CN118112242A

CN118112242A - 一种猪德尔塔冠状病毒n蛋白的应用和试剂盒

Info

Publication number: CN118112242A
Application number: CN202410515065.3A
Authority: CN
Inventors: 张昆丽; 康桦华; 刘志成; 陈坚; 涂玉蓉; 穆光慧; 沈海燕; 张建峰
Original assignee: Guangdong Winsun Biopharmaceuticals Co ltd; Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Guangdong Winsun Biopharmaceuticals Co ltd; Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2024-04-26
Filing date: 2024-04-26
Publication date: 2024-05-31

Abstract

本发明属于生物领域，具体涉及一种采用如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的猪德尔塔冠状病毒重组N蛋白制备间接ELISA检测试剂盒的用途。通过选择该N蛋白用于间接ELISA检测方法检测母乳中猪德尔塔冠状病毒感染后诱导的IgA抗体，可以显著的提高灵敏度，经过实验验证，该蛋白同时具有优异的特异性。同时，本发明还提供了该基于该蛋白的间接ELISA检测试剂盒。

Description

一种猪德尔塔冠状病毒N蛋白的应用和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种猪德尔塔冠状病毒N蛋白的应用和试剂盒。

背景技术

猪德尔塔冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV）又称猪丁型冠状病毒或猪δ冠状病毒。该病毒主要感染仔猪并引起呕吐、严重腹泻等胃肠症状，死亡率为30%~40%，严重时高达100%。

PDCoV为具有囊膜的单股正链RNA病毒，该病毒的基因组全长约25.4 kb，具有与其他冠状病毒类似的冠状病毒组基因，是目前已发现的冠状病毒中基因组最小的。与其他冠状病毒一样，PDCoV的N蛋白是一个高度保守的结构蛋白，包含两个独立的RNA结合结构域，与病毒基因组RNA结合构成病毒的核心。N蛋白在病毒组装，增加病毒转录和装配效率以及致病过程中起关键作用等。N蛋白在病毒感染早期大量表达，具有抗体水平高，维持时间长等特点，常作为诊断PDCoV感染的抗原。

CN109880843A公开了一种猪德尔塔冠状病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的间接ELISA试剂盒，其采用猪德尔塔冠状病毒N基因796～1026nt核苷酸区域与载体结合转入菌种表达，得到了N蛋白，该方法适用于对于IgG的检测。

ELISA检测方法因其高通量、操作相对简便、特异性强和敏感性较高等特点广泛应用于临床抗体检测。目前，关于PDCoV IgA检测方法鲜有报道，加之尚无商品化检测试剂盒及商品化疫苗供应，给猪只养殖带来很大威胁。

现有的间接ELISA检测方法针对母猪初乳的lgA的检测存在的问题主要集中在N蛋白上，由于根据常规方法制备得到的N蛋白的可溶性不佳、蛋白纯净度不高，导致检测灵敏度和精度不佳。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供一种猪德尔塔冠状病毒重组N蛋白的应用，通过选择该N蛋白用于间接ELISA检测方法检测母乳中猪德尔塔冠状病毒感染后诱导的IgA抗体，可以显著的提高灵敏度，经过实验验证，该蛋白同时具有优异的特异性。

同时，本发明还提供了该基于该蛋白的间接ELISA检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供了采用如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的猪德尔塔冠状病毒重组N蛋白制备间接ELISA检测试剂盒的用途。

在上述的用途中，所述间接ELISA检测试剂盒为用于检测母乳中猪德尔塔冠状病毒感染后诱导的IgA抗体的间接ELISA检测试剂盒。

PDCoV主要感染猪的肠道上皮细胞，导致小肠上皮细胞坏死、肠绒毛脱落，进而引起营养吸收不良和腹泻，严重时引起仔猪脱水直至死亡。分泌型IgA是机体粘膜局部抗感染免疫的主要抗体，该IgA可特异性地抵抗感染。由于PDCoV主要侵袭猪只肠道，因此，抗PDCoVIgA所介导的肠道黏膜免疫在抗感染中发挥重要作用。由于仔猪免疫系统尚未发育成熟，无法产生特异性IgA抗体，同时无法通过胎盘途径获得母源IgA，仔猪有且只能从初乳中获得母源特异性抗PDCoV IgA。当母乳中的IgA通过消化道进入仔猪肠道，仔猪完成吸收后，方可获得特异性免疫。综上所述，哺乳仔猪肠道黏膜免疫与抵抗PDCoV入侵至关重要，通过检测母乳中PDCoV特异性sIgA的含量可在一定程度上评价母猪免疫情况以及仔猪获得被动免疫的情况。

同时，本发明还提供了一种用于检测母乳中猪德尔塔冠状病毒感染后诱导的IgA抗体的间接ELISA检测试剂盒，含有包被酶标板；所述包被酶标板中的包被抗原为如SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的猪德尔塔冠状病毒重组N蛋白。

在上述的间接ELISA检测试剂盒中，还包括阴性初乳、阳性初乳、酶标抗体、洗涤液、稀释液、包被液、封闭液、显色液、终止液。

在上述的间接ELISA检测试剂盒中，所述酶标抗体为羊抗猪IgA-HRP，所述洗涤液为PBST；所述洗涤液含0.25% v/v Tween-20，所述稀释液为含5%BSA(w/v) 的PBS溶液，所述包被液为pH为9.6的0.05mol/L的磷酸缓冲液，所述封闭液为含5%BSA(w/v) 的PBS溶液，所述显色液为TMB，所述终止液为1M HCl。

在上述的间接ELISA检测试剂盒中，所述猪德尔塔冠状病毒重组N蛋白的制备方法为：

将猪德尔塔冠状病毒HeN17毒株的N基因克隆到原核表达载体上，构建重组质粒；所述原核表达载体为pGEX-6p-1载体；

将重组质粒转化到大肠杆菌BL21( DE3) 中，得到重组表达菌株；

重组N蛋重组表达菌株经IPTG诱导，超声破碎、离心，取上清；所述上清中含有带有标签的PDCoV-N-GST重组蛋白；所述上清经纯化和3C蛋白酶酶切掉PDCoV-N-GST重组蛋白的标签蛋白，得到猪德尔塔冠状病毒重组N蛋白。

在上述的间接ELISA检测试剂盒中，所述IPTG诱导为加入IPTG至终浓度为1 mM，在温度为16℃条件下诱导表达16 h。

在上述的间接ELISA检测试剂盒中，PDCoV-N-GST重组蛋白的标签切除方法为：

PDCoV-N-GST重组蛋白和Glutathione Sepharose 4B按照2: 1 的体积比混匀，并分别将3C蛋白酶与PDCoV-N-GST重组蛋白按照1: 100 ～1：200的重量比例混匀，置于4 ℃翻转摇床中分别作用8 h～24 h；然后将混合物加入层析柱中，收集流穿液即为切除GST标签的猪德尔塔冠状病毒重组N蛋白。

在上述的间接ELISA检测试剂盒中，3C蛋白酶与PDCoV-N-GST重组蛋白的重量比为1：200；翻转摇床内的反应时间为16 h。

本发明的有益效果如下：

本发明的包被抗原为猪德尔塔冠状病毒N蛋白，为原核表达的上清可溶性蛋白，免疫原性较好；其次该包被蛋白纯化后经高活性3C蛋白酶切后无痕去除标签，提高了蛋白的纯度，避免了检测猪由于免疫其他原核表达蛋白的亚单位疫苗标签带来的假阳性，保证了检测结果特异性；此外，本发明能高效特异性检测母乳中猪德尔塔冠状病毒感染后诱导的IgA抗体，不与其他导致腹泻的病原交叉感染，且检测敏感性可达1：800；本发明的试剂稳定性较好，批内批间变异系数CV%<8%，重复性较高，通过过与免疫荧光实验比对，该发明的重复性为89.19%。

附图说明

图1为本发明的PDCoV N基因的PCR扩增电泳结果。泳道M，DL 2000 Marker；泳道1，PDCoV N基因；泳道2，阴性对照；

图2为本发明的重组质粒pGEX-6p-1-PDCoV-N双酶切验证。泳道M，DL 5000Marker；泳道1，BamH I和Xho I双酶切鉴定pGEX-6p-1-PDCoV-N质粒；泳道2，pGEX-6p-1-PDCoV-N的重组质粒；

图3为本发明的重组N-GST蛋白的SDS-PAGE分析。泳道M，蛋白质分子质量标准；泳道1，未诱导的菌体；泳道2，诱导后全菌蛋白；泳道3，诱导后的菌体裂解上清；泳道4，诱导后的菌体裂解沉淀；

图4为本发明的纯化重组N-GST蛋白的SDS-PAGE分析。泳道M，蛋白质分子质量标准；泳道1，未结合上清液；泳道2，流穿液；泳道3，洗涤液；泳道4、5，洗脱液；

图5为本发明的酶切重组N-GST蛋白的SDS-PAGE分析。泳道M，蛋白质分子质量标准；泳道1，N-GST；泳道2，N；

图6为本发明的纯化重组N蛋白Western blotting鉴定。泳道M，蛋白质分子质量标准；泳道1，猪源PDCoV阳性血清；泳道2，猪源PDCoV阴性血清；

图7为本发明的猪德尔塔冠状病毒N蛋白IgA抗体间接ELISA方法特异性结果；

图8为本发明的猪德尔塔冠状病毒N蛋白IgA抗体间接ELISA方法灵敏度结果。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实验材料

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。其中：PrimeScriptTM Ⅳ 1ST strand cDNA Synthesis Mix、DL 15000 DNAMarker、DL DNA 5000 Marker、DL DNA 2000 Marker均购自宝日医生物技术有限公司（北京）；KOD FX Neo购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；Quick Ligation™ Kit、限制性内切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ均购自New England BioLabs股份有限公司；LB琼脂培养基和LB肉汤培养基购自广东省凯微生物科技有限公司；病毒总核酸快速抽提试剂盒购自广州美基生物科技有限公司；UE DNA凝胶回收试剂盒购自苏州优逸兰迪生物科技有限公司；高纯度质粒DNA小量提取试剂盒购自北京金沙生物科技有限公司；Trans5α 化学感受态细胞、BL21（DE3）化学感受态细胞均购自北京全式金生物技术股份有限公司；Goat Anti-Rabbit IgG (H&L)HRP、Goat Anti-Pig IgG (H&L) HRP购自Bioworld Technology公司；亲和层析柱、5×蛋白上样缓冲液、ECL化学发光试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；TMB Single Solution购自Life Technologies；Glutathione Sepharose 4B购自Cytiva公司；牛血清白蛋白, Fraction Ⅴ（BSA）、Triton-100、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；XKL0901预染蛋白Maker（8~180kDa）购自广州欣凯来生物技术有限公司；10 kDa蛋白超滤管购自Merck公司；酶标板购自美国康宁(Corning)公司；PDCoV-HeN17毒株（GenBank登录号: OR230676.1）、原核表达载体pGEX-6P-1（索来宝）、3C蛋白酶、PDCoV阳性及阴性血清、猪流行性腹泻病毒（PEDV）抗体阳性初乳、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）抗体阳性初乳、猪瘟病毒（CSFV）抗体阳性初乳、轮状病毒（RV）抗体阳性初乳均由广东省农业科学院动物卫生研究所生物技术实验室保存。

本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。

实施例一重组N蛋白的制备

1 方法

1.1 引物设计及合成

根据GenBank上已公布的PDCoV N基因序列（GenBank登录号: OR230676.1，N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示），结合pGEX-6P-1原核表达载体的多克隆酶切位点的序列，利用SnapGene（ver. 6. 0. 2）软件设计特异性扩增PDCoV的N基因的引物N-F: 5’-CGGGATCC ATG GCT GCA CCA GTA GTC C-3’（加粗处为BamH I酶切位点）/N-R: 5’-CCCTCGAGC TAC GCT GCT GAT TCC TGC-3’（加粗处为Xho I酶切位点），由生工（上海）股份有限公司广州分公司进行引物合成。

1.2 RNA提取及目的基因扩增

按照病毒核酸提取试剂盒说明书提取PDCoV基因组，经反转录后获得cDNA。反转录反应体系：5× PrimeScript^TMⅣ 1^STstrand cDNA Synthesis Mix 4 μL，RNA 1 μg，用ddH₂O补至20 μL。反转录反应条件：42 ℃ 20 min，70 ℃ 15 min。然后以该cDNA为模板经PCR扩增得到N基因。PCR反应体系为：2× PCR Buffer 25 μL，2 mM dNTPs 10 μL，PDCoV-N-F 1.5 μL，PDCoV-N-R 1.5 μL，cDNA 3 μL，ddH₂O 8 μL，KOD FX Neo 1 μL。PCR反应条件为：预变性94 ℃ 5 min；变性98 ℃ 9 s，退火58 ℃ 30 s，延伸68 ℃ 45 s，30个循环；终延伸72 ℃ 10 min。

1.3 原核表达载体pGEX-6p-1-PDCoV-N的构建及鉴定

经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，利用胶回收试剂盒对PCR产物回收纯化；用限制性内切酶BamH Ⅰ及限制性内切酶Xho Ⅰ分别对PDCoV-N基因片段和原核表达载体pGEX-6P-1进行双酶切，反应条件为37 ℃ 2 h，回收酶切片段，用Quick Ligation™ Kit进行连接反应。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，利用质粒抽提试剂盒进行质粒提取，后经测序及双酶切鉴定为阳性的质粒命名为pGEX-6p-1-PDCoV-N，-20 ℃保存备用。

1.4 N重组蛋白及表达形式分析

将鉴定重组质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞，挑取阳性单克隆菌落并置于恒温振荡培养箱中37 ℃，220 r/ min扩大培养至OD 600 nm值为0.6~0.8。取2 mL菌液作为未诱导对照，其余菌液加入IPTG诱导剂，使其终浓度为1.0 mmol/L，继续置于恒温振荡培养箱中16 ℃，160 r/ min培养12~16 h。诱导后4 ℃ 12,000 r/min离心10 min离心收集菌体，并用PBS洗涤菌体沉淀并重悬，超声波破碎菌体，4 ℃ 12,000 r/min离心1 h收集上清和沉淀。最后加入5× SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，使其浓度为1× SDS-PAGE，煮沸变性10 min，进行SDS-PAGE鉴定，观察蛋白的表达形式。

1.5 PDCoV-N-GST重组蛋白纯化、鉴定及酶切

诱导后菌体经超声破碎后，4 ℃ 12,000 r/ min离心1 h收集上清，使用0.45 μm的滤膜对上清液进行滤过除菌。将上清液和Glutathione Sepharose 4B按照10: 1的比例混匀，置于翻转摇床中，4 ℃过夜结合。将结合混液转移至亲和层析柱中，靠重力流尽液体，后用5~10倍体积的PBS溶液清洗介质5~10次。加入GST标签重组蛋白洗脱缓冲液【1M TrisHCl（pH8.0），2M NaCl，10mM L-还原性谷胱甘肽】冰上静置20 min进行蛋白洗脱，收集洗脱液后使用10 kDa的蛋白超滤管进行蛋白浓缩，后使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

用纯化后的重组PDCoV-N-GST蛋白（其编码核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示）在SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上进行Western blot检测，用TBS配制5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液，室温封闭2 h；一抗为PDCoV阳性血清（1: 1000稀释），4 ℃孵育过夜；二抗为HRP标记的羊抗猪IgG（1: 5000稀释），室温孵育1 h，用ECL化学发光试剂盒显色观察。

PDCoV-N-GST重组蛋白的标签切除：

将鉴定正确的PDCoV-N-GST重组蛋白和Glutathione Sepharose 4B按照2: 1的比例混匀，并按1: 100、1：200（w/w）比例加入3C蛋白酶，置于4 ℃翻转摇床分别作用8H、16H和24H。将上述混合物加入层析柱中，收集流穿液即为切除GST标签的N蛋白。取纯化后的重组PDCoV-N-GST蛋白和N蛋白进行SDS-PAGE电泳后，用考马斯亮蓝染色观察。

经检测发现3C蛋白酶与PDCoV-N-GST重组蛋白按照1: 200，4 ℃，切割16h效果最佳。

2.1 结果

经RT-PCR扩增得到PDCoV-HeN17株N基因，电泳可见1000 bp左右的目的条带，与预期1045 bp相符（图1）。将双酶切产物进行胶回收纯化后（PDCoV-N基因与pGEX-6P-1原核表达载体）进行连接转化。将测序结果正确的重组表达质粒经限制性内切酶Xho I及BamH I双酶切后，可见约5000 bp和1000 bp左右的条带，符合pGEX-6P-1（4960 bp）和N（1045 bp）预期长度（图2）。

转化重组质粒pGEX-6p-1-PDCoV-N的阳性菌液经1.0 mmol/L IPTG诱导后，将菌体超声波裂解后的上清和沉淀进行SDS-PAGE，结果如图3所示，PDCoV-N-GST重组蛋白与蛋白预期大小一致，约69 kDa；重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式表达，其中上清中的表达量较大；将上清液经Glutathione Sepharose 4B过柱纯化后，得到比较单一的PDCoV-N-GST蛋白（图 4）。为了进一步得到原核表达的PDCoV N蛋白，本发明用3C蛋白酶进行柱上切割，去除GST标签，最后将收集的切割后洗脱液经SDS-PAGE鉴定，在44 kDa左右得单一目的蛋白条带，与PDCoV N蛋白一致（图 5）。该蛋白经过10 kDa的蛋白超滤管浓缩后，BCA法测定N蛋白浓度为12.6 mg/mL。为了进一步验证该蛋白的免疫原性，用PDCoV阳性猪的血清作为一抗，经Western blot检测，在43 kDa附近出现单一特异性条带（图 6）。上述结果表明，利用原核表达系统正确表达并纯化后获得了无纯化标签且反应原性良好PDCoV N蛋白。

实施例二间接ELISA检测方法的建立

1. 方法

最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定：运用棋盘法的方法，使用包被液(0.05M碳酸氢盐包被液(pH9.6))将包被抗原(重组N蛋白)稀释成2、1.5、1、0.75、0.5、0.25μg/mL后包被于酶标板中，每孔100μL，于4℃孵育16h。用5%BSA(w/v)进行封闭后将猪德尔塔冠状病毒阳性初乳及猪德尔塔冠状病毒阴性初乳做1:50、1:100、1:200、1:400倍稀释，每孔100μL。羊抗猪lgA-HRP做1:10000倍稀释后每孔加入100μL，TMB单组分显色液每孔加入100μL，25℃显色15min，终止液每孔加入50μL终止反应，于酶标仪测定450nm吸光度下检测孔内的吸光度，并计算其P/N值。从而确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度。

封闭液的选择：根据筛选的条件，将封闭液分别用5％和10％的脱脂奶粉；1％、3％、5％和10%的BSA进行封闭。利用P/N值确定最佳封闭液。

封闭时间的确定：根据筛选的条件最佳条件，用最佳封闭液分别进行30、60、90和120min封闭，利用P/N值确定最佳封闭时间。

最佳二抗稀释液的确定：根据筛选的条件，分别使用商品化抗体稀释液、5%BSA(w/v)和PBST（含0.25% v/v Tween-20）对羊抗猪lgA-HRP进行稀释后孵育。利用P/N值确定最佳二抗稀释液。

最佳二抗品牌确定：根据筛选的条件，分别使用Abcam、Bio-rad和Bio dragon的羊抗猪lgA-HRP进行稀释后孵育。利用P/N值确定最佳二抗品牌。

最佳二抗稀释度的确定：根据筛选的条件最佳条件，分别将羊抗猪lgA-HRP按1:10000、1:15000、1:20000、1:50000和1:10000的比例进行稀释。利用P/N值确定最佳二抗稀释度。

临界值的确定：按照测得的最佳反应条件，对42份阴性初乳进行检测，于酶标仪测定450nm吸光度下检测孔内的吸光度，根据统计学分析原理，判定阳性值为OD450≥平均值+3×标准差，计算出本检测方法临界值。

2. 结果

通过棋盘法确定该抗原的最佳包被浓度为0.75μg/mL，初乳最佳稀释度为1:100倍，如表1：

表1 最佳抗原包被浓度及血清稀释度的筛选

另本发明通过对各个条件进行反复试验最终得出该检测方法的最佳条件为：抗原以0.75μg/mL的浓度于4℃条件下包被16h，以5%BSA(w/v)为封闭液（表2）于37℃条件下封闭2h（表3），初乳以1:100的比例稀释于5%BSA(w/v)中于37℃条件下反应120min，羊抗猪lgA-HRP抗体（表4）稀释于商品化抗体稀释液中（表5）以1:10000的比例（表6）于37℃条件下反应1h。

表2 最佳封闭液的筛选

表3 最佳封闭时间的筛选

表4 最佳二抗稀释液的筛选

表5 最佳二抗的筛选

表6 最佳二抗稀释倍数的筛选

按照筛选的最佳反应条件，对42份阴性初乳及进行检测，使用酶标仪读取酶标板各孔OD_450nm，当初乳样本OD_450nm≥0.252，判定为阳性，当初乳样本OD_450nm≤0.208，判定为阴性，当初乳样本OD_450nm介于0.252与0.208之间时，判定为疑似。

实施例三方法学考察

1. 方法

1.1 特异性试验：

使用PDCoV IgA间接ELISA检测方法，对实验室保存的PEDV、TGEV、CSFV、PRRSV和PDCoV抗体阳性母乳进行检测，检验所建立的方法是否具有特异性，同时以PDCoV抗体阴性母乳为对照，设置检测方法阴性对照。

1.2 灵敏性试验：

随机选取3份PDCoV抗体阳性母乳按照不同倍数稀释，分别稀释至1:100～1:12800。利用间接ELISA检测方法进行检测，验证其灵敏性。

1.3 批内及批间重复性试验：

在与上述一致的反应条件下，随机选取4份PDCoV抗体阳性母乳和4份阴性母乳在同一块ELISA包被板上进行检测，每份母乳做4个重复，用来做批间重复性试验；相同的，随机选取4份阳性母乳与4份阴性母乳在4个不同时间点包被的ELISA酶标板上进行ELISA检测，分析检测结果，计算OD_450nm的平均值、标准差及变异系数，验证该方法的重复性。

1.4 符合性试验

随机选取的74份猪临床初乳进行检测，利用建立的间接ELISA检测试剂盒与间接免疫荧光法进行对比；

比较并分析本实施例的重组N蛋白建立的间接ELISA检测试剂盒、采用重组PDCoV-N-GST蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA检测试剂盒、采用间接免疫荧光法之间检测结果的符合率。

2. 结果

2.1 特异性结果

结果显示，猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、轮状病毒抗体阳性初乳检测均呈现阴性（图7），说明本检测方法具有较强的特异性。

2.2 灵敏度结果

结果显示，经1：800倍稀释后仍可判定阳性结果（图8），由此可见本检测方法具有较好的灵敏性。

2.3 批内及批间重复性结果

结果显示，其变异系数均在8%以内（表7），说明本检测方法具有较好的重复性。

表7 批内与批间重复性结果

P代表阳性样品，N代表阴性样品。

2.4 符合性结果

表8 重组N蛋白建立的间接ELISA检测试剂盒的符合性结果

表9 PDCoV-N-GST蛋白建立的间接ELISA检测试剂盒的符合性结果

结果显示，本检测方法（表8）阳性初乳共58份，阴性初乳16份；间接免疫荧光方法（表9）检出阳性初乳55份，阴性初乳19份。两种方法共同检出阳性初乳55份，阴性初乳16份，总体符合率为95.95%，明显优于PDCoV-N-GST蛋白建立的间接ELISA检测试剂盒的检测结果。

实施例四临床初乳检测

应用实施例3建立好的间接ELISA检测试剂盒进行检测，对广东省8个发生过腹泻的种猪场的122份临床初乳进行检测。

对8个发生过腹泻的种猪场的122份猪临床初乳进行检测，参考表10，测得猪德尔塔冠状病毒抗体阳性率分别为72.5％、66.67％、66.67％、44.44％、25％、33.33％、37.5％、22.22％，总体的阳性率为52.46％。

表10 间接ELISA检测试剂盒的初乳检测结果

结果分析

1.本领域中，并未有人开发出检测母乳中猪德尔塔冠状病毒感染后诱导的IgA抗体的试剂盒，本发明采用特异性的N蛋白，可以实现母乳中IgA的特异性、高灵敏、高符合率的检测目标；

2.通过本发明的实施例案例证明，采用3C蛋白酶进行标签无痕切除，可以提高检出结果的特异性、敏感性和符合率；

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.采用如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的猪德尔塔冠状病毒重组N蛋白制备间接ELISA检测试剂盒的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述间接ELISA检测试剂盒为用于检测母乳中猪德尔塔冠状病毒感染后诱导的IgA抗体的间接ELISA检测试剂盒。

3.一种用于检测母乳中猪德尔塔冠状病毒感染后诱导的IgA抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，含有包被酶标板；所述包被酶标板中的包被抗原为如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的猪德尔塔冠状病毒重组N蛋白。

4.根据权利要求3所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括阴性初乳、阳性初乳、酶标抗体、洗涤液、稀释液、包被液、封闭液、显色液、终止液。

5.根据权利要求4所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述酶标抗体为羊抗猪IgA-HRP，所述洗涤液为PBST；所述洗涤液含0.25% v/v Tween-20，所述稀释液为含5%BSA(w/v) 的PBS溶液，所述包被液为pH为9.6的0.05mol/L的磷酸缓冲液，所述封闭液为含5%BSA(w/v) 的PBS溶液，所述显色液为TMB，所述终止液为1M HCl。

6.根据权利要求3所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述猪德尔塔冠状病毒重组N蛋白的制备方法为：

7.根据权利要求6所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述IPTG诱导为加入IPTG至终浓度为1 mM，在温度为16℃条件下诱导表达16 h。

8.根据权利要求6所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，PDCoV-N-GST重组蛋白的标签切除方法为：

PDCoV-N-GST重组蛋白和Glutathione Sepharose 4B按照2: 1 的体积比混匀，并分别将3C蛋白酶与PDCoV-N-GST重组蛋白按照1: 100 ～1：200的重量比例混匀，置于4 ℃翻转摇床中分别作用8H～24H；然后将混合物加入层析柱中，收集流穿液即为切除GST标签的猪德尔塔冠状病毒重组N蛋白。

9.根据权利要求8所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，3C蛋白酶与PDCoV-N-GST重组蛋白的重量比为1：200；翻转摇床内的反应时间为16 h。