CN118126108A - 一种靶抗原人工脂滴表面展示系统及其制备方法和应用 - Google Patents
一种靶抗原人工脂滴表面展示系统及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118126108A CN118126108A CN202410094258.6A CN202410094258A CN118126108A CN 118126108 A CN118126108 A CN 118126108A CN 202410094258 A CN202410094258 A CN 202410094258A CN 118126108 A CN118126108 A CN 118126108A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- target antigen
- artificial lipid
- display system
- lipid droplet
- surface display
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 104
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 104
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 104
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 title claims abstract description 69
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 claims abstract description 8
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 18
- UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N Tributyrin Chemical compound CCCC(=O)OCC(OC(=O)CCC)COC(=O)CCC UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 229920003213 poly(N-isopropyl acrylamide) Polymers 0.000 claims description 12
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 claims description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 6
- WGJCBBASTRWVJL-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine-2-thione Chemical compound SC1=NCCS1 WGJCBBASTRWVJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 5
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 5
- 102000007317 Farnesyltranstransferase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010007508 Farnesyltranstransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013404 Geranyltranstransferase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010026318 Geranyltranstransferase Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 claims 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 abstract description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 10
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 6
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 abstract description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 238000002702 ribosome display Methods 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000002824 mRNA display Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M potassium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[K+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 GUUBJKMBDULZTE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000002390 cell membrane structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 235000013341 fat substitute Nutrition 0.000 description 1
- 239000003778 fat substitute Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004719 natural immunity Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000013823 prenylation Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种靶抗原人工脂滴表面展示系统及其制备方法和应用。本发明第一方面提供一种靶抗原人工脂滴表面展示系统，包括人工脂滴和双亲性靶抗原分子；人工脂滴在亲水介质中装配成具有亲水表面和疏水性内核的颗粒；双亲性靶抗原分子为疏水基团修饰的靶抗原分子；靶抗原分子展示在人工脂滴的亲水表面。本发明使用靶抗原人工脂滴表面展示系统取代链霉亲和素磁珠，有助于降低抗体筛选过程中与靶抗原分子的非特异性绑定，提高目标抗体的特异性和筛选效率；并且，本发明提供的展示系统极大程度上模拟了病毒空间结构，但不含基因遗传物质，更加安全有效。
Description
技术领域
本发明涉及一种靶抗原人工脂滴表面展示系统及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。
背景技术
抗体是人和动物体内自然免疫和获得性免疫由B细胞和浆细胞产生的一种免疫球蛋白，是机体对抗病原体和异物入侵的主要免疫防御分子，可以应用于药物研发、疾病诊断、治疗等方向，为医学研究和临床应用提供精准、高效的解决方案。随着抗体药的需求越来越大，抗体筛选技术的发展也是日新月异，目前应用较普遍的有杂交瘤技术、抗体文库筛选技术、纳米抗体技术和转基因小鼠抗体筛选技术。其中抗体文库筛选又分为噬菌体展示技术、酵母表面展示技术、核糖体展示技术和mRNA展示技术。
核糖体展示技术是一种在体外核糖体表面展示抗体，通过筛选与挑选获得具有特异性好、亲和力高的抗体的方法。由于不需要转化，所以可以对库含量极大(1014)的抗体基因文库进行筛选；能够筛选的目标抗原分子十分广泛，包括有毒蛋白、DNA、RNA等；具有较高的筛选效率和准确率。其过程主要为体外转录翻译得到的“mRNA-核糖体-抗体”复合体与连接有特定抗原的链霉亲和素磁珠孵育，并通过磁力分离洗涤筛选获得目标抗体。
虽然核糖体展示技术具有诸多优点，但是也存在一定局限性。由于链霉亲和素磁珠具有强的吸附性，且表面固定有链霉亲和素，所以展示在核糖体表面的抗体与结合在磁珠表面目标抗原作用过程中，会发生非特异性结合。这种非特异性绑定会出现假阳性情况，从而严重影响抗体筛选的准确性，导致一些不与目标蛋白相互作用的抗体被错误地筛选出来，进而影响筛选效率以及抗体特异性。
发明内容
本发明提供一种靶抗原人工脂滴表面展示系统及其制备方法，用于提高抗体与抗原结合过程中的特异性，提高抗体的筛选效率。
本发明还提供上述靶抗原人工脂滴表面展示系统在抗体展示技术中的应用。
本发明第一方面提供一种靶抗原人工脂滴表面展示系统，包括人工脂滴和双亲性靶抗原分子；
所述人工脂滴在亲水介质中装配成具有亲水表面和疏水性内核的颗粒；
所述双亲性靶抗原分子为疏水基团修饰的靶抗原分子；
所述靶抗原分子展示在所述人工脂滴的亲水表面。
在本发明的方案中，如图1所示，人工脂滴1是由表面活性剂在亲水介质中形成的，由于表面活性剂具有亲水端和疏水端，其在亲水介质中可以形成类似细胞膜结构的颗粒，并且亲水端位于颗粒表面形成亲水表面，疏水端位于颗粒内部形成疏水内核；双亲性靶抗原分子2是对靶抗原分子进行疏水化修饰后形成的，亲水性的靶抗原分子21展示在人工脂滴1的亲水表面，以便于抗体筛选过程中与抗体的结合，疏水端位于人工脂滴1内部，使靶抗原分子21紧密的展示在人工脂滴1表面。
本发明使用靶抗原人工脂滴表面展示系统取代链霉亲和素磁珠，由于人工脂滴具有强流动性、疏水性内核(不易黏连杂蛋白)、电中性等性质从而可以减少筛选过程中的非特异性绑定，提高目标抗体的特异性和筛选效率；并且，本发明提供的展示系统极大程度上模拟了病毒空间结构，但不含基因遗传物质，更加安全有效；此外，本发明提供的展示系统所展示的抗原分子可被回收，更加经济环保；而且可展示不同种类抗原，高通量筛选得到高亲和力抗体。此外，本领域技术人员可以通过控制人工脂滴的大小、表面展示的抗原数量以及类型，精确控制其结构、功能等方面参数，因而具备较高的可控性。
在本发明的方案中，靶抗原分子可以是多肽、蛋白质、多糖、脂类、核酸等物质。进一步地，靶抗原分子为多肽或蛋白质。
在本发明的方案中，亲水介质可以为纯水。
在一种具体实施方式中，使用巯基噻唑啉或N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)对靶抗原分子进行修饰后得到双亲性靶抗原分子。具体地，使用巯基噻唑啉或N-羟基丁二酰亚胺对聚(N-异丙基丙烯酰胺)进行活化，将活化后的聚(N-异丙基丙烯酰胺)与靶抗原分子混合并进行反应后得到。
进一步地，活化后的聚(N-异丙基丙烯酰胺)与靶抗原分子的摩尔比为2:1，控制反应体系的pH为8.0，在4℃下反应12h后，加入赖氨酸终止反应。
进一步地，聚(N-异丙基丙烯酰胺)的数均分子量为8000～15000g/mol，通过控制聚合物的分子量，有助于平衡抗原-聚合物的亲疏水性，从而使抗原分子能更好的展示在人工脂滴表面。
在另一种具体实施方式中，对靶抗原分子进行异戊烯基化修饰得到双亲性靶抗原分子；具体地，可以使用法尼基转移酶(FTase)或香叶基转移酶(GGTase)对靶抗原分子进行修饰，以在靶抗原分子的C端形成疏水基团。
在一种具体实施方式中，所述人工脂滴由甘油三丁酸酯在亲水介质中装配得到；甘油三丁酸酯的密度大于水，有利于装配形成的人工脂滴沉至水介质的底部，有助于人工脂滴的富集，以及避免人工脂滴悬浮到空气和水的界面使抗原分子失活。
在一种具体实施方式中，为了便于磁性富集和展示系统的回收，所述人工脂滴在亲水介质中装配成的颗粒的内部包裹有磁性纳米颗粒3，磁性纳米颗粒3疏水性较强，可以分散在甘油三丁酸酯形成的人工脂滴的疏水内部。
进一步地，所述磁性纳米颗粒可以为Fe3O4纳米颗粒。磁性纳米颗粒的质量为甘油三丁酸酯质量的1％-2％。
本发明第二方面提供上述任一所述靶抗原人工脂滴表面展示系统的制备方法，包括如下步骤：
对靶抗原分子进行疏水基团修饰，得到双亲性靶抗原分子；
将表面活性剂与双亲性靶抗原分子混合并分散在亲水介质中，形成所述靶抗原人工脂滴表面展示系统。
在一种具体实施方式中，对靶抗原分子进行疏水基团修饰，得到双亲性靶抗原分子，具体包括如下步骤：
使用巯基噻唑啉或N-羟基丁二酰亚胺对聚(N-异丙基丙烯酰胺)进行活化，将活化后的聚(N-异丙基丙烯酰胺)与靶抗原分子混合并进行反应，反应结束后加入赖氨酸终止反应，得到双亲性靶抗原分子。
进一步地，活化后的聚(N-异丙基丙烯酰胺)与靶抗原分子的摩尔比为2:1，控制反应体系的pH为8.0，在4℃下反应12h后，加入赖氨酸终止反应。
接着，将甘油三丁酸酯和双亲性靶抗原分子分散在亲水介质中，形成所述靶抗原人工脂滴表面展示系统。
此外，还可以加入磁性纳米颗粒。
本发明第三方面提供上述靶抗原人工脂滴表面展示系统或者上述任一所述的制备方法制备得到的靶抗原人工脂滴表面展示系统在抗体筛选技术中的应用。
本发明第四方面提供一种利用抗体展示技术进行目标抗体筛选的方法，包括如下步骤：
构建抗体文库，并制备得到用于展示所述抗体的复合体；
使所述复合体与上述任一所述的靶抗原人工脂滴表面展示系统或者上述任一所述的制备方法制备得到的靶抗原人工脂滴表面展示系统接触，筛选出与所述靶抗原分子结合的目标复合体；
根据所述目标复合体得到目标抗体的基因信息。
在本发明提供的方案中，目标抗体可以为ScFv抗体。
在一种具体实施方式中，以核糖体展示技术为例，首先构建抗体基因文库，抗体基因文库可根据抗体在体内的形成机制，在高突变区引入突变。进一步地，高突变区包括CDR3。
在本发明提供的方案中，抗体基因中还可以包括TonB基团，其位于抗体基因的3’端，以提高mRNA翻译时形成的复合体的结合稳定性。
在本发明提供的方案中，抗体基因的5’和3’端还连接有茎-环结构，5’端还连接有启动子和核糖体结合位点RBS。
将创建好的抗体基因文库在体外转录成mRNA，并在富含核糖体细胞提取液体外表达体系中将mRNA翻译，形成“mRNA-核糖体-抗体”复合体。将复合体与本发明第一方面提供的靶抗原人工脂滴表面展示系统进行孵育，以使展示在人工脂滴表面的靶抗原与复合体中的多肽进行结合，待去除非特异性抗体绑定后，释放复合体中的mRNA。经过RT-PCR以及Taq酶扩增复原出抗体基因。
后续可通过ELISA或RBD检测手段检测所筛选出的抗体基因与靶抗原的结合特异性和亲和力。
可以理解的是，本发明提供的靶抗原人工脂滴表面展示系统也可以用于mRNA展示或者DNA展示。
本发明提供的抗体筛选方法有助于降低非特异性绑定；筛选效率更加快速高效；可重复利用人工细胞更加经济环保；人工细胞表面展示系统可展示不同种类抗原；高通量筛选得到高亲和力抗体。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的靶抗原人工脂滴表面展示系统的结构示意图；
图2为本发明实施例1提供的靶抗原人工脂滴表面展示系统的明场显微镜照片；
图3为本发明实施例1提供的靶抗原人工脂滴表面展示系统的荧光显微镜图，标尺50微米；
图4为ScFv抗体基因文库的构建方法示意图，其中，a为ScFv基因的扩增，b为TonB间隔序列的扩增，并在ScFv基因前加入核糖体结合位点RBS，c为在核糖体结合位点RBS前加入T7启动子，并在ScFv基因的两个CDR3区引入突变；
图5为ScFv抗体基因文库体外转录生成mRNA的琼脂凝胶电泳图，M为RNA分子量标记；
图6为筛选后复原ScFv抗体基因文库的DNA的琼脂凝胶电泳图，M为DNA分子量标记；
图7为ELISA筛选出能结合RBD的抗体；
图8为利用SPR测定抗体亲和力。
附图标记说明：
1-人工脂滴；
2-双亲性靶抗原分子；
21-靶抗原分子；
3-磁性纳米颗粒。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所使用的引物如表1所示：
表1本发明所使用的引物的核酸序列
实施例1利用核糖体展示技术进行目标抗体筛选
1、用于筛选的抗体基因文库的理性设计与构建
如图4所示，步骤a)，利用引物ScFv-F和ScFv-R扩增ScFv抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL，重链可变区VH和轻链可变区VL分别包括高突变区CDR3，并通过Linker连接，去除位于3’端的终止密码子。
步骤b)，利用PCR在ScFv抗体的5’端添加核糖体结合位点RBS，在3’端添加TonB基团和茎-环结构(stem loop)，利用SDA-ScFv-F和tonB-ScFv-R扩增得到完整序列。
步骤c)，在步骤b)的基础上，继续在5’端添加T7启动子和茎-环结构，利用T7B-F和tonB-ScFv-R扩增完整序列。然后，通过模仿自然界存在抗体的高突变区CDR3的氨基酸分布及长度，在ScFv的高突变区(CDR3)引入突变，其中氨基酸的长度为9、12、15和18个氨基酸，高突变区CDR3的氨基酸种类和比例如表2所示，构建得到抗体基因文库。
所构建的抗体基因全长约为1617-1653bp。所用的PCR反应组分如表3。
表2高突变区CDR3的氨基酸种类及比例
表3PCR组分
反应条件：98℃预变性30秒，30轮循环：98℃变性10秒,72℃退火20秒,72℃延伸30秒,最终72℃延伸2分钟。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，胶回收目的片段。
2、靶抗原展示系统的制备
以新冠病毒RBD蛋白为例，将新冠病毒RBD蛋白与巯基噻唑啉活化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)反应。反应条件：蛋白浓度2mg/mL；聚合物浓度1mg/mL；反应pH＝8.0；反应温度4摄氏度；反应时间为12h。反应结束后加入终浓度60mM的赖氨酸溶液终止反应。通过混合6微升甘油三丁酸酯(1％w/w Fe3O4纳米颗粒)和200微升聚合物修饰的抗原溶液，形成两相溶液。通过手动震荡混合物30秒，获得抗原-聚合物稳定的人工脂滴乳液。之后加1mL缓冲液备用。人工脂滴的明场显微图片和荧光图片分别如图2-3所示，根据图3荧光所示，人工脂滴的表面展示有新冠病毒RBD蛋白。
3.特异抗体的超高效筛选
将创建好的抗体基因文库(1μg)在体外转录成mRNA，转录成的mRNA的琼脂凝胶电泳图如图5所示。在富含核糖体细胞提取液体外表达体系中将mRNA(10μg)翻译形成“mRNA-核糖体-抗体”复合体并与步骤2构建得到的抗原展示系统在4℃下孵育1h，用WBT溶液(50mMHEPES-KOH，150mM NaCl，50mM MgOAc，0.2％ BSA，pH 7.4)洗涤6次去除非特异性抗体绑定，利用EDTA溶液(50mM HEPES-KOH，150mM NaCl，20mM EDTA，50μg/mL yeast RNA，0.1％ BSA，pH7.4)释放出mRNA。经过RT-PCR以及Taq酶扩增复原出抗体基因(引物：SDA-ScFv-F和tonB-R)，复原出的抗体基因的琼脂凝胶电泳图如图6所示。所用PCR组分如表4所示。
表4PCR组分
PCR反应条件：94℃预变性5分钟，30轮循环：94℃变性30秒,66℃退火30秒,72℃延伸1分钟,最终72℃延伸10分钟。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，胶回收目的片段。
4.特异性抗体的鉴定
利用引物(ScFv-transfer-F和ScFv-transfer-R)扩增筛选得到的特异结合新冠病毒RBD蛋白的抗体，所用聚合酶为高保真Q5 DNA聚合酶。并通过Gibson DNA assembly转移到表达载体中。将连接在载体上的抗体基因通过电击转化到大肠杆菌TG1细胞中。挑选单克隆并在含有氨苄青霉素抗生素(Amp)的DYT液体培养基中在37℃过夜培养，将菌液转移到新鲜的培养基中在37℃培养2.5h，加入终浓度1mMIPTG，26℃诱导表达过夜。菌液裂解液进行ELISA筛选获得特异结合RBD的抗体(图7)，并通过测序获得抗体的基因信息。所用到的PCR组分和程序同步骤1。
5.RBD抗体的纯化与结合亲和力分析
将步骤4鉴定的阳性克隆C7接种于50mL含Amp的DYT液体培养基中，在37℃过夜培养。次日将培养液重新转接于1L含Amp的DYT液体培养基中37℃培养至OD600约为0.6-0.8，加入终浓度1mM IPTG，18℃诱导表达过夜。离心收集菌体，用PBS悬浮菌体，用超声破碎仪破碎菌液，于低温离心机离心。上清液经Ni2+柱进行蛋白分离纯化，经线性梯度洗脱，收集洗脱峰并进行SDS-PAGE电泳分析，合并目的蛋白具有单一条带的洗脱峰。根据纯化得到的蛋白质的纯度，可以通过离子交互离子交换以及凝胶过滤层析进一步纯化提高目标抗体的纯度。
将生物素化的RBD蛋白质包被在链霉亲和素(SA)传感芯片上，将抗体进行5个梯度稀释(80nM、40nM、20nM、10nM、5nM)，以流速30μl/min流过芯片。通过表面等离子共振技术(SPR)测定结合动力学常数，利用Biacore分析软件，基于五条曲线计算得KD为2.61±0.46×10-9M(图8)。
6.人工脂滴和链霉素磁珠展示的比较
对人工脂滴和链霉素磁珠展示技术的最大库容和单轮筛选效率进行比较，比较结果如表5所示，可以看出，相比链霉素磁珠展示技术，本发明提供的人工脂滴展示有助于提高抗原与抗体结合的特异性，进而提高抗体筛选效率。
表5人工脂滴和链霉素磁珠展示的比较
| 最大库容 | 单轮筛选效率 | |
| 链霉素磁珠 | 1014 | 104 |
| 人工脂滴 | 1014 | 1011 |
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种靶抗原人工脂滴表面展示系统，其特征在于，包括人工脂滴和双亲性靶抗原分子；
所述人工脂滴在亲水介质中装配成具有亲水表面和疏水性内核的颗粒；
所述双亲性靶抗原分子为疏水基团修饰的靶抗原分子；
所述靶抗原分子展示在所述人工脂滴的亲水表面。
2.根据权利要求1所述的靶抗原人工脂滴表面展示系统，其特征在于，所述双亲性靶抗原分子是使用巯基噻唑啉或N-羟基丁二酰亚胺活化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)对靶抗原分子进行修饰后得到的。
3.根据权利要求1所述的靶抗原人工脂滴表面展示系统，其特征在于，所述双亲性靶抗原分子是通过法尼基转移酶或香叶基转移酶对靶抗原分子的C端进行脂质化修饰后得到的。
4.根据权利要求1-3任一项所述的靶抗原人工脂滴表面展示系统，其特征在于，所述人工脂滴在亲水介质中装配成的颗粒的内部包裹有磁性纳米颗粒。
5.根据权利要求1-4任一项所述的靶抗原人工脂滴表面展示系统，其特征在于，所述人工脂滴由甘油三丁酸酯在亲水介质中装配得到。
6.权利要求1-5任一项所述的靶抗原人工脂滴表面展示系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
对靶抗原分子进行疏水基团修饰，得到双亲性靶抗原分子；
将表面活性剂与双亲性靶抗原分子混合并分散在亲水介质中，形成所述靶抗原人工脂滴表面展示系统。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，对靶抗原分子进行疏水基团修饰，得到双亲性靶抗原分子，具体包括如下步骤：
使用巯基噻唑啉或N-羟基丁二酰亚胺对聚(N-异丙基丙烯酰胺)进行活化，将活化后的聚(N-异丙基丙烯酰胺)与靶抗原分子混合并进行反应，反应结束后加入赖氨酸终止反应，得到双亲性靶抗原分子。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将表面活性剂与双亲性靶抗原分子混合并分散在亲水介质中，形成所述靶抗原人工脂滴表面展示系统，具体包括如下步骤：
将甘油三丁酸酯和双亲性靶抗原分子分散在亲水介质中，形成所述靶抗原人工脂滴表面展示系统。
9.权利要求1-5任一项所述的靶抗原人工脂滴表面展示系统或者权利要求6-8任一项所述的制备方法制备得到的靶抗原人工脂滴表面展示系统在抗体筛选技术中的应用。
10.一种利用抗体展示技术进行目标抗体筛选的方法，其特征在于，包括如下步骤：
构建抗体基因文库，并制备得到用于展示所述抗体的复合体；
使所述复合体与权利要求1-5任一项所述的靶抗原人工脂滴表面展示系统或者权利要求6-8任一项所述的制备方法制备得到的靶抗原人工脂滴表面展示系统接触，筛选出与所述靶抗原分子结合的目标复合体；
根据所述目标复合体得到目标抗体的基因信息。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410094258.6A CN118126108A (zh) | 2024-01-23 | 2024-01-23 | 一种靶抗原人工脂滴表面展示系统及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410094258.6A CN118126108A (zh) | 2024-01-23 | 2024-01-23 | 一种靶抗原人工脂滴表面展示系统及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118126108A true CN118126108A (zh) | 2024-06-04 |
Family
ID=91239844
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410094258.6A Pending CN118126108A (zh) | 2024-01-23 | 2024-01-23 | 一种靶抗原人工脂滴表面展示系统及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118126108A (zh) |
-
2024
- 2024-01-23 CN CN202410094258.6A patent/CN118126108A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bacon et al. | Past, present, and future of affinity-based cell separation technologies | |
| WO2016188449A1 (zh) | 一种针对cd47的单域抗体 | |
| Corchero et al. | Biomedical applications of distally controlled magnetic nanoparticles | |
| CN108753792B (zh) | 绿色荧光蛋白纳米抗体的编码基因及其制备方法和应用 | |
| CN109970858B (zh) | Cd22单域抗体、核苷酸序列及试剂盒 | |
| JP2005538929A (ja) | 単一サンプルからの核酸及びタンパク質の単離方法 | |
| CN107474135B (zh) | 抗PD-1的纳米抗体PD-1/Nb20及其制备方法与应用 | |
| CN111217908B (zh) | Cd22单域抗体、核苷酸序列、试剂盒、car-t病毒载体及car-t细胞 | |
| JP5453095B2 (ja) | 磁気認識システム | |
| CN108350450A (zh) | 人血清来源的IgG 多克隆抗体的分离剂、以及使用其的人血清来源的IgG 多克隆抗体的分离方法 | |
| WO2019134630A1 (zh) | 一种Cas蛋白体系分离DNA的方法 | |
| CN106046165A (zh) | 抗CTLA‑4的纳米抗体Nb30及其制备方法与应用 | |
| CN105624081A (zh) | 表达特定重组蛋白的功能化细菌磁颗粒及其制备方法 | |
| CN118126108A (zh) | 一种靶抗原人工脂滴表面展示系统及其制备方法和应用 | |
| CN105624082A (zh) | 表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒及其应用 | |
| CN106928358B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb168 | |
| CN106928355B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb184 | |
| CN109055382A (zh) | 可特异性结合6x组氨酸标签的核酸适配体及其应用 | |
| WO2020087987A1 (zh) | 一种核酸适配体纯化基因工程中表达蛋白的方法及试剂盒 | |
| CN113667014B (zh) | 一种抗bsa纳米抗体及应用 | |
| CN117965528A (zh) | 一种用于交叉活性抗体的高通量筛选方法和应用 | |
| CN110218255B (zh) | 抗CD3的纳米抗体CD3/Nb47及其制备方法与应用 | |
| JP2004201648A (ja) | 遺伝子のスクリーニング方法 | |
| CN106928360B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb68 | |
| CN106928359B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb59 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |