CN118147088A - 一种铜绿假单胞菌噬菌体组合物、噬菌体制剂及其应用 - Google Patents
一种铜绿假单胞菌噬菌体组合物、噬菌体制剂及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种铜绿假单胞菌噬菌体组合物、噬菌体制剂及其应用。铜绿假单胞菌噬菌体组合物包括噬菌体vB_Pae‑SZP1、噬菌体vB_Pae‑SZP8和噬菌体vB_Pae‑SZP17。所述噬菌体vB_Pae‑SZP1、所述噬菌体vB_Pae‑SZP8和所述噬菌体vB_Pae‑SZP17均保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号分别为：GDMCC No：64256‑B1、GDMCC No：64257‑B1和GDMCC No：64258‑B1。本发明的噬菌体宿主谱广、感染能力强，对温度和酸碱耐受范围广，噬菌体组合物较之于单个噬菌体具有更广的宿主谱，对液体培养和生物被膜中的铜绿假单胞菌有良好的杀菌作用，能与不同类型抗生素协同，更好的杀灭铜绿假单胞菌。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌噬菌体组合物、噬菌体制剂及其应用。
背景技术
铜绿假单胞菌是一种广泛分布于自然环境，如土壤、水体和植物表面等的细菌。然而，它也是医院获得性感染的主要致病菌之一。铜绿假单胞菌能够引发多种感染，包括但不限于呼吸道感染、尿路感染、创伤感染等，对于免疫系统较弱的患者，如免疫抑制患者和危重病人，构成了严重的健康威胁。
此外，铜绿假单胞菌也在养殖业中扮演着重要的病原体角色。感染铜绿假单胞菌可能导致鱼类、虾、贝类和水貂等水生动物的疾病和损失，从而影响了养殖业的可持续性和经济效益。铜绿假单胞菌还可引起家禽、家畜和宠物的各种急慢性感染，如中耳炎、乳腺炎、子宫内膜炎、出血性肺炎、泌尿道和生殖道感染等，这些感染可能发展为致死性的腹泻、菌血症和败血症等疾病，严重危害了动物的健康，同时也对动物生产行业造成了巨大的经济损失。
铜绿假单胞菌对多种抗生素表现出天然的耐药性，并且在感染部位常常形成生物被膜，这种生物被膜可保护细菌免受外部不利因素，如免疫和抗生素的压力。相较于浮游细菌，生物被膜内的细菌通常能够耐受高达10至1000倍浓度的抗生素处理，这显著降低了传统抗生素治疗的有效性，为临床治疗带来了巨大的挑战。在这一背景下，迫切需要探索有效的策略以减少铜绿假单胞菌带来的危害。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种铜绿假单胞菌噬菌体组合物、噬菌体制剂及其应用，旨在寻求有效的策略以减少铜绿假单胞菌带来的危害。
为实现上述目的，本发明第一方面提出一种铜绿假单胞菌噬菌体组合物，包括：噬菌体vB_Pae-SZP1、噬菌体vB_Pae-SZP8和噬菌体vB_Pae-SZP17，分类命名分别为Pseudomonas phage vB_Pae-SZP1、 Pseudomonas phage vB_Pae-SZP8 和 Pseudomonasphage vB_Pae-SZP17，所述噬菌体vB_Pae-SZP1、所述噬菌体vB_Pae-SZP8和所述噬菌体vB_Pae-SZP17均保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期：2024年1月10日，保藏编号分别为：GDMCC No：64256-B1、GDMCC No：64257-B1和GDMCC No：64258-B1。
可选地，所述噬菌体vB_Pae-SZP1的效价为107-1011PFU/mL；和/或，
所述噬菌体vB_Pae-SZP8的效价为107-1011PFU/mL；和/或，
所述噬菌体vB_Pae-SZP17的效价为107-1011PFU/mL。
可选地，所述噬菌体vB_Pae-SZP1的感染复数为0.00001-10；和/或，
所述噬菌体vB_Pae-SZP8的感染复数为0.00001-10；和/或，
所述噬菌体vB_Pae-SZP17的感染复数为0.00001-10。
本发明第二方面提供一种噬菌体制剂，包括第一方面所述的铜绿假单胞菌噬菌体组合物。
可选地，所述噬菌体制剂的pH值为5-10。
可选地，所述噬菌体制剂中，所述噬菌体vB_Pae-SZP1、所述噬菌体vB_Pae-SZP8和所述噬菌体vB_Pae-SZP17的活体数量之比为(1-3):(1-3):(1-3)；和/或，
所述噬菌体制剂中，所述噬菌体vB_Pae-SZP1、所述噬菌体vB_Pae-SZP8和所述噬菌体vB_Pae-SZP17的含量均大于或等于108pfu/mL。
可选地，所述噬菌体制剂还包括药学上可接受的辅料，其中，所述药学上可接受的辅料包括稳定剂、分散剂、溶剂和填料中的一种或几种。
可选地，所述噬菌体制剂包括组合物制剂或环境消毒剂，其中，所述噬菌体组合物制剂的剂型为液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂。
本发明第三方面提供一种噬菌体制剂的应用，用于裂解铜绿假单胞菌。
本发明第四方面提供一种药物组合物，包括第一方面的铜绿假单胞菌噬菌体组合物。
本发明的技术方案中，铜绿假单胞菌噬菌体组合物中，噬菌体vB_Pae-SZP1、噬菌体vB_Pae-SZP8和噬菌体vB_Pae-SZP1感染能力强，能快速杀死培养基中的宿主菌，温度、酸碱耐受范围广，对铜绿假单胞菌的增殖有良好的抑制、杀灭作用。噬菌体组合物较之于单个噬菌体具有更广的宿主谱，对液体培养和生物被膜中的铜绿假单胞菌有良好的杀菌作用，能与不同类型抗生素协同，更好的杀灭铜绿假单胞菌。本发明的噬菌体组合物可用于制备喷洒剂和注射剂等噬菌体制剂，可用于杀灭环境中铜绿假单胞菌和用于治疗机体铜绿假单胞菌引起的感染，对多重耐药铜绿假单胞菌有很好的预防和治疗作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为噬菌体vB_Pae-SZP1、噬菌体vB_Pae-SZP8和噬菌体vB_Pae-SZP17的噬菌斑形态和电镜图；
图2为噬菌体vB_Pae-SZP1、噬菌体vB_Pae-SZP8和噬菌体vB_Pae-SZP17基因组分析图；
图3为噬菌体vB_Pae-SZP1、噬菌体vB_Pae-SZP8和噬菌体vB_Pae-SZP17最佳感染复数图；
图4为噬菌体vB_Pae-SZP1、噬菌体vB_Pae-SZP8和噬菌体vB_Pae-SZP17热稳定性图；
图5为噬菌体vB_Pae-SZP1、噬菌体vB_Pae-SZP8和噬菌体vB_Pae-SZP17 pH稳定性图；
图6为噬菌体vB_Pae-SZP1、噬菌体vB_Pae-SZP8和噬菌体vB_Pae-SZP17及噬菌体组合物宿主谱；
图7为噬菌体组合物对铜绿假单胞菌的杀菌效果时效图；
图8为噬菌体组合物对铜绿假单胞菌生物被膜清除效果图；
图9为噬菌体组合物与不同抗生素联合杀灭铜绿假单胞菌效果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
铜绿假单胞菌对多种抗生素表现出天然的耐药性，并且在感染部位常常形成生物被膜，这种生物被膜可保护细菌免受外部不利因素，如免疫和抗生素的压力。相较于浮游细菌，生物被膜内的细菌通常能够耐受高达10至1000倍浓度的抗生素处理，这显著降低了传统抗生素治疗的有效性，为临床治疗带来了巨大的挑战。
在这一背景下，迫切需要探索新的、创新的治疗策略。噬菌体疗法作为一种新兴的治疗方式，引起了广泛的关注。噬菌体是一类专门针对细菌的病毒，具有高度的宿主特异性。它们通过感染细菌、复制并增殖的过程，导致细菌破裂和死亡。与传统抗生素不同，噬菌体疗法在杀灭细菌的同时，对机体正常微生物群几乎没有影响，因此减少了可能引发的副作用和抗药性风险。这种特性使得噬菌体疗法在治疗耐药性细菌感染方面具有巨大的潜力。
然而，单一噬菌体治疗可能会面临多种问题，包括细菌对单一噬菌体产生抗药性、多重细菌株的共存以及噬菌体的稳定性和适应性等挑战。因此，迫切需要探索有效的策略以减少铜绿假单胞菌带来的危害，以提高治疗的特异性、有效性和适应性。
鉴于此，本发明提出本发明第一方面提出一种铜绿假单胞菌噬菌体组合物，包括噬菌体vB_Pae-SZP1、噬菌体vB_Pae-SZP8和噬菌体vB_Pae-SZP17，分类命名分别为Pseudomonas phage vB_Pae-SZP1、 Pseudomonas phage vB_Pae-SZP8 和 Pseudomonasphage vB_Pae-SZP17，所述噬菌体vB_Pae-SZP1、所述噬菌体vB_Pae-SZP8和所述噬菌体vB_Pae-SZP17均保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期：2024年1月10日，保藏编号分别为：GDMCC No：64256-B1、GDMCC No：64257-B1和GDMCC No：64258-B1。
铜绿假单胞菌噬菌体组合物中，噬菌体vB_Pae-SZP1、噬菌体vB_Pae-SZP8和噬菌体vB_Pae-SZP1感染能力强，能快速杀死培养基中的宿主菌，温度、酸碱耐受范围广，对铜绿假单胞菌的增殖有良好的抑制、杀灭作用。对感染多重耐药铜绿假单胞菌的机体（人和动物）提供了解决方案。
在一些实施例中，所述噬菌体vB_Pae-SZP1的效价为107-1011PFU/mL；
所述噬菌体vB_Pae-SZP8的效价为107-1011PFU/mL；所述噬菌体vB_Pae-SZP17的效价为107-1011PFU/mL。
在一些实施例中，所述噬菌体vB_Pae-SZP1的感染复数为0.00001-10；所述噬菌体vB_Pae-SZP8的感染复数为0.00001-10；所述噬菌体vB_Pae-SZP17的感染复数为0.00001-10。即本申请中，噬菌体vB_Pae-SZP1、噬菌体vB_Pae-SZP8和噬菌体vB_Pae-SZP17在感染复数0.00001-10均有相当的感染能力，在4℃-50℃处理90分钟后，仍然能保持95%以上效价，在pH=4-pH=11处理90分钟后，仍然能保持95%以上效价。
本发明第二方面提供一种噬菌体制剂，包括第一方面所述的铜绿假单胞菌噬菌体组合物。由上述三种噬菌体复配形成的噬菌体混合制剂，不仅裂解能力更强，裂解谱更宽，应用范围更广，弥补单一噬菌体应用时宿主谱窄的局限性。
可选地，所述噬菌体制剂的pH值为5-10。
可选地，所述噬菌体制剂中，所述噬菌体vB_Pae-SZP1、所述噬菌体vB_Pae-SZP8和所述噬菌体vB_Pae-SZP17的活体数量之比为(1-3):(1-3):(1-3)；和/或，
所述噬菌体制剂中，所述噬菌体vB_Pae-SZP1、所述噬菌体vB_Pae-SZP8和所述噬菌体vB_Pae-SZP17的含量均大于或等于108pfu/mL。
可选地，所述噬菌体制剂还包括药学上可接受的辅料，其中，所述药学上可接受的辅料包括稳定剂、分散剂、溶剂和填料中的一种或几种。
所述噬菌体制剂可与β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类和多粘菌素抗生素具有协同作用，用于机体感染铜绿假单胞菌后的联合治疗。
所述噬菌体制剂可以经由雾化吸入、静脉内、动脉内、腹膜内、导液管、皮肤、口服、外用和经直肠途径来施用本发明的噬菌体制剂。
可选地，所述噬菌体制剂包括组合物制剂或环境消毒剂，其中，所述噬菌体组合物制剂的剂型为液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂。经喷雾、注射或口服等方式用于预防或治疗铜绿假单胞菌对人体或养殖动物中的感染，或用于改善环境，降低介质表面铜绿假单胞菌含量。
需要说明的是，本发明提供的噬菌体组合物制剂，可以以上述噬菌体组合物作为唯一活性成分。还可以含有除本发明的噬菌体以外的其他噬菌体，其与本发明的噬菌体复配使用，可以得到与之相当或者更好的防治铜绿假单胞菌的效果。
所述噬菌体组合物制剂可与β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类和多粘菌素抗生素具有协同作用，用于机体感染铜绿假单胞菌后的联合治疗。
需要说明的是，本发明提供的环境消毒剂中，每种噬菌体的浓度不低于108pfu/mL，所述环境消毒剂还包含其他用于抑制或消灭环境中铜绿假单胞菌的活性成分。
本发明还提供上述环境消毒剂在医院、社康、养老院、养殖场环境和物体表面消毒中的应用。所述环境消毒剂的应用方法包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、医疗设施、养殖业设施、公共及私人设施或其他环境表面进行消毒去污，可以有效控制铜绿假单胞菌的活性和生长。
本发明第三方面提供一种噬菌体制剂的应用，用于裂解铜绿假单胞菌。
本发明第四方面提供一种药物组合物，包括第一方面的铜绿假单胞菌噬菌体组合物。
由上述技术方案可知，本发明与现有技术相比至少具备以下优点和积极效果：
（1）本发明的噬菌体组合物中，噬菌体vB_Pae-SZP1、噬菌体vB_Pae-SZP8和噬菌体vB_Pae-SZP17的基因组上均不携带毒力基因、耐药基因和融源基因，不会引起毒力基因和耐药基因的传播，使用安全。
（2）铜绿假单胞菌噬菌体vB_Pae-SZP1、噬菌体vB_Pae-SZP8和噬菌体vB_Pae-SZP1感染能力强，能快速杀死培养基中的宿主菌，温度、酸碱耐受范围广，可制成喷洒剂和注射剂，对铜绿假单胞菌的增殖有良好的抑制、杀灭作用，对感染多重耐药铜绿假单胞菌的机体（人和动物）有很好的治疗和保护作用。
（3）铜绿假单胞菌噬菌体vB_Pae-SZP1、噬菌体vB_Pae-SZP8和噬菌体vB_Pae-SZP17组合物具有宽谱性，可以杀灭90%耐药铜绿假单胞菌，噬菌体组合物具有增强噬菌体治疗效果优势。
（4）本发明的噬菌体组合物在107pfu/mL-109pfu/mL效价可有效清除铜绿假单胞菌生物被膜，能够实现将噬菌体在临床上的应用，克服铜绿假单胞菌耐药性和生物被膜的治疗难题。
（5）本发明的噬菌体组合物在109pfu/mL效价时，与β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类和多粘菌素抗生素具有协同作用，可以快速杀灭耐药铜绿假单胞菌，解决单一使用噬菌体或抗生素治疗效果不理想的问题。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明：
实施例1
（1）铜绿假单胞菌噬菌体噬菌体vB_Pae-SZP1、噬菌体vB_Pae-SZP8和噬菌体vB_Pae-SZP17扩增浓缩
噬菌体vB_Pae-SZP1、噬菌体vB_Pae-SZP8和噬菌体vB_Pae-SZP17均为从深圳市第三人民医院污水中分离获得。取出-80℃保存的铜绿假单胞菌PAO1，LB无抗平板划线，37 ℃静置培养16 h后，挑单菌落到10 mL LB培养基中，37℃ 200 rpm培养过夜；取过夜菌液1:20转接至新鲜10 mL LB中，37℃ 200 rpm培养2 h，加入vB_Pae-SZP1、vB_Pae-SZP8或vB_Pae-SZP17噬菌体溶液；噬菌体与宿主菌数量的比值约为（0.001-10:1），本实施例中采用0.1:1，37℃ 150 rpm培养2 h至菌液变清，获得噬菌体扩增液；将扩增后的噬菌体粗悬液用聚乙二醇（PEG8000）进行浓缩，具体步骤如下：富集液中加入终浓度为1M的NaCl固体，搅拌溶解，冰浴1 h促进噬菌体与PAO1细菌碎片分离；11000 g离心10 min去除细胞碎片，上清中加入10%PEG（v/v）后4℃静置过夜；11 000 g于4℃离心10 min后去除上清，沉淀用适量 SM buffer轻柔重悬，用0.22 μm滤膜过滤除菌，获得噬菌体浓缩液。
（2）噬菌体的形态学观察
使用磷钨酸（Phosphotungstic acid，PTA）负染法通过TEM观察噬菌体。将噬菌体浓缩颗粒滴在Formvar碳支持膜上，静置10 min干燥，用纸除去多余液体。滴加10 μL PTA于膜上染色10 min，滴加去离子水洗去多余PTA，用纸除去多余液体，再次干燥样品10 min。在TEM下观察噬菌体的形态。结果如图1所示，噬菌体vB_Pae-SZP1的形态为：头部为24面体结构，头部长度为40-50 nm，尾部长度为10-20nm，属于短尾噬菌体，根据噬菌体最新分类与命名，通过全基因组序列分析，噬菌体vB_Pae-SZP1属于autographiviridae噬菌体科。噬菌体vB_Pae-SZP8的形态为：头部为24面体结构，头部长度为50-60 nm，尾部长为20-30 nm，属于短尾噬菌体，根据噬菌体最新分类与命名，通过全基因组序列分析，噬菌体vB_Pae-SZP8属于autographiviridae噬菌体科。噬菌体vB_Pae-SZP17的形态为：头部为24面体结构，头部长度为45-55 nm，噬菌体尾部长度为30-40 nm，属于短尾噬菌体，根据噬菌体最新分类与命名，通过全基因组序列分析，噬菌体vB_Pae-SZP17属于autographiviridae噬菌体科。
（3）噬菌体基因组提取和测序
取1 mL噬菌体浓缩液，加入终浓度为6 U/ mL的 DNase I（PROMEGA）及终浓度为50μg/mL的RNase（TAKARA）除去外源核酸，37 °C反应1 h。再加入20 μL 2M ZnCl2，颠倒混匀后37 °C反应5 min，10000g离心1 min后弃上清。用TIANGEN病毒基因组提取试剂盒提取，最后用20 μL无菌水溶解核酸，送诺禾致源测序公司进行全基因组测序。结果如图2所示。
由图2可知，噬菌体vB_Pae-SZP1、vB_Pae-SZP8和vB_Pae-SZP17基因组全长分别为42937bp、42797bp和43475bp，不携带耐药基因、毒力基因和融源基因。
（4）噬菌体最佳感染复数测定
将噬菌体1 mL（效价109pfu/mL）用LB肉汤进行10倍梯度稀释，按照MOI值为10、1、0.1、0 .01、0 .001、0.0001、0.00001，分别取每个梯度0 .1 mL稀释液和0 .1mL的宿主菌增殖液（106pfu/mL）加至5 mL的LB肉汤中，37℃ 200 rpm振荡培养4h。将培养液10000 rpm离心5 min，采用双层平板法测其效价，效价最高的组合为其最佳感染复数。结果如图3所示。
由图3可知，噬菌体vB_Pae-SZP1、vB_Pae-SZP8和vB_Pae-SZP17从MOI 10至0.00001均有很强的裂解能力。
（5）噬菌体热稳定性的测定
取无菌2 mL EP管数支，分别添加噬菌体500 μL，置于4℃、25℃、30℃、37℃、50℃、60℃、70℃和80℃孵育2 h，使用双层琼脂法测定不同温度孵育后噬菌体效价。结果如图4所示。
由图4可知，在50℃处理2h，噬菌体的效价与4℃相当，表明噬菌体vB_Pae-SZP1、vB_Pae-SZP8和vB_Pae-SZP17具有极好的耐高温性。
（6） 噬菌体pH稳定性的测定
用HCl和NaOH调节LB液体培养基酸碱度，得到pH=3-12的LB溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤。分别取100 μL噬菌体与900 μL不同pH的LB液体培养基混合，置于37℃水浴锅孵育2h，使用双层琼脂法测定不同pH下噬菌体的效价。结果如图5所示。
由图5可知，噬菌体vB_Pae-SZP1、vB_Pae-SZP8和vB_Pae-SZP17在pH＝4-11范围内作用2 h，仍保持高效价，表明这三株噬菌体的酸碱耐受范围较宽。
（7）噬菌体宿主谱的测定
此实施例共检测100株深圳市第三人民医院临床耐药铜绿假单胞菌，取150 μL对数生长的临床耐药铜绿假单胞菌于15 mL离心管中，倒入15 mL 55℃的0.5% Agar LB， 混匀后倒入立即倒入方形板，在生物安全柜内开盖静置凝固。将方形板和保存有深圳市第三人民医院噬菌体库的96孔板置于自动移液工作站中进行高通量移液。随后将菌板于37℃培养8 h，使用菌落成像仪对筛选结果进行拍照记录。结果如图6所示。
由图6可知，噬菌体vB_Pae-SZP1、vB_Pae-SZP8和vB_Pae-SZP17分别可以对34%、38%和68%临床耐药铜绿假单胞菌形成透亮噬菌斑，对49%、44%和23%临床耐药铜绿假单胞菌形成模糊噬菌斑，三种噬菌体混合物对78%临床耐药铜绿假单胞菌形成透亮噬菌斑，对12%临床耐药铜绿假单胞菌形成模糊噬菌斑，表明三株噬菌体组合物有很好的广谱性。
（8） 噬菌体组合物液体培养基中杀菌测定
将噬菌体vB_Pae-SZP1、vB_Pae-SZP8和vB_Pae-SZP17按数量比（pfu/mL）1:1:1混合，使组合物噬菌体效价为1010pfu/mL，于4℃保存备用。将对数期的铜绿假单胞菌PAO1调整OD600≈0.2，分别添入数量比（pfu/mL）为1:1:1的200 μL 噬菌体组合物（107pfu/mL、108pfu/mL和109pfu/mL），并在37 °C下静止培养，每30 min测定OD600。结果如图7所示。
由图7可知，三株铜绿假单胞菌噬菌体组合物在不同感染复数条件下，可以快速杀灭铜绿假单胞菌PAO1。
（9） 噬菌体组合物对生物被膜清除能力测定
将 200 μL LB铜绿假单胞菌PAO1悬液（107cfu/ mL）添加到96孔板中，在37 °C静置培养24 h和48 h，形成 24 h和48 h成熟生物膜。用PBS 洗涤三次后，分别添入数量比（pfu/mL）为1:1:1的噬菌体vB_Pae-SZP1、vB_Pae-SZP8和vB_Pae-SZP17（107pfu/ mL、108pfu/ ml和109pfu/ mL）组成的噬菌体组合物200 μL ，并在37 °C下静置处理4 h。加入等体积LB作为阴性对照。生物膜清除率=100%×（实验组OD595-对照组OD595）/对照组OD595。结果如图8所示。
由图8可知，三株铜绿假单胞菌噬菌体组合物不同效价条件下，对铜绿假单胞菌PAO1生物被膜有很好的清除效果。
（10）噬菌体组合物与不同抗生素联合杀菌测定
设置4个组别，分别为阴性对照组（PBS）、抗生素组、噬菌体组合物组（噬菌体vB_Pae-SZP1、vB_Pae-SZP8和vB_Pae-SZP17按数量比1:1:1混合）和抗生素+噬菌体组合物组，进行杀菌测定，其中铜绿假单胞菌PAO1细菌数量为106pfu/mL，抗生素为β-内酰胺类抗生素亚胺培南（Imipenem，Imp，最小抑菌浓度为8 μg/mL）、氟喹诺酮类抗生素环丙沙星（Ciprofloxacin，Cip，最小抑菌浓度为0.5 μg/mL）、氨基糖苷类抗生素阿美卡星（Amikacin，Amk，最小抑菌浓度为4 μg/mL）和多肽类抗生素多粘菌素B（Polymyxin B，PolyB，最小抑菌浓度为1 μg/mL），终浓度为最小抑菌浓度的1/2，噬菌体数量为109pfu/mL。加样后，于37℃孵育，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、16 h和24 h取50 μL10倍梯度稀释后，测定铜绿假单胞菌PAO1细菌数量。结果如图9所示。
由图9可知，三株铜绿假单胞菌噬菌体组合物可以协同亚胺培南（β-内酰胺类抗生素）、环丙沙星（氟喹诺酮类抗生素）、阿美卡星（氨基糖苷类抗生素）和多粘菌素杀灭铜绿假单胞菌PAO1。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种铜绿假单胞菌噬菌体组合物，其特征在于，包括：噬菌体vB_Pae-SZP1、噬菌体vB_Pae-SZP8和噬菌体vB_Pae-SZP17，分类命名分别为Pseudomonas phage vB_Pae-SZP1、Pseudomonas phage vB_Pae-SZP8 和 Pseudomonas phage vB_Pae-SZP17，所述噬菌体vB_Pae-SZP1、所述噬菌体vB_Pae-SZP8和所述噬菌体vB_Pae-SZP17均保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号分别为：GDMCC No：64256-B1、GDMCC No：64257-B1和GDMCC No：64258-B1。
2.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌噬菌体组合物，其特征在于，所述噬菌体vB_Pae-SZP1的效价为107-1011PFU/mL；和/或，
所述噬菌体vB_Pae-SZP8的效价为107-1011PFU/mL；和/或，
所述噬菌体vB_Pae-SZP17的效价为107-1011PFU/mL。
3.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌噬菌体组合物，其特征在于，所述噬菌体vB_Pae-SZP1的感染复数为0.00001-10；和/或，
所述噬菌体vB_Pae-SZP8的感染复数为0.00001-10；和/或，
所述噬菌体vB_Pae-SZP17的感染复数为0.00001-10。
4.一种噬菌体制剂，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的铜绿假单胞菌噬菌体组合物。
5.如权利要求4所述的噬菌体制剂，其特征在于，所述噬菌体制剂的pH值为5-10。
6.如权利要求4所述的噬菌体制剂，其特征在于，所述噬菌体制剂中，所述噬菌体vB_Pae-SZP1、所述噬菌体vB_Pae-SZP8和所述噬菌体vB_Pae-SZP17的活体数量之比为(1-3):(1-3):(1-3)；和/或，
所述噬菌体制剂中，所述噬菌体vB_Pae-SZP1、所述噬菌体vB_Pae-SZP8和所述噬菌体vB_Pae-SZP17的含量均大于或等于108 pfu/mL。
7.如权利要求4所述的噬菌体制剂，其特征在于，所述噬菌体制剂还包括药学上可接受的辅料，其中，所述药学上可接受的辅料包括稳定剂、分散剂、溶剂和填料中的一种或几种。
8.如权利要求4所述的噬菌体制剂，其特征在于，所述噬菌体制剂包括组合物制剂或环境消毒剂，其中，所述噬菌体组合物制剂的剂型为液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂。
9.一种如权利要求4-8任一项所述的噬菌体制剂的应用，其特征在于，用于裂解铜绿假单胞菌。
10.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的铜绿假单胞菌噬菌体组合物。
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| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |