CN118165973A - 一种mmlv逆转录酶储存试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种MMLV逆转录酶储存试剂。该储存试剂由二硫苏糖醇、NaCl、EDTA、IGEPAL CA630、甘油和Tris‑HCl制备而成且pH为6～8.5，成分简单，且具有极高的储存稳定性和极高的冻融稳定性，其中在最佳的条件下，可以保证MMLV酶在37℃储存20天，性能依旧稳定，干冰反复冻融50次，酶活力依旧变化不大。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种MMLV逆转录酶储存试剂及其应用。
背景技术
MMLV是目前体外转录技术应用最为广泛的逆转录酶之一，其中影响逆转录酶效果的一个重要因素是RNA能否形成二级结构，当RNA分子具有足够的互补性以形成双链RNA时，可形成此类二级结构，通常的方法为提高其RNA分子溶液温度来减少RNA二级结构的生成，这样就会影响cDNA的生成。为了降低此类因素的影响，通常是提高转录反应温度，这就对逆转录酶的性能要求很高，因此，需要开发一种方法提高逆转录酶的耐高温性，稳定其酶活。
另外，现有的逆转录酶通常以溶液的形式在-20至-80℃的温度下存储且需要避免反复冻融。另外，为了增加其稳定性，通常在储存液中添加硫酸镁、氯化钾、海藻糖、多元醇(如山梨糖醇、木糖醇)等，使得其成分较为复杂且耐高温性能一般，37℃加速稳定性实验下15天时，酶活就会显著下降。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供一种MMLV逆转录酶储存试剂，该试剂成分简单，且具有极高的储存稳定性和冻融稳定性。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种MMLV逆转录酶储存试剂，所述储存试剂由二硫苏糖醇、NaCl、EDTA、IGEPAL CA630、甘油和Tris-HCl制备而成，储存液pH值为6～8.5。
作为一种优选的实施方式，所述储存试剂由0.5mM～20mM二硫苏糖醇、0.1mM～5MNaCl、0.1mM～50mM EDTA、体积比0.01％～20％的IGEPAL CA630、体积比0～50％的甘油和0.1mM～20M的Tris-HCl制备而成，储存液pH值为6～8.5。
作为一种优选的实施方式，所述储存试剂由5mM-10mM二硫苏糖醇、50mM～100mMNaCl、0.1mM-5mMEDTA、体积比0.01％～1％的IGEPAL CA630、体积比10％～50％甘油和0.1mM～1M Tris-HCl制备而成且pH为6～7.5。
本发明还保护上述MMLV逆转录酶储存试剂在保存MMLV酶中的应用。
本发明还提供一种试剂组合物，包含上述的试剂组合物和MMLV酶。
本发明还提供一种扩增试剂盒，所述试剂盒包括上述试剂组合物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明所提供的MMLV逆转录酶稳定性试剂，成分简单，且具有极高的储存稳定性和极高的冻融稳定性，其中在最佳的条件下，可以保证MMLV酶在37℃储存20天，性能依旧稳定，干冰反复冻融50次，酶活力依旧变化不大。
附图说明
图1为本发明实施例1所提供的储存液4℃条件下酶活百分比统计结果；
图2为本发明实施例1所提供的储存液25℃条件下酶活百分比统计结果；
图3为本发明实施例1所提供的储存液37℃条件下酶活百分比统计结果；
图4为本发明对比例1所提供的储存液37℃条件下酶活百分比统计结果；
图5为本发明对比例2(即市售产品)37℃条件下酶活百分比统计结果；
图6为本发明实施例1所提供的储存液干冰冻融下酶活百分比统计结果；
图7为本发明对比例2(即市售产品)干冰冻融下酶活百分比统计结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。在本发明实施例中，所使用的原料均为常规市售产品。
部分试剂及酶活测试条件：
IGEPAL CA630购自ABclonal，货号STB0018。
酶活测试时所用的引物信息如下表1所示，反应程度如下表2所示，反应体系配制如下表3所示：
表1引物探针信息
| 名称 | 检测基因 | 序列 |
| Oligo(dT)18Primer | / | TTTTTTTTTTTTTTTTTT |
表2反应程序
| 温度 | 时间 | 循环数 | 热盖 | 备注 |
| 25℃ | 60min | 1 | 55℃ | 模板制备程序 |
| 37℃ | 10min | 1 | 75℃ | 逆转录反应 |
表3反应体系
探究试验1：储存液pH值对酶活影响
将同一逆转录酶分别以相同的量加入到下表4所示的储存液中进行37℃加速试验，进行逆转录酶酶活测定实验，具体的测试方法如下：
将参考品RT和待测品RT分别进行梯度稀释，与相同量的模板-引物复合物进行反应，另外以1×RT稀释液作为空白对照代替酶同步反应，将λDNA梯度稀释，与RT组同步反应。反应结束后均加入EDTA终止反应，再加入Pico Green工作液进行染色，染色后检测各组荧光值。以λDNA投入量-荧光值关系做散点图，拟合趋势作标准曲线。将RT组荧光值代入标准曲线中，计算得到的杂合链生成量，再代入RT酶活力方程中计算得到酶活力U，进而计算酶比活U/μL。通过参考品确定的校正系数，得到校正酶比活，校正酶比活即为最终结果，结果如下表5所示。
表4不同pH储存液成分表
表5不同pH酶储存液37℃加速实验酶活测定结果
| 37℃放置天数/酶比活(U/μl) | 组合1 | 组合2 | 组合3 | 组合4 | 组合5 |
| 1D | 17.95 | 21.57 | 9.16 | 12.28 | 8.16 |
| 3D | 16.89 | 16.26 | 7.66 | 13.36 | 3.70 |
| 5D | 7.95 | 6.96 | 5.27 | 5.22 | 4.90 |
| 7D | 10.16 | 8.72 | 5.89 | 6.06 | 4.17 |
由上述结果可知：储存液的PH对酶活具有影响，当储存液pH在7.5时，在37℃加速实验中，MMLV逆转录酶酶活降低速率最慢。
探究试验2：DTT投入量对酶活影响
将同一逆转录酶分别以相同的量加入到下表6所示的储存液中进行37℃加速试验，进行逆转录酶酶活测定实验，具体的测试方法如下：
将参考品RT和待测品RT分别进行梯度稀释，与相同量的模板-引物复合物进行反应，另外以1×RT稀释液作为空白对照代替酶同步反应，将λDNA梯度稀释，与RT组同步反应。反应结束后均加入EDTA终止反应，再加入Pico Green工作液进行染色，染色后检测各组荧光值。以λDNA投入量-荧光值关系做散点图，拟合趋势作标准曲线。将RT组荧光值代入标准曲线中，计算得到的杂合链生成量，再代入RT酶活力方程中计算得到酶活力U，进而计算酶比活U/μL。通过参考品确定的校正系数，得到校正酶比活，校正酶比活即为最终结果，结果如下表7所示。
表6不同DTT投入量储存液成分表
表7 DTT投入量储存液37℃加速实验酶活测定结果
由上述结果可知：DTT投入量对酶活具有重要影响，当DTT含量为10mM时，酶活降低速率最慢，RT酶的热稳定性最好。
在上述探究实验的基础上，本发明研发了一种新的MMLV逆转录酶储存试剂，其仅由二硫苏糖醇、NaCl、EDTA、IGEPAL CA630、甘油和Tris-HCl制备而成且采用氢氧化钠或盐酸将其pH调整为6～8.5。下面结合具体实施案例对本发明进行详细的说明：
实施例1
本发明实施例提供了一种MMLV逆转录酶储存试剂，其成分如下：
实施例2
本发明实施例提供了一种MMLV逆转录酶储存试剂，其成分如下：
实施例3
本发明实施例提供了一种MMLV逆转录酶储存试剂，其成分如下：
对比例1
本对比例提供一种MMLV逆转录储存试剂，其与实施例1的区别之处在于，按照实施例1中的各成分添加配制完成后，检测pH为8.5，但不进行pH的调整。
对比例2
市售MMLV酶，购自NEB。
性能检测：
(1)对上述实施例1和对比例1中的储存液储存的MMLV逆转录酶以及市售的MMLV酶进行稳定性试验，具体方法如下：
将上述储存液中的MMLV逆转录酶分别在4℃放置1天、5天、10天、15天，在25℃放置1天、3天、5天、10天、15天、20天，在37℃下放置1天、3天、5天、7天、10天、15天、20天，检测酶活变化。将对比例1中储存液储存的MMLV逆转录酶和对比例2中市售MMLV酶分别在37℃下放置1天、3天、5天、7天、10天、15天、20天(21天)，检测酶活变化。稳定性能达标标准：至少采用5个数据，并R2≥0.99，与对照差值在20％内，参考品RT为同批次制备的但在-20℃条件下储存的逆转录酶(储存液为实施例1、对比例1中的储存液)或市售MMLV酶分装并保存在-20℃条件下的酶。
将参考品RT与待测品RT分别进行梯度稀释，与相同量的模板-引物复合物进行反应，另外以1×RT稀释液作为空白对照代替酶同步反应，将λDNA梯度稀释，与RT组同步反应。反应结束后均加入EDTA终止反应，再加入Pico Green工作液进行染色，染色后检测各组荧光值。以λDNA投入量-荧光值关系做散点图，拟合趋势作标准曲线。将RT组荧光值代入标准曲线中，计算得到的杂合链生成量，再代入RT酶活力方程中计算得到酶活力U，进而计算酶比活U/mL。通过参考品确定的校正系数，得到校正酶比活，校正酶比活即为最终结果。每组实验组与参考品(即图1-5中的对照)比值的百分比，作柱状图进行比较，具体结果如下图1-5所示。
由上述结果可知，实施例1中储存液的酶4℃储存15天、25℃储存20天、37℃储存20天时，酶活性能仍旧稳定，而对比例1中储存液的酶在37℃下储存10天时，酶活即下降大于20％，对比例2中的市售MMLV酶产品在37℃下稳定性测试至15天时，酶活即出现下降，21天时，酶活仅为-20℃存储条件下的23％。
(2)对上述实施例1中的储存液储存的MMLV逆转录酶以及市售的MMLV酶进行反复冻融后进行试验，具体方法如下：
将参考品RT与待测品RT分别进行梯度稀释，与相同量的模板-引物复合物进行反应，另外以1×RT稀释液作为空白对照代替酶同步反应，将λDNA梯度稀释，与RT组同步反应。反应结束后均加入EDTA终止反应，再加入Pico Green工作液进行染色，染色后检测各组荧光值。以λDNA投入量-荧光值关系做散点图，拟合趋势作标准曲线。将RT组荧光值代入标准曲线中，计算得到的杂合链生成量，再代入RT酶活力方程中计算得到酶活力U，进而计算酶比活U/μL。通过参考品确定的校正系数，得到校正酶比活，校正酶比活即为最终结果。每组实验组与参考品(即图6、7中的对照)比值的百分比，作柱状图进行比较，具体结果如下图6、7所示。
稳定性性能达标标准：至少采用5个数据，并并R2≥0.99，与对照差值在20％内，参考品RT为同批次制备的但在-20℃条件下储存的逆转录酶(储存液为实施例1中的储存液)。
由图6、7可知，实施例1中储存液的酶支持干冰反复冻融50次，酶活性能仍旧稳定，而市售MMLV酶产品反复冻融20次酶活下降到75.55％。
发明人进一步经过大量研究表明：由0.5mM～20mM二硫苏糖醇、0.1mM～5M NaCl、0.1mM～50mM EDTA、体积比0.01％～20％的IGEPAL CA630、体积比0～50％的甘油和0.1mM～20M的Tris-HCl制备而成且pH值为6～8.5的储存液，均能保持较好的热稳定性和储存稳定性。
其中当储存液由5mM-10mM二硫苏糖醇、50mM～100mMNaCl、0.1mM-5mMEDTA、体积比0.01％～1％的IGEPAL CA630、体积比10％～50％甘油和0.1mM～1M Tris-HCl制备而成且pH为6～7.5时，其热稳定性和冻融稳定性最佳，可以保证MMLV酶在37℃储存20天，性能依旧稳定，干冰反复冻融50次，酶活力依旧变化不大。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.根据权利要求1所述的MMLV逆转录酶储存试剂，其特征在于，所述储存试剂由二硫苏糖醇、NaCl、EDTA、IGEPAL CA630、甘油和Tris-HCl制备而成，储存液pH值为6～8.5。
2.根据权利要求1所述的MMLV逆转录酶储存试剂，其特征在于，所述储存试剂由0.5mM～20mM二硫苏糖醇、0.1mM～5M NaCl、0.1mM～50mMEDTA 、体积比0.01％～20％的IGEPALCA630、体积比0～50％的甘油和0.1mM～20M的Tris-HCl制备而成，储存液pH值为6～8.5。
3.根据权利要求1所述的MMLV逆转录酶储存试剂，其特征在于，所述储存试剂由5mM-10mM二硫苏糖醇、50mM～100mMNaCl、0.1mM-5mMEDTA、体积比0.01％～1％的IGEPAL CA630、体积比10％～50％甘油和0.1mM～1M Tris-HCl制备而成且pH为6～7.5。
4.权利要求1～3任一项所述的MMLV逆转录酶储存试剂在保存MMLV酶中的应用。
5.一种试剂组合物，其特征在于，包含权利要求1～4任一项所述的试剂组合物和MMLV酶。
6.一种扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求5所述的试剂组合物。
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