CN118084955A - 用于克服肿瘤乏氧的新型光敏剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于克服肿瘤乏氧的新型光敏剂及其制备方法和应用，所述光敏剂的结构如式I所示通过低氧敏感的偶氮苯基团将光敏剂与烷化剂苯胺氮芥结合，在肿瘤低氧区域偶氮键断裂，释放出化疗药与光敏剂，从而解决低氧区域光动力治疗疗效不足和化疗药物没有细胞选择性的问题，兼具光动力治疗和化疗能力，经试验验证，其对肿瘤细胞具有很好的抑制效果。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于克服肿瘤乏氧的新型光敏剂及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)作为一种新型的癌症治疗手段，受到了广泛的关注。氧气，光源，光敏剂是PDT三大基本要素，在PDT过程中接受辐射的光敏剂转变为激发态，进而与细胞中的基态氧作用，产生单线态氧，从而杀伤细胞。相比于传统的癌症治疗方式PDT拥有非常多的优势，如具有微创性质、高时空精准度、可控性、局部性治疗以及几乎没有耐药性等。然而在实际应用过程中光动力治疗也存在一定的局限性，如，对肿瘤组织和正常组织的无差别损伤、对分子氧浓度的高度依赖以及激发光组织穿透性差等。
传统的光动力疗法是基于II型的光化学过程，其中单线态氧的产生对氧气浓度有很强的依赖性。然而，肿瘤的微环境呈乏氧状态，在很大程度上限制了光动力治疗的应用。临床上为了克服光动力治疗过程中肿瘤乏氧的问题，往往采用高压氧仓的方法，但是高压氧仓的使用同时也会带来氧中毒等一些副作用；通过载体运输氧气至肿瘤部位也是克服肿瘤乏氧的一种方法，如血红蛋白载体，红细胞载体，全氟碳化载体等，但该方法可运输的氧气有限，实际应用过程中效果并不理想。此外，原位催化生成氧气的方法可以通过纳米催化剂催化肿瘤部位的过氧化氢原位生成氧气来改善缺氧环境，但该方法氧气产生能力受到细胞内过氧化氢浓度的限制，纳米材料的复杂性以及批次不稳定性，在一定程度上也限制了该方法的发展。相比之下有机小分子在该领域更具有应用前景。
化疗是目前主要的抗肿瘤方法之一，被广泛用于临床研究，与其他治疗方式相比，化疗药物杀伤力较大，但同时也具有很大的局限性，常用化疗药物无法区分肿瘤细胞和正常细胞，在抗肿瘤作用的同时对正常组织细胞也危害较大，临床中多数患者因承受不了化疗的副作用，如化疗后食欲不振、消瘦、掉发等从而终止治疗。
氟硼二吡咯(BODIPY)类荧光染料相比于荧光素、罗丹明以及菁染料有非常多的优势，如吸光能力强、光稳定性优异、生物相容性以及易于修饰等，近年来在离子识别、生物标记以及光疗等方面扮演着重要角色。
因此开发通过光动力治疗与化疗结合在肿瘤缺氧微环境中高效的BODIPY类光敏剂具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一类用于克服肿瘤乏氧的新型光敏剂，通过低氧敏感的偶氮苯基团将光敏剂与烷化剂苯胺氮芥结合，在肿瘤低氧区域偶氮键断裂，释放出化疗药与光敏剂，从而解决低氧区域光动力治疗疗效不足的问题，也解决化疗药物无法区分肿瘤细胞和正常细胞的问题，并同时提供其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明第一方面提供了一种用于克服肿瘤乏氧的新型光敏剂，结构如下：
本发明第二方面提供了上述用于克服肿瘤乏氧的新型光敏剂的制备方法，通过以下步骤实现：
S1：以苯甲酰氯为起始原料，在有机溶剂A中，与2,4-二甲基吡咯反应，然后加入三乙胺和三氟化硼乙醚，络合得到BODIPY-1；
S2：在有机溶剂B中，BODIPY-1通过NBS溴代得到BODIPY-2；
S3：BODIPY-2与Azo-3，在有机溶剂C中，滴入哌啶和乙酸，通过克脑文格尔反应得到BODIPY-Azo-single；
反应式如下：
作为本发明进一步的改进，通过以下步骤实现：
S1：以苯甲酰氯为起始原料，在有机溶剂A中，与2,4-二甲基吡咯反应，然后加入三乙胺和三氟化硼乙醚，络合得到BODIPY-1；
S2：在有机溶剂B中，BODIPY-1通过NBS溴代得到BODIPY-2；
S3：BODIPY-2与Azo-3，在有机溶剂C中，滴入哌啶和乙酸，通过克脑文格尔反应得到BODIPY-Azo-single；
反应式如下：
作为本发明的进一步改进，所述有机溶剂A选自二氯甲烷或四氢呋喃；所述溶剂B选自二氯甲烷或四氢呋喃；所述溶剂C选自乙腈、甲苯或苯。
作为本发明的进一步改进，所述苯甲酰氯与所述2,4-二甲基吡咯的摩尔比为1:2～2.5；所述BODIPY-1和所述NBS的摩尔比为1:2～2.4；所述BODIPY-2和所述Azo-3的比例为1:2.5～3。
作为本发明的进一步改进，所述步骤S1的反应温度为15～35℃，三乙胺和三氟化硼乙醚的滴加温度为-10～0℃，；所述步骤S2的反应温度为15～35℃，NBS的滴加温度为-10～0℃；所述步骤S3的反应温度为回流。
作为本发明的进一步改进，所述Azo-3的合成通过如下步骤实现：
a.对氨基苯甲醇与N-苯基二乙醇胺通过重氮化反应得到Azo-1；
b.Azo-1与三氯氧磷氯代得到Azo-2；
c.Azo-2与对羟基苯甲醛通过威廉姆森醚合成得到Azo-3；
反应式如下：
作为本发明的进一步改进，所述步骤a的溶剂为水，反应温度为-5～5℃，所述对氨基苯甲醇和所述N-苯基二乙醇胺的摩尔比为1:1-1.2；所述步骤b的反应温度为回流；所述步骤c的溶剂为乙腈或甲苯、苯，反应温度为回流，所述Azo-2与所述对羟基苯甲醛的摩尔比为1:1.1～1.3。
本发明第三方面提供了一种组合物，包含上述新型光敏剂。
本发明第四方面提供了一种上述光敏剂在制备肿瘤诊断和/或肿瘤治疗产品中的应用。
本发明第五方面提供了一种上述光敏剂的代谢产物在制备肿瘤诊断和/或肿瘤治疗产品中的应用，所述代谢产物结构如下式II：
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
本发明所提供的新型光敏剂，通过低氧敏感的偶氮苯基团将光敏剂与烷化剂苯胺氮芥结合，在肿瘤低氧区域偶氮键断裂，释放出化疗药与光敏剂，从而解决低氧区域光动力治疗疗效不足和化疗药物没有细胞选择性的问题，兼具光动力治疗和化疗能力，经试验验证，其对肿瘤细胞具有很好的抑制效果。
本发明所提供的新型光敏剂中偶氮键还可以降低光敏剂的单线态氧产生能力以及苯胺氮芥的细胞毒性，使得该分子可以降低对正常细胞毒副作用。
附图说明
图1是本发明BODIPY-Azo-single和BODIPY-3-single在PBS中的紫外吸收图谱；
图2是本发明BODIPY-Azo-single和BODIPY-3-single在PBS中的荧光发射图；
图3是本发明不同反应体系的DPBF的紫外—可见光吸收图；
图4是BODIPY-Azo-Single的光稳定试验图；
图5BODIPY-Azo-single和BODIPY-3-single在常氧光照状态以及低氧光照状态下细胞生存率柱状图；
图6是各组小鼠体重变化对比图；
图7是各组小鼠肿瘤重量对比图；
图8是各组小鼠肿瘤直径对比图；
图9是各组小鼠肿瘤体积对比图；
图10是各组小鼠肿瘤形态对比图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件、合成路线及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明的内容。
实施例1中间体BODIPY-2的制备
将苯甲酰氯(1.4g,10mmol)加入150ml干燥的二氯甲烷中，搅拌均匀。置换氮气，氮气保护下，加入2，4-二甲基吡咯(1.9g,20mmol)，搅拌均匀，室温反应12h，TLC监测反应至2，4-二甲基吡咯反应完全后，0℃下加入三乙胺(10ml)，30min后，保持0℃注射器加入三氟化硼乙醚(10ml)，在室温下持续反应12h。TLC监测反应完全后，反应液用200ml的饱和氯化钠洗涤3遍，将有机相合并，加入适量的无水硫酸钠干燥，将其过滤，随后减压除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化样品，洗脱剂比例二氯甲烷：石油醚(DCM:PE)＝5：1(v:v)，减压蒸干溶剂。得橘红色固体粉末(BODIPY-1)1.26g，产率40％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.56(dd,J＝4.9,2.5Hz,3H),7.36(dd,J＝7.2,2.2Hz,2H),6.17(s,2H),2.45(s,6H),1.33(s,6H).13CNMR(151MHz,DMSO-d6)δ154.85,142.72,141.93,133.99,130.68,129.27,127.71,121.37,14.19,13.91.HRMS(ESI)：Calcd for：317.1787，Found：317.2111.
将化合物BODIPY-1(0.316g,1mmol)加入50ml的二氯甲烷中，搅拌溶解。将NBS溶于50ml二氯甲烷中，在0℃下，缓慢滴入上述体系中，滴加完毕后，将体系转移到常温条件下，反应1h，TLC监测反应至BODIPY-1反应完全，减压蒸除溶剂，硅胶柱层析分离纯化样品，洗脱剂比例石油醚：二氯甲烷＝5：1(v:v)，得红色固体粉末0.36g，产率76％。1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.54-7.51(m,3H),7.25(d,J＝3.8Hz,2H),2.61(s,6H),1.37(s,6H).13CNMR(151MHz,Chloroform-d)δ154.10,142.25,140.79,134.52,130.54,129.69,129.58,127.91,111.92,13.83,13.80.HRMS(ESI)：Calcd for：480.9820，Found：480.9875.
实施例2Azo-3的制备
将10ml去离子水和10ml浓盐酸混合在装有磁力搅拌的250ml单口瓶中，随后在0℃下向上述体系中缓慢加入4-氨基苄醇(4.0g，32.5mmol)使其溶解；之后将亚硝酸钠(2.42g，32.5mmol)溶于10ml去离子水中，加入上述体系搅拌1h，将N-苯基二乙醇胺(5.88，32.5mmol)，30ml去离子水和10ml浓盐酸混合后加入，温度保持在0℃，继续搅拌2h后用1mol/L的氢氧化钠溶液中和获得大量沉淀，过滤沉淀得橙色固体，硅胶柱层析进一步分离纯化样品，洗脱剂比例为二氯甲烷：甲醇＝15：1(v：v)得橙色固体化合物Azo-1 5.3g，产率51％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.74(dd,J＝8.8,7.4Hz,1H),7.45(d,J＝8.2Hz,1H),6.84(d,J＝9.2Hz,2H),5.29(t,J＝5.7Hz,2H),4.84(t,J＝5.4Hz,1H),4.57(d,J＝5.7Hz,2H),3.60(t,J＝5.8Hz,2H),3.54(t,J＝6.2Hz,4H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ151.38,150.83,144.15,142.27,127.05,124.74,121.59,111.26,62.56,58.13,53.30.HRMS(ESI)：Calcd for：316.1583，Found：316.1817.
将Azo-1(3.15g，10mmol)加入到装有磁力搅拌的250ml的单口瓶中，在0℃下加入50ml的三氯氧磷，转移至常温搅拌10min，缓慢加热并回流4h，反应结束，减压蒸除POCl3，二氯甲烷稀释，用饱和碳酸钠溶液洗涤三次，收集有机相，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析进一步纯化产物，洗脱剂比例为石油醚：乙酸乙酯＝5：1得黄色油状物Azo-2 2.9g，产率80％。1HNMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.90(d,J＝9.1Hz,2H),7.85(d,J＝8.3Hz,2H),7.50(d,J＝8.3Hz,2H),6.77(d,J＝9.1Hz,2H),3.83(t,J＝7.1Hz,4H),3.69(t,J＝7.0Hz,4H).13C NMR(151MHz,Chloroform-d)δ152.93,148.79,144.74,139.05,129.45,125.53,122.84,111.74,53.61,46.01,40.36.HRMS(ESI)：Calcd for：369.0566，Found：370.0728.
将Azo-2(0.42g，1.13mmol)，对羟基苯甲醛(0.165g，1.35mmo)和碳酸钾(0.187g，1.35mmol)加入到装有磁力搅拌的100ml单口瓶中，向其中加入乙腈30ml，搅拌均匀加热回流3h，硅胶柱层析分离纯化样品，洗脱剂比例为石油醚：乙酸乙酯＝5：1得淡黄色粉末Azo-30.22g，产率42％。1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ9.89(s,1H),7.89(dd,J＝10.3,8.7Hz,4H),7.85(d,J＝8.7Hz,2H),7.54(d,J＝8.4Hz,2H),7.10(d,J＝8.7Hz,2H),6.77(d,J＝9.1Hz,2H),5.22(s,2H),3.84(t,J＝7.0Hz,5H),3.70(t,J＝7.0Hz,4H).13C NMR(151MHz,Chloroform-d)δ190.90,163.72,152.85,148.89,144.65,137.71,132.15,130.37,128.13,125.63,122.82,115.33,111.80,70.01,53.62,40.37.HRMS(ESI)：Calcd for：456.1167Found：456.1358.
实施例3BODIPY-Azo-single的制备
在装有磁力搅拌的100ml三口瓶中加入Azo-3(0.397g，0.872mmol)、BODIPY-2(0.139，0.290mmol)、乙腈40ml、哌啶4滴、乙酸4滴，置换氮气三次,85℃回流1h至原料反应完全，减压蒸除溶剂，二氯甲烷溶解，饱和氯化钠溶解洗涤3遍，收集有机相，加入适量无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析，洗脱剂比例DCM得紫色粉末固体0.09g，产率34％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.05(d,J＝16.7Hz,1H),7.82(dd,J＝8.6,6.4Hz,4H),7.67-7.57(m,7H),7.47-7.42(m,3H),7.17(d,J＝8.8Hz,2H),6.95(d,J＝9.2Hz,2H),5.27(s,2H),3.87(t,J＝6.6Hz,4H),3.81(t,J＝6.7Hz,4H),2.57(s,3H),1.38(s,3H),1.34(s,3H).13C NMR(151MHz,Chloroform-d)δ159.94,153.98,152.72,148.80,144.74,141.70,140.72,140.22,138.88,138.56,134.80,130.17,129.66,129.56,129.38,128.21,128.14,125.62,122.79,115.43,111.81,69.87,53.67,40.40,32.08,31.59,30.34,29.85,22.84,14.27,13.99,13.82,1.17.HRMS(ESI)：Calcd for：918.0081Found：918.1217.
实施例4BODIPY-3-single的制备
在装有磁力搅拌的100ml三口瓶中加入Azo-3(0.397g，0.872mmol)、BODIPY-2(0.139，0.290mmol)、乙腈40ml、哌啶4滴和乙酸4滴，置换氮气三次,85℃回流1h至原料反应完全，减压蒸除溶剂，二氯甲烷溶解，饱和氯化钠溶解洗涤三遍，收集有机相，加入适量无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析，洗脱剂比例DCM得紫色粉末固体0.051g，产率30％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.07(s,1H),8.03(d,J＝16.6Hz,1H),7.61(dd,J＝4.9,1.7Hz,3H),7.48(d,J＝8.7Hz,2H),7.46-7.43(m,2H),7.39(d,J＝16.8Hz,1H),6.88(d,J＝8.6Hz,2H),2.56(s,3H),1.37(s,3H),1.33(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ159.59,152.57,141.56,141.16,139.12,133.55,130.86,130.33,129.83,129.50,129.19,127.98,127.02,116.24,113.85,13.54,13.37,13.32.HRMS(ESI)：Calcd for：585.0082Found：585.0195.
试验例1BODIPY-Azo-single和BODIPY-3-Single光谱数据的测试
将化合物BODIPY-Azo-single和BODIPY-3-single分别配成1mmol/L的母液，取30μL的母液用2970的PBS缓冲液(PH＝7.4)配成100μmol/L的测试溶液，用紫外-可见分光光度计测试其紫外吸收光谱(100μM)，见图1。
将化合物BODIPY-Azo-single和BODIPY-3-single分别配成1mmol/L的母液，取30μL的母液用2970的PBS缓冲液(PH＝7.4)配成100μmol/L的测试溶液，用荧光分光光度计测试其荧光发射光谱(100μM)，见图2。
试验例2BODIPY-Azo-single的单线态氧生成能力测试
采用DPBF(1,3-二苯基异苯并呋喃)作为单线态氧捕获剂，通过对其415nm处的特征吸收峰的紫外监测，来验证目标物的单线态氧产生能力。具体步骤为，在25mL的两口圆底烧瓶中加入1.0×10-4M DPBF和0.2×10-4M MB、BODIPY-Azo-single和BODIPY-3-single的DMSO溶液以及磁子，以35W的氙灯作为光源，在光源与两口圆底烧瓶中间，放置0.72M NaNO2水溶液作为385nm以下光的吸收剂，过滤紫外光和热。开启磁力搅拌，光照60s后从两口圆底烧瓶中取样测紫外吸收光谱，测试完成后倒回圆底瓶继续搅拌，再光照60s后，重复上述步骤，直至紫外吸收光谱无明显变化为止，结果见图3。
试验例3BODIPY-Azo-single的光稳定性测试
将合成的光敏剂BODIPY-Azo-Single PBS溶液(10uM)暴露在白光照射下(20W/cm2)10min。如图4所示，化合物在10min内的吸收强度仅有略微下降，证明该化合物光稳定性良好，适合用于光动力治疗。
试验例4体外抗肿瘤活性测定
采用CCK-8法，对BODIPY-Azo-single和BODIPY-3-single的光毒性进行了考察，均在加药4h，光照30min，辐射强度为20W/m2,所设浓度梯度范围是0.25μmol/L到8μmol/L。结果如图5所示，可以看出在常氧状态下，BODIPY-3-single的光毒性优于BODIPY-Azo-single，而在低氧状态下BODIPY-Azo-single的光毒性优于BODIPY-3-single，可能是由于偶氮键断裂代谢出了BODIPY-3-single和苯胺氮芥，同时也注意到BODIPY-3-single从常氧状态到低氧状态光毒性有了一个明显的下降，这可能归因于细胞内氧气浓度导致的单线态氧产生较少。
实施例5体内抗肿瘤活性测定
实验所用小鼠为四周龄的免疫缺陷的Balb/c裸鼠，饲养在加压通风笼中。将A375细胞溶解在PBS中以制备细胞悬浮液，将裸鼠分为6组，每组3只动物，背部皮下注射100μLPBS细胞悬浮液，并使肿瘤自由生长，当肿瘤体积约到200mm3时，裸鼠的6个组分别为：空白对照(仅PBS)、仅光照组，BOD-Azo-single组，BOD-3-single组，BOD-Azo-single+光照组，BOD-3-single+光照组。采用瘤内注射一次给药的治疗方(每次注射0.1ml药物，注射浓度BODIPI-Azo-single为4.6mg/ml；BODIPY-3-single为2.9mg/ml；光照强度为40W/cm2)每天监测肿瘤生长，并记录肿瘤体积和小鼠体重，5天后，将小鼠处死，解剖肿瘤部位，并使用标尺参考进行摄影记录，并称重记录各组肿瘤重量。
结果：如图6所示在治疗期间小鼠的体重并没有出现一个明显的变化。如图7-10所示，空白组和光照组,以及BOD-3-single肿瘤呈现增长趋势，BOD-Azo-single相比之下有一定程度的抑制作用，BOD-3-single+光照组的肿瘤抑制作用更为明显，BOD-Azo-single+光照组的抑制作用最强。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域技术人员依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种用于克服肿瘤乏氧的新型光敏剂，其特征在于，其结构如下：
式I。
2.一种如权利要求1所述的新型光敏剂的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
S1：以苯甲酰氯为起始原料，在有机溶剂A中，与2,4-二甲基吡咯反应，然后加入三乙胺和三氟化硼乙醚，络合得到BODIPY-1；
S2：在有机溶剂B中，BODIPY-1通过NBS溴代得到BODIPY-2；
S3：BODIPY-2与Azo-3，在有机溶剂C中，滴入哌啶和乙酸，通过克脑文格尔反应得到BODIPY-Azo-single；
反应式如下：
。
3.根据权利要求2所述的新型光敏剂的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂A选自二氯甲烷或四氢呋喃；所述溶剂B选自二氯甲烷或四氢呋喃；所述溶剂 C选自乙腈、甲苯或苯。
4.根据权利要求2所述的新型光敏剂的制备方法，其特征在于，所述苯甲酰氯与所述2,4-二甲基吡咯的摩尔比为1:2~2.5；所述BODIPY-1和所述NBS的摩尔比为1:2~2.4；所述BODIPY-2和所述Azo-3的比例为1:2.5~3。
5.根据权利要求2所述的新型光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1的反应温度为15~35℃，三乙胺和三氟化硼乙醚的滴加温度为-10~0℃；所述步骤S2的反应温度为15~35℃，NBS的滴加温度为-10~0℃；所述步骤S3的反应温度为回流。
6.根据权利要求2所述的新型光敏剂的制备方法，其特征在于，所述Azo-3的合成通过如下步骤实现：
a．对氨基苯甲醇与N-苯基二乙醇胺通过重氮化反应得到Azo-1；
b．Azo-1与三氯氧磷氯代得到Azo-2；
c．Azo-2与对羟基苯甲醛通过威廉姆森醚合成得到Azo-3；
反应式如下：
。
7.根据权利要求2所述的新型光敏剂的制备方法，其特征在于，所述步骤a的溶剂为水，反应温度为-5~5℃，所述对氨基苯甲醇和所述N-苯基二乙醇胺的摩尔比为1:1-1.2；所述步骤b的反应温度为回流；所述步骤c的溶剂为乙腈或甲苯、苯，反应温度为回流，所述Azo-2与所述对羟基苯甲醛的摩尔比为1:1.1~1.3。
8.一种组合物，其特征在于，包含如权利要求1所述的新型光敏剂。
9.一种如权利要求1所述的新型光敏剂在制备肿瘤诊断和/或肿瘤治疗产品中的应用。
10.一种如权利要求1所述的光敏剂的代谢产物在制备肿瘤诊断和/或肿瘤治疗产品中的应用，所述代谢产物结构如下：
。
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