CN118217321A - 艾叶提取物在制备抗幽门螺杆菌产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药技术领域，具体涉及艾叶提取物在制备抗幽门螺杆菌产品中的应用。本发明从艾叶干燥叶子中分离得到艾叶水提取物及乙醇提取物，通过实验发现，叶水提取物及乙醇提取物对幽门螺杆菌抗生素敏感株和耐药株均具有很强的抑制杀灭作用，且与部分临床治疗幽门螺杆菌感染的抗生素联合使用表现为相加作用。此外，1/2MIC浓度下能明显抑制幽门螺杆菌产生脲酶，且抑制效果与脲酶抑制剂乙酰氧肟酸相当，可用于抗幽门螺杆菌产品的制备中。同时，艾叶作用温和，耐药发生率低，不良反应少，患者服药依从性好，尤其适用于幽门螺杆菌感染者。本发明拓宽了临床常用热门中药艾叶的应用领域，为幽门螺杆菌的治疗提供了新方向。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域，具体涉及艾叶提取物在制备抗幽门螺杆菌产品中的应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种螺旋状的、微需氧的革兰氏阴性杆菌，较强的感染能力使其在全球感染率高达50％，Hp感染与慢性活动性胃炎、胃十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤、胃癌等多种消化系统疾病密切相关。目前，针对Hp感染的常规治疗是抗生素三联或四联疗法，但随着抗生素的滥用，Hp对抗生素的耐药率不断升高，导致Hp感染治疗的常规抗生素疗法根除率不断下降、不良反应越来越多。因此，寻找非抗生素的替代疗法迫在眉睫。
脲酶(urease,EC3.5.1.5)是H.pylori重要的定殖因子与毒力因子，可分解尿素产生氨以中和胃酸，在其周围形成一片“氨云”，使得H.pylori可以在胃部生长繁殖。研究表明，剔除脲酶突变基因后，H.pylori不能在无菌猪仔胃部定殖。脲酶能分解尿素产生过量氨，并进一步形成硝酸盐和亚硝酸盐损害组织甚至致癌；尿素的水解产物还能激活单核细胞，促使免疫炎症递质和超氧自由基的分泌，从而形成空泡。在脲酶的结构单元中，其活性位点的Ni2+和活性位点附近的必需基团巯基对脲酶的催化作用是必需的，而脲酶的活性又与H.pylori能否成功定殖胃部密切相关，并影响生物体氮的利用。因此，抑制脲酶活性被视为抗菌物质研究的关键。
中医药是独特的卫生资源，具有广谱低毒、多靶点多途径的优点，逐渐成为Hp感染治疗的研究热点。艾叶(Folium Artemisia Argyi)为菊科植物艾(Artemisia argyi H.Lév.&Vaniot)的干燥叶，又名冰台、灸草、医草等，其制作是在夏季花未开时采摘，除去杂质，略洗，切碎，干燥。艾叶具有散寒止痛、温经止血的功效，临床上主要用于治疗钩蚴皮炎、急性菌痢、慢性气管炎、慢性肝炎、间日疟、肺结核喘息症、妇女白带、寻常疣等疾病。艾叶既可单味药使用，又可与多种中药配伍使用，其中与当归、阿胶、川芎、地黄、白芍等中药配伍较多，多用于治疗妇科、消化道及皮肤等方面的疾病。艾叶的药用历史悠远，始载于梁代的《名医别录》，传统药性理论认为艾叶性味苦、辛温，归肝、脾、肾经，具有灸百病、理气血、逐寒湿、止痛、安胎、温胃、温经止血、杀虫止痒、止痢、开郁等功效。许多研究报道艾叶具有抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利胆、止血及抗凝血、抗过敏、免疫调节、抗癌等作用。然而，目前还没有关于艾叶单味药抗幽门螺杆菌的作用及抑制其产生脲酶的报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明从艾的干燥叶子中分离得到艾叶水提取物及乙醇提取物，经大量研究发现，艾叶水提取物及乙醇提取物对幽门螺杆菌抗生素敏感株和耐药株均具有很强的抑制及杀灭作用，且与部分临床治疗幽门螺杆菌感染的抗生素联合使用表现出相加作用。此外，1/2MIC浓度下的艾叶水提取物及乙醇提取物能明显抑制幽门螺杆菌产生脲酶，且抑制效果与脲酶抑制剂乙酰氧肟酸相当。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明第一方面提供了艾叶水提取物和/或乙醇提取物制备抗幽门螺杆菌产品中的应用。
本发明从艾的干燥叶子中分离得到艾叶水提取物及乙醇提取物，通过实验发现，艾叶水提取物及乙醇提取物对幽门螺杆菌抗生素敏感株和耐药株均具有很强的抑制杀灭作用，与部分临床治疗幽门螺杆菌感染的抗生素联合作用表现为相加，1/2MIC浓度下能明显抑制幽门螺杆菌产生脲酶，且抑制效果与脲酶抑制剂乙酰氧肟酸相当，有望用于抗幽门螺杆菌产品的制备中。
优选地，所述艾叶水提取物和/或乙醇提取物通过破坏幽门螺杆菌的细胞膜和/或抑制幽门螺杆菌产生脲酶而发挥抗幽门螺杆菌作用。
优选地，所述艾叶水提取物的制备方法为包括以下步骤：
S1、将艾叶叶子打碎至粉末状，再往艾叶粉末中加入8-12倍量的水，浸泡30-60min；
S2、将含有艾叶的水浸液置于80-100℃下水浴回流提取0.5-3h，收集滤液；
S3、将滤液蒸发浓缩至浸膏状，再干燥至固体粉末，即得。
优选地，所述艾叶水提取物的制备方法为包括以下步骤：
S1、将艾叶叶子打碎至粉末状，再往艾叶粉末中加入8-12倍量的80％乙醇溶液，浸泡30-60min；
S2、将含有艾叶的80％乙醇浸液置于20-25℃下超声提取0.5-2h，收集滤液；
S3、将滤液蒸发浓缩至浸膏状，再干燥至固体粉末，即得。
更优选地，S1中，所述艾叶叶子为菊科植物艾的叶经干燥制成。
更优选地，S1中，将艾叶叶子打碎至粉末状后，过30-50目筛后再浸泡。
更优选地，S2中，所述提取共重复2-5次，合并滤液。
优选地，所述抗幽门螺杆菌产品包括(但不限于)药物或预防保健品。
优选地，所述抗幽门螺杆菌产品的剂型包括(但不限于)粉剂、颗粒剂、注射液、胶囊、片剂或口服液，可以是药学领域可接受的任一剂型。
本发明第二方面提供了一种抗幽门螺杆菌的药物，所述幽门螺杆菌为标准株ATCC700392，所述药物包括艾叶水提取物以及阿莫西林。
本发明第三方面还提供了一种抗幽门螺杆菌的药物，所述幽门螺杆菌为标准株ATCC 43504，所述药物包括艾叶水提取物以及克拉霉素或阿莫西林或甲硝唑，或者包括艾叶乙醇提取物以及克拉霉素或阿莫西林。
本发明第四方面还提供了一种抗幽门螺杆菌的药物，所述幽门螺杆菌为标准株SS1，所述药物包括艾叶水提取物以及克拉霉素或阿莫西林，或者包括艾叶乙醇提取物以及左氧氟沙星或阿莫西林或甲硝唑。
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
更优选地，所述辅料为制剂领域中可得到的功能性辅料，包括表面活性剂、助悬剂、乳化剂以及一些新型药用高分子材料，如环糊精、壳聚糖、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸聚乳酸共聚物(PLGA)、透明质酸等。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的艾叶水提取物及乙醇提取物具有多成分、多途径、多靶点的作用效果，对幽门螺杆菌抗生素敏感株和耐药株均具有很强的抑制杀灭作用，且与部分临床治疗幽门螺杆菌感染的抗生素联合使用表现为相加作用。此外，1/2MIC浓度下能明显抑制幽门螺杆菌产生脲酶，且抑制效果与脲酶抑制剂乙酰氧肟酸相当。同时，艾叶是“医草”，是临床常用热门中药之一，具有提高机体免疫力等作用，作用温和，耐药发生率低，不良反应少，患者服药依从性好，尤其适用于幽门螺杆菌感染者，能够补充或替代目前治疗幽门螺杆菌普遍使用的抗生素三联或四联疗法。本发明不仅拓宽了临床常用热门中药艾叶的应用领域，而且为幽门螺杆菌的治疗提供了新方向。再有，通过本发明方法制得的艾叶水提取物及乙醇提取物无有毒的有机溶剂残留，含有较多有效成分，简单易得。
附图说明
图1为本发明所述的艾叶水提取物及乙醇提取物的UPLC-ESI-MS图(AY-AE:艾叶水提取物；AY-HE：艾叶乙醇提取物)；
图2为艾叶水提取物及乙醇提取物抗幽门螺杆菌的抑菌曲线(AY-AE:艾叶水提取物；AY-HE：艾叶乙醇提取物)；
图3为艾叶水提取物及乙醇提取物抗幽门螺杆菌的杀菌曲线(AY-AE:艾叶水提取物；AY-HE：艾叶乙醇提取物)；
图4为不同处理的H.pylori 43504的扫描电镜图像；生长对照(ATCC 43504)组(A、B、C)、MIC浓度AY-AE组(D、E、F)、MIC浓度AY-HE组(G、H、I)处理10h后H.pylori细胞形态的扫描电镜图像(放大倍数25.0kx、40.0kx、50.0kx)，其中AY-AE为艾叶水提取物，AY-HE为艾叶乙醇提取物；
图5为艾叶水提取物及乙醇提取物对幽门螺杆菌产生脲酶的影响(AA:脲酶抑制剂乙酰氧肟酸；AY-AE:艾叶水提取物；AY-HE：艾叶乙醇提取物)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1艾叶水提取物及乙醇提取物的制备方法
1、艾叶水提取物的制备
(1)将艾叶叶子(由菊科植物艾的叶经干燥制成)打碎至粉末状，过40目筛后往艾叶粉末中加入10倍量(料液比：g/mL)的水浸泡30min；
(2)将含有艾叶的水浸液置于100℃下水浴回流提取1h，重复提取3次，合并滤液；
(3)将滤液旋转蒸发浓缩至浸膏状，再冷冻干燥至固体粉末，即得。
2、艾叶乙醇提取物的制备
(1)将艾叶叶子(由菊科植物艾的叶经干燥制成)打碎至粉末状，过40目筛后往艾叶粉末中加入10倍量(料液比：g/mL)的80％乙醇浸泡30min；
(2)将含有艾叶的80％乙醇浸液置于25℃下超声提取1h，重复提取3次，合并滤液；
(3)将滤液旋转蒸发浓缩至浸膏状，再冷冻干燥至固体粉末，即得。
对本实施例所制得的艾叶水提取物及乙醇提取物进行UPLC-ESI-MS分析，结果如图1所示。
从图中可以看出，本实施例所制得的艾叶水提取物及乙醇提取物按照UPLC-ESI-MS法分别检测得到32个化合物(艾叶水提取物)和37个化合物(艾叶醇提取物)。
实施例2艾叶水提取物及乙醇提取物的制备方法
1、艾叶水提取物的制备
(1)将艾叶叶子(由菊科植物艾的叶经干燥制成)打碎至粉末状，过40目筛后往艾叶粉末中加入8倍量(料液比：g/mL)的水浸泡45min；
(2)将含有艾叶的水浸液置于80℃下水浴回流提取3h，重复提取3次，合并滤液；
(3)将滤液旋转蒸发浓缩至浸膏状，再冷冻干燥至固体粉末，即得。
2、艾叶乙醇提取物的制备
(1)将艾叶叶子(由菊科植物艾的叶经干燥制成)打碎至粉末状，过40目筛后往艾叶粉末中加入8倍量(料液比：g/mL)的80％乙醇浸泡45min；
(2)将含有艾叶的80％乙醇浸液置于25℃下超声提取1.5h，重复提取3次，合并滤液；
(3)将滤液旋转蒸发浓缩至浸膏状，再冷冻干燥至固体粉末，即得。
同样通过UPLC-ESI-MS法分别检测得到32个化合物(艾叶水提取物)和37个化合物(艾叶醇提取物)。
实施例3艾叶水提取物及乙醇提取物的制备方法
1、艾叶水提取物的制备
(1)将艾叶叶子(由菊科植物艾的叶经干燥制成)打碎至粉末状，过40目筛后往艾叶粉末中加入12倍量(料液比：g/mL)的水浸泡60min；
(2)将含有艾叶的水浸液置于90℃下水浴回流提取2h，重复提取5次，合并滤液；
(3)将滤液旋转蒸发浓缩至浸膏状，冷冻干燥至固体粉末，即得。
2、艾叶乙醇提取物的制备
(1)将艾叶叶子(由菊科植物艾的叶经干燥制成)打碎至粉末状，过40目筛后往艾叶粉末中加入12倍量(料液比：g/mL)的80％乙醇浸泡60min；
(2)将含有艾叶的80％乙醇浸液置于25℃下超声提取2h，重复提取5次，合并滤液；
(3)将滤液旋转蒸发浓缩至浸膏状，再冷冻干燥至固体粉末，即得。
同样按照UPLC-ESI-MS法分别检测得到32个化合物(艾叶水提取物)和37个化合物(艾叶醇提取物)。
实验例：艾叶水提取物及乙醇提取物的抗幽门螺杆菌作用研究
1、艾叶水提取物及乙醇提取物的抗菌实验
通过微量肉汤稀释法检测实施例1所制得的艾叶水提取物及乙醇提取物对幽门螺杆菌标准菌株(ATCC 43504/ATCC 700392/SS1)和临床菌株(CS01、QYZ-001、QYZ-003、QYZ-004)的最小抑菌浓度(MIC)，同时以克拉霉素作为阳性对照，具体试验方法如下：
(1)称取10.24mg艾叶水提取物及乙醇提取物粉末，加入2mL脑心浸出液溶解混匀，12000rpm离心3min，收集上清液过0.22μm水系滤膜或有机滤膜，得到5.12mg/mL的储备液。取500μL储备液+500μL脑心浸出液按二倍稀释法配制2560、1280、640、320、160、80μg/mL等多个浓度梯度的药液，抗生素则用二甲基亚砜(DMSO)溶解配制成2560μg/mL储备液，使用时稀释成多个浓度梯度(DMSO含量≤1％)。
(2)将步骤(1)配制好的药液吸取50μL加入到96孔板中，每个药物浓度至少设置3个复孔，并设置阴性对照孔(只含药物、不接种菌株)和生长对照孔(不含药物、只接种菌株)。从培养箱取出菌株，用润湿的灭菌棉签刮取菌苔至脑心浸出液中，用含20％FBS的脑心浸出液调节菌悬液浊度为1McF，稀释10倍后，每孔接种50μL于上述含药96孔板中(最终在96孔板中的菌悬液浊度约为1×106CFU/mL)。
(3)将96孔板置于培养箱中，37℃微需氧条件下以150rpm振荡培养72h，最后取出观察结果。当生长对照呈现纽扣状或明显浑浊时结果才可用，肉眼观察澄清孔的最小药物浓度即为MIC，每次实验均以克拉霉素作为阳性对照，MIC值测定重复3次。
(4)根据MIC的测定结果确定MBC，从MIC实验的96孔板中吸取100μL(MBC、2MBC、4MBC、8MBC)的菌液于哥伦比亚血平板(5％羊血)上，微需氧条件下以37℃培养5d，与对照组相比杀死99.9％细菌数量的最小药物浓度为MBC。
结果如表1所示，由表可知：艾叶水提取物对幽门螺杆菌标准菌株和临床菌株均有一定的抑杀作用，对四种耐药临床株的MIC与对标准菌株的MIC相当。当艾叶水提取物的MIC为320μg/mL，且MBC为1～4MIC时，表现为杀菌效应。与艾叶水提取物相比，艾叶乙醇提取物对幽门螺杆菌标准菌株和临床菌株也都具有较强的抑杀作用，其中对耐药临床株QYZ-001、QYZ-004的MIC与对标准菌株的MIC相当。值得注意的是，艾叶乙醇提取物对耐药临床株CS01、QYZ-004的MIC则比对标准菌株的MIC更低，提示其抑菌作用更强。当艾叶乙醇提取物的MIC为160～320μg/mL，且MBC为1～2MIC时，表现为杀菌效应。
表1艾叶水提取物及乙醇提取物体外对多种幽门螺杆菌菌株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)
注：R表示耐药，S表示敏感；MTZ：甲硝唑，CLR：克拉霉素，LEF：左氧氟沙星，AMO：阿莫西林；根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会2019(EUCAST 2019)标准确定耐药折点值。
2、艾叶水提取物及乙醇提取物抗幽门螺杆菌的抑菌曲线
通过测定菌液OD600 nm绘制艾叶水提取物及乙醇提取物的时间-抑菌曲线，具体试验方法如下：
(1)按二倍稀释法配制MIC、1/2MIC、1/4MIC等多个浓度梯度的艾叶水提取物及乙醇提取物药液，并以不含药脑心浸出液作为生长对照组。
(2)以ATCC 43504为代表，从培养箱取出菌株，用润湿的灭菌棉签刮取菌苔至脑心浸出液中，用含20％FBS的脑心浸出液调节菌悬液浊度为1McF。
(3)按照菌悬液：药液/不含药脑心浸出液的体积比为1：1的比例，每孔取2mL接种于6孔板中，放置于三气培养箱中，37℃微需氧环境条件下以150rpm进行振荡培养，在0、8、12、24、28、32、36、48、60、72h吸取100μL培养液于96孔板中测定OD600 nm，吸光度值越大则代表细菌数量越多，药物的抑菌效果越差。
结果如图2所示，由图可知：24～48小时为幽门螺杆菌的快速生长期，在48小时艾叶水提取物及乙醇提取物的抑菌效果与生长对照组相比最显著。艾叶水提取物及乙醇提取物在1/4～1MIC范围内均能有效抑制幽门螺杆菌的生长，抑菌效果呈现剂量依赖性。
3、艾叶水提取物及乙醇提取物抗幽门螺杆菌的杀菌曲线
通过计数不同时间点细菌单菌落的数量绘制艾叶水提取物及乙醇提取物的时间杀菌曲线，具体试验方法如下：
(1)按二倍稀释法配制MIC、1/2MIC、1/4MIC等多个浓度梯度的艾叶水提取物及乙醇提取物药液，并以不含药脑心浸出液作为生长对照组。
(2)以ATCC 43504为代表，从培养箱取出菌株，用润湿的灭菌棉签刮取菌苔至脑心浸出液中，用含20％FBS的脑心浸出液调节菌悬液浊度为1McF。
(3)按照菌悬液：药液/不含药脑心浸出液的体积比为1：1的比例，每孔取1.6mL接种于6孔板中，放置于三气培养箱中，37℃微需氧环境条件下以150rpm进行振荡培养，在0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h分别吸取100μL液体，进行10倍梯度稀释(1:10-1:108)后均匀涂布于哥伦比亚血平板上。再于37℃微需氧条件下培养5天，计数平板上单菌落的数量，结果以Log10(CFU/mL)表示，Log10(CFU/mL)越大则代表细菌数量越多，药物的抑菌效果越差。
结果如图3所示，由图3可知：艾叶水提取物在1MBC、2MBC、4MBC浓度时，细菌的生长受到明显的抑制，但杀菌能力并未表现出严格的剂量依赖性。其中，当艾叶水提取物在4MBC时，36h就能杀死全部的H.pylori；在2MBC时，48h就能杀死全部H.pylori；在1MBC时，60h就能杀死全部H.pylori。艾叶醇提取物在1MBC、2MBC、4MBC浓度时，细菌的生长受到明显的抑制，但杀菌能力并未表现出严格的剂量依赖性。其中，当艾叶醇提取物在4MBC时，36h就能杀死全部的H.pylori；在1～2MBC时，48h就能杀死全部H.pylori。
4、艾叶水提取物及乙醇提取物与抗生素的联用效果
采用棋盘稀释法测定艾叶水提取物及乙醇提取物分别与临床常用于治疗幽门螺杆菌感染的抗生素的联用效应，具体实验步骤如下：
(1)采用二倍稀释法分别制备1/2-16MIC浓度的提取物和抗生素(克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑、阿莫西林)的BHI溶液。
(2)以ATCC 700392、ATCC 43504、SS1为代表，采用微量肉汤棋盘稀释法，按照菌悬液：提取物药液：抗生素的体积比为2：1：1的比例，每孔共取120μL接种于96孔板中，放置于三气培养箱中，37℃微需氧环境下以150rpm振荡培养72h，以肉眼观察明显澄清时的孔为最小联合抑菌浓度，并根据以下公式计算联合抑菌指FICI：
联合抑菌指FICI＝MICDY(combine)/MICDY(alone)+MICantibiotics(combine)/MICantibiotics(alone)。
其中，FICI≤0.5时提示协同效应，0.5<FICI≤1为相加效应，1<FICI≤2为无关效应，FICI>2为拮抗效应。
结果如表2所示，由表2可知：艾叶水提取物及乙醇提取物与临床上用于治疗幽门螺杆菌的感染的抗生素均不产生抑制作用。值得注意的是，在标准株ATCC 700392、ATCC43504和SS1菌株中，艾叶水提取物及乙醇提取物与部分抗生素的联合作用表现为相加，有望替代常规的抗生素三联或四联疗法用于Hp感染的治疗中。
表2艾叶水提取物及乙醇提取物与抗生素联用的最小联合抑菌浓度
注：表中AY-AE为艾叶水提取物，AY-HE为艾叶乙醇提取物。
5、艾叶水提取物及乙醇提取物对幽门螺杆菌的形态学变化影响
采用扫描电镜法观察艾叶水提取物及乙醇提取物对幽门螺杆菌的菌体形态的影响。具体实验步骤如下：
(1)将H.pylori ATCC 43504的混悬液调节至1McF，微需氧条件下培养至对数生长期。然后将1mL的菌液加入到49mL含提取物(MIC浓度)的BHI溶液的培养基中(10％FBS)，并以不含提取物的培养基作为生长对照。
(2)37℃微需氧条件下以150rpm振荡培养10h，8000rpm离心3min后收集细菌沉淀，PBS洗涤3次，加入1mL 2.5％戊二醛固定，并保存在4℃冰箱，再经30％、50％、70％、80％、95％乙醇系列脱水，叔丁醇浸泡置换，干燥，贴台、喷金后用于扫描电镜观察。
结果如图4所示，由图可知：生长对照组的H.pylori整体形态为螺旋状、棒状或杆状，细菌表面光滑，形态饱满，细胞结构完整，未见细胞破损情况；而在艾叶水提取物及乙醇提取物作用10h后，细菌形态发生明显的变化，细胞膜表面出现明显的破损，内容物溢出。
6、艾叶水提取物及乙醇提取物对幽门螺杆菌产生脲酶的影响
评估艾叶水提取物及乙醇提取物对幽门螺杆菌产生脲酶的影响。具体实验步骤如下：
(1)以标准菌ATCC 700392为代表，将H.pylori的混悬液调节至1McF，微需氧条件下培养至对数生长期，然后采用二倍稀释法分别制备1-4MIC浓度的提取物和160μg/mL浓度的脲酶抑制剂(乙酰氧肟酸)的BHI溶液。
(2)按照微量肉汤稀释法，按照菌悬液：提取物药液或阳性对照药脲酶抑制剂的体积比为1：1的比例，每孔共取1mL接种于6孔板中，放置于三气培养箱中，37℃微需氧环境下以150rpm振荡培养24h。
(3)将孵育后的幽门螺杆菌培养物进行离心(8800×g,10分钟，4℃)，并将收集的沉积物用0.02M磷酸盐缓冲液(PBS,pH 6.8)洗涤两次，之后将其重新悬浮在冷缓冲液A(25mM磷酸盐缓冲液，pH 6.8)中，并标准化至OD600＝4.0。
(4)用50μL缓冲液B(25mM磷酸盐缓冲液，pH 6.8,0.2％Tween-20)稀释50μL标准菌悬液，然后将25μL稀释后的菌悬液转移到96孔板的一个孔中，用150μL缓冲液C(25mM磷酸盐缓冲液，pH 6.8,250μM酚红)稀释后，在37℃孵育5min。
(5)将75μL尿素溶液(0.5M)添加到孔中，使用酶标仪测定560nm处的吸光度，每72s测量一次，共30个周期。其中，吸光度随时间的变化率即为脲酶的活性，可用于表示生长对照组幽门螺杆菌的脲酶活性的百分比。实验至少重复3次。
结果如图5所示，由图可知：与ATCC 700392组相比，在艾叶水提取物及乙醇提取物作用24h后，幽门螺杆菌产生脲酶的相对含量明显降低。值得注意的是，艾叶水提取物抑制幽门螺杆菌产生脲酶的活性与阳性对照组乙酰氧肟酸相当。
综上可见，本发明从艾叶干燥叶子中分离得到艾叶水提取物及乙醇提取物，通过实验发现，叶水提取物及乙醇提取物对幽门螺杆菌抗生素敏感株和耐药株均具有很强的抑制杀灭作用，且与部分临床治疗幽门螺杆菌感染的抗生素联合使用表现为相加作用。此外，1/2MIC浓度下能明显抑制幽门螺杆菌产生脲酶，且抑制效果与脲酶抑制剂乙酰氧肟酸相当，有望用于抗幽门螺杆菌产品的制备中。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.艾叶水提取物和/或乙醇提取物制备抗幽门螺杆菌产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述艾叶水提取物和/或乙醇提取物通过破坏幽门螺杆菌的细胞膜和/或抑制幽门螺杆菌产生脲酶而发挥抗幽门螺杆菌作用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述艾叶水提取物的制备方法为包括以下步骤：
S1、将艾叶叶子打碎至粉末状，再往艾叶粉末中加入8-12倍量的水，浸泡30-60min；
S2、将含有艾叶的水浸液置于80-100℃下水浴回流提取0.5-3h，收集滤液；
S3、将滤液蒸发浓缩至浸膏状，再干燥至固体粉末，即得。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述艾叶水提取物的制备方法为包括以下步骤：
S1、将艾叶叶子打碎至粉末状，再往艾叶粉末中加入8-12倍量的80％乙醇溶液，浸泡30-60min；
S2、将含有艾叶的80％乙醇浸液置于20-25℃下超声提取0.5-2h，收集滤液；
S3、将滤液蒸发浓缩至浸膏状，再干燥至固体粉末，即得。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，S1中，所述艾叶叶子为菊科植物艾的叶经干燥制成。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，S1中，将艾叶叶子打碎至粉末状后，过30-50目筛后再浸泡。
7.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，S2中，所述提取共重复2-5次，合并滤液。
8.一种抗幽门螺杆菌的药物，其特征在于，所述幽门螺杆菌为标准株ATCC 700392，所述药物包括艾叶水提取物以及阿莫西林。
9.一种抗幽门螺杆菌的药物，其特征在于，所述幽门螺杆菌为标准株ATCC 43504，所述药物包括艾叶水提取物以及克拉霉素或阿莫西林或甲硝唑，或者包括艾叶乙醇提取物以及克拉霉素或阿莫西林。
10.一种抗幽门螺杆菌的药物，其特征在于，所述幽门螺杆菌为标准株SS1，所述药物包括艾叶水提取物以及克拉霉素或阿莫西林，或者包括艾叶乙醇提取物以及左氧氟沙星或阿莫西林或甲硝唑。
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