聚甲醛固定细胞，用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核。然后在Olympus FV1000激光共聚焦显微镜(CLSM)下观察细胞，CLSM照片见图9。由图9可知，在细胞质中能观测到明显的红光和绿光，并存在明显的共定位现象，说明CCCy5@PHRHOFFITC可将CCCy5成功携载进入细胞。
应用例2
体外抗肿瘤作用评价
制备乏氧响应性空白氢键有机框架作为对照，方法如下：
(1)将偶氮苯-4，4’-二羧酸(4.2mg,15.5μmol)、AZB-PEG2000(2.2mg,0.50μmol)加入0.5mL蒸馏水中，加入30μL NaOH(1.0M)去质子，加水稀释至1.0mL，得到总羧酸配体浓度为16.0mM的二羧酸配体溶液；
(2)将四(4-脒基苯基)甲烷(5.1mg,8.0μmol)溶于1.0mL蒸馏水中，配置成四(4-脒基苯基)甲烷浓度为8mM的四脒基配体溶液。
(3)将0.2mL步骤(1)中的二羧酸配体溶液在剧烈搅拌条件下加至0.2mL步骤(2)中的四脒基配体溶液中，继续搅拌20分钟后，以11000rpm离心5分钟分离得到产物，然后用水洗涤3次以去除未反应的配体，得到乏氧响应性空白氢键有机框架，命名为PHRHOF。采用SEM对其结构进行表征，结果见图10。由图10可知，PHRHOF结构于CC@PHRHOF类似，也呈棒状结构。
将4T1细胞接种于96孔板，孵育24h。然后，在常氧或缺氧条件下，分别用CC、PHRHOF、CC@PHRHOF(CC浓度当量为10μg/mL)处理细胞。48h后，弃去培养基，加入CCK-8试剂继续孵育2h。用多功能Varioskan Flash ELISA板读仪测定450nm处的吸光度。细胞存活率计算为处理后细胞的吸光度值与未处理细胞的吸光度值之比，结果见图11。
由图11可知，游离CC对细胞存活率无明显影响；PHRHOF处理后细胞的存活率高于80％，说明乏氧响应性空白氢键有机框架具有良好的相互相容性，是一种潜在的优良载体。在正常条件下，用CC@PHRHOF处理的4T1细胞的存活率为72.8％。而在缺氧条件下，CC@PHRHOF组的细胞存活率降至33.5％。以上结果说明，CC@PNRHOF能够响应乏氧环境，对4T1细胞产生明显的杀伤作用。
应用例3
体内抗肿瘤作用研究
将荷有4T1细胞的小鼠随机分为4组(n＝4)，分别给予PBS(对照)、CC、PHRHOF、和CC@PHRHOF(相当于CC剂量为5.0mg/kg)，每2天给药一次，共给药4次(图12a)。每2天测量肿瘤的长度和宽度，计算肿瘤体积；同时记录小鼠的体重。20天后，将小鼠安乐死，收集肿瘤组织称重，相关结果见图12。
如图12b所示，小鼠体重无明显变化。由图12c所示，CC@PHRHOF对肿瘤生长有显著抑制作用，肿瘤抑制率为46.1％，明显高于原生CC和空白PHRHOF。与其他三组相比，接受CC@PHRHOF治疗的小鼠的平均离体肿瘤重量明显较低(图12d)。以上结果表明，本发明中的乏氧响应性载蛋白氢键有机框架其作为CC载体制备的CC@PNRHOF对小鼠体重无明显影响，且对肿瘤具有显著的抑制作用，有望开发其在制备抗肿瘤蛋白药物中的应用。
根据技术方案的具体举例，按照发明内容的步骤和条件写明具体例子，证明技术方案可以实施并且达到发明的效果；实施例是具体发明内容的体现，发明内容是范围，而实施例是具体操作的条件，要包括发明内容所有范围的端值和中间值举例，并体现效果。有几个从属内容必须都有对应的实施例和效果。

Claims (10)

1.一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架；其特征是，在配体分子边臂上修饰聚乙二醇分子增加氢键有机框架的生理稳定性，并利用偶氮键作为乏氧响应元件，实现氢键有机框架对乏氧环境的响应和可控蛋白释放效果。
2.权利要求1所述一种构成乏氧响应性载蛋白氢键有机框架的制备方法，其特征是，包括如下步骤:
1)将偶氮苯-4，4’-二羧酸和聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸溶于蒸馏水中，加入碱溶液去质子化，得到二羧酸配体溶液；所述二羧酸配体溶液中偶氮苯-4，4’-二羧酸和聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸的摩尔比为30:(1～3)；
2)将四(4-脒基苯基)甲烷和蛋白溶于蒸馏水中得四脒基配体溶液，所述二羧酸配体溶液中总二羧酸配体的摩尔浓度为四脒基配体溶液中四(4-脒基苯基)甲烷的摩尔浓度的2倍；
3)在1500～1800rpm搅拌条件下，将等体积的二羧酸配体溶液与四脒基配体溶液混合，搅拌10～60min，离心，蒸馏水洗涤，得到乏氧响应性载蛋白氢键有机框架。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾或四丁基氢氧化铵。
4.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述四(4-脒基苯基)甲烷和蛋白的质量比为10:
(1～3)。
5.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述蛋白为细胞色素C或RNA酶或具体的药物。
6.如权利要求2所述的方法，其特征是，聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸制备方法包括如下步骤：
1)将4-氨基水杨酸甲酯和碳酸钾加入反应容器中，在搅拌下，溶于有机溶剂中，加入3-溴丙炔，在氮气保护下反应，得到化合物(I)：4-氨基-2-(丙-2-炔基氧基)苯甲酸甲酯；
所述4-氨基水杨酸甲酯、碳酸钾和3-溴丙炔的摩尔比为1:(1～1.5):(1～1.5)；
2)将化合物(I)、NaI加入反应容器中，用THF溶解，在氮气保护下加入次氯酸叔丁酯，反应，得到化合物(II)：4,4'-(二氮烯-1,2-二基)(E)-双(2-(丙-2-炔基氧基)苯甲酸二甲酯；
所述化合物(I)、NaI和次氯酸叔丁酯的摩尔比为1:(2～3):(2～3)；
3)将化合物(II)、叠氮-聚乙二醇加入反应容器中，用THF溶解，再加入CuSO4·5H2O水溶液和抗坏血酸钠水溶液，在氮气保护下，反应，减压蒸馏去除溶剂，将残渣和NaOH用水溶解，搅拌，纯化，干燥得到聚乙二醇修饰的偶氮苯-4，4’-二羧酸(III)：(E)-4,4'-(二氮烯-1,2-二基)双(2-(1-(聚乙二醇2000)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)苯甲酸。
7.如权利要求6所述的方法，其特征是，所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮或乙腈。
8.如权利要求6所述的方法，其特征是，所述化合物(II)、叠氮-聚乙二醇、CuSO4·5H2O和抗坏血酸钠的摩尔比为1:(2～3):(1.2～1.5):(1.2～1.5)。
9.如权利要求6所述的方法，其特征是，所述叠氮-聚乙二醇中聚乙二醇的重均分子量为2000～5000。
10.权利要求1的一种乏氧响应性载蛋白氢键有机框架在制备抗肿瘤药物中的应用。
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