CN118307971A - 基于非对称型方酸菁染料的纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药化学领域，具体公开了一种基于非对称型方酸菁染料的纳米材料及其制备方法和应用。该非对称型方酸菁染料的分子结构式如式(1)所示：式(1)；其中：R1为氢或C1‑C20的烷基；R2为氧或丙二氰基。纳米材料包括胶束纳米粒子和MnO2‑BSA纳米粒子，MnO2‑BSA纳米粒子通过静电吸附于胶束纳米粒子的表面；胶束纳米粒子的核心为非对称型方酸菁染料，非对称型方酸菁染料的外层包覆有两亲性嵌段共聚物和偶联肿瘤靶向多肽的两亲性嵌段共聚物。该纳米材料在肿瘤的精准诊疗领域中具有巨大的应用潜力，为未来的肿瘤治疗提供了新的可能。
Description
技术领域
本发明属于医药化学领域，具体涉及一种基于非对称型方酸菁染料的纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
传统的癌症诊断手段如核磁共振(MRI)、计算机断层扫描(CT)等，存在放射性风险、操作困难、特异性差和灵敏度低等问题。相比之下，光学成像技术，特别是近红外荧光成像技术，因其成像时间短、灵敏度高和测试成本低等优点，为这一问题提供了新的解决路径。近红外荧光成像技术具有强组织穿透能力、避免生物背景荧光和对活体损伤小等优点，弥补了传统诊断手段的缺陷。虽然各种成像技术都有其优缺点，但临床实践中已不局限于单一的成像检测技术。例如，磁共振成像(MRI)可以实现病灶的三维断层图像和较高的空间分辨率，但其相对较弱且成像时间长等特点限制了其在肿瘤方面的应用；而近红外荧光成像(NIRFI)虽空间分辨率较低，但其成像快速、灵敏度高等特点正好可以弥补MRI的不足。将MRI和NIRFI成像优点结合起来，将为医学临床和科学研究带来更广阔的应用前景。这种结合将有望为癌症的诊断和治疗提供更准确、高效的方法，从而更好地服务于全球的癌症患者。
相较于化疗、放疗和手术切除等传统治疗手段，光动力治疗(PDT)具有更高的时空选择性、更小的创伤性和更低的毒副作用。这一新兴的癌症治疗方法，利用特定光源激活无毒或微毒的光敏剂(PS)，生成具有细胞毒性的物质(ROS)。这些ROS能直接氧化蛋白质、脂质、核酸碱基和氨基酸残基等，从而改变脂质的新陈代谢，上调细胞因子和应激蛋白的表达，最终引发细胞凋亡、坏死或自噬。PDT的机理在于，适当波长的光照射下，PS被激发至单线态激发态，并迅速转换为三线态激发态。在这一状态下，PS与底物发生光动力反应，生成具有细胞毒性的ROS。目前，这种光动力反应过程分为I型和II型两种机制。在I型光化学反应中，三线态的PS通过电子转移与附近底物反应，形成自由基阳离子或自由基阴离子。这些离子会进一步与含氧基质(如水、氧气等)反应，产生超氧阴离子和羟基自由基。相比之下，II型光化学反应中，三线态的PS直接将能量传递给氧气，生成高反应活性的单线态氧(1O2)。尽管II型PDT具有高氧依赖性和高耗氧量，但I型PDT的耗氧量较少，有助于克服实体瘤的恶性缺氧困境。这意味着，I型PDT在临床治疗应用方面具有巨大潜力。此外，无机材料如TiO2、ZnO已被报道能高效率地产生超氧阴离子和羟基自由基。然而，单独的无机材料可能存在生物安全性问题，同时短波长也限制了组织穿透深度，不利于深度治疗肿瘤。相比之下，一些用于PDT治疗的有机金属络合物和金属-有机框架虽然避免了氧气依赖和消耗的问题，但它们仍存在重复性差、严重的细胞毒性、生物降解性低和药代动力学复杂等缺点。有机小分子光敏剂为克服无机材料在治疗肿瘤方面的局限性提供了新的解决路径。理想的有机小分子光敏剂需满足以下条件：1)易于制备、具备良好的稳定性与高纯度；2)能够有效地到达并选择性地集中在目标组织中；3)具有优异的光物理和光化学性质，特别是在600-900nm波长范围内有高吸收率；4)具有良好的生物相容性；5)能产生高活性的活性氧(ROS)。
肿瘤微环境，一个由复杂细胞群体构成的生态系统，包含癌细胞和癌症干细胞的异质性以及多种被招募的基质细胞类型。与正常的组织细胞环境相比，肿瘤微环境具有独特的特征，如缺氧、氧化应激的加剧以及谷胱甘肽(GSH)的过表达。这些特性对各种抗癌治疗方法的效果产生了深远的影响，极大地限制了癌症的治疗。针对肿瘤部位缺氧的问题，研发基于I型光化学过程的创新光动力治疗光敏剂更具有研究意义。这种光敏剂的独特之处在于，它无需氧气参与，能够直接产生具有强大细胞毒性的羟基自由基。肿瘤细胞内存在一种复杂的氧化还原平衡机制，可能会抵抗ROS诱导的细胞损伤，从而影响治疗效果。为了克服这一挑战，研究人员正在探索消耗细胞内过表达的谷胱甘肽(GSH)的方法。GSH是一种在肿瘤细胞中高度表达的还原剂，负责消除氧化应激以维持肿瘤细胞的活性。通过消耗过表达的GSH，可以生成更多的ROS。此外研究人员利用肿瘤细胞内的高含量的H2O2，设计制备包含过氧化氢酶的纳米平台进行光动力治疗(PDT)，过氧化氢酶是一种关键的催化酶，能将细胞内的过氧化氢(H2O2)转化为氧气(O2)和水过氧化氢酶的过表达，降低肿瘤细胞的生长速度和扩散速率，从而显著改善治疗效果。
因此，亟需研发一种新型制剂，以应对肿瘤乏氧环境并降低GSH水平，从而优化PDT治疗的效果。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于非对称型方酸菁染料的纳米材料及其制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种非对称型方酸菁染料，其分子结构式如式(1)所示：
其中：R1为氢或C1-C20的烷基；R2为氧或丙二氰基。
具体地，本发明的方酸菁染料是一种不对称方酸类有机小分子化合物，融合了方酸部分、吲哚部分和噻吩-酚噻嗪基团，即在方酸母核上连接了不同的富电子集团，吲哚和噻吩-酚噻嗪基团，增强了分子内的电荷转移特性，增大了分子的刚性和空间位阻，有效抵御了单线态氧的进攻。相较于传统的对称型方酸菁染料，这种设计不仅增大了斯托克位移，还显著增强了光稳定性，使得该化合物在近红外成像领域具有更广阔的应用前景。经过实验，证实这类有机小分子能够通过I型光动力反应产生羟基自由基，能在肿瘤的缺氧环境中生成ROS，从而发挥PDT治疗作用。
作为上述方案的进一步改进，所述的非对称型方酸菁染料的分子结构式如式(2)或式(3)所示：
作为上述方案的进一步改进，上述非对称型方酸菁染料的制备方法，包括以下步骤：
将1，3-方酸作为电子受体结构单元与电子供体结构单元混合，进行偶联反应，制得所述非对称型方酸菁染料；所述电子供体结构单元包括氢或甲基取代的吲哚和噻吩-吩噻嗪共轭单元。
优选地，所述电子受体结构单元与电子供体结构单元的摩尔比为(2-3)：1。
本发明的第二方面提供了一种纳米材料，包括胶束纳米粒子和MnO2-BSA(牛血清蛋白)纳米粒子，所述MnO2-BSA纳米粒子通过静电吸附于所述胶束纳米粒子的表面；
所述胶束纳米粒子具有包覆结构，其核心为权利要求1或2所示的非对称型方酸菁染料，外包覆层含有两亲性嵌段共聚物和偶联肿瘤靶向多肽的两亲性嵌段共聚物。
优选地，所述两亲性嵌段共聚物包括二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)。
优选地，所述肿瘤靶向多肽包括CREKA，CREKA为Cys-Arg-Glu-Lys-Ala五肽，可特异性结合肿瘤血管壁上的微血栓内的纤维蛋白-纤连蛋白复合物，具有肿瘤靶向功能。
具体地，本发明的纳米材料包括含有非对称型方酸菁染料和肿瘤靶向多肽的胶束纳米粒子，以及MnO2-BSA纳米粒子。该纳米材料可以通过EPR效应和CREKA的主动靶向作用到达肿瘤部位，高效地聚集在肿瘤组织区域。在肿瘤微环境中，系统中的非对称型方酸菁染料被释放，实现近红外荧光成像，同时在近红外(660nm)光照下展现了优异的I型光动力性能，产生羟基自由基，杀死肿瘤细胞；此外，MnO2-BSA纳米粒子的加入可以实现T1对比增强磁共振成像，Mn2+可发生类芬顿反应，产生额外的羟基自由基，进一步增强了其治疗效果。
本发明的第三方面提供了上述纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将非对称型方酸菁染料溶于有机溶剂后，滴加至含两亲性嵌段共聚物和肿瘤靶向多肽的水溶液中，进行混合、透析，得胶束纳米粒子水溶液，记为Cy Nps水溶液；
(2)在牛血清蛋白水溶液中加入高锰酸水溶液，分散，得含MnO2和牛血清蛋白的水溶液，记为MnO2-BSA Nps水溶液；
(3)将步骤(1)制得的Cy Nps水溶液与步骤(2)制得的MnO2-BSA Nps水溶液混合，经透析，得所述纳米材料，记为Cy@MnO2 Nps水溶液。
具体地，本发明的纳米材料在制备时，通过纳米沉淀法，先将上述非对称型方酸菁染料与DSPE-PEG2000-CREKA自组装，制备稳定且尺寸均匀并具有肿瘤靶向功能的脂质体纳米粒子，即胶束纳米粒子Cy Nps；然后将其与核磁成像剂MnO2-BSA纳米粒子混合，使MnO2-BSA纳米粒子静电结合在胶束纳米粒子Cy Nps表面，形成多功能肿瘤微环境响应型纳米材料Cy@MnO2 Nps。该纳米材料不仅具备精准靶向肿瘤细胞的能力，而且面对复杂的肿瘤微环境可展现出双重优势：一方面，通过消耗过量的GSH，保护光敏剂；另一方面，还原得到的Mn2 +，能在H2O2催化下触发类芬顿反应，生成更多的羟基自由基。这一特性使得该纳米材料在近红外光的照射下，能够对缺氧乳腺癌细胞进行I型光动力治疗。
优选地，所述Cy Nps水溶液与所述MnO2-BSA Nps水溶液的体积比为1：(1-2)。
优选地，步骤(1)中，所述有机溶剂包括四氢呋喃。
优选地，步骤(1)中，所述非对称型方酸菁染料溶于有机溶剂后所形成的溶液(溶液A)的浓度为1-10mg/mL，所述含两亲性嵌段共聚物和肿瘤靶向多肽的水溶液(溶液B)的浓度为2-20mg/mL，溶液A与溶液B的体积比为(0.01-1)：1。
优选地，步骤(1)中，所述混合为先超声5-30min，然后搅拌，以使有机溶剂挥发。
优选地，步骤(1)中，所述透析为采用0.22μm的微孔滤膜，透析12-36小时。
优选地，步骤(2)中，所述牛血清蛋白水溶液(溶液C)的浓度为10-100mg/mL，所述高锰酸水溶液(溶液D)的浓度为10-100mg/mL，溶液C与溶液D的体积为(0.04-4)：1。
优选地，步骤(2)中，所述分散为采用超声分散15-30min。
优选地，步骤(3)中，所述混合为搅拌0.5-1小时。
优选地，步骤(3)中，所述透析为采用0.22μm的微孔滤膜，透析12-36小时。
本发明的第四方面提供了上述非对称型方酸菁染料或纳米材料在肿瘤细胞生物成像领域中的应用。
本发明的第五方面提供了一种磁共振成像制剂，包括上述纳米材料。
本发明的第六方面提供了上述非对称型方酸菁染料或纳米材料在制备光动力抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括乳腺癌。
本发明的上述技术方案相对于现有技术，至少具有如下技术效果或优点：
(1)本发明的非对称型方酸菁染料，通过在方酸母核上连接了不同的富电子集团，吲哚和噻吩-酚噻嗪基团，增强了分子内的电荷转移特性，增大了分子的刚性和空间位阻，有效抵御了单线态氧的进攻；表现出优越的稳定性，较大的斯托克位移，并能通过I型光动力反应，在不需要氧气的参与下，即可生成具有强大细胞毒性的羟基自由基，在肿瘤的缺氧环境中生成ROS，从而发挥PDT治疗作用。这一发现为乏氧肿瘤的治疗提供了新的思路，预示着这类化合物在肿瘤光动力治疗领域具有巨大的发展潜力。
(2)本发明通过纳米沉淀法，先将非对称型方酸菁染料与DSPE-PEG2000-CREKA自组装，制备稳定且尺寸均匀并具有肿瘤靶向功能的脂质体纳米粒子Cy Nps；再与核磁成像剂MnO2-BSA纳米粒子偶联，形成多功能肿瘤微环境响应型纳米材料Cy@MnO2 Nps。这一体系不仅具备近红外荧光(NIRFI)和磁共振成像(MRI)双模态成像，实现在活体内监测纳米粒子的分布，为精确指导PDT治疗提供了有力手段，通过Ⅰ型光敏剂Cy Nps协同Mn2+化学动力学，共同产生的羟基自由基进行抗肿瘤治疗。这一创新策略实现了癌症诊疗一体化，为优化PDT的设计与应用提供了宝贵的策略，对推动临床肿瘤治疗的发展具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例非对称型方酸菁染料Cy-532和Cy-580在不同溶剂的紫外吸收光谱图；
图2为本发明实施例非对称型方酸菁染料Cy-532和Cy-580在不同溶剂的荧光光谱图；
图3为本发明实施例非对称型方酸菁染料Cy-532和Cy-580在660nm光照下吸光度比值图；
图4为本发明实施例非对称型方酸菁染料Cy-532和Cy-580测定羟基自由基荧光比值图；
图5为本发明实施例纳米材料Cy-580 Nps和Cy-580@MnO2 Nps的紫外吸收和荧光发射光谱图；
图6为本发明实施例纳米材料Cy-580 Nps和Cy-580@MnO2 Nps的水和粒径图和透射电镜图；
图7为本发明实施例纳米材料Cy-580 Nps和Cy-580@MnO2 Nps测定羟基自由基荧光比值图；
图8为本发明实施例纳米材料Cy-580@MnO2 Nps的T1加权磁共振成像图；
图9为本发明实施例纳米材料Cy-580 Nps和Cy-580@MnO2 Nps对4T1肿瘤细胞的摄取图；
图10为本发明实施例纳米材料Cy-580 Nps和Cy-580@MnO2 Nps在非光照或光照下对4T1肿瘤细胞的光动力治疗图；
图11为本发明实施例纳米材料Cy-580 NPs、Cy-580@MnO2 NPs用于靶向荷瘤小鼠肿瘤近红外荧光成像图；
图12为本发明实施例纳米材料Cy-580@MnO2 Nps用于荷瘤小鼠肿瘤磁共振成像图；
图13为本发明实施例纳米材料Cy-580 Nps、Cy-580@MnO2 Nps在不同处理组小鼠的肿瘤生长曲线及14天解剖后肿瘤重量图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。
以下实施例1-2中化合物Cy-532和化合物Cy-580的合成路线如下：
实施例1
一种非对称型方酸菁染料，其分子结构式如下，记为化合物Cy-532，其制备方法包括如下步骤：
(1)称取3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮(684mg，6mmol)、二氯亚砜SOCl2(1.2mL)和二甲基甲酰胺(DMF，120μL)添加至甲苯(10mL)，然后在95℃下搅拌1.5h；随后，旋蒸除去SOCl2，得到黄色油状物质；
(2)在室温下向步骤(1)得到的黄色油状物3,4-二氯-3-环丁烯-1,2-二酮加入化合物2(338mg，1.5mmol)、氯化铝(100mg，0.75mmol)和无水二氯甲烷(15mL)，N2下回流过夜。将化合物冷却至室温后，用饱和氯化铵(NH4Cl)溶液淬灭反应液，然后用二氯甲烷萃取。收集有机层，依次用饱和碳酸氢钠(NaHCO3)、去离子水、饱和氯化钠溶液(NaCl)洗涤，有机层用无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，减压蒸去溶剂，将固体溶解在5mL丙酮中，并加入三乙胺(N(Et)3)在室温下搅拌30min后，减压蒸去溶剂，加入15mL水，过滤除去未溶解的物质。滴加HCl至pH＝2左右，有褐色固体形成。减压过滤，对该固体通过硅胶柱层析法(二氯甲烷：甲醇＝50：1v/v)分离和纯化以得到黄色化合物3(113mg，20％)；
(3)将步骤(2)得到的化合物3(189mg，0.5mmol))和化合物6(180mg，0.6mmol)，加入甲苯、正丁醇各5mL，加热回流4h。TLC监测反应，反应完成后将反应液冷却至室温，减压旋蒸除去溶剂，用硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝200：1，V/V)得到深蓝色目标化合物Cy-532(202mg，38％)。
对化合物Cy-532的结构进行鉴定，具体数据如下：
核磁氢谱1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.69(d,J＝7.6Hz,1H),7.66(d,J＝8.0Hz,1H),7.60(d,J＝4.0Hz,1H),7.49(t,J＝8.0Hz,1H),7.46(d,J＝9.6Hz,2H),7.40(d,J＝3.2Hz,1H),7.37(br,2H),7.35(t,J＝8.0Hz,2H),7.24(t,J＝7.2Hz,2H),6.91(d,J＝4.0Hz,1H),6.14(s,1H),3.85(s,3H),1.71(s,6H).
核磁碳谱13C NMR(100MHz,CDCl3)δ185.6,175.3,162.6,161.8,142.4,142.2,141.6,133.6,131.1,128.2,127.7,126.6,125.8,124.0,122.4,119.3,113.9,110.6,50.5,31.8,26.4.
质谱ESI-MS:m/z 533.1([M+H]+)and HR-MS for C32H24N2O2S2([M+H]+)calcd:533.1352,found:533.1339.
以上证明所制得的非对称型方酸菁确实具有Cy-532所示分子结构。其中DMSO-d6为氘代二甲基亚砜。
实施例2
一种非对称型方酸菁染料，其分子结构式如下，记为化合物Cy-580，其制备方法包括如下步骤：
(1)称取3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮(684mg，6mmol)、SOCl2(1.2mL)和DMF(120μL)添加至甲苯(10mL)，然后在95℃下搅拌1.5h。随后，旋蒸除去SOCl2，得到黄色油状物质；
(2)在室温下向步骤(1)得到的黄色油状物3,4-二氯-3-环丁烯-1,2-二酮加入化合物2(338mg，1.5mmol)、AlCl3(100mg，0.75mmol)和无水二氯甲烷(15mL)，N2下回流过夜。将化合物冷却至室温后，用饱和氯化铵溶液淬灭反应液，然后用二氯甲烷萃取。收集有机层，依次用饱和碳酸氢钠(NaHCO3)、去离子水、饱和氯化钠溶液(NaCl)洗涤，有机层用无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，减压蒸去溶剂，将固体溶解在5mL丙酮中，并加入三乙胺(N(Et)3)在室温下搅拌30min后将固体(790mg，2mmol)溶于6mL DMF中，加入丙二腈(198mg，3mmol)，搅拌下滴加80μL N(Et)3，室温下反应2h，TLC监测反应，反应完全后旋蒸除去溶剂，用硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝50：1，v/v)分离纯化得橙色化合物4(85mg，10％)；
(3)将步骤(2)得到的化合物化合物4(85mg，0.2mmol))和化合物6(105mg，0.35mmol)，加入甲苯、正丁醇各3mL，加热回流4h。TLC监测反应，反应完成后将反应液冷却至室温，减压旋蒸除去溶剂，用硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3：1，v/v)得到绿色目标化合物Cy-580(25.5mg，22％)。
对化合物Cy-580的结构进行鉴定，具体数据如下：
核磁氢谱1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.20(d,J＝4.4Hz,1H),7.64(d,J＝7.6Hz,2H),7.44(d,J＝8.0Hz,2H),7.41(t,J＝4.0Hz,2H),7.38(br,1H),7.35(d,J＝4.4Hz,1H),7.33(t,J＝6.8Hz,1H),7.28(br,1H),7.22(t,J＝8.0Hz,2H),6.78(s,1H),6.72(d,J＝4.4Hz,1H),3.76(s,3H),1.74(s,6H).
核磁碳谱13C NMR(100MHz,CDCl3)δ176.7,173.5,170.0,165.1,164.8,157.2,142.5,141.9,141.0,137.6,132.0,128.5,127.8,127.2,126.6,124.6,122.5,119.3,118.6,118.0,113.9,111.3,91.6,50.7,32.5,25.9.
质谱ESI-MS:m/z 579.1([M-H]-)and HR-MS for C35H24N4OS2([M-H]-)calcd:579.1319,found:579.1318.
以上证明所制得的非对称型方酸菁确实具有Cy-580所示分子结构。其中CDCl3为氘代氯仿。
实施例3
一种纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将实施例2制得的化合物Cy-580溶解在四氢呋喃(200μL，3mg/mL)中，在超声处理下将其滴加至含DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-CREKA的超纯水(2mL，5mg/mL)中，所得分散液超声15min，室温下搅拌12h，除去四氢呋喃后进行透析，在透析24h，最后收集透析袋中的溶液即为光敏剂Cy-580的纳米颗粒(Cy-580 NPs)；
(2)将高锰酸钾水溶液(2.5mL，5mg/mL)，在超声处理下将其加至含牛血清蛋白(BSA)的超纯水中(5mL，20mg/mL)，超声1h，透析24h，得到棕色的MnO2-BSA纳米材料；
(3)将步骤(1)制得的Cy-580 NPs与步骤(2)制得的MnO2-BSA按体积比1：1混合，搅拌1h，即得到Cy-580@MnO2 NPs纳米材料。
效果测试
1.非对称型方酸菁染料在溶液中的光学性质
(1)分别将实施例1和实施例2制备的两种非对称型方酸菁染料Cy-532和Cy-580溶解于不同的有机溶剂(DCM、CH3OH、DMSO、THF和CHCl3)中，配制成的浓度为10μM的溶液，进行吸收光谱和荧光发射光谱的测试，所有测试均在25℃下完成。其中：在有机溶剂溶液中的紫外光谱图如图1所示，横坐标Wavelength表示波长，纵坐标Absorbance表示吸光度；荧光光谱图如图2所示，纵坐标Fluorescence intensity表示荧光强度。由图1-2可知，Cy-532和Cy-580在这些有机溶剂中均显示近红外(NIR)吸收和发射光谱，其中Cy-532在DMSO中最大吸收波长为642nm，最大发射波长为677nm。Cy-580在DMSO中最大吸收波长为681nm，最大发射波长为719nm。Cy-580在Cy-532的结构上引入丙二腈基，进一步NIR区域的红移。在这些有机溶剂中，Cy-532和Cy-580的Stokes位移均大于20nm，这有利于减小激发和发射光谱之间的干扰，便于灵敏检测和准确分析。
(2)分别将实施例1和实施例2制备的两种非对称型方酸菁染料化合物Cy-532和化合物Cy-580溶解于水中，配制成的浓度为10μM的水溶液，使用660nm激光(220mW·cm-2)在室温下对溶液进行不同时间间隔的光照射，时间间隔为0min、0.5min、1min、1.5min、2min、3min、4min、5min、10min和15min，测量溶液的紫外光谱，其结果如图3所示，横坐标Irradiation time表示照射时间。分析它们在各自紫外光谱的最大吸收峰的吸光度值变化(Cy-532：664nm；Cy-580：717nm)，660nm激光照射15min后，两种非对称型方酸菁染料吸光度值无明显变化，光稳定性优异，其中Cy-580的光稳定性略强于Cy-532。
2.羟基自由基指示剂HPF评估Ⅰ型光动力效果
配制以PBS缓冲液为溶剂，均匀混合浓度为10μM的非对称型方酸菁染料Cy-532、Cy-580和HPF(4μM)(Eλ/Em＝480/514nm)，用660nm(220mW·cm-2)氙气灯照射15分钟，测其荧光光谱以及在514nm荧光比值的变化，时间间隔为0min、0.5min、1min、2min、3min、4min、5min、7min、10min和15min，结果如图4所示。由图4可知，Cy-532和Cy-580显示了较高的羟基自由基生成能力，而且Cy-580活性比Cy-532略高，这表明引入噻吩-酚噻嗪的非对称型方酸菁染料在660nm的激光照射下，发生I型光动力反应，进而产生大量的羟基自由基，是一类新型的I型方酸菁类光敏剂。
基于以上非对称型方酸菁染料Cy-580优异的光学性质和I型光动力治疗潜力，本发明还提供了Cy-580制备成纳米材料用于肿瘤诊疗的应用。
3.纳米材料Cy-580 Nps和Cy-580@MnO2 Nps的光学性质及其表征
通过紫外-可见-近红外吸收光谱仪和荧光光谱仪，分别测试了实施例3制得的纳米材料Cy-580 NPs和Cy-580@MnO2 NPs在水中的紫外吸收光谱和荧光光谱，结果如图5所示。根据紫外光谱图5(a)，可以看到Cy-580 NPs的紫外光谱和Cy-580紫外光谱相似，在400nm和700nm处有吸收峰；MnO2-BSA纳米粒子在400nm处有强的吸收峰；Cy-580@MnO2 NPs在400nm处有强的吸收峰，在700nm处也有明显的吸收峰，说明纳米材料中包裹了染料Cy-580和无机材料MnO2。以695nm为激发波长，得到两种纳米材料在726nm处的发射荧光光谱，参见图5(b)，且同浓度(10μg/mL)下Cy-580 NPs展示了更强的荧光强度。
采用透射电镜和粒径分析仪对纳米材料Cy-580 NPs和Cy-580@MnO2 NPs的尺寸和形貌进行了表征，结果如图6所示。其中：图6(a)为粒径分布图，横坐标Size表示粒径，纵坐标Intensity表示强度，Zeta potential表示电位；由纳米粒子的粒径分析数据表明，其水合粒径为100nm左右；6(b)和图6(c)分别为Cy-580 Nps和Cy-580@MnO2 Nps的TEM图，表明纳米粒子呈球形，直径与水的粒径图相近。
4.纳米材料Cy-580 Nps和Cy-580@MnO2 Nps产生羟基自由基能力评估
配制以碳酸氢钠溶液(10mM)为溶剂，均匀混合Cy-580@MnO2 NPs、HPF(4μM)和H2O2(200μM)(Eλ/Em＝480/514nm)，或者Cy-580 NPs、HPF(4μM)和H2O2(200μM)(Eλ/Em＝480/514nm)，其中Cy-580浓度为10μg/mL，在不加和加4mM的GSH，用660nm(220mW·cm-2)氙气灯照射15min，测其荧光光谱，时间间隔为0min、0.5min、1min、2min、3min、4min、5min、7min、10min和15min，结果如图7所示。由图7可知，在四种体系下，Cy-580@MnO2 NPs和H2O2体系在存在GSH时，产生·OH的能力最强。究其原因主要在于：MnO2与GSH反应，产生Mn2+，在Mn2+和HCO3 -的共同催化下发生类芬顿反应，H2O2也分解产生了额外的·OH。
5.纳米材料Cy-580@MnO2 Nps的磁共振成像
使用pH 6.5和pH 7.4的去离子水溶液，配制含不同浓度的纳米材料Cy-580@MnO2Nps(0μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL和500μg/mL)，用7T临床磁共振成像扫描仪扫描，分别测试无GSH存在下的T1加权像，GSH浓度为6mM时T1加权像和GSH浓度为6mM、H2O2浓度为200μM时T1加权像，结果如图8所示。由图8可知，在酸性条件下，Cy-580@MnO2 Nps溶液在T1加权MRI成像下显示出明显的浓度依赖性增亮效果，特别在6mM GSH存在下，随着纳米材料浓度的不断增大，其T1加权成像能力不断增强；如在纳米材料中同时加入GSH和H2O2(withGSH and H2O2)，其T1加权成像能力稍有下降，可能原因是Mn2+作为催化H2O2分解羟基自由基，浓度略有变化导致。
6.纳米材料Cy-580 Nps和Cy-580@MnO2 Nps对肿瘤细胞摄取实验
将4T1细胞与10μg/mL的Cy-580 NPs和Cy-580@MnO2 NPs分别孵育不同时间(0-10h)，并在激光共聚焦显微镜下观察，结果分别如图9(a)和图9(b)。由图9可知，随着时间的推移，两者能够有效进入胞内并发出荧光，但是发现8h时，两种材料均为荧光最亮，其亮度可维持到10h。
7.纳米材料Cy-580 Nps和Cy-580@MnO2 Nps对肿瘤细胞的光动力治疗效果
将处于指数生长期的4T1(小鼠乳腺癌细胞)种于96孔板(5000个细胞/100μL/每孔)，培养过夜，化合物配制成不同浓度含Cy-580 Nps和Cy-580@MnO2 Nps(0-64μg/mL)的纳米材料，分别加入，每个浓度5个复孔，孵育4h后用660灯板照10分钟后继续孵育至满24h，将旧培养基除去，加入100μL含MTT(0.5g/mL)的培养基，继续孵育4h。然后吸去培养基，每孔加入100μL DMSO，使用多功能微孔板检测仪对每孔中490nm处吸光度进行检测，细胞存活率(Cell viability)％＝(Fn-Fb)/(F0-Fb)×100％，其中，F0、Fn和Fb分别代表对照组、实验组和空白组的吸光度值，结果如图10所示。图10(a)和图10(b)分别为Cy-580 NPs和Cy-580@MnO2 NPs在0-16μg/mL和pH 6.5时对4T1细胞的光毒性(Light)和暗毒性(Dark)。由图10可知，Cy-580@MnO2 NPs比Cy-580 NPs具备更强的光毒性，它们的IC50值分别为4.8μg/mL和6.4μg/mL在0-16μg/mL浓度范围内暗毒性都较小。
8.纳米材料Cy-580 NPs、Cy-580@MnO2 NPs用于荷瘤小鼠的近红外荧光成像
首先，建立4T1荷瘤BALB/c小鼠肿瘤模型用于评价Cy-580 NPs、Cy-580@MnO2 NPs在活体内的靶向成像能力。将培养好的4T1细胞以2×106细胞/100μL的密度接种在小鼠背部的右下方皮下处，培养至长出肿瘤体积为100mm3左右。通过尾静脉对荷瘤小鼠注射100μL的纳米材料(5mg/mL)溶液，对照组注射100μL的PBS。采集注射后时间点为0h、1h、3h、6h、12h和30h的小鼠近红外荧光图像。
结果如图11所示，两种纳米材料均表现出肿瘤靶向性，负载了多肽CREKA的Cy-580NPs和Cy-580@MnO2 NPs，具备明显的肿瘤靶向性，表现为在肿瘤部位有荧光聚集，而在其他器脏无明显的荧光聚集。这种现象可能是被动靶向(EPR效应)和多肽的主动靶向的共同作用。从图11可知，Cy-580@MnO2 NPs和Cy-580 NPs具备相似的近红外成像能力，随着时间的延长，肿瘤部位荧光逐渐增强，到6h达到最大值，随后荧光慢慢减弱。表明Cy-580NPs和Cy-580@MnO2 NPs具有较好的活体近红外荧光成像能力，更有利于肿瘤的诊疗。
9.纳米材料Cy-580@MnO2 NPs用于荷瘤小鼠的磁共振成像
首先，对4T1荷瘤BALB/c小鼠(肿瘤体积为100mm3左右)，配置pH 6.5的Cy-580@MnO2NPs(5mg/kg)溶液，瘤内注射至荷瘤小鼠，分别测定0、0.5h、1h、3h和6h时T1信号强弱变化(T1WI:TR＝300.0ms,TE＝6.2ms)，收集各个时间点肿瘤部位的T1磁共振图像。结果如图12所示，随着时间的延长，能观测到肿瘤部位的MR信号明显增强，在3h强度达到最大，肿瘤部位信噪比即达到峰值，随后MRI强度逐渐衰减。这是由于纳米材料Cy-580@MnO2 NPs在酸性肿瘤微环境中，MnO2与过表达的GSH发生氧化还原反应，生成Mn2+，T1磁共振成像能力逐渐增强，表明纳米材料在肿瘤部位能够释放Mn2+离子，实施MR成像监测。
10.纳米材料Cy-580 NPs、Cy-580@MnO2 NPs用于荷瘤小鼠的肿瘤治疗
建立4T1荷瘤BALB/c小鼠模型，肿瘤体积为100mm3左右时，将小鼠随机分为8组，每组6只。实验小鼠分组：Ⅰ(PBS组)、Ⅱ(PBS+light组)、Ⅲ(Cy-580 Nps组)、Ⅳ(Cy-580@MnO2Nps组)、Ⅴ(Cy-580 Nps+light组)、Ⅵ(Cy-580@MnO2 Nps+light组)。每只以2mg/mL的剂量通过肿瘤原位注射的方式给小鼠注射100μL的PBS或不同的纳米材料。660nm氙灯照射(500mW·cm-2,15min)，测量并记录0、2、4、6、8、10、12、14天的肿瘤体积、小鼠体重。如图13所示，图13(a)图13(b)分别是不同处理组小鼠的肿瘤生长曲线和14天后不同处理组得到的肿瘤重量。由图13(a)和(b)可知，Ⅰ-Ⅳ组，肿瘤体积随着治疗天数而增加，而Ⅴ和Ⅵ这两组，在经过660nm氙灯照射治疗后，明显肿瘤体积减小，解剖后肿瘤的重量几乎为0。这两种情况下都显示了优良的光治疗肿瘤效果。同时对比光照组Ⅴ和Ⅵ，Ⅵ组解剖后肿瘤治疗效果更加明显，说明含MnO2的纳米材料能产生更多的·OH杀死癌细胞，说明了Cy-580@MnO2 Nps在治疗乳腺癌方面具有巨大的潜力。
综上所述，本发明提供了一类非对称型方酸菁染料的合成方法，考察了Cy-532和Cy-580在不同溶液下的吸收和发射光谱、光稳定性，其中Cy-580的光学性质更为优越。同时不同的活性氧指示剂评估化合物光动力效果实验，证明本发明提供的非对称型方酸菁染料是一类Ⅰ型光敏剂，未来可应用于乏氧的肿瘤环境，高效产生羟基自由基杀死肿瘤细胞。将Cy-580通过纳米沉淀法，自组装制备了两种肿瘤微环境响应型纳米材料Cy-580 NPs和Cy-580@MnO2 NPs，研究了纳米粒子溶液水平上磁共振效果和羟基自由基的产生效果，进一步考察肿瘤细胞水平的近红外成像、光动力治疗效果，发现两种纳米粒子暗毒性低，在近红外光660nm激光激发照射下可实现I型光动力治疗，其中Cy-580@MnO2 NPs的光动力产生活性氧效果更强。这是由于含MnO2可以与肿瘤微环境中的GSH反应得到Mn2+，在H2O2/HCO3 -的存在下发生类芬顿反应产生更多的羟基自由基。此外，纳米粒子溶液中加入GSH，降解得到的Mn2 +，也可以作为核磁成像的造影剂。进一步考察了活体荷瘤小鼠水平的近红外/磁共振成像和治疗效果，发现含肿瘤靶向的CREKA更有利于纳米材料靶向肿瘤部位，实现动态近红外荧光成像。体外动物磁共振成像实验发现，Cy-580@MnO2 NPs中的MnO2降解得到的Mn2+，实现磁共振成像。同时更多的Cy-580@MnO2 NPs靶向聚集在肿瘤组织，可以实现更好的治疗效果。证明本发明提供的Cy-580@MnO2 NPs是一种基于Ⅰ型光敏剂非对称型方酸菁染料的、近红外-磁共振双模态成像的、还可实现光动力和化学动力学协同治疗的新型纳米粒子，对于肿瘤的成像治疗提供了新的思路。
对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下还可以做出若干简单推演或替换，而不必经过创造性的劳动。因此，本领域技术人员根据本发明的揭示，对本发明做出的简单改进都应该在本发明的保护范围之内。上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。
Claims (10)
1.一种非对称型方酸菁染料，其特征在于，其分子结构式如式(1)所示：
其中：R1为氢或C1-C20的烷基；R2为氧或丙二氰基。
2.根据权利要求1所述的非对称型方酸菁染料，其特征在于，其分子结构式如式(2)或式(3)所示：
3.一种纳米材料，其特征在于，包括胶束纳米粒子和MnO2-BSA纳米粒子，所述MnO2-BSA纳米粒子通过静电吸附于所述胶束纳米粒子的表面；
所述胶束纳米粒子具有包覆结构，其核心为权利要求1或2所示的非对称型方酸菁染料，外包覆层含有两亲性嵌段共聚物和偶联肿瘤靶向多肽的两亲性嵌段共聚物。
4.根据权利要求3所述的纳米材料，其特征在于，所述两亲性嵌段共聚物包括二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇；和/或，所述肿瘤靶向多肽包括CREKA。
5.一种如权利要求3或4所述的纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将非对称型方酸菁染料溶于有机溶剂后，滴加至含两亲性嵌段共聚物和偶联肿瘤靶向多肽的两亲性嵌段共聚物的水溶液中，进行混合、透析，得胶束纳米粒子水溶液，记为Cy Nps水溶液；
(2)在牛血清蛋白水溶液中加入高锰酸水溶液，分散，得含MnO2和牛血清蛋白的水溶液，记为MnO2-BSA Nps水溶液；
(3)将步骤(1)制得的Cy Nps水溶液与步骤(2)制得的MnO2-BSA Nps水溶液混合，经透析，得所述纳米材料，记为Cy@MnO2 Nps水溶液。
6.根据权利要求5所述的纳米材料的制备方法，其特征在于，所述Cy Nps水溶液与所述MnO2-BSA Nps水溶液的体积比为1：(1-2)。
7.权利要求1或2所述的非对称型方酸菁染料，或权利要求3或4所述的纳米材料在肿瘤细胞生物成像领域中的应用。
8.一种磁共振成像制剂，其特征在于，包括权利要求3或4所述的纳米材料。
9.权利要求1或2所述的非对称型方酸菁染料，或权利要求3或4所述的纳米材料在制备光动力抗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9的应用，其特征在于，所述肿瘤包括乳腺癌。
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