CN118222764A - 一种抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光pcr扩增反应试剂、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR扩增反应试剂、试剂盒及检测方法。该荧光PCR扩增反应试剂中添加DTT、BSA、Brij35和甜菜碱抗干扰组分。该荧光PCR检测试剂盒的检测极限达到1copies/μL，与猪瘟病毒、流行性腹泻病毒、蓝耳病病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒均无阳性交叉反应，因此，该荧光PCR检测试剂盒具有特异性强、敏感性高、结果判读准确性好、尤其能够避免假阴性判读等优点。另外，该荧光PCR检测试剂盒能够用于检测猪血液、唾液、组织研磨液、环境拭子、车辆拭子中的非洲猪瘟病毒，且能够有效抵抗养殖场中未知消毒剂的干扰。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，涉及一种抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR扩增反应试剂、试剂盒及检测方法。
背景技术
非洲猪瘟病毒（简称：ASFV）具有传染性和极高的致病性，急性病例临床症状以高热、病程短、死亡率高、内脏器官广泛性出血以及呼吸系统和精神系统功能紊乱为主。
目前，对ASFV的防控仍是依赖于早期病毒检测，尤其是对环境样品及各种运输车的病毒检测。在实际工作中，养殖场会对运料车、运猪车、物资车以及整个养殖环境进行消杀处理，以消灭大部分病毒。一般情况下会使用浓度为5%的84消毒剂、浓度为2%的戊二醛或浓度为1%的卫可进行消毒，其中，5%的84消毒剂按照1：20稀释配制，2%的戊二醛按照1：50倍稀释配制，1%的卫可按照1:100倍稀释配制。但是在养殖场的实际操作中并不会严格按照上述配比进行稀释，因此，实际使用的消毒剂浓度会略大于配制浓度，这便会导致环境中或者消杀物体表面残存部分消毒剂。
在采用非洲猪瘟病毒荧光PCR检测技术对ASFV进行病毒核酸检测时发现，环境中或者消杀物体表面残存的部分消毒剂会被混入样品中，最终导致检测结果出现异常，例如阳性样品Ct值大幅错后；严重的还会假阴性，从而导致漏检。这种检测失误很大程度上增加了ASFV的传播风险，使防控非洲猪瘟病毒流行增加难度，进而造成经济损失，无法精确检测ASFV。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR扩增反应试剂、试剂盒及检测方法，以解决样品中因残存消毒剂而影响ASFV检测的问题。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
第一方面，本申请提供一种抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR扩增反应试剂，该荧光PCR扩增反应试剂包括含有抗干扰组分的抗消毒剂干扰5×PCR缓冲液，其中，抗干扰组分包括：DTT（英文名称：dithiothreitol；中文名称：二硫苏糖醇）、BSA（英文名称：Bovine albumin；中文名称：牛血清白蛋白）、Brij35和甜菜碱。
DTT是一种强还原剂，可中和缓冲液中的氧化性成分，保护酶的稳定性和活性。BSA在PCR体系中可以维持taq DNA聚合酶的稳定性及活性，提高PCR的效率，减少蛋白的降解，减轻非特异性吸附造成的酶蛋白丢失。Brij35是一种非离子型清洁剂，用于分离差别很小的物质，能够增加模版基因的扩增。甜菜碱是一种两性离子表面活性剂，可以消除引物和模板的二级结构，降低缓冲体系中干扰物质对核酸的影响，增加退火时碱基配对的特异性。
本发明通过实验对不同种类消毒剂进行抗干扰效果对比，表明了在含有全部抗干扰组分的组合中，荧光PCR扩增反应试剂的抗干扰能力最强，此时可将含有消毒剂的弱阳性样品全部检出，能够显著提高样本检出效率。
进一步，该抗消毒剂干扰5×PCR缓冲液包括：pH9.0的Tris-HCL 100mM、KCl400mM、MgCl2•6H2O 7.5mM、TritonX-100 0.05%、DTT 5mM、BSA 0.5%、Brij35 1%、甜菜碱3M。
更进一步，该荧光PCR扩增反应试剂还包括dNTP Mixture、上游引物ASFVF、下游引物ASFVR、探针ASFVP、MgCl2、DEPC（英文名称：Diethyl pyrocarbonate；中文名称：焦碳酸二乙酯）处理水。
具体的，按照浓度和体积，该荧光PCR扩增反应试剂包括浓度为2.5mmol/L、体积为2μL的dNTP Mixture，浓度为10μmol/L、体积为2.5μL的上游引物ASFVF，浓度为10μmol/L、体积为2.5μL的下游引物ASFVR，浓度为10μmol/L、体积为0.3μL的探针ASFVP，浓度为25mmol/L、体积为2μL的MgCl2，浓度为0.1%、体积为5.7μL的DEPC处理水。上述试剂在低温无菌条件下混合后，用0.45μm滤膜过滤除菌，分装成小管，加贴标签。
在本申请中，参考非洲猪瘟病毒24个基因型参考毒株和中国流行病毒株的p72基因序列，筛选保守区域，设计引物探针。其中，上游引物、下游引物和探针的序列为：
上游引物ASFVF：TCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATAC；
下游引物ASFVR：TCTTGCTCTRGATACGTTAATATGRC；
探针ASFVP：5'-FAM-CACTGGGTTGGTATTCCTCCCGT-BHQ1-3'。
进一步，探针ASFVP还包括5’端或3’端增加1-3个碱基的核苷酸序列。
第二方面，本申请提供一种抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包括上述荧光PCR扩增反应试剂、Taq DNA聚合酶、阴性对照、阳性对照。
在本申请中，Taq DNA聚合酶为从Promega公司购买的商品，其体量为100 μL/管，浓度为5U/μL。将Taq DNA聚合酶无菌定量分装，加贴标签，备用。
在本申请中，阴性对照为无菌、浓度为0.1%的DEPC处理水。DEPC处理水无菌分装后，加贴标签，备用。
在本申请中，阳性对照的制备方法包括：以常规方法克隆非洲猪瘟病毒P72基因，以构建pMD20-T-P72载体质粒；测定该pMD20-T-P72载体质粒的基因序列。测序结果测定正确后，转化大肠杆菌Top10感受态细胞、扩大培养、提取质粒，稀释后得到阳性对照。
第三方面，本申请提供一种抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的检测方法，包括：在反应管中加入20μL的荧光PCR扩增反应试剂和0.5μL的Taq DNA聚合酶，混匀后加入5.0 μL待检测样品核酸，同时设置阳性对照管及阴性对照管；盖紧管帽，瞬时离心，放入荧光PCR检测仪内检测。
其中，荧光PCR检测的反应条件为：95℃/3min；95℃/15s，60℃/30s共45个循环，荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸时进行。
本发明具有以下有益效果：
1）加入抗干扰组分后，本申请中的荧光PCR扩增反应试剂具有特异性强、敏感性高等优点，能有效减少样品中消毒剂的干扰。
2）加入抗干扰组分后， 本申请中的试剂盒能有效抵抗样品中多种消毒剂的干扰，提高结果判读准确性、防止假阴性的出现。
3）本申请中的试剂盒特异性强，与猪瘟病毒、流行性腹泻病毒、蓝耳病病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒均无阳性交叉反应，具有明显的特异性。
4）本申请中的试剂盒对104～10-1copies/μL的非洲猪瘟病毒质粒DNA模板进行荧光PCR检测，结果显示检测极限达到1 copies/μL，具有较高的灵敏度。
5）本申请中的荧光PCR扩增反应试剂或试剂盒用于检测猪血液、唾液、组织研磨液、环境拭子、车辆拭子中的非洲猪瘟病毒。
附图说明
图1为试验组试剂盒进行敏感性检测的荧光PCR检测结果图；
图2为对照组试剂盒进行敏感性检测的荧光PCR检测结果图；
图3为本申请实施例提供的试剂盒进行特异性检测的荧光PCR检测结果图；
图4为试验组和对照组试剂盒对浓度10%的84消毒剂进行抗干扰性检测的荧光PCR检测结果图；其中，红线为对照组，蓝线为试验组；
图5为试验组和对照组试剂盒对浓度5%的戊二醛进行抗干扰性检测的荧光PCR检测结果图；其中，红线为对照组，蓝线为试验组；
图6为试验组和对照组试剂盒对稀释比为1:50的卫可进行抗干扰性检测的荧光PCR检测结果图；其中，红线为对照组，蓝线为试验组；
图7为试验组试剂盒对使用不同消毒剂处理的非洲猪瘟阳性样品1进行抗干扰性检测的荧光PCR检测结果图；
图8为试验组试剂盒对使用不同消毒剂处理的非洲猪瘟阳性样品2进行抗干扰性检测的荧光PCR检测结果图；
图9为试验组试剂盒对使用不同消毒剂处理的非洲猪瘟阳性样品3进行抗干扰性检测的荧光PCR检测结果图；
图10为试验组和对照组试剂盒对养殖场样品进行抗干扰性检测的荧光PCR检测结果图；其中，红线为试验组对养殖场环境样品1的检测结果，蓝线为对照组对养殖场环境样品1的检测结果，紫线为试验组对养殖场环境样品2的检测结果，绿线为对照组对养殖场环境样品2的检测结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
实施例1
本申请实施例提供一种抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR扩增反应试剂，该荧光PCR扩增反应试剂包括：5μL抗消毒剂干扰5×PCR缓冲液，浓度为2.5mmol/L、体积为2μL的dNTP Mixture，浓度为10μmol/L、体积为2.5μL的上游引物ASFVF，浓度为10μmol/L、体积为2.5μL的下游引物ASFVR，浓度为10μmol/L、体积为0.3μL的探针ASFVP，浓度为25mmol/L、体积为2μL的MgCl2，浓度为0.1%、体积为5.7μL的DEPC处理水。
其中，抗消毒剂干扰5×PCR缓冲液包括：pH9.0的Tris-HCL 100mM、KCl 400mM、MgCl2•6H2O 7.5mM、TritonX-100 0.05%、DTT 5mM、BSA 0.5%、Brij35 1%、甜菜碱3M。
上游引物、下游引物和探针的序列为：
上游引物ASFVF：TCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATAC；
下游引物ASFVR：TCTTGCTCTRGATACGTTAATATGRC；
探针ASFVP：5'-FAM-CACTGGGTTGGTATTCCTCCCGT-BHQ1-3'。
实施例2
本申请实施例提供一种抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR扩增反应试剂，该PCR扩增反应试剂同实施例1，仅是探针ASFVP还包括5’端或3’端增加1-3个碱基的核苷酸序列。
实施例3
本申请实施例提供一种抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：荧光PCR扩增反应试剂、Taq DNA聚合酶、阴性对照、阳性对照。
具体的，荧光PCR扩增反应试剂包括：5μL抗消毒剂干扰5×PCR缓冲液，浓度为2.5mmol/L、体积为2μL的dNTP Mixture，浓度为10μmol/L、体积为2.5μL的上游引物ASFVF，浓度为10μmol/L、体积为2.5μL的下游引物ASFVR，浓度为10μmol/L、体积为0.3μL的探针ASFVP，浓度为25mmol/L、体积为2μL的MgCl2，浓度为0.1%、体积为5.7μL的DEPC处理水。
其中，抗消毒剂干扰5×PCR缓冲液包括：pH9.0的Tris-HCL 100mM、KCl 400mM、MgCl2•6H2O 7.5mM、TritonX-100 0.05%、DTT 5mM、BSA 0.5%、Brij35 1%、甜菜碱3M。
上游引物、下游引物和探针的序列为：
上游引物ASFVF：TCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATAC；
下游引物ASFVR：TCTTGCTCTRGATACGTTAATATGRC；
探针ASFVP：5'-FAM-CACTGGGTTGGTATTCCTCCCGT-BHQ1-3'。
Taq DNA聚合酶为从Promega公司购买的商品，其体量为100 μL/管，浓度为5U/μL。将Taq DNA聚合酶无菌定量分装，加贴标签，备用。
阴性对照为无菌、浓度为0.1%的DEPC处理水。DEPC处理水无菌分装后，加贴标签，备用。
阳性对照的制备方法包括：以常规方法克隆非洲猪瘟病毒P72基因，以构建pMD20-T-P72载体质粒；测定该pMD20-T-P72载体质粒的基因序列。测序结果测定正确后，转化大肠杆菌Top10感受态细胞、扩大培养、提取质粒，稀释后得到阳性对照。
实施例4
本申请提供一种抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的检测方法，包括：在反应管中加入20μL实施例1中的的荧光PCR扩增反应试剂和0.5μL的Taq DNA聚合酶，混匀后加入5.0 μL待检测样品核酸，同时设置阳性对照管及阴性对照管；盖紧管帽，瞬时离心，放入荧光PCR检测仪内检测。其中，荧光PCR检测的反应条件为：95℃/3 min；95℃/15 s，60℃/30 s共45个循环，荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸时进行。
为验证本申请实施例提供的荧光PCR检测试剂盒的敏感性、特异性以及抗干扰性，本申请实施例分别以实施例3所制备的试剂盒为试验组，以未添加抗干扰组分的试剂盒为对照组进行实验，其中，对照组中试剂盒的制备同试验组中试剂盒的制备相同，仅是没有添加抗干扰组分。具体试验内容如下：
（1）荧光PCR检测试剂盒的敏感性试验
使用DEPC处理水将DNA含量为104copies/μL的阳性对照质粒pMD20-T-P72倍比稀释10、100、1000、10000、100000倍，作为敏感性质控样品。其中，对应于阳性对照质粒pMD20-T-P72的倍比稀释，敏感性质控样品的拷贝数依次为103、102、101、100、10-1copies/μL。采用试验组试剂盒对敏感性质控样品进行荧光PCR扩增检测，得到附图1，采用对照组试剂盒对敏感性质控样品进行荧光PCR扩增检测，得到附图2。
由附图1、附图2可见，试验组和对照组的两种试剂盒对1:10、1:100、1:1000、1:10000稀释的敏感性质控样品的检测结果均为阳性，对1:100000稀释的敏感性质控样品的检测结果均为阴性。由此表明，试验组和对照组的两种试剂盒的检测极限均能够达到1:10000，也就是，试验组试剂盒的检测极限达到1copies/μL，具有较高的灵敏度。
（2）荧光PCR检测试剂盒的特异性试验
采用试验组试剂盒对猪瘟病毒、流行性腹泻病毒、蓝耳病病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒的核酸进行荧光PCR扩增检测，得到附图3。
由附图3可见，试验组试剂盒对猪瘟病毒、流行性腹泻病毒、蓝耳病病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒的核酸均无阳性交叉反应。另外，检测60份经临床诊断并鉴定为ASFV阴性的样品，包括唾液、血液，结果全部为阴性，特异性为100%。
（3）荧光PCR检测试剂盒对阳性标准品的抗干扰试验
采用试验组和对照组试剂盒分别对含有不同种类消毒剂的ASFV阳性对照品进行检测，验证本申请实施例提供的试剂盒对不同消毒剂的抗干扰效果。
具体的，取非洲猪瘟阳性质粒，稀释成103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL和100copies/μL 4种不同的浓度，备用。分别制备3种不同稀释比例的消毒剂，其浓度均大于常规使用浓度。其中，消毒剂为浓度10%的84消毒剂、浓度5%的戊二醛以及稀释比为1:50的卫可。将消毒剂分别与4种不同浓度的非洲猪瘟阳性质粒进行1:1混合，混合均匀并放置30min后分别进行核酸提取操作。其中，消毒剂与4种不同浓度的非洲猪瘟阳性质粒的混合配比如表1所示。采用试验组和对照组试剂盒分别对表1中处理后的核酸进行荧光PCR扩增检测，得到附图4-6。
表1：消毒剂与4种不同浓度的非洲猪瘟阳性质粒的混合配比
由附图4-6可见，蓝线所示的试验组试剂盒的荧光PCR扩增曲线呈标准S型，ct值判定不受影响，这表明试验组的试剂盒能够抵抗浓度10%的84消毒液、浓度5%的戊二醛溶液、稀释比1:50的卫可消毒液的干扰。也就是，当养殖场使用的84消毒剂的浓度小于10%、戊二醛消溶液的浓度小于5%、卫可消毒剂的浓度小于2%时，残留的消毒剂不对PCR反应产生干扰。
（4）荧光PCR检测试剂盒对阳性样品的抗干扰试验
取3份不同病毒含量的非洲猪瘟阳性样品，使用10% 84消毒液、5%戊二醛、2%卫可消毒剂、DEPC处理水分别与不同病毒含量的非洲猪瘟阳性样品按照体积比1:1混合，混合均匀放置30min后分别进行核酸提取操作。使用试验组试剂盒分别对上述处理后的核酸进行荧光PCR扩增检测，得到附图7-9。
由附图7-9可见，试验组的试剂盒的荧光PCR扩增曲线呈标准S型，ct值判定不受影响，这表明试验组的试剂盒能够抵抗浓度10%的84消毒液、浓度5%的戊二醛溶液、稀释比1:50的卫可消毒液的干扰。
（5）荧光PCR检测试剂盒对养殖场样品的抗干扰试验
由于养殖场中不会单一使用某一种消毒剂，且会按照一定的频率更换消毒剂，因此，养殖场的环境中可能会同时存在多种消毒剂残留。本申请实施例中，采用试验组和对照组试剂盒分别对2份不同的养殖场弱阳性环境样品分别进行荧光PCR扩增检测，得到附图10。
由附图10可见，红线所示的试验组试剂盒和蓝线所示的对照组试剂盒对养殖场环境样品1的检测结果基本一致，均可检出养殖场弱阳性环境样品中残留的消毒剂。紫线所示的试验组试剂盒可以检出养殖场环境样品2号中残留的消毒剂，但绿线所示的对照组试剂盒无法检出。综上，试验组试剂盒能够有效抵抗养殖场中未知消毒剂的干扰。
通过上述试验检测可知，本申请实施例提供的荧光PCR检测试剂盒的检测极限达到1copies/μL，且与猪瘟病毒、流行性腹泻病毒、蓝耳病病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒均无阳性交叉反应，因此，该荧光PCR检测试剂盒具有特异性强、敏感性高、结果判读准确性高、防止假阴性等优点。另外，该荧光PCR检测试剂盒能够用于检测猪血液、唾液、组织研磨液、环境拭子、车辆拭子中的非洲猪瘟病毒，且能够有效抵抗养殖场中未知消毒剂的干扰。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR扩增反应试剂，其特征在于，包括含有抗干扰组分的抗消毒剂干扰5×PCR缓冲液，所述抗干扰组分包括：DTT、BSA、Brij35和甜菜碱。
2.根据权利要求1所述的抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR扩增反应试剂，其特征在于，所述抗消毒剂干扰5×PCR缓冲液包括：pH9.0的Tris-HCL 100mM、KCl 400mM、MgCl2•6H2O 7.5mM、TritonX-100 0.05%、DTT 5mM、BSA 0.5%、Brij35 1%、甜菜碱3M。
3.根据权利要求2所述的抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR扩增反应试剂，其特征在于，所述荧光PCR扩增反应试剂还包括dNTP Mixture、上游引物ASFVF、下游引物ASFVR、探针ASFVP、MgCl2、DEPC处理水。
4.根据权利要求3所述的抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR扩增反应试剂，其特征在于，所述荧光PCR扩增反应试剂还包括浓度为2.5mmol/L、体积为2μL的dNTPMixture，浓度为10μmol/L、体积为2.5μL的上游引物ASFVF，浓度为10μmol/L、体积为2.5μL的下游引物ASFVR，浓度为10μmol/L、体积为0.3μL的探针ASFVP，浓度为25mmol/L、体积为2μL的MgCl2，浓度为0.1%、体积为5.7μL的DEPC处理水。
5.根据权利要求3所述的抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR扩增反应试剂，其特征在于，所述上游引物、所述下游引物和所述探针的序列为：
上游引物ASFVF：TCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATAC；
下游引物ASFVR：TCTTGCTCTRGATACGTTAATATGRC；
探针ASFVP：5'-FAM-CACTGGGTTGGTATTCCTCCCGT-BHQ1-3'。
6.根据权利要求5所述的抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR扩增反应试剂，其特征在于，所述探针ASFVP还包括5’端或3’端增加1-3个碱基的核苷酸序列。
7.一种抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1-6中任意一项所述的荧光PCR扩增反应试剂、Taq DNA聚合酶、阴性对照、阳性对照。
8.根据权利要求7所述的抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为无菌、浓度为0.1%的DEPC处理水。
9.根据权利要求7所述的抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照的制备方法包括：以克隆非洲猪瘟病毒P72基因构建pMD20-T-P72载体质粒；测定所述pMD20-T-P72载体质粒基因序列正确后，转化大肠杆菌Top10感受态细胞、扩大培养、提取质粒，稀释后得到阳性对照。
10.权利要求6-8中任意一项所述抗多种消毒剂干扰的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括：在反应管中加入20μL的荧光PCR扩增反应试剂和0.5μL的Taq DNA聚合酶，混匀后加入5.0 μL待检测样品核酸，同时设置阳性对照管及阴性对照管；盖紧管帽，瞬时离心，放入荧光PCR检测仪内检测；其中，荧光PCR检测的反应条件为：95℃/3min；95℃/15 s，60℃/30 s共45个循环，荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸时进行。
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