CN118086261A - 一种高稳定性和高酶活的Kex2蛋白酶突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高稳定性和高酶活的Kex2蛋白酶突变体，所述突变体是在SEQ ID NO.2所示的Kex2蛋白酶的氨基酸序列的基础上，将第248位的甘氨酸突变为苯丙氨酸，还将第250位的异亮氨酸突变为谷氨酸，还将第275位的脯氨酸突变为组氨酸。本发明还公开了编码所述突变体的基因，以及用于表达Kex2蛋白酶的重组毕赤酵母菌株等。本发明通过定点突变显著提高了双碱基酶Kex2的酶活，最优突变体酶活与野生型相比提高了2.2倍；本发明通过定点突变双碱基酶Kex2的稳定性得到了显著提高，重组Kex2蛋白酶在pH 7.0～10.0之间酶活稳定，pH 9.0时活性最高达到了22.46U/mg。在30℃，pH 9.0条件下放置12h活力可保持82.3％。
Description
技术领域
本发明属于生物酶工程技术领域，具体地说，是关于一种高稳定性和高酶活的Kex2蛋白酶突变体。
背景技术
Kex2蛋白酶是一种来自于酿酒酵母细胞内的钙离子依赖型前体加工蛋白酶，属于枯草杆菌蛋白酶家族。天然Kex2由814个氨基酸构成，整个Kex2分子主要包括信号肽、前体肽、催化结构域、P结构域、Ser/Thr富集结构域、跨膜区以及胞外结构域七部分。其中信号肽和前体肽主要负责Kex2蛋白酶的自我加工；催化结构域中含有高度保守的催化三联体氨基酸和Ca2+结合位点；P结构域有保证正确折叠的作用，并且是酶活关键部位；Ser/Thr富集结构域为糖基化的主要场所；跨膜区以及胞外结构域主要负责Kex2蛋白酶在细胞内各细胞器之间的转换与运输。
Kex2蛋白酶能够识别并切割碱性氨基酸残基对中的羧基端肽键，如Lys-Arg、Arg-Arg、以及Pro-Arg，在酵母外源分泌途径中切割外源蛋白前体中的信号肽，释放成熟分泌蛋白。另外，在哺乳动物细胞内也存在同家族的前体加工酶，在哺乳动物细胞的前体蛋白加工过程中起关键作用。Kex2在酵母和昆虫细胞中已得到成功表达，但表达量均很低。在甲醇酵母中分泌表达，粗酶液中能够检测到酶活，但是随后Kex2肽段会发生自降解，不能够成功纯化得到Kex2蛋白。
因此，本领域迫切需要找到能够稳定且高效表达Kex2蛋白酶的方法。
发明内容
为解决现有技术中的上述问题，本发明通过对Kex2蛋白酶进行结构改造，成功获得了具有高稳定性和高酶活的突变体。
因此，本发明的第一个方面，提供了一种高稳定性和高酶活的Kex2蛋白酶突变体，所述突变体是在SEQ ID NO.2所示的Kex2蛋白酶的氨基酸序列的基础上，将第248位的甘氨酸突变为苯丙氨酸(G248F)。
优选的，所述突变体还将第250位的异亮氨酸突变为谷氨酸(I250E)。
更好的，所述突变体还将第275位的脯氨酸突变为组氨酸(P275H)。
本发明的第二个方面，提供了编码上述的Kex2蛋白酶突变体的编码基因。
本发明的第三个方面，提供了一种用于表达Kex2蛋白酶的重组毕赤酵母菌株，所述重组毕赤酵母菌株是将上述的Kex2蛋白酶突变体的编码基因与表达载体连接构建重组表达质粒，然后转化毕赤酵母宿主菌而得到。
根据本发明的优选实施例，所述表达载体为pPICZαA。
根据本发明的优选实施例，所述毕赤酵母宿主菌为毕赤酵母X33。
本发明的第四个方面，提供了一种重组表达质粒，所述重组表达质粒是将上述的Kex2蛋白酶突变体的编码基因与表达载体连接而得到。
根据本发明的优选实施例，所述表达载体为pPICZαA
本发明的第五个方面，提供了所述的重组毕赤酵母菌株用于发酵生产Kex2蛋白酶的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过定点突变显著提高了双碱基酶Kex2的酶活，最优突变体酶活与野生型相比提高了2.2倍，因而在反应中酶的使用量可以大大降低，提高使用效率。
2、本发明通过定点突变双碱基酶Kex2的稳定性得到了显著提高，重组Kex2蛋白酶在pH 7.0～10.0之间酶活稳定，pH 9.0时活性最高，达到了22.46U/mg。在30℃，pH 9.0条件下放置12h活力可保持82.3％。
3、本发明中所采用低盐无机盐培养基发酵表达，双碱基酶Kex2可以直接分泌表达，且以可溶性形式存在，大大降低了发酵成本。发酵过程中对甲醇流加方式进行优化，发酵96h后，上清液中粗酶含量高达1.90mg/mL，相较优化前提高了48％。
附图说明
图1为实施例5中发酵样品的电泳结果。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步详细描述。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过本技术领域中已知的常规方法制备。
以下实施例中所使用的毕赤酵母宿主菌X33为商业化菌株，可通过常规市售途径获得。
以下实施例中所使用的质粒载体pPICZαA为商业化质粒，可通过常规市售途径获得。
以下实施例中所使用的方法，如无特别说明，均为本技术领域中的常规操作，或者是按照产品说明书进行操作。
实施例1、Kex2蛋白酶突变体的设计
从Uniprot网站中下载Kex2蛋白酶的氨基酸序列(登录号：P13134)，根据毕赤酵母密码子的偏好性对序列进行优化，得到密码子优化的Kex2蛋白酶基因，其序列如SEQIDNo.1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
由南京金斯瑞生物科技有限公司进行Kex2蛋白酶的优化序列的全基因合成，分别连接至载体pPICZαA的多克隆酶切位点，得到重组质粒pPICZαA-Kex2。
以重组质粒pPICZA-Kex2为模板，设计不同引物进行全质粒PCR，依次进行三轮定点突变，构建得到相对应的携带突变体的重组质粒，具体如下：
第一轮定点突变位点及引物对序列如下表所示：
| 引物名称 | 序列(5′-3′) |
| A276K-F | AAAGATGATGGCCGCCATCTGCAGGGCCCGAG |
| A276K-R | TGGCGGCCATCATCTTTCGGGCCCCAGCTGCAGCT |
| P285W-F | TGGAGCGATCTGGTGAAAAAAGCGCTGGTGAA |
| P285W-R | TTCACCAGATCGCTCCAGCCCTGCAGATGGCGGCC |
| D325Y-F | CTGCAACTATTATGGCTATACCAACAGCATTTATAGCA |
| D325Y-R | AGCCATAATAGTTGCAGTTATCGCCGCGGGTG |
| P275H-F | TGGGGCCACGCGGATGATGGCCGCCATCTGCA |
| P275H-R | TCATCCGCGTGGCCCCAGCTGCAGCTATAAAT |
| G248F-F | CGCATTCTGAGCTTTGATATTACCACCGAAGATGAAGCG |
| G248F-R | TCAAAGCTCAGAATGCGAATGCCGCTAATTTT |
| I250E-F | GCGATGAAACCACCGAAGATGAAGCGGCGAGC |
| I250E-R | TTCGGTGGTTTCATCGCCGCTCAGAATGCGAA |
| I250K-F | GGCGATAAAACCACCGAAGATGAAGCGGCGAG |
| I250K-R | TCGGTGGTTTTATCGCCGCTCAGAATGCGAAT |
经过对第一轮突变菌株进行筛选，发现X33-G248F(第248位的甘氨酸突变为苯丙氨酸)所生产的酶液酶活较高，在此基础上进行第二轮定点突变，突变位点及引物对序列如下表所示：
| 引物名称 | 序列(5′-3′) |
| A276K-F | AAAGATGATGGCCGCCATCTGCAGGGCCCGAG |
| A276K-R | TGGCGGCCATCATCTTTCGGGCCCCAGCTGCAGCT |
| P285W-F | TGGAGCGATCTGGTGAAAAAAGCGCTGGTGAA |
| P285W-R | TTCACCAGATCGCTCCAGCCCTGCAGATGGCGGCC |
| D325Y-F | CTGCAACTATTATGGCTATACCAACAGCATTTATAGCA |
| D325Y-R | AGCCATAATAGTTGCAGTTATCGCCGCGGGTG |
| P275H-F | TGGGGCCACGCGGATGATGGCCGCCATCTGCA |
| P275H-R | TCATCCGCGTGGCCCCAGCTGCAGCTATAAAT |
| I250E-F | GCGATGAAACCACCGAAGATGAAGCGGCGAGC |
| I250E-R | TTCGGTGGTTTCATCGCCGCTCAGAATGCGAA |
| I250K-F | GGCGATAAAACCACCGAAGATGAAGCGGCGAG |
| I250K-R | TCGGTGGTTTTATCGCCGCTCAGAATGCGAAT |
经过对第二轮突变菌株进行筛选，发现X33-I250E/G248F(第250位的异亮氨酸突变为谷氨酸+第248位的甘氨酸突变为苯丙氨酸)所生产的酶液酶活较高，在此基础上进行第三轮定点突变，突变位点及引物对序列如下表所示：
| 引物名称 | 序列(5′-3′) |
| A276K-F | AAAGATGATGGCCGCCATCTGCAGGGCCCGAG |
| A276K-R | TGGCGGCCATCATCTTTCGGGCCCCAGCTGCAGCT |
| D325Y-F | CTGCAACTATTATGGCTATACCAACAGCATTTATAGCA |
| D325Y-R | AGCCATAATAGTTGCAGTTATCGCCGCGGGTG |
| P275H-F | TGGGGCCACGCGGATGATGGCCGCCATCTGCA |
| P275H-R | TCATCCGCGTGGCCCCAGCTGCAGCTATAAAT |
所得到的突变体质粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序鉴定，确保获得的质粒为正确的突变体质粒。
实施例2、重组毕赤酵母的构建
将实施例1得到的含有Kex2蛋白酶突变体的重组表达质粒进行线性化酶切纯化后，电转化至毕赤酵母宿主菌X33感受态细胞中，然后涂布至含有100μg/mL博莱霉素的YPDS固体平板(20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉，20g/L葡萄糖，182.17g/L山梨醇)上，30℃倒置培养，筛选阳性转化子，最终得到对应的17株重组毕赤酵母菌株，其中对应单一突变体的菌株7株，对应两点突变体的菌株6株，对应三点突变体的菌株3株，以及无突变菌株一株，具体如下
单一突变菌株，分别命名为：X33-A276K、X33-P285W、X33-D325Y、X33-P275H、X33-G248F、X33-I250E、X33-I250K。
两点突变菌株，分别命名为：X33-A276K/G248F、X33-P275H/G248F、X33-I250K/G248F、X33-D325Y/G248F、X33-P285W/G248F、X33-I250E/G248F。
三点突变菌株，分别命名为：X33-A276K/G248F/I250E、X33-P275H/G248F/I250E、X33-D325Y/G248F/I250E。
无突变菌株，命名为X33-Kex2(作为对照)。
实施例3、重组毕赤酵母菌株诱导表达及粗酶液制备
将实施例2获得的17株重组毕赤酵母菌株接种至YPG培养基中，于30℃、220r/min震荡培养24h。然后按10％的体积比接入50mL二级种子培养基中，同样条件培养过夜后离心收集菌体，无菌水洗涤两次，接入BMMY培养基，继续于30℃、220r/min震荡培养，每24h补加7.5mL/L甲醇，共诱导培养72h后，离心收集上清即为粗酶液。
按照上述方法分别得到17株重组毕赤酵母菌株的Kex2蛋白酶粗酶液，分别标记为：
A276K、P285W、D325Y、P275H、G248F、I250E、I250K；
A276K/G248F、P275H/G248F、I250K/G248F、D325Y/G248F、P285W/G248F、I250E/G248F；
A276K/G248F/I250E、P275H/G248F/I250E、D325Y/G248F/I250E；以及野生型。
实施例4、Kex2蛋白酶的酶活测定
将实施例3获得的17种Kex2粗酶液经过Ca+过夜激活后测定酶活。
蛋白酶的活性测定依据Kex2蛋白酶与底物反应能产生可见物质，选择了Boc-GIn-Arg-Arg-pNA(Boc-QRR-pNA)作为测活底物，酶活力单位(U)的定义为：在25℃、pH8.0的条件下，每分钟催化的BOc-ORR-pNA转化为产物所需要的酶量。
取1μM Boc-ORR-pNA底物溶液200μL加入96孔酶标板中，将酶液浓度稀释到5～10μg/ml，每加入20μL，在波长405nm下每间隔20s记录吸光值A405，连续记录3min，保证分钟的吸光值的变化不超过0.040。
根据以下公式计算酶活：
酶活力公式U(umol/L)＝ΔA/min×F；
TV为反应的总体积(mL)，
SV为样本体积(mL)，
L为酶标板(0.220mL)体系的光径(L＝0.60573cm)，
ε为酶标板(0.220mL)反应体系被检测物质的摩尔消光系数，ε＝6178.45[L/(molcm)]。
测定结果如以下表1所示。
表1：Kex2突变体酶活
| 突变体 | 酶活(U/mg) | 相对酶活(倍) |
| 野生型 | 10.21 | 1.00 |
| A276K | 13.22 | 1.29 |
| G248F | 15.15 | 1.48 |
| D325Y | 3.11 | 0.30 |
| P275H | 5.22 | 0.51 |
| P285W | 6.21 | 0.61 |
| I250E | 9.00 | 0.88 |
| I250K | 11.28 | 1.10 |
| A276K/G248F | 13.21 | 1.29 |
| P275H/G248F | 14.28 | 1.40 |
| I250K/G248F | 7.60 | 0.74 |
| D325Y/G248F | 6.58 | 0.64 |
| P285W/G248F | 16.21 | 1.59 |
| I250E/G248F | 17.10 | 1.67 |
| A276K/G248F/I250E | 22.21 | 2.18 |
| P275H/G248F/I250E | 27.25 | 2.67 |
| D325Y/G248F/I250E | 20.34 | 1.99 |
由表1的结果可知，在16中突变体粗酶液中，与野生型酶相比，有6种突变体酶的催化活性出现了明显的降低，其余10种突变体酶的活性都有所提高，其中，携带三个突变的粗酶P275H/G248F/I250E(第275位的脯氨酸突变为组氨酸+第250位的异亮氨酸突变为谷氨酸+第248位的甘氨酸突变为苯丙氨酸)的酶活最高，达到了27.25U/mg，相比野生型酶足足提高了2.67倍，提升效果非常显著。
后续选用酶活最高的P275H/G248F/I250E重组毕赤酵母菌株进行发酵工艺优化，并对粗酶进行温度和pH稳定性的考察。
实施例5、发酵工艺优化
通过对发酵过程中的各个条件和甲醇流加方式进行优化，得出最优发酵工艺如下：
YPG种子培养基：酵母粉10g/L，甘油20g/L，蛋白胨20g/L。
分批发酵初始培养基：甘油40g/L，H3PO4 26.07mL/L、CaCO3·2H2O 1.18g/L、K2SO418.2g/L、MgSO4·7H2O 14.9g/L、KOH 4.13g/L、甘油40g/L、PTM1 8.7mL/L。
甘油流加培养基：甘油600g/L，PTM1 8.7mL/L。
甲醇诱导流加培养基：甲醇(分析纯，纯度99.5％)，PTM1 8.7mL/L。
将最优突变体重组毕赤酵母菌株X33-P275H/G248F/I250E接种至YPG培养基中，经过两次传代得到种子液。
将二级种子液按照10％(v/v)的比例接种至装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为＜700rpm，通气比为1vvm，温度为30℃，用氨水控制pH为5.0。当基础培养基中的碳源耗尽，开始甘油补料。当甘油补料耗尽时，DO上升，饥饿1h，确保培养基中的甘油和可利用代谢副产物消耗完全后，开始甲醇补料。刚开始时甲醇流加速度为6.0～7.0ml/h；以每隔4h左右提高1.3ml/h的流速来流加过夜；24h后甲醇流加速度以每隔6h左右提高1.3ml/h的流速来流加过夜，48h后甲醇流加速度以每隔4h左右提高1.3ml/h持续诱导，最大流速不超过20ml/h，直到补料结束。发酵过程每24h留样1ml，用于电泳测定，结果如图1所示。
由图1的结果可见，在相应的位置出现了条带，可知获得了目的蛋白；进一步采用Bradford方法测定蛋白浓度，结果显示，采用这种方式发酵，粗酶液中蛋白浓度较优化前提高了48％。
实施例6、pH稳定性研究
在25℃条件下分别配制不同pH的缓冲液：pH分别为3、4、5、6的50mM的NaAc-HAc缓冲液；pH分别为7、8、9的50mM的Tris-HCl缓冲液；以及pH分别为10、11的50mM的Gly-NaOH缓冲液。
用不同pH的缓冲液分别配制1μM的底物Boc-QRR-pNA溶液，测定Kex2蛋白酶在不同pH下的活性。结果显示，过酸或过碱都会造成Kex2蛋白酶的严重失活。野生型Kex2蛋白酶在pH 3.0、4.0、11.0下1h内均完全失活，重组Kex2蛋白酶也不例外。重组Kex2蛋白酶在pH 4.0～7.0之间，酶失活较慢，1h内酶活残余率都保持在80％以上，而野生型的酶活残余率只有50％。在pH 8.0～10.0之间，Kex2蛋白酶较为稳定，在pH 9.0时Kex2蛋白酶在25℃可以保持24h活性不降低。
实施例7、温度稳定性研究
取Kex2纯酶液，分别置于15℃、25℃、30℃、37℃、45℃、65℃的水浴中温育，分别在0、2、4、6、8、12h取样，按实施例4的方法测定酶活，以水浴前酶液的初始活性作为100％计算活性残余率。
结果显示，在12h内，15℃条件下Kex2蛋白酶相对最为稳定，酶活几乎不损失；25℃条件下，野生型和突变体的酶活均能残余80％以上；随温度的升高，Kex2蛋白酶分子的活性降低速率也随之加快，这可能与Kex2蛋白酶在温度高的情况下产生自降解所致；45℃条件下，突变体的酶活残余还有50％，野生型的酶活残余只有20％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表信息:
DTD版本:V1_3
文件名:241038SEQ.xml
软件名称:WIPOSequence
软件版本:2.3.0
生成日期:2024-03-25
基本信息:
当前申请/申请人档案名:241038
申请人姓名或名称:铭诚惠众(江苏)药物研究有限公司
申请人姓名或名称/语言:zh
申请人姓名或名称/拉丁名称:MCHZ
发明名称:一种高稳定性和高酶活的Kex2蛋白酶突变体(zh)
序列总量:2
序列:
序列号(ID):1
长度:2848
分子类型:DNA
特征位置/限定符:
-source,1..2848
>mol_type,other DNA
>organism,Saccharomyces cerevisiae
残基:
tgcataattc tgtcataagc ctgttctttt tcctggctta aacatcccgt tttgtaaaag 60
agaaatctat tccacatatt tcattcattc ggctaccata ctaaggataa actaatcccg 120
ttgttttttg gcctcgtcac ataattataa actactaacc cattatcaga tgaaagtgag 180
gaaatatatt actttatgct tttggtgggc cttttcaaca tccgctcttg tatcatcaca 240
acaaattcca ttgaaggacc atacgtcacg acagtatttt gctgtagaaa gcaatgaaac 300
attatcccgc ttggaggaaa tgcatccaaa ttggaaatat gaacatgatg ttcgagggct 360
accaaaccat tatgtttttt caaaagagtt gctaaaattg ggcaaaagat catcattaga 420
agagttacag ggggataaca acgaccacat attatctgtc catgatttat tcccgcgtaa 480
cgacctattt aagagactac cggtgcctgc tccaccaatg gactcaagct tgttaccggt 540
aaaagaagct gaggataaac tcagcataaa tgatccgctt tttgagaggc agtggcactt 600
ggtcaatcca agttttcctg gcagtgatat aaatgttctt gatctgtggt acaataatat660tacaggcgca ggggtcgtgg ctgccattgt tgatgatggc cttgactacg aaaatgaaga720cttgaaggat aatttttgcg ctgaaggttc ttgggatttc aacgacaata ccaatttacc780taaaccaaga ttatctgatg actaccatgg tacgagatgt gcaggtgaaa tagctgccaa840aaaaggtaac aatttttgcg gtgtcggggt aggttacaac gctaaaatct caggcataag900aatcttatcc ggtgatatca ctacggaaga tgaagctgcg tccttgattt atggtctaga960cgtaaacgat atatattcat gctcatgggg tcccgctgat gacggaagac atttacaagg1020ccctagtgac ctggtgaaaa aggctttagt aaaaggtgtt actgagggaa gagattccaa1080aggagcgatt tacgtttttg ccagtggaaa tggtggaact cgtggtgata attgcaatta1140cgacggctat actaattcca tatattctat tactattggg gctattgatc acaaagatct1200acatcctcct tattccgaag gttgttccgc cgtcatggca gtcacgtatt cttcaggttc1260aggcgaatat attcattcga gtgatatcaa cggcagatgc agtaatagcc acggtggaac1320gtctgcggct gctccattag ctgccggtgt ttacactttg ttactagaag ccaacccaaa1380cctaacttgg agagacgtac agtatttatc aatcttgtct gcggtagggt tagaaaagaa1440cgctgacgga gattggagag atagcgccat ggggaagaaa tactctcatc gctatggctt1500tggtaaaatc gatgcccata agttaattga aatgtccaag acctgggaga atgttaacgc1560acaaacctgg ttttacctgc caacattgta tgtttcccag tccacaaact ccacggaaga1620gacattagaa tccgtcataa ccatatcaga aaaaagtctt caagatgcta acttcaagag1680aattgagcac gtcacggtaa ctgtagatat tgatacagaa attaggggaa ctacgactgt1740cgatttaata tcaccagcgg ggataatttc aaaccttggc gttgtaagac caagagatgt1800ttcatcagag ggattcaaag actggacatt catgtctgta gcacattggg gtgagaacgg1860cgtaggtgat tggaaaatca aggttaagac aacagaaaat ggacacagga ttgacttcca1920cagttggagg ctgaagctct ttggggaatc cattgattca tctaaaacag aaactttcgt1980ctttggaaac gataaagagg aggttgaacc agctgctaca gaaagtaccg tatcacaata2040ttctgccagt tcaacttcta tttccatcag cgctacttct acatcttcta tctcaattgg2100tgtggaaacg tcggccattc cccaaacgac tactgcgagt accgatcctg attctgatcc2160aaacactcct aaaaaacttt cctctcctag gcaagccatg cattattttt taacaatatt2220tttgattggc gccacatttt tggtgttata cttcatgttt tttatgaaat caaggagaag2280gatcagaagg tcaagagcgg aaacgtatga attcgatatc attgatacag actctgagta2340cgattctact ttggacaatg gaacttccgg aattactgag cccgaagagg ttgaggactt2400cgattttgat ttgtccgatg aagaccatct tgcaagtttg tcttcatcag aaaacggtga2460tgctgaacat acaattgata gtgtactaac aaacgaaaat ccatttagtg accctataaa2520gcaaaagttc ccaaatgacg ccaacgcaga atctgcttcc aataaattac aagaattaca2580gcctgatgtt cctccatctt ccggacgatc gtgattcgat atgtacagaa agcttcaaat2640tacaaaatag catttttttc ttatagatta taatactctc tcatacgtat acgtatatgt2700gtatatgata tataaacaaa cattaatatc ctattccttc cgtttgaaat ccctatgatg2760tactttgcat tgtttgcacc cgcgaataaa atgaaaactc cgaaccgata tatcaagcac2820ataaaagggg agggtccaat taatgcat 2848序列号(ID):2
长度:814
分子类型:AA
特征位置/限定符:
-source,1..814
>mol_type,protein
>organism,Saccharomyces cerevisiae
残基:
MKVRKYITLC FWWAFSTSAL VSSQQIPLKD HTSRQYFAVE SNETLSRLEE MHPNWKYEHD 60
VRGLPNHYVF SKELLKLGKR SSLEELQGDN NDHILSVHDL FPRNDLFKRL PVPAPPMDSS120
LLPVKEAEDK LSINDPLFER QWHLVNPSFP GSDINVLDLW YNNITGAGVV AAIVDDGLDY 180
ENEDLKDNFC AEGSWDFNDN TNLPKPRLSD DYHGTRCAGE IAAKKGNNFC GVGVGYNAKI 240
SGIRILSGDI TTEDEAASLI YGLDVNDIYS CSWGPADDGR HLQGPSDLVK KALVKGVTEG 300
RDSKGAIYVF ASGNGGTRGD NCNYDGYTNS IYSITIGAID HKDLHPPYSE GCSAVMAVTY 360
SSGSGEYIHSSDINGRCSNS HGGTSAAAPL AAGVYTLLLE ANPNLTWRDV QYLSILSAVG 420
LEKNADGDWR DSAMGKKYSH RYGFGKIDAH KLIEMSKTWE NVNAQTWFYL PTLYVSQSTN 480
STEETLESVI TISEKSLQDA NFKRIEHVTV TVDIDTEIRG TTTVDLISPA GIISNLGVVR 540
PRDVSSEGFK DWTFMSVAHW GENGVGDWKI KVKTTENGHR IDFHSWRLKL FGESIDSSKT 600
ETFVFGNDKE EVEPAATEST VSQYSASSTS ISISATSTSS ISIGVETSAIPQTTTASTDP 660
DSDPNTPKKL SSPRQAMHYF LTIFLIGATF LVLYFMFFMK SRRRIRRSRA ETYEFDIIDT 720
DSEYDSTLDN GTSGITEPEE VEDFDFDLSD EDHLASLSSS ENGDAEHTID SVLTNENPFS 780
DPIKQKFPND ANAESASNKL QELQPDVPPS SGRS 814END
Claims (10)
1.一种高稳定性和高酶活的Kex2蛋白酶突变体，其特征在于，所述突变体是在SEQ IDNO.2所示的Kex2蛋白酶的氨基酸序列的基础上，将第248位的甘氨酸突变为苯丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的Kex2蛋白酶突变体，其特征在于，还将第250位的异亮氨酸突变为谷氨酸。
3.根据权利要求1所述的Kex2蛋白酶突变体，其特征在于，还将第275位的脯氨酸突变为组氨酸。
4.编码权利要求1～3中任一项所述的Kex2蛋白酶突变体的基因。
5.一种用于表达Kex2蛋白酶的重组毕赤酵母菌株，其特征在于，所述重组毕赤酵母菌株是将权利要求4所述的Kex2蛋白酶突变体的编码基因与表达载体连接构建重组表达质粒，然后转化毕赤酵母宿主菌而得到。
6.根据权利要求5所述的重组毕赤酵母菌株，其特征在于，所述表达载体为pPICZαA。
7.根据权利要求5所述的重组毕赤酵母菌株，其特征在于，所述毕赤酵母宿主菌为毕赤酵母X33。
8.一种重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒是将权利要求4所述的Kex2蛋白酶突变体的编码基因与表达载体连接而得到。
9.根据权利要求8所述的重组表达质粒，其特征在于，所述表达载体为pPICZαA。
10.权利要求5所述的重组毕赤酵母菌株用于发酵生产Kex2蛋白酶的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410353859.4A CN118086261B (zh) | 2024-03-27 | 2024-03-27 | 一种高稳定性和高酶活的Kex2蛋白酶突变体 |
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| KOHEI ODA 等: ""Cloning and rational mutagenesis of kexstatin I, a potent proteinaceous inhibitor of Kex2 proteinase"", BIOCHEMICAL JOURNAL, vol. 355, 31 December 2001 (2001-12-31), pages 339 - 346 * |
| 杨帆 等: ""Kex2 蛋白酶K291突变体性质和动力学研究"", 华东理工大学学报, vol. 47, no. 6, 31 December 2021 (2021-12-31), pages 699 - 705 * |
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