CN118078698A

CN118078698A - 一种具有舒缓和延缓衰老功效的松茸提取物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN118078698A
Application number: CN202410517203.1A
Authority: CN
Inventors: 李从严; 李秋月; 张誉荠; 黄灿; 周戟; 罗慧
Original assignee: Yunnan Yinge Biotechnology Co ltd
Current assignee: Yunnan Yinge Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-04-28
Filing date: 2024-04-28
Publication date: 2024-05-28
Anticipated expiration: 2044-04-28
Also published as: CN118078698B

Abstract

本发明涉及一种具有舒缓和延缓衰老功效的松茸提取物及其制备方法和应用，制备方法包括如下步骤：将松茸原料与乙醇水溶液混合进行回流提取，得到提取液；将提取液过滤，得到醇提滤液和滤渣；醇提滤液使用大孔树脂进行纯化，收集洗脱液；滤渣与水混合进行水提处理，得到水提取液，过滤得到水提滤液；将洗脱液和水提滤液合并，得到松茸提取物。本发明将醇提滤液与醇提滤渣的水提产物进行组合使用，不仅实现了松茸原料更有效的利用，还显著提高了终产物的安全性和在抗炎舒缓、抗氧化、抗衰、抵御光老化方面的功效，为制备抗衰舒缓类的化妆品提供了新的策略。

Description

一种具有舒缓和延缓衰老功效的松茸提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，涉及一种松茸提取物及其制备方法和应用，尤其涉及一种具有舒缓和延缓衰老功效的松茸提取物及其制备方法和在制备化妆品中的应用。

背景技术

衰老是生命的自然过程，表现为结构和功能的衰退。作为披覆于人体表面的皮肤，不仅发生内在的退行性变化，还时刻受到外界环境的侵袭。因此，皮肤的衰老分为内在性老化和外源性老化。内在性老化又称为自然老化，是随着年龄的增长，由机体内在的不可抗拒的生理因素（如遗传、免疫等）引起的老化。

外源性老化主要是指环境因素引起的皮肤老化，如紫外线辐射、吸烟、生活压力等，这种老化是可以预防和减缓的。其中，紫外线辐射是最主要的因素，紫外光分为长波紫外线（Ultraviolet A, UVA）320-400nm、中波紫外线（Ultraviolet B, UVB）280-320nm和短波紫外线（Ultraviolet C，UVC）100-280nm，其中，UVC被大气中臭氧层基本完全吸收。UVA具有较强的皮肤穿透性，能深入真皮层引起胶原纤维和弹力纤维结构变化，造成皮肤皱纹和下垂。UVB大多被表皮吸收，引起皮肤红斑、晒伤和DNA损伤。紫外线辐射可引起机体内蛋白质和DNA结构改变、产生活性氧（ROS）、引发炎症反应。此外，ROS作为第二信使，能激活相关信号通路，引起炎症反应，导致细胞外基质（ECM）降解。胶原蛋白是细胞外基质中最丰富的成分，主要组成为Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白，维持皮肤的强度和弹性。

松茸（Tricholoma matsutake Sing），又名松菌、松口蘑。松茸是担子菌亚门、口蘑科、口蘑属的真菌。松茸具有很高的食用和药用价值，目前，松茸在化妆品方向的功效研究较少。研究表明，松茸中含有多糖、氨基酸、多肽和蛋白质、甾类、萜类、挥发油等成分，目前对松茸中成分的研究集中在多糖、挥发油、多肽和蛋白质，对萜类物质成分的提取方法和活性的研究较少。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种松茸提取物及其制备方法和应用，尤其提供一种具有舒缓和延缓衰老功效的松茸提取物及其制备方法和在制备化妆品中的应用。该松茸提取物为黄色至深黄色液体，具有松茸特有气味，10%水溶液的pH为4.0-6.5，总三萜的含量≥0.6%。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种具有舒缓和延缓衰老功效的松茸提取物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

（1）将松茸原料与乙醇水溶液混合进行回流提取，得到提取液；

（2）将提取液过滤，得到醇提滤液和滤渣；

（3）醇提滤液使用大孔树脂进行纯化，收集洗脱液；

滤渣与水混合进行水提处理，得到水提取液，过滤得到水提滤液；

（4）将洗脱液和水提滤液合并，得到松茸提取物。

本发明创造性地开发了一种制备松茸提取物的方法，将醇提滤液与醇提滤渣的水提产物进行组合使用，不仅实现了松茸原料更有效的利用，更加绿色环保和节约资源；还显著提高了终产物的安全性和在抗炎舒缓、抗氧化、抗衰、抵御光老化方面的功效，具体表现为抑制炎症因子释放、抑制ROS产生、抑制弹性蛋白酶活性、保护胶原蛋白，多靶点多途径地发挥舒缓和抗衰老功效，为制备抗衰舒缓类的化妆品提供了新的策略。同时该制备方法容易实现工业化放大生产，具有实用性。

优选地，所述乙醇水溶液的浓度为65-85%，例如65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、84%、85%等。

本发明特定选择浓度为65-85%的乙醇水溶液作为提取溶剂，使醇提产物与醇提滤渣的水提产物在抗炎舒缓、抗氧化、抗衰、抵御光老化上具有更优异的协同促进效果。

优选地，所述松茸原料与乙醇水溶液的料液比为1:(8-15) g/mL，例如1:8 g/mL、1:9 g/mL、1:10 g/mL、1:11 g/mL、1:12 g/mL、1:13 g/mL、1:14 g/mL、1:15 g/mL等。

优选地，所述回流提取的次数为1-3次，例如1次、2次或3次；每次0.5-3 h，例如0.5h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h等。

优选地，所述大孔树脂包括为D101树脂或AB-8树脂。

优选地，所述纯化的过程包括：醇提滤液上样后先用纯水进行洗脱，再用乙醇水溶液进行洗脱，收集醇洗后的洗脱液。

特定选择浓度为65-85%的乙醇水溶液作为洗脱剂，使洗脱液在抗炎舒缓、抗氧化、抗衰、抵御光老化上具有更优异的技术效果。

优选地，所述用纯水进行洗脱的体积为柱体积的1-3倍，例如1倍、2倍或3倍等。

优选地，所述用乙醇水溶液进行洗脱的体积为柱体积的2-4倍，例如2倍、3倍或4倍等。

优选地，所述水提处理使用的水的用量为滤渣质量的5-15倍，例如5倍、7倍、9倍、11倍、13倍或15倍等。

优选地，所述水提处理的温度为90-100℃，例如90℃、93℃、95℃、97℃、100℃等；时间为1-3 h，例如1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h等。

上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，在获得所述醇提滤液、洗脱液和水提滤液后还进行浓缩处理。

优选地，所述松茸原料包括经过粉碎过筛的松茸饮片。

第二方面，本发明提供根据第一方面所述的具有舒缓和延缓衰老功效的松茸提取物的制备方法制得的松茸提取物。

由上述方法制得的松茸提取物为黄色至深黄色液体，具有松茸特有气味，10%水溶液的pH为4.0-6.5，总三萜的含量≥0.6%，该松茸提取物可以通过抑制炎症因子释放、抑制ROS产生、抑制弹性蛋白酶活性、保护胶原蛋白的途径有效解决皮肤红肿、松弛、弹性降低等消费者关心的问题，尤其针对紫外线引起的皮肤损伤和衰老问题。

第三方面，本发明提供一种含有松茸提取物的制剂，所述制剂包括第二方面所述的具有舒缓和延缓衰老功效的松茸提取物、多元醇和水。

所述多元醇在所述制剂中的作用主要为分散松茸提取物和辅助防腐。

优选地，所述多元醇选自1,3-丁二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇或甘油中的任意一种或至少两种的组合。

第四方面，本发明提供第二方面所述的松茸提取物或第三方面所述的含有松茸提取物的制剂在制备化妆品中的应用；所述化妆品具有如下功效的任意一种或至少两种的组合：

（1）抗炎舒缓；（2）抗氧化；（3）抗衰；（4）抵御光老化。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明创造性地开发了一种制备松茸提取物的方法，将醇提产物与醇提滤渣的水提产物进行组合使用，不仅实现了松茸原料更有效的利用，更加绿色环保和节约资源；还显著提高了终产物的安全性和在抗炎舒缓、抗氧化、抗衰、抵御光老化方面的功效，具体表现为抑制炎症因子释放、抑制ROS产生、抑制弹性蛋白酶活性、保护胶原蛋白，多靶点多途径地发挥舒缓和抗衰老功效，为制备抗衰舒缓类的化妆品提供了新的策略。同时该制备方法容易实现工业化放大生产，具有实用性。由上述方法制得的松茸提取物为黄色至深黄色液体，具有松茸特有气味，10%水溶液的pH为4.0-6.5，总三萜的含量≥0.6%。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述涉及的松茸饮片购自于香格里拉市和正藏药药业有限公司。

实施例1

本实施例提供一种松茸提取物，其制备方法如下：

（1）将干燥的松茸饮片粉碎，过45目筛；

（2）以1:10 g/mL的料液比将松茸粉碎物与75%的乙醇水溶液混合进行回流提取，共提取2次，每次2 h，得到提取液；

（3）将提取液过滤，得到醇提滤液和滤渣；

（4）醇提滤液减压浓缩后使用D101大孔树脂进行纯化，2倍柱体积水洗后再采用3倍柱体积的75%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液；

（5）在滤渣中，加入质量10倍的水中混合均匀，在95℃下提取2h，得到水提液，经滤纸过滤，得到水提滤液；

（6）将洗脱液和水提滤液减压浓缩后合并，并冷冻干燥，得到所述松茸提取物。

实施例2

本实施例提供一种松茸提取物，其制备方法如下：

（1）将干燥的松茸饮片粉碎，过45目筛；

（2）以1:15 g/mL的料液比将松茸粉碎物与65%的乙醇水溶液混合进行回流提取，共提取2次，每次3 h，得到提取液；

（3）将提取液过滤，得到醇提滤液和滤渣；

（4）醇提滤液减压浓缩后使用D101大孔树脂进行纯化，1倍柱体积水洗后再采用2倍柱体积70%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液；

（5）在滤渣中，加入质量8倍的水中混合均匀，在90℃下提取反应3 h，得到水提液，经滤纸过滤，得到水提滤液；

实施例3

本实施例提供一种松茸提取物，其制备方法如下：

（1）将干燥的松茸饮片粉碎，过45目筛；

（2）以1:8 g/mL的料液比将松茸粉碎物与85%的乙醇水溶液混合进行回流提取，共提取3次，每次1.5 h，得到提取液；

（3）将提取液过滤，得到醇提滤液和滤渣；

（4）醇提滤液减压浓缩后使用D101大孔树脂进行纯化，3倍柱体积水洗后再采用4倍柱体积80%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液；

（5）在滤渣中，加入质量12倍的水中混合均匀，100℃下提取1 h，得到水提液，经滤纸过滤，得到水提滤液；

实施例4

本实施例提供一种松茸提取物，其制备方法与实施例1的区别仅在于将步骤（4）中的大孔树脂D101换成AB-8，其他工艺条件均保持不变。

实施例5

本实施例提供一种松茸提取物，其制备方法与实施例1的区别仅在于将步骤（2）中的75%的乙醇水溶液替换为90%的乙醇水溶液，将步骤（4）中的75%的乙醇水溶液替换为90%的乙醇水溶液，其他工艺条件均保持不变。

实施例6

本实施例提供一种松茸提取物，其制备方法与实施例1的区别仅在于将步骤（2）中的75%的乙醇水溶液替换为60%的乙醇水溶液，将步骤（4）中的75%的乙醇水溶液替换为60%的乙醇水溶液，其他工艺条件均保持不变。

对比例1

本对比例提供一种松茸提取物，其制备方法如下：

（1）将干燥的松茸饮片粉碎，过45目筛；

（3）将提取液过滤，得到醇提滤液；

（5）将洗脱液减压浓缩，并冷冻干燥，得到所述松茸提取物。

对比例2

本对比例提供一种松茸提取物，其制备方法如下：

（1）将干燥的松茸饮片粉碎，过45目筛；

（3）将提取液过滤，得到醇提滤液和滤渣；

（4）在滤渣中加入质量10倍的水中混合均匀，在95℃下提取2h，得到水提液，经滤纸过滤，得到水提滤液；

（6）将水提滤液减压浓缩，并冷冻干燥，得到所述松茸提取物。

测试例1

细胞毒性实验：

用DMEM基础培养基分别稀释实施例1-6和对比例1-2制得的松茸提取物至质量浓度分别为5.00%、2.50%、1.25%、0.62%、0.31%、0.16%，测试其在不同浓度下，对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性作用，具体操作为：

1）接种：当细胞密度≥70%时，弃除旧培养基，加入5mL PBS清洗细胞后重新加入4mL DMEM基础培养基，移液枪吹打细胞致重悬，转移至2mL离心管中，1000rpm离心4分钟，弃上清；重新加入1mL完全培养基，吹打混匀后，稀释适当倍数并计数，根据计数的结果将细胞密度调整为1×10⁵cell/mL，按照每孔200μL的体积接种细胞至96孔板中，放回培养箱孵育（37℃、5%CO₂）。

2）实验分组：实验设置空白对照组与实验组，另设3个无细胞的孔作调零孔，实验组中样品设置6个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个复孔；

3）配液：按实验设计，用基础培养基配置不同浓度的受试物；质量浓度分别为5.00%、2.50%、1.25%、0.62%、0.31%、0.16%。

4）给药：24h后取出96孔板，弃除旧培养基，调零孔和空白对照组每孔加200μL基础培养基，实验组每孔加200μL用基础培养基配制的样品，按照每组每个浓度3个复孔进行布板。然后放回培养箱培养（37℃，5% CO₂）。

5）检测：加药处理后24h，取出96孔板，每孔加入MTT工作液（5mg/mL）20μL，放回培养箱继续培养4h，然后弃除孔内液体，每孔重新加入150μL DMSO，振摇10min后于490nm波长处测定吸光度（OD值）。

6）计算细胞相对活力（%）=（实验组OD值-调零孔OD值）/（空白对照组OD值-调零组OD值）×100%。

结果如表1所示。

表1

由表1数据结果可知，单一的松茸醇提滤液高浓度下对细胞活力影响较大，单一的松茸水提滤液对细胞活力影响较小，与松茸中不同极性段成分有关，水提液中主要以大分子糖类为主，醇提液为萜类化合物，将两段成分混合，利于减小松茸提取物对细胞的毒性，提高松茸提取物的生物活性。

测试例2

对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响实验：

肿瘤坏死因子（TNF-α）是机体在受到致病因素作用后产生最早和最重要的促炎细胞因子，其可作用于多种细胞，激发TNF-α→IL-1→IL-6级联反应，作用于内皮细胞、增加毛细血管通透性，加重炎症反应。因此，抑制TNF-α分泌可下调其他促炎细胞因子的表达，从而有效减轻和抑制炎症反应的发生，达到舒缓的功效。

用DMEM基础培养基分别稀释实施例1-6和对比例1-2制得的松茸提取物至质量浓度为0.25%，通过LPS诱导（1μg/mL）的小鼠巨噬细胞（RAW264.7）炎症模型，测定样品对TNF-α分泌的抑制作用，具体操作为：

1）接种：当细胞密度≥70%时，弃除培养基，加入5mL PBS清洗细胞后重新加入4mLDMEM基础培养基，移液枪吹打细胞至重悬，转移至2mL离心管中，1000rpm离心4分钟，弃上清；重新加入1mL完全培养基，吹打混匀后，稀释适当倍数并计数，根据计数的结果将细胞密度调整为8×10⁴cell/mL，按照每孔200μL的体积接种细胞至96孔板中，放回培养箱孵育（37℃、5%CO₂）。

2）实验分组：按实验要求进行分组，分别设置实验组、阳性对照组、空白对照组和阴性对照品组；另设3个无细胞的孔作调零组，按照每组每个浓度3个复孔进行布板。

3）配液：根据细胞活力测试结果，选择实验组0.25%浓度作为实验组样品待测液；以地塞米松（100μg/mL）为阳性对照进行实验。

4）给药：24h后取出96孔板，弃除旧培养基，按照每组每个浓度3个复孔进行加样，调零孔、空白对照组（BC）和阴性对照组（NC）每组3个复孔，每孔加180μL基础培养基，阳性对照组每孔加180μL地塞米松（100μg/mL），实验组每个浓度3个复孔，每孔加180μL对应浓度样品，然后放回培养箱培养（37℃，5%CO₂）；1h后取出96孔板，调零孔、空白对照组（BC）每孔加20μL基础培养基，阴性对照组（NC）、阳性对照组（PC）和实验组每孔加20μL LPS（3ng/mL），然后放回培养箱孵育。

5）细胞上清收集：给药24h后取出96孔板，分别收集各样品组对应的细胞上清液至离心管中，1000rpm离心10min，收集上清置于1.5mL离心管中，-20℃储存备用。

6）ELISA试剂盒测定细胞上清中TNF-α浓度。

结果如表2所示。

表2

由表2数据结果可知，在松茸提取物质量浓度为0.25%时，醇提滤液和水提滤液混合工艺制备的松茸提取物，对炎症因子TNF-α抑制效果优于单一的醇提滤液或单一的水提滤液。

测试例3

对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞分泌IL-6的影响实验：

白细胞介素-6（interleukin 6, IL-6）是一种多功能细胞因子，具有调节免疫应答、介导炎症反应的作用，在机体抗感染免疫反应中起重要作用。拮抗IL-6可下调其他促炎细胞因子的表达，从而有效减轻和抑制炎症反应的发生。

用DMEM基础培养基分别稀释实施例1-6和对比例1-2制得的松茸提取物至质量浓度为0.25%，通过LPS诱导（1μg/mL）的小鼠巨噬细胞（RAW264.7）炎症模型，测定样品对IL-6分泌的抑制作用，具体操作为：

2）实验分组：按实验要求进行分组，分别设置实验组、阳性对照组、空白对照组和阴性对照品组，另设3个无细胞的孔作调零组，按照每组每个浓度3个复孔进行布板。

3）配液：根据细胞活力测试结果，选择0.25%作为实验组样品待测浓度；以地塞米松（100μg/mL）为阳性对照进行实验。

4）给药：24h后取出96孔板，弃除旧培养基，按照每组每个浓度3个复孔进行加样，调零孔、空白对照组（BC）和阴性对照组（NC）每组3个复孔，每孔加180μL基础培养基，阳性对照组每孔加地塞米松（100μg/mL）,实验组每个浓度3个复孔，每孔加180μL对应浓度样品，然后放回培养箱培养（37℃，5%CO₂）；1h后取出96孔板，调零孔、空白对照组（BC）每孔加20μL基础培养基，阴性对照组（NC）、阳性对照组（PC）和实验组每孔加20μL LPS（10ug/mL），然后放回培养箱孵育。

6）ELISA试剂盒测定细胞上清中IL-6浓度。

结果如表3所示。

表3

由表3数据结果可知，在松茸提取物质量浓度为0.25%时，醇提滤液和水提滤液混合工艺制备的松茸提取物，对炎症因子IL-6抑制效果优于单一的醇提滤液或单一的水提滤液。且根据数据推测松茸提取物对IL-6有抑制效果的成分集中在醇提滤液中。

测试例4

对UVB致Hacat细胞产生ROS的影响实验：

以UVB作为外源性氧化剂，诱导人角质细胞内ROS含量升高作为光老化细胞模型，通过比较各实验组细胞内荧光染料DCFH-DA的荧光强度变化来表征活性氧ROS的表达强度，以此评价样品对活性氧的影响。

用MEM基础培养基分别稀释实施例1-6和对比例1-2制得的松茸提取物至质量浓度为0.4%，测试其对UVB诱导（50mJ/cm²）Hacat细胞产生ROS的影响，具体操作为：

1）接种：当细胞密度≥70%时，弃除培养基，加入5mL PBS清洗细胞后重新加入4mLDMEM基础培养基，移液枪吹打细胞至重悬，转移至2mL离心管中，1000rpm离心4分钟，弃上清；重新加入1mL完全培养基，吹打混匀后，稀释适当倍数并计数，根据计数的结果将细胞密度调整为1×10⁵cell/mL，按照每孔200μL的体积接种细胞至96孔板中，放回培养箱孵育（37℃、5%CO₂）。

2）实验分组：分别将待测进行分组，按照每组每个浓度4个复孔进行布板。

3）配液：根据细胞活力测试结果，选择0.4%浓度为测试浓度配制待测液；以地塞米松（100μg/mL）为阳性对照进行实验。

4）给药：24h后取出24孔板，弃除旧培养基，按照每组每个浓度4个复孔进行加样，空白对照组（BC）和阴性对照组（NC）每组加1000μL基础培养基，阳性对照每孔加1000μL维生素E溶液（200μL/ml），实验组每孔加1000μL对应浓度样品，然后放回培养箱培养（37℃，5%CO₂）。

5）UVB照射：24h后取出24孔板，根据实验分组，对阴性对照组（NC）、阳性对照组（PC）和实验组进行50 mJ/m²的UVB辐照，空白对照组（BC）不辐照，培养箱（37℃，5%CO₂，95%相对湿度）中孵育30min。

6）ROS的检测：吸去细胞培养上清，PBS清洗细胞后，每孔加200μL探针DCFH-DA，37℃细胞培养箱孵育30min，弃去DCFH-DA溶液，用PBS清洗细胞3次，用胰酶消化细胞并将细胞收集至2ml离心管中，2500rpm离心10min，弃去上清，每孔加300μLPBS重悬细胞，将细胞重悬液按每孔200μL加入96孔板中，荧光酶标仪（入射光波长525nm，激发光波长488nm）检测荧光强度。

7）结果分析：汇总各组荧光强度值进行统计分析。

结果如表4所示。

表4

由表4数据结果可知，在松茸提取物质量浓度为0.4%时，醇提滤液和水提滤液混合工艺制备的松茸提取物，对ROS抑制效果优于单一的醇提滤液或单一的水提滤液。

测试例5

对Ⅰ型胶原蛋白含量的影响实验：

Ⅰ型胶原蛋白约占人体真皮蛋白的80%，对维持皮肤的强度和弹性起重要作用。紫外线一方面抑制新胶原的产生，一方面促使基质金属蛋白酶（MMPs）表达，而MMPs促进细胞外基质的降解，特别是Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白降解。Ⅰ型胶原的流失，会造成皮肤皱纹、松弛、弹性降低等衰老现象。

用PBS分别稀释实施例1-6和对比例1-2制得的松茸提取物至质量浓度为0.675%，采用UVA和UVB联合辐照（35J/cm² +50mJ/cm²）3D全层皮肤模型(FulKutis@)，通过检测Ⅰ型胶原(Collagen I)含量的变化，具体操作为：

1）测试前准备：将模型转移到6孔板上，每孔加入2ml的3D全层皮肤模型培养液，同时将模型随机分为空白对照组（BC）、阴性对照组（NC）、阳性对照组（PC）和实验组，每组设置3个重复。

2）紫外线辐照：除空白组外，阴性对照组、阳性对照组和实验组分别进行UVA和UVB的辐照，UVA照射剂量为35 J/cm²，UVB辐照剂量为50 J/cm²。

3）样品给药：样品组采用表面给药，给药体积为20 μL，表面给药时以轻柔打圈的方式进行。

4）模型培养：给药结束后，将模型转移至培养皿，置于CO₂培养箱（37℃、5%CO₂）中孵育培养，其中辐照和给药频次均为1次/天，共计4次。最后一次辐照给药结束后，模型继续培养24h，培养结束后，用无菌PBS溶液的洗瓶清洗模型表面残留的受试物，用无菌棉签轻轻擦去模型内残留的液体。

5）免疫荧光检测：取用于检测的模型，用4%的多聚甲醛进行固定处理，固定24h后，进行免疫荧光检测，显微镜下采集图片进行分析。

6）提升率计算：提升率（%）=（样品组-阴性对照组）/阴性对照组×100%。

7）结果统计分析，Ⅰ型胶原含量以荧光强度，即相对积分光密度（IOD）值计算。并设置空白对照组（不进行辐照也不加样品）、阴性对照组（仅进行辐照不加样品）和阳性对照组（维生素C 100μg/mL+维生素E 7μg/mL）。

结果如表5所示。

表5

由表5数据结果可知，在松茸提取物质量浓度为0.675%时，醇提滤液和水提滤液混合工艺制备的松茸提取物，对Ⅰ型胶原蛋白的提升率优于单一的醇提滤液或单一的水提滤液。

测试例6

对弹性蛋白酶的活性抑制作用实验：

以表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）作为阳性对照，EGCG的质量浓度分别为10mg/mL。用Tris-HCl缓冲液分别稀释实施例1-6和对比例1-2制得的松茸提取物至质量浓度为2.0mg/mL，测试其对弹性蛋白酶活性的抑制作用，具体操作为：

1）阴性对照组

1.1）阴性空白组：取1.7mL Tris-HCl缓冲液与0.1 mL 弹性蛋白酶底物溶液混匀，25℃保温15 min，再加入0.1mL Tris-HCl缓冲液，混匀，25℃保温15 min，最后加入0.2 mL2M HCl终止反应，取200 μL反应液置酶标板中，于405 nm处测定吸光度OD值。

1.2）阴性实验组：取1.7 mL Tris-HCl缓冲液与0.1 ml弹性蛋白酶底物溶液混匀，25℃保温15 min，再加入0.1 mL 弹性蛋白酶液，混匀，25℃保温15 min，最后加入0.2 mL2M HCl终止反应，取200 μL反应液置酶标板中，于405 nm处测定吸光度OD值。

2）阳性对照组

2.1）阳性空白组：分别取0.021 mL、0.042 mL、0.105 mL、0.21 mL EGCG溶液，加Tris-HCl缓冲液补足至1.7 mL，与0.1 mL弹性蛋白酶底物溶液混匀，25℃保温15 min，再加入0.1mL Tris-HCl缓冲液，混匀，25℃保温15 min，最后加入0.2 mL 2M HCl终止反应，各取200 μL反应液置酶标板中，于405 nm处测定吸光度OD值。

2.2）阳性实验组：分别取0.021 mL、0.042 mL、0.105 mL、0.21 mL EGCG溶液，加Tris-HCl缓冲液补足至1.7 mL，与0.1 mL弹性蛋白酶底物溶液混匀，25℃保温15 min，再加入0.1 mL弹性蛋白酶液，混匀，25℃保温15 min，最后加入0.2 mL 2M HCl终止反应，各取200 μL反应液置酶标板中，于405 nm处测定吸光度OD值。

3）样品组

3.1）样品空白组：分别取0.075 mL、0.15 mL、0.3 mL、0.6 mL样品溶液，加Tris-HCl缓冲液补足至1.7 mL，与0.1 mL弹性蛋白酶底物溶液混匀，25℃保温15 min，再加入0.1mL Tris-HCl缓冲液，混匀，25℃保温15 min，最后加入0.2 mL 2M HCl终止反应，各取200 μL反应液置酶标板中，于405 nm处测定吸光度OD值。

3.2）样品实验组：分别取0.075 mL、0.15 mL、0.3 mL、0.6 mL样品溶液，加Tris-HCl缓冲液补足至1.7 mL，与0.1 mL弹性蛋白酶底物溶液混匀，25℃保温15 min，再加入0.1mL弹性蛋白酶液，混匀，25℃保温15 min，最后加入0.2 mL 2M HCl终止反应，各取200 μL反应液置酶标板中，于405 nm处测定吸光度OD值。

4）实验结果计算：按照下式进行样品弹性蛋白酶抑制率的计算。在同一实验浓度下，实施例1-6和对比例1-2松茸提取物的弹性蛋白酶抑制率差异，使用GraphPad Prism进行单因素方差分析，*表示P<0.05，认为差异有统计学意义。

弹性蛋白酶抑制率（%）=[(A1-A0)-(B1-B0)]/(A1-A0)×100%

A0：阴性空白组吸光度值

A1：阴性实验组吸光度值

B0：阳性/样品空白组吸光度值

B1：阳性/样品实验组吸光度值。

结果如表6所示。

表6

由表6数据结果可知，醇提滤液和水提滤液混合工艺制备的松茸提取物，对弹性蛋白酶的抑制率优于单一的醇提滤液或单一的水提滤液。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims

1.一种具有舒缓和延缓衰老功效的松茸提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法为如下步骤：

（2）将提取液过滤，得到醇提滤液和滤渣；

（3）醇提滤液使用大孔树脂进行纯化，收集洗脱液；

（4）将洗脱液和水提滤液合并，得到松茸提取物；

所述乙醇水溶液的浓度为65-85%；

所述松茸原料与乙醇水溶液的料液比为1:(8-15) g/mL；

所述回流提取的次数为1-3次，每次0.5-3 h；

所述大孔树脂包括D101树脂或AB-8树脂；

所述纯化的过程包括：醇提滤液上样后先用纯水进行洗脱，再用乙醇水溶液进行洗脱，收集醇洗后的洗脱液；

所述乙醇水溶液的浓度为65-85%。

2.根据权利要求1所述的具有舒缓和延缓衰老功效的松茸提取物的制备方法，其特征在于，所述水提处理使用的水的用量为滤渣质量的5-15倍；

所述水提处理的温度为90-100℃，时间为1-3 h。

3.根据权利要求1所述的具有舒缓和延缓衰老功效的松茸提取物的制备方法，其特征在于，在获得所述醇提滤液、洗脱液和水提滤液后还进行浓缩处理。

4.根据权利要求1所述的具有舒缓和延缓衰老功效的松茸提取物的制备方法，其特征在于，所述松茸原料包括经过粉碎过筛的松茸饮片。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的具有舒缓和延缓衰老功效的松茸提取物的制备方法制得的松茸提取物。

6.一种含有松茸提取物的制剂，其特征在于，所述制剂包括权利要求5所述的具有舒缓和延缓衰老功效的松茸提取物、多元醇和水。

7.根据权利要求6所述的含有松茸提取物的制剂，其特征在于，所述多元醇选自1,3-丁二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇或甘油中的任意一种或至少两种的组合。

8.权利要求5所述的松茸提取物或权利要求6-7中任一项所述的含有松茸提取物的制剂在制备化妆品中的应用；所述化妆品具有如下功效的任意一种或至少两种的组合：