CN118112124A - 一种灵敏且易用的非标记单细胞蛋白质组学分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物分析技术领域，尤其涉及一种灵敏且易用的非标记单细胞蛋白质组学分析方法。本发明提供的一种灵敏且易用的非标记单细胞蛋白质组学分析方法，解决了现有技术中针对单细胞水平的蛋白质组学前处理和质谱检测工艺不合理，单个细胞中鉴定和定量的蛋白质数量准确性低的技术问题。本发明采用一种全新的单细胞蛋白质提取方法，在无需任何定制器械或耗材、不改造仪器的前提下实现对单个细胞中的蛋白质组学分析，且能从单个人源常规细胞中检测到超过2000种包含精确定量信息的蛋白质，获得的单细胞蛋白质组数据集深度广且通量高。同时，本发明无需添加标记试剂和增益通道蛋白，无需考虑增益通道蛋白对单细胞数据所产生的不利影响。
Description
技术领域
本发明涉及生物分析技术领域，尤其涉及一种灵敏且易用的非标记单细胞蛋白质组学分析方法。
背景技术
生物体的组织和器官都是由大量不同形态、功能、分子的细胞所构成。所以说，细胞是组成人体结构和功能的基本单元。就人体而言，人体的各个组织和器官中的细胞数量大约为4×1013。在一个组织中，各种功能性独特的细胞间相互作用，互相支持又互相牵制，由此构成了一个庞大的细胞社会结构，这对于维持生物体生长发育和器官功能至关重要。近年来随着单细胞基因组和转录组测序技术的发展，人们发现，正常细胞中每个细胞的基因组和基因表达也存在不同程度的差异，对于健康人，部分细胞的异质性对正常生理功能并没有明显的影响，而对于病人来讲，癌变细胞的异质性则有可能放大了它们对生理活动的影响。大量的传统研究都聚焦于组织水平，或者是细胞群体水平，这些数据忽略了细胞个体之间的差异，导致细胞之间的异质性淹没在于数据的平均值之中。单细胞测序技术已成为研究细胞异质性和识别不同表型细胞类型的强大工具。然而由于蛋白质分子的物理和化学特征显著不同于基于核酸的DNA或RNA分子，在单细胞中测定如此微量的蛋白质，需要克服两个障碍。首先，蛋白质分子没有合适的扩增技术；如何有效富集蛋白质或者最大限度地减少在实验过程中的蛋白质损失是一个首要棘手的技术难题。其次，受限于质谱灵敏度的影响，难以有效的测定如此微量的蛋白质。单细胞蛋白质组(single cell proteome,SCP)技术，正处在急剧发展的阶段。
目前的SCP分析方法大致可以分为三个类型：基于抗体的方法、基于单分子蛋白质测序的方法、基于质谱(mass spectrometry,MS)的方法。
质谱方法是目前蛋白质组分析的主流，自然也成为SCP分析方法的首选。从质谱技术角度来看，SCP分析主要分为两种：无标记分析和标记分析。所谓无标记SCP指的是，完全基于质谱信号对蛋白质进行定性和定量的微量分析技术，而标记SCP则指示蛋白质/肽段通过化学标记之后再利用质谱对其进行定性和定量分析的技术。而现有的基于质谱的单细胞蛋白质组学方法大多高度依赖于特殊的自制前处理装置、微流控芯片、或改造后需要特殊维护的液相色谱系统。这些前处理过程或需定制特殊的微型毛细管管路及进样阀，或需定制特殊的微流控芯片，在推广应用方面仍有很高的门槛。
发明内容
本发明提供的一种灵敏且易用的非标记单细胞蛋白质组学分析方法，解决了现有技术中针对单细胞水平的蛋白质组学前处理和质谱检测工艺不合理，单个细胞中鉴定和定量的蛋白质数量准确性低的技术问题。
解决上述技术问题采用的一些实施方案包括：
一种灵敏且易用的非标记单细胞蛋白质组学分析方法，包括如下步骤：
制备Mix液；
制备细胞悬液；
制备一次混合液，其中，所述一次混合液为所述细胞悬液中的单细胞与500nl的所述Mix液的混合物，将该混合物放置于玻璃玻片上；
将制备的所述一次混合液加热至37℃并保温60分钟得到一次制取液，其中，保温过程中每隔5分钟向所述一次混合液中补充500nl的系统水；系统水是由超纯水经过0.22μm的滤膜过滤之后，再经过20min的超声得到；
向制得的一次制取液中再次加入500nl的Mix液得到二次混合液；
将制备的所述二次混合液加热至37℃并保温60分钟得到包含肽段的二次制取液，其中，保温过程中每隔5分钟向所述二次混合液中补充500nl的系统水；
将制取的所述二次制取液用6μl溶液溶解得到样本液，其中，所述溶液为0.1％FA/H2O；
采用飞行时间质谱仪以及色谱仪进行分析，得到单细胞蛋白质组学数据；
其中，100μl所述Mix液包括60μl的H2O、20μl的0.5％-3％DDM、10μl的1M TEAB、10μl的50ng-500ng/μl Trypsin。
作为优选，将制取的二次制取液用6μl溶液溶解得到样本液中，制取的二次制取液用6μl溶液溶解得到样本液后再次用2μl溶液溶解被6μl溶液溶解后剩余的二次抽取液。
作为优选，所述飞行时间质谱仪为捕集离子淌度飞行时间质谱仪timsTOF Pro2。
作为优选，所述色谱仪为纳升级液相色谱仪nanoElute。
作为优选，制备细胞悬液包括如下步骤：
吸去细胞培养皿中的细胞培养基，加入2ml 37℃1×PBS轻柔漂洗贴壁细胞，加入1ml 4℃胰蛋白酶覆盖贴壁细胞表面，待显微镜下可观察到细胞变圆、边缘透亮时，然后加入1ml含有FBS的DEME培养基终止酶解，并收集至15ml离心管内离心3分钟，弃去上清液后，重新用37℃1×PBS分散细胞并计数得到前级悬液，将前级悬液过滤后得到所述细胞悬液。
作为优选，所述细胞悬液中的单细胞根据细胞的平均直径、圆度提取获得单个细胞。
作为优选，所述离心速度为1200RPM/分钟。
作为优选，所述加入2ml 37℃1×PBS轻柔漂洗贴壁细胞循环至少两次。
作为优选，所述前级悬液的细胞浓度为2×105/ml。
作为优选，所述前级悬液过40μm滤膜除去成团细胞和大颗粒，得到所述细胞悬液。
相对于现有技术，本发明具有如下优点：
1、无需微流控芯片；无需昂贵的超声设备；无需添加昂贵的标记试剂；无需对系统进行难以维护的改造；可规模化的实验单细胞蛋白质组的采集，兼容市售的主流液质联用质谱仪。
2、本发明在无需任何定制器械或耗材、不改造仪器的前提下实现对单个细胞中的蛋白质组学分析，且能从单个人源常规细胞中检测到超过2000种包含精确定量信息的蛋白质，获得的单细胞蛋白质组数据集深度广且通量高，可以与现有主流10X Genomics等单细胞转录组数据的深度匹敌。
3、本发明采用一种全新的单细胞蛋白质提取方法，通过“一锅法”的提取方法，无需除盐，减少单细胞肽段在转管过程中的损失。进一步简化实验步骤，反应时间缩短至2小时，通过增加液滴密度和玻片数量，可以进一步提升通量和规模。
4、本发明可全程使用相关的分液系统添加液体和分选细胞，降低人为操作对微量样品处理引入的误差，减少处理大批量样品时所需的人力和时间成本，实现真正快速、高精度、无损、低样本容量、全自动的单细胞分离。
5、本发明无需添加标记试剂和增益通道蛋白，无需考虑增益通道蛋白对单细胞数据所产生的不利影响。
附图说明
出于解释的目的，在以下附图中阐述了本发明技术的若干实施方案。以下附图被并入本文本并且构成具体实施方案的一部分。在一些情况下，以框图形式示出了熟知的结构和部件，以便避免使本发明主题技术的概念模糊。
图1为本发明中超敏且易用的单细胞蛋白质组学技术流程图。
图2为500nl反应体系中的3次单细胞蛋白质组的overlap。
图3为本发明在捕集离子淌度飞行时间质谱仪timsTOF Pro上表现的能力其中：
图3a：用于timsTOF Pro的单细胞蛋白质组学样品设计；
图3b：来自HEK-293T与HeLa两种细胞系的单个细胞的蛋白质定量数据；
图3c来自HEK-293T与HeLa两种细胞系的单个细胞的蛋白质组的聚类结果；
图3d来自HEK-293T与HeLa两种细胞系的单个细胞的蛋白质组的主成分分析结果。
具体实施方式
下面示出的具体实施方案旨在作为本发明主题技术的各种配置的描述，并且，不旨在表示本发明主题技术可被实践的唯一配置。具体实施方案包括具体的细节旨在提供对本发明主题技术的透彻理解。然而，对于本领域的技术人员来说将清楚和显而易见的是，本发明主题技术不限于本文示出的具体细节，并且，可在没有这些具体细节的情况下被实践。
参照图1至图3所示，一种灵敏且易用的非标记单细胞蛋白质组学分析方法，包括如下步骤：
制备Mix液；
制备细胞悬液；
制备一次混合液，其中，所述一次混合液为所述细胞悬液中的单细胞与500nl的所述Mix液的混合物，将该混合物放置于玻璃玻片上；
将制备的所述一次混合液加热至37℃并保温60分钟得到一次制取液，其中，保温过程中每隔5分钟向所述一次混合液中补充500nl的系统水；
向制得的一次制取液中再次加入500nl的Mix液得到二次混合液；
将制备的所述二次混合液加热至37℃并保温60分钟得到包含肽段的二次制取液，其中，保温过程中每隔5分钟向所述二次混合液中补充500nl的系统水；
将制取的所述二次制取液用6μl溶液溶解得到样本液，其中，所述溶液为0.1％FA/H2O；
采用飞行时间质谱仪以及色谱仪进行分析，得到单细胞蛋白质组学数据；
其中，100μl所述Mix液包括60μl的H2O、20μl的0.5％-3％DDM、10μl的1M TEAB、10μl的50ng-500ng/μl Trypsin。
在一些实施例中，将制取的二次制取液用6μl溶液溶解得到样本液中，制取的二次制取液用6μl溶液溶解得到样本液后再次用2μl溶液溶解被6μl溶液溶解后剩余的二次抽取液。
所述飞行时间质谱仪为捕集离子淌度飞行时间质谱仪timsTOF Pro2。
所述色谱仪为纳升级液相色谱仪nanoElute。
在一些实施例中，制备细胞悬液包括如下步骤：
吸去细胞培养皿中的细胞培养基，加入2ml 37℃1×PBS轻柔漂洗贴壁细胞，加入1ml 4℃胰蛋白酶覆盖贴壁细胞表面，待显微镜下可观察到细胞变圆、边缘透亮时，然后加入1ml含有FBS(胎牛血清)的DEME培养基终止酶解，并收集至15ml离心管内离心3分钟，弃去上清液后，重新用37℃1×PBS分散细胞并计数得到前级悬液，将前级悬液过滤后得到所述细胞悬液。
所述细胞悬液中的单细胞根据细胞的平均直径、圆度提取获得单个细胞。
所述离心速度为1200RPM/分钟。
所述加入2ml 37℃1×PBS轻柔漂洗贴壁细胞循环至少两次。
所述前级悬液的细胞浓度为2×105/ml。
所述前级悬液过40μm滤膜除去成团细胞和大颗粒，得到所述细胞悬液。
下面结合具体的应用例进一步介绍本发明的技术方案：
首先按照下表配置Mix液：
| 体积(μL) | 100 |
| H2O | 60 |
| 0.5％-3％DDM | 20 |
| 1M TEAB | 10 |
| 50ng-500ng/μl Trypsin | 10 |
将配置好的Mix液，利用的分液模块将500nl的液体加入到玻片的制定位置。
制备合适的单细胞数目的单细胞悬液，通过全自动单细胞分离系统分选单细胞至加入Mix液的指定位置；
打开的加热模块，设置为50℃，使玻片的温度为37℃。打开的加湿模块，减少液体的蒸发。
每隔5分钟将500nl的系统水打入到玻片的原有位置；反应1小时后，在原设定的位置在加入一次Mix液，随后继续每隔5分钟添加500nl的系统水。
再反应1小时后，将玻片取出，将玻片上原有的位置的肽段用2ul的A液复溶，将其取入进样瓶。为减少肽段损失，再次使用2ul的A液润洗玻片的单细胞的位置。
采用纳升级液相色谱仪进行液相色谱梯度分离，采用捕集离子淌度飞行时间质谱仪timsTOF Pro2进行质谱检测；
Nano-LC-MS/MS，将抽干的肽段样品用流动相A(H2O，0.1％FA)复溶，通过Bruker公司的nanoElute进行分离。样品进入Bruker TEN色谱柱串联。
其中，色谱柱为75μm内径，1.9μm柱料粒径，10cm柱长，分别以100ml/200nl/300nL/min流速通过如下有效梯度进行分离：0min,2％流动相B(ACN，0.1％FA)；0～30min，流动相B从2％线性升至35％；30～30.50min，流动相B从35％升至95％；30.50～32.90min，95％流动相B。纳升液相分离末端直接连接质谱仪并按如下参数进行检测：
经过液相分离的肽段通过CaptiveSpray源离子化后进入到串联质谱仪timsTOFPro2进行DDA(Data Dependent Acquisition)模式检测。
质谱检测
经过液相分离的肽段通过CaptiveSpray源离子化后进入到串联质谱仪timsTOFPro2(Bruker Corporation,Billerica,MA)进行DDA(Data Dependent Acquisition)模式检测。
主要参数设置：离子源电压设置为1.7kV；斜坡时间为200ms，总周期时间为1.03s，包括1次全程TIMS-MS扫描和4次平行累积-串联碎裂(PASEF)MS/MS扫描，离子迁移率(1/K0)扫描范围为0.75～1.30vs/cm2，MS/MS扫描的强度阈值和靶强度分别为500和5000，MS/MS扫描仅选择二重或三重电荷特征；主动排除设置为0.30分钟，一级质谱扫描范围100～1,700m/z；离子淌度范围是0.60-1.60V.S/cm2，二级质谱扫描范围为100-1700m/z。一级扫描累积时间100ms，二级扫描累积时间100ms，离子碎裂模式为CID，碎片离子在TOF中进行检测。动态排除时间设定为0.3min。
采用PEAKS online搜索引擎和/或MaxQuant搜索引擎对质谱数据进行数据库检索；其中：
所述PEAKS online搜索引擎采用的数据库为UniProt/SwissProt humandatabase，检索条件包括：胰酶酶切，肽段长度为6–45个氨基酸，允许不大于2–5个漏切位点；可变修饰为蛋氨酸的氧化和肽段N-端的乙酰化；Denovo匹配时前体离子的容错度为15ppm，碎片离子的容错度为0.001–0.05Da或1–10ppm；假阳性率小于1–5％；
所述MaxQuant搜索引擎的人源蛋白质数据库为UniProt/SwissProthumandatabase，检索条件包括：胰酶酶切，最小肽段长度为6–7个氨基酸；允许不大于2–5个漏切位点；可变修饰为蛋氨酸的氧化和肽段N-端的乙酰化；谱图、肽段、蛋白质的假阳性率均要求小于1–5％。
在实际操作过程中：无需微流控芯片；无需昂贵的超声设备；无需添加昂贵的标记试剂；无需对系统进行难以维护的改造；可规模化的实验单细胞蛋白质组的采集，兼容市售的主流液质联用质谱仪。
同时，本发明在无需任何定制器械或耗材、不改造仪器的前提下实现对单个细胞中的蛋白质组学分析，且能从单个人源常规细胞中检测到超过2000种包含精确定量信息的蛋白质，获得的单细胞蛋白质组数据集深度广且通量高，可以与现有主流10X Genomics等单细胞转录组数据的深度匹敌。
本发明采用一种全新的单细胞蛋白质提取方法，通过“一锅法”的提取方法，无需除盐，减少单细胞肽段在转管过程中的损失。进一步简化实验步骤，反应时间缩短至2小时，通过增加液滴密度和玻片数量，可以进一步提升通量和规模。
本发明全程使用的分液系统添加液体和分选细胞，降低人为操作对微量样品处理引入的误差，减少处理大批量样品时所需的人力和时间成本，实现真正快速、高精度、无损、低样本容量、全自动的单细胞分离。
本发明无需添加标记试剂和增益通道蛋白，无需考虑增益通道蛋白对单细胞数据所产生的不利影响。
本发明中所用的主要仪器如下表所示：
本发明中所用主要试剂和耗材如下表所示：
| 试剂/耗材名称 | 货号 | 来源 |
| 玻片 | CSC-5350-5 | Cellenion公司 |
| 胰蛋白酶 | V5280 | Promega |
| 四乙基溴化铵TEAB | 90114 | Thermo Scientific |
| 十二烷基-β-D-麦芽糖苷 | D806359-1g | 麦克林 |
具体地说：
制备细胞悬液：吸去细胞培养皿中的细胞培养基，加入2ml 37℃1×PBS轻柔漂洗贴壁细胞，共两次；加入1ml 4℃胰蛋白酶覆盖贴壁细胞表面，待显微镜下可观察到细胞变圆、边缘透亮时，加入含有FBS(胎牛血清)的DEME培养基终止酶解，然后转入15mL离心管，1200RPM离心3min，弃去上清后，重新用37℃1×PBS分散细胞并计数，使细胞浓度为2×105/ml，将细胞悬液过40μm滤膜除去成团细胞和大颗粒。
制备一次混合液，其中，所述一次混合液为所述细胞悬液中的单细胞与500nl的所述Mix液的混合物：使用X1单细胞分选系统分选单个细胞，清洗喷针后，操作喷针吸取10μl制备好的细胞悬液，调节喷针电压使其能形成稳定、大小合适的液滴。启动分选程序，点击mapping按钮分析待分选细胞的平均直径、圆度，并根据结果设置识别单细胞所用的参数，设置好待分选的孔位后，分选开始，将单个细胞分选到玻片的固定位置；
然后，使用X1将500nl的Mix液打在玻片的固定位置，待/>X1单细胞分选系统初始化完成、系统清洗完毕后，操作喷针吸取13μl制备好的Mix液，调节喷针电压使其能形成稳定、大小合适的液滴。启动分液系统；将500nl的液滴分选在玻片的固定位置。
制备一次混合液，打开系统自带的加热模块，设置反应温度为50℃，确保玻片的反应温度为37℃左右。同时打开仪器的加湿模块，减缓液体的蒸发。将喷针清洗干净，每隔5分钟，按照之前设置好的固定位置将500nl的系统水打入玻片的固定位置。37℃反应1小时后，操作喷针吸取13μl制备好的Mix液，调节喷针电压使其能形成稳定、大小合适的液滴。启动分液系统；将500nl的液滴分选在玻片的固定位置，之后继续每隔5分钟将500nl的系统水添加到玻片的固定位置。继续反应1小时后，将玻片制备的肽段用6μl0.1％FA/H2O溶解，放入进样瓶中，制得样本液。
质谱数据采集：
本发明使用捕集离子淌度飞行时间质谱timsTOF Pro2进行数据采集。
使用捕集离子淌度飞行时间质谱timsTOF Pro2进行数据采集时，取6μl样本液进行蛋白质组学分析，采用纳升级液相色谱仪nanoElute进行色谱分离，采用捕集离子淌度飞行时间质谱timsTOF进行质谱检测，Bruker TEN色谱柱(75μm内径，1.9μm柱料粒径，10cm柱长),流动相A为，流动相A为0.1wt％FA/99.9％H2 O，流动相B为0.1wt％FA/99.9％ACN，柱温为40℃，流速为100nl/min。液相色谱分离梯度下表所示：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0.00 | 96 | 4 |
| 30 | 65 | 35 |
| 30.5 | 5 | 95 |
经过液相分离的肽段通过CaptiveSpray源离子化后进入到串联质谱仪timsTOFPro2(Bruker Corporation,Billerica,MA)进行DDA(Data Dependent Acquisition)模式检测。主要参数设置：离子源电压设置为1.7kV；斜坡时间为200ms，总周期时间为1.03s，包括1次全程TIMS-MS扫描和4次平行累积-串联碎裂(PASEF)MS/MS扫描，离子迁移率(1/K0)扫描范围为0.75～1.30vs/cm2，MS/MS扫描的强度阈值和靶强度分别为500和5000，MS/MS扫描仅选择二重或三重电荷特征；主动排除设置为0.30分钟，一级质谱扫描范围100～1,700m/z；离子淌度范围是0.60-1.60V.S/cm2，二级质谱扫描范围为100-1700m/z。一级扫描累积时间100ms，二级扫描累积时间100ms，离子碎裂模式为CID，碎片离子在TOF中进行检测。动态排除时间设定为0.3min。
数据库搜索：
采用PEAKS online搜索引擎和/或MaxQuant搜索引擎对质谱数据进行数据库检索；其中：
所述PEAKS online搜索引擎采用的数据库为UniProt/SwissProt humandatabase，检索条件包括：胰酶酶切，肽段长度为6–45个氨基酸，允许不大于2–5个漏切位点；可变修饰为蛋氨酸的氧化和肽段N-端的乙酰化；Denovo匹配时前体离子的容错度为15ppm，碎片离子的容错度为0.001–0.05Da或1–10ppm；假阳性率小于1–5％；
所述Spectnoraut搜索引擎的人源蛋白数据库为UniProt/SwissProt humandatabase，
DIA文件使用Spectronaut(BGS工厂设置)直接DIA实验分析工作流程使用默认设置进行处理。胰蛋白酶特异性设置为两次漏切以及蛋白质和PSM错误发现率为1％；
用于捕集离子淌度飞行时间质谱timsTOF Pro2的单细胞蛋白质组学：
其中HEK-293T细胞的数目为26个，Hela细胞的数目为23个。按照上的方法进行数据采集和分析后，两种细胞类型均能从单个细胞种获得超过2000个具有准确定量信息的蛋白质，两种细胞可以依据它们的蛋白质组进行清晰聚类(图3c)，在主成分分析中也能明显区分(图3d)。全部49个单细胞蛋白质组鉴定及定量的总蛋白质数目达到3183种，优于已有文献报道中需要上百个单细胞才可达到2000种以上的蛋白质鉴定和定量，说明本方法在捕集离子淌度飞行时间质谱timsTOF Pro上的检测深度和定量准确性均有优异的表现。
以上对本发明主题技术方案以及相应的细节进行了介绍，可以理解的是，以上介绍仅是本发明主题技术方案的一些实施方案，其具体实施时也可以省去部分细节。
另外，在以上发明的一些实施方案中，多个实施方案存在组合实施的可能，各种组合方案限于篇幅不再一一列举。本领域技术人员在具体实施时可以根据需求自由结合实施上述实施方案，以获得更佳的应用体验。
本领域技术人员在实施本发明主题技术方案时，可以根据本发明的主题技术方案以及附图获得其它细节配置或附图，显而易见地，这些细节在不脱离本发明主题技术方案的前提下，这些细节仍属于本发明主题技术方案涵盖的范围。
Claims (10)
1.一种灵敏且易用的非标记单细胞蛋白质组学分析方法，其特征在于,包括如下步骤：
制备Mix液；
制备细胞悬液；
制备一次混合液，其中，所述一次混合液为所述细胞悬液中的单细胞与500nl的所述Mix液的混合物，将该混合物放置于玻璃玻片上；
将制备的所述一次混合液加热至37℃并保温60分钟得到一次制取液，其中，保温过程中每隔5分钟向所述一次混合液中补充500nl的系统水；
向制得的一次制取液中再次加入500nl的Mix液得到二次混合液；
将制备的所述二次混合液加热至37℃并保温60分钟得到包含肽段的二次制取液，其中，保温过程中每隔5分钟向所述二次混合液中补充500nl的系统水；
将制取的所述二次制取液用6μl溶液溶解得到样本液，其中，所述溶液为0.1％FA/H2O；
采用飞行时间质谱仪以及色谱仪进行分析，得到单细胞蛋白质组学数据；
其中，100μl所述Mix液包括60μl的H2O、20μl的0.5％-3％DDM、10μl的1M TEAB、10μl的50ng-500ng/μl Trypsin。
2.根据权利要求1所述的灵敏且易用的非标记单细胞蛋白质组学分析方法，其特征在于：将制取的二次制取液用6μl溶液溶解得到样本液中，制取的二次制取液用6μl溶液溶解得到样本液后再次用2μl溶液溶解被6μl溶液溶解后剩余的二次抽取液。
3.根据权利要求1所述的灵敏且易用的非标记单细胞蛋白质组学分析方法，其特征在于：所述飞行时间质谱仪为捕集离子淌度飞行时间质谱仪timsTOF Pro2。
4.根据权利要求1所述的灵敏且易用的非标记单细胞蛋白质组学分析方法，其特征在于：所述色谱仪为纳升级液相色谱仪nanoElute。
5.根据权利要求1所述的灵敏且易用的非标记单细胞蛋白质组学分析方法，其特征在于：制备细胞悬液包括如下步骤：
吸去细胞培养皿中的细胞培养基，加入2ml 37℃1×PBS轻柔漂洗贴壁细胞，加入1ml 4℃胰蛋白酶覆盖贴壁细胞表面，待显微镜下可观察到细胞变圆、边缘透亮时，然后加入1ml含有FBS的DEME培养基终止酶解，并收集至15ml离心管内离心3分钟，弃去上清液后，重新用37℃1×PBS分散细胞并计数得到前级悬液，将前级悬液过滤后得到所述细胞悬液。
6.根据权利要求5所述的灵敏且易用的非标记单细胞蛋白质组学分析方法，其特征在于：所述细胞悬液中的单细胞根据细胞的平均直径、圆度提取获得单个细胞。
7.根据权利要求5所述的灵敏且易用的非标记单细胞蛋白质组学分析方法，其特征在于：所述离心速度为1200RPM/分钟。
8.根据权利要求5所述的灵敏且易用的非标记单细胞蛋白质组学分析方法，其特征在于：所述加入2ml 37℃1×PBS轻柔漂洗贴壁细胞循环至少两次。
9.根据权利要求5所述的灵敏且易用的非标记单细胞蛋白质组学分析方法，其特征在于：所述前级悬液的细胞浓度为2×105/ml。
10.根据权利要求5所述的灵敏且易用的非标记单细胞蛋白质组学分析方法，其特征在于：所述前级悬液过40μm滤膜除去成团细胞和大颗粒，得到所述细胞悬液。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118112124A true CN118112124A (zh) | 2024-05-31 |
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