CN118146355A - 一种重组胶原蛋白及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种重组胶原蛋白及其制备方法、应用，涉及生物工程技术领域，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如i或ii所示：i、氨基酸序列包括如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列；ii、在i中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有人胶原蛋白活性的由i衍生的蛋白质。本发明提供的重组胶原蛋白源自天然胶原蛋白氨基酸序列，与人体高度同源，不会引起人体免疫排斥反应，具有优良的生物学性能，且能够实现工业化量产。此外，本发明提供的重组胶原蛋白相对于现有技术中同来产品具有更好的促进胶原蛋白分泌的功效。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种重组胶原蛋白及其制备方法、应用。
背景技术
胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多的一类功能性蛋白质，约占蛋白质总量的25％～35％，是细胞外基质的重要组成成分。胶原蛋白主要存在于人体皮肤、骨骼、眼睛、牙齿、肌腱、内脏(包括心、胃、肠、血管)等部位，其功能是维持皮肤和组织器官的形态和结构，也是修复各损伤组织的重要原料物质。
生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织，获取胶原蛋白。但通过以上方式获取的胶原蛋白本身已经丧失了原本的生物学活性，此外，动物源胶原蛋白存在病毒隐患及免疫排斥的风险，在组织工程产品及医药产品应用方面，安全性风险较高。
随着合成生物学技术的快速发展，国内外一些研究机构通过将人胶原蛋白基因重组于底盘细胞内，通过高密度发酵及分离纯化的方式获取的蛋白，称为重组胶原蛋白。但是通常重组胶原蛋白技术壁垒高，生产的成本过高，表达产量低，无法满足工业化量产的需求。因此市场上急需一种氨基酸序列与人体高度同源，具有优良的生物学特性，且能够实现工业化量产的胶原蛋白材料。
发明内容
本发明解决的技术问题在于如何提供一种重组胶原蛋白，与人体高度同源，具有优良生物学性能，且能够实现工业化量产。
为解决上述问题，本发明提供了一种重组胶原蛋白，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如i或ii所示：
i、氨基酸序列包括如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列；
ii、在i中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有人胶原蛋白活性的由i衍生的蛋白质。
优选地，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如i或ii所示：
i、氨基酸序列由如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列直接相连形成；
ii、在i中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有人胶原蛋白活性的由i衍生的蛋白质。
本发明提供的重组胶原蛋白源自天然胶原蛋白氨基酸序列，与人体高度同源，不会引起人体免疫排斥反应，具有优良的生物学性能，且能够实现工业化量产。此外，本发明提供的重组胶原蛋白相对于现有技术中同来产品具有更好的促进胶原蛋白分泌的功效。
本发明还提供了一种用于编码如上所述的重组胶原蛋白的多核苷酸。
本发明还提供了一种重组表达载体，包括如上所述的多核苷酸。
本发明还提供了一种宿主细胞，包括如上所述的多核苷酸或如上所述的重组表达载体。
本发明提供的多核苷酸、重组表达载体、宿主细胞相对于现有技术的有益效果，与上述重组胶原蛋白基本一致，在此不再赘述。
本发明还提供了一种重组胶原蛋白的制备方法，用于制备如上所述的重组胶原蛋白，包括以下步骤：
步骤S1、根据如上所述的重组胶原蛋白的氨基酸序列，获取多核苷酸；
步骤S2、采用所述多核苷酸构建重组表达载体；
步骤S3、将所述重组表达载体转入目标细胞中，筛选阳性转化子，得到宿主细胞；
步骤S4、培养所述宿主细胞，使所述宿主细胞表达目标蛋白；
步骤S5、对所述目标蛋白进行分离纯化，得到所述重组胶原蛋白。
优选地，所述步骤S4中，采用组成表达或诱导表达中的至少一种方法使所述宿主细胞表达所述目标蛋白。
优选地，所述步骤S5中，所述分离纯化包括盐析、色谱层析、亲和层析、酸碱沉淀和膜分离中的至少一种。
本发明提供的重组胶原蛋白的制备方法能够高效地制得上述重组胶原蛋白，适于大规模生产，为重组胶原蛋白的应用提供了有效的制备方法。
如上所述的重组胶原蛋白在制备止血产品或抗菌产品中的应用。
本发明提供的应用相对于现有技术的有益效果，与上述重组胶原蛋白基本一致，在此不再赘述。
本发明还提供了如上所述的重组胶原蛋白在制备化妆品、食品、组织工程产品或药物中的应用。
优选地，所述重组胶原蛋白用作促胶原分泌剂在制备化妆品、食品、组织工程产品或药物中的应用。
本发明提供的重组胶原蛋白的应用相对于现有技术的有益效果，与上述重组胶原蛋白基本一致，在此不再赘述。
附图说明
图1为本发明实施例中重组胶原蛋白的纯化电泳图；
图2为本发明实施例中不同重组胶原蛋白促Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白分泌的分析对比图；
图3为本发明实施例中不同重组胶原蛋白促Ⅳ型胶原蛋白分泌的分析对比图；
图4为本发明实施例中不同重组胶原蛋白促Ⅶ型胶原蛋白分泌的分析对比图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。另外，术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。如无特殊说明的，材料、设备、试剂均为市售。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、质量分数的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细说明。
I型胶原蛋白主要存在于皮肤、骨骼、肌肉和其他结缔组织中，起到维持组织结构完整性和弹性的关键作用。此外，I型胶原蛋白还参与细胞的黏附、迁移和信号传导等生理过程，对于维持机体正常功能至关重要。I型胶原蛋白在皮肤中起着保湿和弹性维持的重要作用。随着年龄的增长，人体内的胶原蛋白逐渐减少，导致皮肤干燥和弹性下降，从而出现皮肤衰老的迹象。研究发现，改善I型胶原蛋白的合成和功能可以延缓皮肤衰老的过程。
IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、串珠蛋白聚糖、巢蛋白、XVII型胶原蛋白是基底膜核心组成成分。基底膜是在所有上皮细胞、内皮细胞、外周神经轴突、脂肪细胞和肌肉细胞下面的特化细胞外基质。IV型胶原蛋白主要以不溶性网络存在于基底膜中，IV型胶原蛋白网络对于维持基底膜结构是必不可少的，并为其他胶原蛋白提供支架，对于维护基底膜屏障结构具有至关重要的作用，可修护皮肤屏障，延缓衰老。
本发明实施例提供了一种重组胶原蛋白，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如i或ii所示：
i、氨基酸序列包括如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列；
ii、在i中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有人胶原蛋白活性的由i衍生的蛋白质。
具体地，SEQ ID No.1的氨基酸序列筛选自人Ⅳ型胶原蛋白α2链，包括79个氨基酸，具体的氨基酸序列为：GPPGERGDPGEANTLPGPVGVPGQKG DQGAPGERGPPGSPGLQGFPGITPPSNISGAPGDKGAPGIFGLKGYRGPPGP P；SEQ ID No.2的氨基酸序列筛选自人Ⅰ型胶原蛋白α1链，包括249个氨基酸，具体的氨基酸序列为：GERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGP AGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGARGERGFPGERGVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGER。
本发明实施例提供的重组胶原蛋白源自天然胶原蛋白氨基酸序列，与人体高度同源，不会引起人体免疫排斥反应，具有优良的生物学性能，且能够实现工业化量产。此外，本发明提供的重组胶原蛋白相对于现有技术中同来产品具有更好的促进胶原蛋白分泌的功效。
此外，本发明实施例提供的重组胶原蛋白包括了人Ⅳ型胶原蛋白和人Ⅰ型胶原蛋白中筛选的活性片段，能够与人体胶原蛋白高级结构具有精确的对准皮肤基底膜或真皮层。
具体地，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如i或ii所示：
i、氨基酸序列由如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列直接相连形成；
ii、在i中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有人胶原蛋白活性的由i衍生的蛋白质。
如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列直接相连，形成了重组胶原蛋白，即，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示：GPPGERGDPGEANTLPGPVG VPGQKGDQGAPGERGPPGSPGLQGFPGITPPSNISGAPGDKGAPGIFGLKGYRGPPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGARGERGFPGERGVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGER。
需要说明的是，本发明实施例提供的重组胶原蛋白命名为C4C1。
在一些实施例中，所述重组胶原蛋白还包括纯化标签。
为了方便将制得的重组胶原蛋白分离和纯化，可以在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列基础上增加纯化标签。
示例性地，所述纯化标签可以为His标签、Flag标签或c-Myc标签。
本发明实施例还提供了一种用于编码如上所述的重组胶原蛋白的多核苷酸。
本发明实施例还提供了一种重组表达载体，包括如上所述的多核苷酸。
本发明实施例还提供了一种宿主细胞，包括如上所述的多核苷酸或如上所述的重组表达载体。
具体地，宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，包括：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等细菌宿主，或毕赤酵母、酿酒酵母、动物细胞、植物细胞等真核宿主，优选大肠杆菌及毕赤酵母，更优选大肠杆菌。
本发明实施例提供的多核苷酸、重组表达载体、宿主细胞相对于现有技术的有益效果，与上述重组胶原蛋白基本一致，在此不再赘述。
本发明还提供实施例了一种重组胶原蛋白的制备方法，用于制备如上所述的重组胶原蛋白，包括以下步骤：
步骤S1、根据如上所述的重组胶原蛋白的氨基酸序列，获取多核苷酸；
步骤S2、采用所述多核苷酸构建重组表达载体；
步骤S3、将所述重组表达载体转入目标细胞中，筛选阳性转化子，得到宿主细胞；
步骤S4、培养所述宿主细胞，使所述宿主细胞表达目标蛋白；
步骤S5、对所述目标蛋白进行分离纯化，得到所述重组胶原蛋白。
其中，步骤S4中，采用组成表达或诱导表达中的至少一种方法使所述宿主细胞表达所述目标蛋白。
步骤S5中，所述分离纯化包括盐析、色谱层析、亲和层析、酸碱沉淀和膜分离中的至少一种。
本发明实施例提供的重组胶原蛋白的制备方法能够高效地制得上述重组胶原蛋白，适于大规模生产，为重组胶原蛋白的应用提供了有效的制备方法。
本发明还提供了如上所述的重组胶原蛋白在制备化妆品、食品、组织工程产品或药物中的应用。
在一些实施例中，所述重组胶原蛋白用作促胶原分泌剂在制备化妆品、食品、组织工程产品或药物中的应用。
本发明实施例提供的应用相对于现有技术的有益效果，与上述重组胶原蛋白基本一致，在此不再赘述。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1重组胶原蛋白在大肠杆菌表达系统中的制备
1、宿主细胞的构建
将如SEQ ID No.3的氨基酸序列根据大肠杆菌密码子偏好优化后，通过全基因合成的方式合成后，直接连接在pKK223-3质粒上即得pKK223－3－C4C1质粒，将pKK223－3－C4C1以热击的方式转入DE3感受态细胞，涂布抗性平板，挑取平板上的单菌落即为表达菌株(构建得到宿主细胞)；
2、目标蛋白的表达
挑取经菌落PCR验证构建成功的单菌落，接种至装有3.0mL LB培养基试管中(添加氨苄抗生素)，37℃培养10-12h，获得种子液；
将培养好的种子液以1％的接种量接入100mL LB液体培养基中，37℃，220rpm培养，待OD600达到0.8-1.0时，添加终浓度为0.15mM的IPTG，降温至28℃诱导，诱导10-12h后，8000rpm离心10min收集菌体；
以pH 6.0的PBS缓冲液配制15％(g湿菌体/mL PBS)的菌悬液，800bar条件下高压匀浆5min，8000rpm离心10min收集离心上清液即为粗蛋白溶液；
3、目标蛋白分离纯化
将离心收集的粗蛋白上清液中加入终浓度为60％的NaCl，搅拌溶解后常温下静置2h，8000rpm离心10min后收集上清液。将收集的上清液经10KD超滤膜浓缩脱盐；
将浓缩脱盐后的蛋白上清液用磷酸调整PH至6.5，阳离子交换树脂上样，通过0.5MNaCl洗脱后获得目标蛋白；
将收集的目标蛋白溶液经10KD超滤膜脱盐后，然后置于-80℃冰箱预冻4h，然后转入真空冷冻干燥机中进行冻干，48h后收集冻干后蛋白，即为重组胶原蛋白C4C1。
实施例2重组胶原蛋白的发酵产量、分子量及纯度检测
通过实施例1制备的重组胶原蛋白C4C1发酵罐产量BCA检测结果高达24.6g/L。取实施例1中纯化冻干后的蛋白5mg，加入10mL超纯水中，完全溶解后，取10μL样品溶液进行SDS-PAGE。蛋白电泳结果如图1所示，图1中从左至右的样品分别为Marker、粗蛋白溶液、流穿样1、流穿样2、纯化后的目标蛋白，制备的重组胶原蛋白C4C1分子量约为30KD，与理论分子量基本一致，蛋白纯度在95％以上。
对比例1对照重组胶原蛋白的制备
采用实施例1中所述的制备方法，分别设计了SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2的氨基酸序列，进行密码子优化后获得目的基因，全基因合成目的基因后采用同样的穿梭质粒及宿主菌进行蛋白序列的表达，最终得到C4C1-1蛋白和C4C1-2蛋白。
实验例不同重组胶原蛋白的促胶原分泌功效分析
将人皮肤成纤维细胞-HSF细胞培养至对数期，以1×104个/mL接种于6孔板中，每孔2ml，37℃，5％ CO2培养条件下培养；待细胞长至80％时开始实验；实验组分为正常组(NC)、模型组(BC)、C4C1组、对照蛋白C4C1-1组、对照蛋白C4C1-2组和人IV型胶原蛋白组(IV型)，其中人IV型胶原蛋白(IV型)购买自Sigma-Aldrich，货号CC076；
吸弃培养基，对照组不进行造模处理，直接加入培养基；模型组和样品组加入1mLPBS，在紫外老化箱中进行UVA照射30min(10mW/cm2，365nm)，照射结束后，吸出PBS缓冲液，模型组加入培养基，实验组分别加入含0.2mg/mL胶原蛋白样品的培养基，每组3个复孔，37℃，5％ CO2培养条件下培养；
培养24h后，PBS清洗细胞两遍，加入4％多聚甲醛固定细胞15min，进行I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、VII型胶原蛋白免疫荧光染色处理，采集图片并进行数据分析；
图2-4分别为不同重组胶原蛋白促Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白分泌、促Ⅳ型胶原蛋白分泌以及促Ⅶ型胶原蛋白分泌的分析对比图。图2-4中，红色荧光表示Ⅰ型胶原蛋白，绿色荧光表示Ⅲ型胶原蛋白，蓝色表示细胞核；红色越多说明对Ⅰ型胶原蛋白的促生效果越好，绿色越多说明对Ⅲ型胶原蛋白的促生效果越好。
如图2-4所示，重组胶原蛋白C4C1(即本发明实施例提供的重组胶原蛋白)对I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、VII型胶原蛋白均有促分泌的功效，且促胶原分泌能力显著优于对照蛋白C4C1-1和C4C1-2，同时也优于人IV型胶原蛋白，具有良好的保湿、修护和抗衰老的功效。
虽然本发明披露如上，但本发明的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种重组胶原蛋白，其特征在于，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如i或ii所示：
i、氨基酸序列包括如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列；
ii、在i中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有人胶原蛋白活性的由i衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白，其特征在于，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如i或ii所示：
i、氨基酸序列由如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的序列直接相连形成；
ii、在i中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有人胶原蛋白活性的由i衍生的蛋白质。
3.一种用于编码如权利要求1或2所述的重组胶原蛋白的多核苷酸。
4.一种重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求3所述的多核苷酸或如权利要求4所述的重组表达载体。
6.一种重组胶原蛋白的制备方法，用于制备如权利要求1或2所述的重组胶原蛋白，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1、根据权利要求1或2任一项所述的重组胶原蛋白的氨基酸序列，获取多核苷酸；
步骤S2、采用所述多核苷酸构建重组表达载体；
步骤S3、将所述重组表达载体转入目标细胞中，筛选阳性转化子，得到宿主细胞；
步骤S4、培养所述宿主细胞，使所述宿主细胞表达目标蛋白；
步骤S5、对所述目标蛋白进行分离纯化，得到所述重组胶原蛋白。
7.根据权利要求6所述的重组胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，采用组成表达或诱导表达中的至少一种方法使所述宿主细胞表达所述目标蛋白。
8.根据权利要求6所述的重组胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中，所述分离纯化包括盐析、色谱层析、亲和层析、酸碱沉淀和膜分离中的至少一种。
9.如权利要求1或2所述的重组胶原蛋白在制备化妆品、食品、组织工程产品或药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述重组胶原蛋白用作促胶原分泌剂在制备化妆品、食品、组织工程产品或药物中的应用。
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