CN118147216A - AabHLH5及其编码基因的应用和提高青蒿素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，提供了AabHLH5转录因子或者其编码基因的应用以及生产青蒿素的方法。具体为，AabHLH5转录因子或者其编码基因可调控青蒿素合成的关键酶表达或者调控青蒿素合成；敲除AabHLH5基因能够提高黄花蒿中青蒿素合成的关键酶表达，提高黄花蒿中青蒿的含量。本发明获得敲除AabHLH5基因的转基因黄花蒿蒿中，青蒿素的含量显著提高，为利用转基因黄花蒿大规模生产青蒿素打下了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为植物基因的应用，以及敲除基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法。
背景技术
青蒿素来源于我国传统中药材青蒿的基源植物黄花蒿(Artemisia annua L.)，对治疗疟疾具有十分显著的效果。由于青蒿中青蒿素的含量非常低(占干重的0.01％-1％)，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。虽然现在已经能够人工化学方法合成青蒿素，但由于难度大，产量低，成本高，不具备商业化生产的可行性。与合成生物学半合成法及化学全合成法生产青蒿素相比，利用调控次生代谢手段提高黄花蒿体内青蒿素含量更具经济效益。
通过组织培养及细胞工程来生产青蒿素是一种很有吸引力的方法。然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1％，在芽中最高也只有干重的0.16％，在根中几乎没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性不高。
青蒿素的生物合成途径，主要包括以下步骤：
(1)通过甲羟戊酸途径和非甲羟戊酸两条途径形成法尼基焦磷酸FPP；
(2)在紫穗槐-4,11-二烯合酶(ADS)的作用下，将FPP环化形成青蒿素的中间体紫穗槐-4,11-二烯；
(3)紫穗槐-4,11-二烯在紫穗槐-4,11-二烯氧化酶(CYP71AV1)和细胞色素还原酶、乙醛脱氢酶1(ALDH1)的作用下，被氧化形成青蒿酸；在CYP71AV1)(ALDH1)和青蒿醛双键还原酶(DBR2)与ALDH1的催化下形成二氢青蒿酸；
(4)青蒿酸、二氢青蒿酸通过非酶促光氧化反应形成青蒿素。
利用基因工程技术获得稳定的青蒿素含量较高的黄花蒿新品种是一种比较可行的方法，目前主要是采用过量表达青蒿合成途径中的关键酶法尼基焦磷酸合酶(farnesyldiphosphate synthase，FPS)。
bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子是一种普遍存在于动植物中的转录因子家族,是植物中最大的转录因子家族之一,具有重要的生物学功能。bHLH对于青蒿素合成途径中关键酶的作用目前没有研究。
如果能够找到抑制青蒿素生物合成途径关键酶基因的调控因子，那么通过抑制调控因子的表达，有望提高青蒿素的含量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供转录因子AabHLH5及其编码基因的应用，本发明还提供了一种用基因编辑提高黄花蒿中青蒿素含量的方法。
黄花蒿的转录因子AabHLH5是一种负调控因子，能抑制青蒿素生物合成途径基因DBR2、的表达，从而抑制青蒿素的合成。因此，能够通过敲除AabHLH5来提高植株中青蒿素的含量。AabHLH的氨基酸序列见GenBank:PWA57173.1。
本发明技术方案为，
AabHLH5转录因子或者其编码基因能够调控青蒿素合成的关键酶表达或者调控青蒿素合成。
所述的关键酶包括紫穗槐-4,11-二烯合成酶(ADS)、紫穗槐-4,11-二烯氧化酶(CYP71AV1)、乙醛脱氢酶1(ALDH1)和青蒿醛双键还原酶(DBR2)。
所述的AabHLH5转录因子的氨基酸序列GenBank编号：PWA57173.1。
具体的，AabHLH5转录因子及其编码基因能够抑制青蒿素合成的关键酶表达，而敲除AabHLH5基因能够提高青蒿素合成的关键酶表达。
AabHLH5转录因子具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，优选的，所述AabHLH5转录因子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
SEQ ID No.1：
atgagtattgaaagttttaatgatgaggataaagcaatagttgcatcagtgttagggactaaggcttatgattatttaatatcgagttcggttactaatgaatctttgttaacttcattagctagtaatgatgataatttgcaaaataagctatcagatctagtggagaatgttagtttaggtaactttagttggaattacgccattttttggcagatttcgcggtcgaaaacaggggagttggttttggtttggggggatgggtgttgtagggagcctagagaaggggaggagtttgatattgcgcggatattgagtattcgtctagaagatgagaatcaacagagggtgaagaaacgggttttgcagaaattgcatgttttgtttggggggttggatgaggataattatgcttttggattggatagagttactgatactgagatgttctttttgatatctatgtatttttcctttccgcaagggcaaggtggtcccgggaaatgtttttcgtccggtaagcatttttggtattctgatgctttgaagtcgagttctgattattgtttccggtcgaatttggccaagtctgctggtattcagacggttgttttggttcctactgatggtggggtagttgaggttggttccattcgttctattcctgaaaatatggaccttttacattccgtgagatcatccttttcgttaaagccaaataatggtttagtggctgcggctccattgatgggtaatgcacaattatcgagtgcgttgattggggagagaaaaaacgaaaatggccatggcgggcattttttggatttaggtcttgttgatcatcaacttaaggcgtctaaggttgttcgacaagatatgggcttgagtttgcggcagcctcaatttagggaaaaacttgcagttaggaaagcagaggagccacggtctccttgggaagggtatcctgttactaattcccgactcctggcttcaaatactagaaacagaataactggttcgaattggggacagttcactagtccccaagaggagttccaacttaacagttttaggcctcaaaagtcaccaacagaaatgcaaattgacttcacgggtgctgtttctcgtccttcagtagtttctcggccagttagtggtgactctgaggcatctgatgtggaagcttcaggcagggatgaaagagctgtcctaactggtttaacagatgataaacggcctcgtaaaaggggccgaaagcctgctaacggaagggaagagccgctgaatcatgttgaagcagagagacaaagaagagagaagctgaaccagaggttttatgctttacgagcggttgttcccaacatctcaaagatggacaaagcttcactgttgggagatgcaatcacttacataaccgaccttcagaagaagctcaaggagatggaatccgaaagaagtggttcacacggaagcacttctatggaaacacccaacaacagtaacaacgggtcaagtttagagaaaatcgaaattgaagcagataaagatcaagtaactgttagagtaagctgtccggtagatacacaccctatatctaaggttatccaagcattcaaagaagctcagataagagtcgttgattcaaaaatggctgcagcaaacgacaaagtgtttcacatattcgtcatcaagtctcaaggaccggaacaactgacaaaagagaagttgatggctgtgttttcaaaggaatcaagctcctctttaaactcattaccataa
本发明另一个方案为，提供一种提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，可通过敲除黄花蒿中AabHLH5基因实现。
通过构建AabHLH5基因敲除载体，可以敲除黄花蒿中AabHLH5基因。
具体的，可以利用Cas 9敲除AabHLH5基因，抑制青蒿素负调控因子的表达，从而提高青蒿素含量。也可以通过RNA干扰法敲除黄花蒿中的AabHLH5基因。
AabHLH5基因敲除载体或者含有该载体的微生物可用于提高黄花蒿中青蒿素合成的关键酶表达、提高黄花蒿中青蒿素含量，或者制备青蒿素含量高的黄花蒿，用来生产青蒿素。
本发明的一个优选方式，从黄花蒿中克隆AabHLH5基因部分序列，通过构建Cas9-AabHLH5植物表达载体，用根癌农杆菌介导，利用CRISPR/cas9敲除黄花蒿AabHLH5，通过PCR和RT-PCR检测目的基因AabHLH5-cas9的整合和表达情况，通过高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定黄花蒿中青蒿素含量，筛选获得高产青蒿素的转基因青蒿植株。
敲除了AabHLH5基因的黄花蒿，其中青蒿素含量有显著提高，能够用于生产青蒿素。
从敲除AabHLH5基因的黄花蒿中提取青蒿素，能够实现青蒿素的生产。
本发明的有益效果在于，利用CRISPR/cas9或者其他方法敲除黄花蒿AabHLH5，获得了青蒿素含量显著提高的转基因植株，建立了提高黄花蒿中青蒿素含量的方法。所获得的转基因黄花蒿植株中青蒿素的含量最高可达到11.2mg/g DW(即干重的1.12％)，是非转化普通青蒿(8mg/g DW，即干重的0.8％)的1.4倍。因此，本发明为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源，为利用转基因黄花蒿大规模生产青蒿素奠定坚实的基础，具有重要意义和应用前景。
附图说明
图1为转基因黄花蒿中AabHLH5的表达量；(a)过表达AabHLH5的转基因黄花蒿(OE)；(b)敲除AabHLH5的转基因黄花蒿(cas9)。
图2为转基因黄花蒿中青蒿素合成途径基因表达，(a)过表达AabHLH5的转基因黄花蒿(OE)；(b)敲除AabHLH5的转基因黄花蒿(cas9)。
图3为转基因黄花蒿中青蒿素含量，(a)过表达AabHLH5的转基因黄花蒿(OE)；(b)敲除AabHLH5的转基因黄花蒿(cas9)。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1青蒿AabHLH5基因片段的克隆
1.青蒿基因组总RNA的提取
剪取2-3周大小的黄花蒿幼苗叶片提取RNA，提前在1.5mLRNA-free的EP管中放入两颗RNA-free的小钢珠，将大约100mg新鲜的离体叶片放入1.5mLRNA-free的EP管中，立即将其置于液氮中速冻，以免RNA降解。将液氮速冻后的样品放入冷冻破碎仪中破碎(50Hz,30s)，向破碎成粉末的样品中加入1mLTransZol Up，用涡旋仪充分振荡混匀，室温静置5min。再加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀30s，室温孵育3min，然后离心15min(12000rpm,4℃)。用移液枪小心地吸取上层水相，移入新的1.5mLRNA-free的EP管中，加入等体积无水乙醇，轻轻颠倒混匀。将混匀后的液体移入离心柱，分两次移入，室温12000rpm离心30s，弃去流出液体。向离心柱中加入500μLCB9，室温12000rpm离心30s，弃流出液，此步骤重复一次。向离心柱中加入500μLWB9，室温12000rpm离心30s，弃流出液，此步骤重复一次，为了彻底去除乙醇，将离心柱室温12000rpm空离2min，弃去收集柱，把离心柱放入新的1.5mLRNA-free的EP管中，向离心柱的膜中央加入50μLRNA-free water，室温静置1min，12000rpm离心2min，即可得到洗脱的RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
2.青蒿AabHLH5基因片段的克隆
将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL(AMV)反转录获得第一链cDNA,根据所述青蒿AabHLH5基因的编码序列，设计扩增出含有部分AabHLH5编码序列(SEQ ID No.1的1bp到300bp)的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入接头序列(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由苏州金唯智技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的部分序列与GenBank中所报道的青蒿AabHLH5基因的编码序列(SEQ ID No.1的1bp到300bp)一致。
本实施例采用基因克隆方法从青蒿中获得序列正确的青蒿中青蒿负调控基因AabHLH5的部分编码序列，为通过Cas9敲除AabHLH5基因的表达从而提高青蒿素含量提供了基因片段。
实施例2黄花蒿敲除AabHLH5载体构建
选取AabHLH5编码区不跨越内含子的AGG前的20bp(831bp-850bp)作为cas9识别的靶标序列构建到cas9-1300载体上，以BsaⅠ为酶切连接位点设计引物AabHLH5-cas9-F和AabHLH5-cas9-R。引物各取25μL混合，放入PCR仪退火形成双链，退火程序为：
98℃5min，94℃1min，90℃1min，85℃1min，80℃1min，75℃1min，70℃1min，65℃1min，60℃1min，55℃1min，50℃1min，45℃1min，40℃1min，35℃1min，30℃1min，25℃1min，20℃1min，15℃1min，10℃5min，4℃∞，单循环。
cas9-1300载体用BsaⅠ酶切，37℃反应1h；直接挂柱回收。使用T4 DNA连接酶连接退火产物和切开的cas9-1300载体。室温连接30min，转化大肠杆菌，PCR菌检鉴定阳性转化子送测序，将测序正确的菌株小摇抽提质粒，质粒保存于-20℃备用。
实施例3根癌农杆菌介导AabHLH5-cas9基因遗传转化青蒿获得转基因青蒿植株
1.黄花蒿无菌苗的种植
取适量春化后的黄花蒿种子于1.5mLEP管中，向装有种子的EP管中加入1mL75％乙醇，振荡消毒2min。将75％乙醇吸出，再加入10％NaClO(含有1％tritonX-100)1mL,振荡除菌10min。将10％NaClO吸出，加入无菌水1mL,振荡清洗5min，将水吸出，再用无菌水重复清洗2-3次，彻底洗去消毒液。将最后一次清洗的无菌水吸除干净，再加入1mL无菌水悬浮种子，用剪开的枪头吸取悬浮的种子，将种子均匀铺撒于MS平板，吸去平板上多余的水，用封口膜封口。将平板置于25℃、8h光照、16h黑暗的环境中培养，种子萌发后即可获得黄花蒿无菌苗。
2.黄花蒿的遗传转化
从-80℃冰箱取出冻存的农杆菌，冰上融化，取20μL菌液加入1mL三抗培养基(LB+ka+rif+gent)，置于28℃摇床200rpm过夜活化，然后用适量三抗培养基按5％接菌量扩大培养。扩大培养后离心(3000rpm,10min)，用液体MS重悬菌体并稀释菌液为OD 600＝0.6，向菌液中添加100μmol/L的AS(乙酰丁香酮)，再将侵染菌液置于28℃摇床200rpm混匀30min。将2～3周大的黄花蒿无菌幼苗叶片沿叶柄处剪下，平铺在含MS固体培养基的培养皿上，向培养皿中加入农杆菌侵染液15mL，轻微摇晃培养皿，使叶片浸没在侵染液中，侵染20min，然后吸干培养皿中的液体，并用无菌纸巾吸干叶片上残留的侵染液，最后将叶片转移到另一个MS固体培养基平板上，28℃避光培养48h。将侵染后的黄花蒿叶片移到长芽的筛选培养基上(MS+6-BA1 mg/L+NAA0.1mg/L+羧苄西林200mg/L+特美汀200mg/L)培养2周，培养条件为25℃，16h/8h的光照/黑暗。每2周更换一次长芽培养基，经过3～4次继代，长出的小芽便可发育成小植株，再将小植株转移到生根培养基(1/2MS+羧苄西林200mg/L+特美汀200mg/L)，大约2～4周植株便可生根，生根后再培养一个月可将植株种植在穴盘中，穴盘中加入了营养土(蛭石：泥炭土：珍珠岩＝5:1:0.5)，放入人工气候培养箱继续培养，即得到转基因黄花蒿。
3.转基因青蒿植株的PCR检测
取少许转基因植株的叶片于1.5mL EP管中，提前在管中加入两颗灭菌钢珠，立即将装有叶片的EP管放入液氮中速冻，将液氮速冻后的样品放入冷冻破碎仪中破碎(50Hz,30s)。向破碎好的样品中加入预热的GP1缓冲液700μL(已加入0.1％β-巯基乙醇)，迅速颠倒混匀，放入水浴锅中65℃水浴20min，水浴过程中颠倒EP管数次。再加入700μL氯仿，充分混匀后离心(12000rpm,5min),将上层水相移入新的EP管，加入700μL GP2缓冲液，充分混匀。将混匀后的液体移入吸附柱CB3，离心(12000rpm,30s)，弃废液。向吸附柱内加入500μLGD缓冲液，离心(12000rpm,30s)，弃废液。再向吸附柱内加入600μLPW漂洗液，离心(12000rpm,30s)，弃废液，重复此步骤一次，空离(12000rpm,2min)，彻底清除漂洗液。将吸附柱放入新的EP管，开盖室温静置2min，向吸附膜中间滴加50μL TE洗脱缓冲液，室温静置2min，离心(12000rpm,2min)，即获得转基因植物DNA。
以转基因植物DNA为模板做PCR鉴定，引物为基因的JD-bHLH5-F与载体引物RBC48A，鉴定体系如下：
PCR产物跑胶，根据条带大小确定阳性植株。
用pBI121为载体，采用CaMV 35S启动子构建AabHLH5基因的过表达载体(OE)，并用根癌农杆菌介导转化青蒿，其方法为本领域常规操作。
实施例4QRT-PCR检测转基因青蒿植株中AabHLH5基因的表达
1.引物的设计和合成
取阳性转基因黄花蒿植株从上至下数第四片叶片，提取RNA，剪取2-3周大小的黄花蒿幼苗叶片提取RNA，提前在1.5mL RNA-free的EP管中放入两颗RNA-free的小钢珠，将大约100mg新鲜的离体叶片放入1.5mL RNA-free的EP管中，立即将其置于液氮中速冻，以免RNA降解。将液氮速冻后的样品放入冷冻破碎仪中破碎(50Hz,30s)，向破碎成粉末的样品中加入1mLTransZol Up，用涡旋仪充分振荡混匀，室温静置5min。再加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀30s，室温孵育3min，然后离心15min(12000rpm,4℃)。用移液枪小心地吸取上层水相，移入新的1.5mL RNA-free的EP管中，加入等体积无水乙醇，轻轻颠倒混匀。将混匀后的液体移入离心柱，分两次移入，室温12000rpm离心30s，弃去流出液体。向离心柱中加入500μLCB9，室温12000rpm离心30s，弃流出液，此步骤重复一次。向离心柱中加入500μLWB9，室温12000rpm离心30s，弃流出液，此步骤重复一次，为了彻底去除乙醇，将离心柱室温12000rpm空离2min，弃去收集柱，把离心柱放入新的1.5mLRNA-free的EP管中，向离心柱的膜中央加入50μLRNA-free water，室温静置1min，12000rpm离心2min，即可得到洗脱的RNA，将RNA存于-80℃保存。
将RNA总量定为1μg进行反转录，用Takara的反转录试剂盒将提取的黄花蒿RNA反转录成cDNA，反转录体系如下
将上述试剂混匀，65℃反应5min，迅速转移至冰上冷却，再添加以下试剂。
混匀上述反应液，按以下PCR程序完成反转录。反转录得到的cDNA存于-20℃，用作后续基因克隆的PCR反应模板。
反转录程序：30℃10min，42℃100min，95℃5min，4℃∞。
设计相关基因Q-PCR引物，以稀释30倍的反转录得到的cDNA为模板，进行定量PCR检测，Q-PCR体系如下：
Q-PCR程序如下：95℃30sec；95℃15sec，60℃30sec，95℃15sec，40cycles；60℃1min；95℃1sec。
AaActin-qRT-F(SEQ ID No.2)ATGAGTATTGAAAGTTTTA
AaActin-qRT-R(SEQ ID No.3)CGCTCGGTAAGGATCTTCATCA
JD-cas9-AabHLH5-F(SEQ ID No.4)GCCAAGTCTGCTGGTAT
JD-cas9-AabHLH5-R(SEQ ID No.5)ACTAGTGAACTGTCCCCAAT
本实施例采用qRT-PCR技术测定转基因青蒿中负调控因子AabHLH5基因表达量的高低，同时检测青蒿素合成途径基因的表达量的高低可以初步筛选出可能高产青蒿素的青蒿植株。
AabHLH5表达结果如图1所示，图1(a)为过表达AabHLH5的转基因黄花蒿(OE)，图1(b)为敲除AabHLH5的转基因黄花蒿(cas9)，CK为非转基因黄花蒿。由图1可见，过表达AabHLH5的转基因黄花蒿和敲除AabHLH5的转基因黄花蒿构建成功。
过表达AabHLH5的转基因青蒿和敲除AabHLH5的转基因黄花蒿中，ADS、ALDH1、CYP71AV1和DBR2的表达量如图2所示，图2(a)为过表达AabHLH5的转基因青蒿(OE)，图2(b)为敲除AabHLH5的转基因黄花蒿(cas9)，CK为非转基因黄花蒿。由图2可知，过表达AabHLH5的转基因黄花蒿中，与非转基因青蒿相比，ADS、ALDH1、CYP71AV1和DBR2的表达量有不同程度的降低；敲除AabHLH5的转基因黄花蒿中，ADS、ALDH1、CYP71AV1和DBR2的表达量具有提高，并且ADS、CYP71AV1表达量提高尤为显著。
实施例5利用HPLC-ELSD测定转基因黄花蒿中青蒿素含量
1.HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制
HPLC：采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymmetryShieldTM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)，流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液(65：35)，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度(AUFS＝1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。
ELSD：采用water alliance 2420系统,蒸发光散射检测器漂移管温度40℃,放大系数(gain)为7，载气压力5bar；
精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于-20℃备用。
本发明中流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液(65：35)时，青蒿素的保留时间为5.1min,峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。
2.样品的制备和青蒿素含量的测定
青蒿素的提取过程基于Van Nieuwerburgh et al.(2006)中报道的方法:取少量新鲜的青蒿叶片(1-2g鲜重)，于50mL试管中将其浸没在10mL氯仿中摇荡1min，将浸出液倒入新的试管中使氯仿挥发完全，取3mL无水乙醇充分溶解提取物，用于HPLC检测。同时，氯仿提取后的叶片收集放入60℃烘箱进行烘干，称重(计算青蒿叶片的干重)。
采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20μL，根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。
结果显示，敲除Cas9-AabHLH5基因，能够显著提高黄花蒿中青蒿素含量。敲除AabHLH5基因黄花蒿中青蒿素的含量最高可达到11.2mg/g DW(即干重的1.12％)，是非转化普通黄花蒿CK(8mg/g DW，即干重的0.8％)的1.4倍。结果如图3(b)。图3(a)显示，AabHLH5基因过表达的黄花蒿(OE)中，与非转化普通黄花蒿CK相比，青蒿素的含量约4.2-6.5mg/g DW，含量明显降低。
Claims (8)
1.AabHLH5转录因子或者其编码基因在调控青蒿素合成的关键酶表达或者调控青蒿素合成方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的关键酶包括紫穗槐-4,11-二烯合成酶、紫穗槐-4,11-二烯氧化酶、乙醛脱氢酶1和青蒿醛双键还原酶中的任一种。
3.AabHLH5基因敲除载体或者含有该载体的微生物在提高黄花蒿中青蒿素合成的关键酶表达、提高黄花蒿中青蒿素含量或者制备青蒿素含量高的黄花蒿方面的应用。
4.AabHLH5基因敲除载体或者含有该载体的微生物在制备青蒿素方面的应用。
5.一种提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，敲除黄花蒿中的AabHLH5基因。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用RNA干扰法或者CRISPR/cas9法敲除黄花蒿中的AabHLH5基因。
7.敲除了AabHLH5基因的黄花蒿在制备青蒿素方面的应用。
8.一种生产青蒿素的方法，其特征在于，从敲除了AabHLH5基因的黄花蒿中提取青蒿素。
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