CN117965528A - 一种用于交叉活性抗体的高通量筛选方法和应用 - Google Patents
一种用于交叉活性抗体的高通量筛选方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117965528A CN117965528A CN202410094417.2A CN202410094417A CN117965528A CN 117965528 A CN117965528 A CN 117965528A CN 202410094417 A CN202410094417 A CN 202410094417A CN 117965528 A CN117965528 A CN 117965528A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- target antigen
- screening
- target
- antibody
- rbd
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 102
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 102
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 102
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 39
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 claims description 12
- UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N Tributyrin Chemical compound CCCC(=O)OCC(OC(=O)CCC)COC(=O)CCC UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 9
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 claims description 8
- 229920003213 poly(N-isopropyl acrylamide) Polymers 0.000 claims description 8
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 claims description 6
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 6
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 5
- WGJCBBASTRWVJL-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine-2-thione Chemical compound SC1=NCCS1 WGJCBBASTRWVJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- 230000013823 prenylation Effects 0.000 claims description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 238000002702 ribosome display Methods 0.000 claims description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 2
- 102000007317 Farnesyltranstransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010007508 Farnesyltranstransferase Proteins 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102000013404 Geranyltranstransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010026318 Geranyltranstransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 102100029469 WD repeat and HMG-box DNA-binding protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710097421 WD repeat and HMG-box DNA-binding protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N dimethyl(dioctadecyl)azanium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OGQYPPBGSLZBEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种用于交叉活性抗体的高通量筛选方法,包括如下步骤:步骤1、构建抗体基因文库,基于抗体基因文库构建得到用于展示抗体的复合体;步骤2、使用至少两种抗原展示系统依次对复合体进行筛选,每种抗原展示系统表面展示有不同靶抗原分子,以筛选出能够同时与不同靶抗原分子结合的目标复合体;步骤3、根据目标复合体得到目标抗体的基因信息。本发明将多种靶抗原分子展示在人工脂滴表面,作为多轮抗体筛选的抗原展示系统,有助于高效、快速、经济地筛选出具有交叉活性的广谱抗体。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于交叉活性抗体的高通量筛选方法和应用,涉及生物技术领域。
背景技术
基因工程抗体临床干预在预防和治疗病毒感染方面非常有效。由于病毒种类多,并且具有极高的突变率会产生多样的突变体。针对所有病毒及突变体逐一进行抗体筛选十分具有挑战性,往往筛选特异性抗体的速度比不上病毒变异的速度。因此,本领域迫切需要开发具有良好靶向各种病毒及其突变体的高亲和力的广谱性抗体。
发明内容
本发明提供一种用于交叉活性抗体的高通量筛选方法,用于筛选靶向各种病毒及其突变体的高亲和力的广谱性抗体。
本发明还提供上述筛选方法在对靶向新型冠状病毒及其突变株的广谱性抗体筛选中的应用。
本发明第一方面提供一种用于交叉活性抗体的高通量筛选方法,包括如下步骤:
步骤1、构建抗体基因文库,基于所述抗体基因文库构建得到用于展示抗体的复合体;
步骤2、使用至少两种抗原展示系统依次对所述复合体进行筛选,每种抗原展示系统表面展示有不同靶抗原分子,以筛选出能够同时与不同靶抗原分子结合的目标复合体;
步骤3、根据所述目标复合体得到目标抗体的基因信息;
其中,所述抗原展示系统包括人工脂滴和双亲性靶抗原分子;所述人工脂滴在亲水介质中装配成具有亲水表面和疏水性内核的颗粒,所述双亲性靶抗原分子为疏水基团修饰的靶抗原分子,所述靶抗原分子展示在所述人工脂滴的亲水表面。
基于抗体和抗原结合的特异性,本发明首先建立抗体基因文库,并利用本领域常规的抗体文库筛选技术构建用于展示抗体的复合体;其次,将展示有抗体的复合体与展示有不同靶抗原分子的抗原展示系统进行孵育,以筛选出对多种靶抗原分子具有交叉活性的抗体;最后,即可根据本领域常规技术手段,获取具有交叉活性抗体的基因信息。可以理解的是,不同靶抗原分子可以来源于病毒原始毒株及其突变株中的至少两种,具体可以是病毒及其突变株表面的受体结合域(RBD)。
本领域通常使用链霉亲和素磁珠进行抗原展示,然而,链霉亲和素磁珠具有强的吸附性,且表面固定有链霉亲和素,所以展示在核糖体表面的抗体与结合在磁珠表面目标抗原作用过程中,会发生非特异性结合。这种非特异性绑定会出现假阳性情况,从而严重影响抗体筛选的准确性,导致一些不与目标蛋白相互作用的抗体被错误地筛选出来,进而影响筛选效率以及抗体特异性。因此,本发明提供了一种如图1所示的抗原展示系统,其包括人工脂滴1和双亲性靶抗原分子2;其中,人工脂滴1是由表面活性剂在亲水介质中形成的,由于表面活性剂具有亲水端和疏水端,其在亲水介质中可以形成具有亲水表面和疏水性内核的颗粒;双亲性靶抗原分子2是对靶抗原分子21进行疏水化修饰后形成的,亲水性的靶抗原分子21展示在人工脂滴1的亲水表面,以便于抗体筛选过程中与抗体的结合,疏水端位于人工脂滴1内部,使靶抗原分子21紧密的展示在人工脂滴1表面。在本发明的方案中,亲水介质可以为纯水。
本发明使用人工脂滴取代链霉亲和素磁珠,有助于降低抗体筛选过程中与靶抗原分子的非特异性绑定,提高目标抗体的特异性和筛选效率;并且,本发明提供的展示系统极大程度上模拟了病毒空间结构,但不含基因遗传物质,更加安全有效;此外,本领域技术人员可以通过控制人工脂滴的大小、表面展示的抗原数量以及类型,精确控制其结构、功能等方面参数,因而具备较高的可控性。本发明将多种靶抗原分子展示在人工脂滴表面,作为多轮抗体筛选的抗原展示系统,有助于高效、快速、经济地筛选出具有交叉活性的广谱抗体。
在一种具体实施方式中,本发明提供的抗原展示系统的制备方法包括:
对靶抗原分子进行疏水基团修饰,得到双亲性靶抗原分子;
将表面活性剂与双亲性靶抗原分子混合并分散在亲水介质中,形成所述抗原展示系统。
首先,本发明提供两种对靶抗原分子进行疏水基团修饰的方法,在一种具体实施方式中:使用巯基噻唑啉或N-羟基丁二酰亚胺对聚(N-异丙基丙烯酰胺)进行活化,将活化后的聚(N-异丙基丙烯酰胺)与靶抗原分子混合并进行反应,加入赖氨酸终止反应,得到双亲性靶抗原分子。
进一步地,活化后的聚(N-异丙基丙烯酰胺)与靶抗原分子的摩尔比为2:1,控制反应体系的pH为8.0,在4℃下反应12h后,加入赖氨酸终止反应。
进一步地,聚(N-异丙基丙烯酰胺)的数均分子量为8000~15000g/mol,通过控制聚合物的分子量,有助于平衡抗原-聚合物的亲疏水性,从而使抗原分子能更好的展示在人工脂滴表面。
在另一种具体实施方式中,对靶抗原分子进行异戊烯基化修饰得到双亲性靶抗原分子;具体地,可以使用法尼基转移酶(FTase)或香叶基转移酶(GGTase)对靶抗原分子进行修饰,以在靶抗原分子的C端形成疏水基团;具体可根据本领域常规技术手段进行。
其次,将表面活性剂与制备得到的双亲性靶抗原分子混合并分散在亲水介质中,形成所述抗原表面展示系统。进一步地,所述人工脂滴由甘油三丁酸酯在亲水介质中装配得到;甘油三丁酸酯的密度大于水,有利于装配形成的人工脂滴沉至水介质的底部,有助于人工脂滴的富集,以及避免人工脂滴悬浮到空气和水的界面使抗原分子失活。
在一种具体实施方式中,为了便于磁性富集和展示系统的回收,所述人工脂滴在亲水介质中装配成的颗粒的内部包裹有磁性纳米颗粒3,磁性纳米颗粒疏水性较强,可以分散在甘油三丁酸酯形成的人工脂滴的疏水内部。
进一步地,所述磁性纳米颗粒可以为Fe3O4纳米颗粒。磁性纳米颗粒的质量为甘油三丁酸酯质量的1%-2%。
以对新冠病毒SARS-CoV-2及其突变株具有交叉活性的抗体的筛选为例,该筛选方法具体包括如下步骤:
步骤1、构建抗体基因文库,基于所述抗体基因文库构建得到用于展示抗体的复合体。
在本发明提供的方案中,抗体可以为ScFv抗体。根据抗体在体内的形成机制,在高突变区引入突变构建得到抗体基因文库。进一步地,高突变区包括CDR3。
以核糖体展示技术为例,抗体基因还包括TonB基团,其位于抗体基因的3’端,以提高mRNA翻译时形成的复合体的结合稳定性。
在本发明提供的方案中,抗体基因的5’和3’端还连接有茎-环结构,5’端还连接有启动子和核糖体结合位点RBS。
将创建好的抗体基因在体外转录成mRNA,并在富含核糖体细胞提取液体外表达体系中将mRNA翻译,形成“mRNA-核糖体-多肽”复合体。
步骤2、使用至少两种抗原展示系统依次对所述复合体进行筛选,每种抗原展示系统表面展示有不同靶抗原分子,以筛选出能够同时与不同靶抗原分子结合的目标复合体。
以新冠病毒SARS-CoV-2及其突变株Omicron、Gamma、Alpha为例,首先,以病毒及其突变株表面的RBD为靶抗原分子,经疏水基团修饰后制备得到四种抗原展示系统;其次,使用展示有SARS-CoV-2-RBD的第一抗原展示系统对抗体基因文库进行第一轮筛选,筛选结束后,释放能够与第一抗原展示系统结合的复合体上的mRNA,并通过逆转录得到cDNA,连接启动子后得到用于第二轮筛选的抗体基因文库;接着,使用展示有Omicron-RBD的第二抗原展示系统对第一轮筛选得到的抗体基因文库进行第二轮筛选,按照与第一轮筛选结束后相同的方法;再使用展示有Gamma-RBD的第三抗原展示系统对第二轮筛选得到的抗体基因文库进行第三轮筛选;再使用展示有Alpha-RBD的第四靶抗原人工脂滴展示系统对第三轮筛选得到的抗体基因进行第四轮筛选,最终得到能够与SARS-CoV-2-RBD、Omicron-RBD、Gamma-RBD、Alpha-RBD四种靶抗原结合的目标复合体。
可以理解的是,四轮筛选过程中靶抗原分子及其顺序均可根据本领域常规技术手段进行调整。
步骤3、根据所述目标复合体得到目标抗体的基因信息。
最后,即可根据目标复合体得到目标抗体的基因信息,并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)与表面等离子共振(SPR)等方法对目标抗体进行分析和鉴定。
本发明提供一种高通量筛选具有交叉活性的广谱抗体的方法,将抗体基因文库在体外转录翻译形成“mRNA-核糖体-抗体”复合物,并与分别展示有不同靶抗原分子的人工脂滴展示系统进行孵育,进行至少两轮筛选得到具有交叉活性的广谱抗体,解决了目前的交叉活性抗体筛选方法不能够快速、简便、高通量的筛选,从而造成筛选成本高的问题。
可以理解的是,本发明除了可以用于对新冠病毒及其突变株进行广谱抗体筛选之外,还可用于其他种类病毒、癌症、细菌等的筛选。
本发明将多种靶抗原分子展示在人工脂滴表面,作为多轮抗体筛选的抗原展示系统,有助于高效、快速、经济地筛选出具有交叉活性的广谱抗体;同时,本发明提供的人工脂滴抗原展示系统有助于降低非特异性绑定;筛选效率更加快速高效;可重复利用更加经济环保;人工脂滴抗原展示系统可展示不同种类抗原;高通量筛选得到高亲和力抗体。
附图说明
图1为本发明提供的靶抗原人工脂滴表面展示系统的结构示意图;
图2为本发明实施例1提供的靶抗原人工脂滴表面展示系统的明场显微镜照片;
图3为本发明实施例1提供的靶抗原人工脂滴表面展示系统的荧光显微镜图,标尺50微米;
图4为本发明实施例中mRNA的琼脂凝胶电泳图,M为RNAmarker;
图5为本发明实施例中交叉筛选后复原抗体基因文库的DNA的琼脂凝胶电泳图,M为DNAmarker,1、2、3和4分别代表第一、第二、第三、第四轮交叉筛选复原的抗体基因文库的DNA条带,分别用SARS-CoV-2-RBD、Omicron-RBD、Gamma-RBD和Alpha-RBD人工细胞作为抗原;
图6为本发明实施例中ELISA筛选具有交叉活性的靶向SARS-CoV-2-RBD、Omicron-RBD、Gamma-RBD和Alpha-RBD的抗体;
图7为本发明实施例中重组具有交叉活性的抗体G8的Ni2+柱纯化SDS-PAGE电泳图,M为蛋白质marker,FT为流穿液,HS为高盐洗液,W1、W2、W3为用缓冲液洗三次柱子,E1、E2、E3、E4为不同浓度洗脱液,Pooled为将E1、E2、E3、E4收集并进行下一步纯化;
图8为本发明实施例中离子交换层析进一步纯化抗体G8的SDS-PAGE电泳图,M为蛋白质marker,Pooled为将洗脱液收集并进行下一步纯化;
图9为本发明实施例中抗体G8的亲和层析SDS-PAGE电泳图,Pooled为收集的洗脱液;
图10为本发明实施例中具有交叉靶向SARS-CoV-2-RBD、Omicron-RBD、Gamma-RBD和Alpha-RBD的抗体G8动力学曲线。
附图标记说明:
1-人工脂滴;
2-双亲性靶抗原分子;
21-靶抗原分子;
3-磁性纳米颗粒。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明的实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所使用的引物如表1所示:
表1本发明实施例所使用的引物的核苷酸序列
实施例1:抗体基因文库的扩增
利用引物(上游引物:T7B-F和下游引物:tonB-ScFv-R)PCR扩增出用于筛选的ScFv抗体基因文库。所用聚合酶为高保真Q5 DNA酶,PCR的组分见表2。所用到的引物见表1。
表2 PCR组分
组分 | 体积(μL) | 浓度 |
模板 | 1 | 0.02-2ng/μL |
上游引物(10μM) | 0.5 | 0.5μM |
下游引物(10μM) | 0.5 | 0.5μM |
GC enhancer(optional) | 5 | 1x |
Q5 PCR mix | 12.5 | - |
ddH2O | adjust to 25 | - |
PCR的程序为:98℃预变性30秒,30轮循环:98℃变性10秒,72℃退火20秒,72℃延伸30秒,最终72℃延伸2分钟。通常回收到达抗体基因文库为200ng/μl。
实施例2:抗体基因文库的转录与翻译
如图4所示,将1μg ScFv抗体基因文库进行体外转录并纯化获得mRNA。然后,10μg的mRNA在富含核糖体的大肠杆菌细胞抽提物中,体外翻译为“mRNA-核糖体-抗体”复合物,并稳定于4℃。
实施例3:靶抗原分子的人工脂滴展示系统的构建
将SARS-CoV-2-RBD、Omicron-RBD、Gamma-RBD和Alpha-RBD蛋白通过聚合物修饰形成水油双亲分子,并将抗原分子展示在人工脂滴的表面。
具体包括:将SARS-CoV-2-RBD与巯基噻唑啉活化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)反应。反应条件:蛋白浓度2mg/mL;聚合物浓度1mg/mL;反应pH=8.0;反应温度4摄氏度;反应时间为12h。反应结束后加入终浓度60mM的赖氨酸溶液终止反应。通过混合6微升甘油三丁酸酯(1%w/wFe3O4纳米颗粒)和200微升聚合物修饰的抗原溶液,形成两相溶液。通过手动震荡混合物30秒,获得抗原-聚合物稳定的人工脂滴乳液。之后加1mL缓冲液备用。人工脂滴的明场显微图片和荧光图片分别如图2-3所示,根据图3荧光所示,人工脂滴的表面展示有新冠病毒RBD蛋白。
采用相同的方法,将Omicron-RBD、Gamma-RBD和Alpha-RBD分别与巯基噻唑啉活化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)反应,并构建得到展示有不同RBD的人工脂滴。
实施例4:具有交叉活性的广谱抗体的筛选
在第一轮筛选中将“mRNA-核糖体-抗体”复合物与SARS-CoV-2-RBD人工脂滴进行孵育,通过6次洗涤去除非特异性抗体绑定,利用EDTA溶液洗脱得到富集的抗体mRNA并通过逆转录得到cDNA。利用引物(上游引物:SDA-ScFv-F和下游引物:tonB-R)PCR反应重新获得经过富集的抗体基因文库,所用聚合酶为Taq合酶,PCR组分见表3。
通过引物(上游引物:T7B-F和下游引物:tonB-ScFv-R)在其N端加入T7启动子,所用PCR组分和程序同上。然后进行第二轮,第三轮以及第四轮筛选,并分别利用Omicron-RBD、Gamma-RBD和Alpha-RBD作为抗原。所用到的引物见表1。所筛选到的DNA的琼脂凝胶电泳图如图5所示。
表3 PCR组分
组分 | 体积(μL) | 浓度 |
模板 | 1 | 0.02-2ng/μL |
上游引物(10μM) | 1 | 0.5μM |
下游引物(10μM) | 1 | 0.5μM |
GC enhancer(optional) | 10 | 1x |
Platinum Taq PCR mix | 25 | - |
ddH2O | adjust to 50 | - |
反应条件:94℃预变性5分钟,30轮循环:94℃变性30秒,66℃退火30秒,72℃延伸1分钟,最终72℃延伸10分钟。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物,胶回收目的片段。
实施例5:ELISA筛选核酸测序鉴定具有交叉活性的广谱抗体
利用引物(上游引物:ScFv-transfer-F和下游引物:ScFv-transfer-R)特异性扩增筛选得到的抗体,所用聚合酶为高保真Q5 DNA酶,PCR组分和程序见表3,所用到的引物见表1。并通过Gibson DNA assembly转移到质粒中,并且通过电击转化到TG1大肠杆菌细胞中。然后利用每一个克隆的菌液裂解液进行ELISA检测(如图6所示)。筛选出对SARS-CoV-2-RBD、Omicron-RBD、Gamma-RBD和Alpha-RBD具有交叉活性的特异性抗体。并将目标抗体进行测序,获得其基因和氨基酸序列信息。
实施例6:抗体的表达纯化以及结合动力学常数测定
将步骤5获得的阳性克隆G8,利用BL21DE3大肠杆菌,在含氨苄青霉素的DYT培养基中振荡培养至OD600为0.6-0.8,加入终浓度1mM IPTG,18℃诱导表达过夜。将菌体进行细胞破碎,离心得到的上清液经Ni2+柱进行蛋白分离纯化,经线性梯度洗脱,收集洗脱峰并进行SDS-PAGE,合并目的蛋白具有单一条带的洗脱峰(如图7所示)。为了提高蛋白质纯度,进一步进行离子交换以及凝胶过滤层析纯化(如图8-9所示)。将纯化到的抗体包被在链霉亲和素(SA)传感芯片上,将抗原SARS-CoV-2-RBD、Omicron-RBD、Gamma-RBD和Alpha-RBD进行梯度稀释,在表面等离子共振仪上测定结合亲和力。测定结果见图10,根据图10可知,筛选得到的抗体与四种抗原均具有较高的结合亲和力。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种用于交叉活性抗体的高通量筛选方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1、构建抗体基因文库,基于所述抗体基因文库构建得到用于展示抗体的复合体;
步骤2、使用至少两种抗原展示系统依次对所述复合体进行筛选,每种抗原展示系统表面展示有不同靶抗原分子,以筛选出能够同时与不同靶抗原分子结合的目标复合体;
步骤3、根据所述目标复合体得到目标抗体的基因信息;
其中,所述抗原展示系统包括人工脂滴和双亲性靶抗原分子;所述人工脂滴在亲水介质中装配成具有亲水表面和疏水性内核的颗粒,所述双亲性靶抗原分子为疏水基团修饰的靶抗原分子,所述靶抗原分子展示在所述人工脂滴的亲水表面。
2.根据权利要求1所述的筛选方法,其特征在于,基于核糖体展示技术,构建得到包括mRNA、核糖体和多肽的复合体。
3.根据权利要求1或2所述的筛选方法,其特征在于,所述抗原展示系统的制备方法包括:
对靶抗原分子进行疏水基团修饰,得到双亲性靶抗原分子;
将表面活性剂与双亲性靶抗原分子混合并分散在亲水介质中,形成所述抗原展示系统。
4.根据权利要求3所述的筛选方法,其特征在于,对靶抗原分子进行疏水基团修饰,得到双亲性靶抗原分子,具体包括如下步骤:
使用巯基噻唑啉或N-羟基丁二酰亚胺对聚(N-异丙基丙烯酰胺)进行活化,将活化后的聚(N-异丙基丙烯酰胺)与靶抗原分子混合并进行反应,加入赖氨酸终止反应,得到双亲性靶抗原分子。
5.根据权利要求3所述的筛选方法,其特征在于,对靶抗原分子进行异戊烯基化修饰得到双亲性靶抗原分子。
6.根据权利要求1-5任一项所述的筛选方法,其特征在于,所述人工脂滴由甘油三丁酸酯在亲水介质中装配得到。
7.根据权利要求1-6任一项所述的筛选方法,其特征在于,所述人工脂滴的内部包裹有磁性纳米颗粒。
8.根据权利要求1-7任一项所述的筛选方法,其特征在于,所述靶抗原分子包括病毒蛋白的受体结合域。
9.一种对新型冠状病毒及其突变株具有交叉活性的抗体筛选方法,其特征在于,使用权利要求1-8任一项所述的筛选方法进行。
10.根据权利要求9所述的筛选方法,其特征在于,所述靶抗原分子选自SARS-CoV-2-RBD、Omicron-RBD、Gamma-RBD、Alpha-RBD中的至少两种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410094417.2A CN117965528A (zh) | 2024-01-23 | 2024-01-23 | 一种用于交叉活性抗体的高通量筛选方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410094417.2A CN117965528A (zh) | 2024-01-23 | 2024-01-23 | 一种用于交叉活性抗体的高通量筛选方法和应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117965528A true CN117965528A (zh) | 2024-05-03 |
Family
ID=90854638
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202410094417.2A Pending CN117965528A (zh) | 2024-01-23 | 2024-01-23 | 一种用于交叉活性抗体的高通量筛选方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117965528A (zh) |
-
2024
- 2024-01-23 CN CN202410094417.2A patent/CN117965528A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Murphy et al. | An improved method for the in vitro evolution of aptamers and applications in protein detection and purification | |
US8110351B2 (en) | Method for isolating nucleic acids and protein from a single sample | |
CN101878304A (zh) | 用于从单个样品中分离基因组dna、rna和蛋白质的方法 | |
JP2003505041A (ja) | 固体支持体担体を用いる試験管内選択及びポリペプチドの任意の同定 | |
AU2001260507A1 (en) | Nucleic acid isolation | |
WO2022179349A1 (zh) | 新型冠状病毒抗原及其应用 | |
JP2010515463A (ja) | 配座的に束縛されたポリペプチド配列のコンビナトリアルライブラリー | |
CN111574631A (zh) | 针对硫氧还蛋白的抗体、缀合物和检测试剂盒 | |
US8916376B2 (en) | Metal-binding peptides | |
JP2010508530A (ja) | 磁気認識システム | |
CN117965528A (zh) | 一种用于交叉活性抗体的高通量筛选方法和应用 | |
JPWO2006103772A1 (ja) | グルタチオン−s−トランスフェラーゼ・タンパク質に対する高親和性rnaアプタマー分子 | |
CN109055382B (zh) | 可特异性结合6x组氨酸标签的核酸适配体及其应用 | |
KR101351647B1 (ko) | 인간 심근 트로포닌 ⅰ에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 | |
CN118126108A (zh) | 一种靶抗原人工脂滴表面展示系统及其制备方法和应用 | |
CN114107306B (zh) | Cas9蛋白的核酸适配体及其应用 | |
CN110386986B (zh) | 人工改造蛋白质及其构建方法与应用 | |
JP4122694B2 (ja) | タンパク質−dna連結分子及びその利用 | |
JP2011520101A (ja) | 磁性標識セット | |
Carapito et al. | Arginine-Affinity Chromatography for Nucleic Acid (DNA and RNA) Isolation | |
JP2014003908A (ja) | タンパク質機能改変法 | |
WO2021010482A1 (ja) | 分離ペプチド | |
Gao et al. | Antibody affinity purification using metallic nickel particles | |
CN115247177A (zh) | 一种特异性识别cd38蛋白的核酸适配体、衍生物、应用、试剂盒及检测芯片 | |
CN110003334B (zh) | 多肽、cd19单域抗体及其制备方法、核苷酸序列及试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |