KR102300749B1

KR102300749B1 - 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물과 7-데하이드로콜레스테롤의 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102300749B1
Application number: KR1020200158092A
Authority: KR
Inventors: 탁기민; 이대우; 문은정; 김남주
Original assignee: 한국콜마주식회사; (주)더마랩
Priority date: 2020-11-23
Filing date: 2020-11-23
Publication date: 2021-09-10

Abstract

본 발명은 꽃송이버섯(Sparassis crispa), 주름버섯(Psalliota campestris), 둥근잎나팔꽃(Ipomoea purpurea) 및 복사나무꽃(Prunus persica flower) 혼합추출물과 7-데하이드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol)의 복합물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 이들 복합물을 유효성분으로 함유하여 자외선에 의해 증가되는 피부의 산화적 스트레스와 염증을 완화하고 피부 온도 감소에 관여하는 단백질 인자의 발현을 증가시킴으로서 결과적으로는 피부 광노화 억제와 피부 온도 감소 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화장료 조성물은 자외선에 의한 산화적 스트레스 억제용, 피부진정용, 노화 억제용 및 피부온도 감소용 화장료로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물과 7-데하이드로콜레스테롤의 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing Sparassis crispa, Psalliota campestris, Ipomoea purpurea and Prunus persica flower complex extract and 7-dehydrocholesterol}

본 발명은 꽃송이버섯(Sparassis crispa), 주름버섯(Psalliota campestris), 둥근잎나팔꽃(Ipomoea purpurea) 및 복사나무꽃(Prunus persica flower) 혼합추출물과 7-데하이드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol)의 복합물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 이들 복합물을 유효성분으로 함유하여 자외선에 의해 증가되는 피부의 산화적 스트레스와 염증을 완화하고 피부 온도 감소에 관여하는 단백질 인자의 발현을 증가시킴으로서 결과적으로는 피부 광노화 억제와 피부 온도 감소 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부 노화는 나이가 증가하면서 개인의 유전적인 요인에 의하여 발생하는 내인성 노화(intrinsic aging)와 자외선이나 외부물질의 자극 등에 의한 산화적 스트레스에 의하여 발생하는 광노화(photoaging)로 나눌 수 있다(전혜숙 등, 2014). 특히 야외활동으로 인하여 피부가 자외선에 그대로 노출되어 발생하는 광노화는 깊은 주름, 염증, 색소침착과 같은 피부손상을 유발하며, 이는 내인성 노화에 비해 더욱 심한 임상적 특성을 나타낸다. 자외선은 피부조직 내 활성산소를 형성시켜, 피부에 존재하는 항산화 물질을 감소시킴으로써 산화적 스트레스를 유발하고 이러한 과정에서 체내의 단백질, 지방, 세포막, 핵산 등을 산화시켜 피부 노화를 더욱 더 촉진하는 것으로 보고되고 있다. 또한 자외선은 피부에 염증반응을 일으켜 피부의 혈관을 확장시키고 홍반을 유도하며 심할 경우 히스타민 방출에 의한 소양증을 유도하기도 한다(임애경 등, 2010).

피부의 이상적인 온도는 체온보다 낮은 30 ~ 31℃로 알려져 있다. 15 ~ 20분 정도 직사광선을 받으면 피부의 온도가 40℃ 이상으로 올라가게 되는데, 이와 같이 피부 온도가 올라가면 피부의 주요 구성물질인 콜라겐을 분해하는 효소가 활성화되어 피부 손상과 노화를 촉진하게 된다(주지혜 등, 2016). 일시적 수용체 전위 통로(transient receptor potential channel, TRP channel)는 다양한 세포 및 조직에서 발현되는 양이온 통로를 말하는데, 이 중 냉 자극과 관련된 TRP 이온통로로 TRPM8이 알려져 있다. TRPM8은 피부세포에서 발현되는 수용체로 25℃ 이하의 온도에 의해 활성화되며 시원한 온도감각에 관여한다. 그러므로 열노화을 개선하고 쿨링감각을 증가시키기 위해 TRPM8을 증가시키는 소재에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다(유화선 등, 2018).

비타민 D는 골격 성장, 칼슘 항상성 유지에 관여하며 비만, 고혈압, 당뇨 등의 질병과도 밀접한 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 또한 피부 각질세포의 분화를 촉진하며 각질세포의 성장을 조절하고, 피부 항균작용에 관여하며 아토피피부염과 같은 질환에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(민택기 등, 2013). 비타민 D는 피부가 햇빛에 노출되면 체내에서 생성이 되지만 외부활동이 적은 다수의 현대인들에게 결핍되어 있다. 그러므로 음식 등을 통해 반드시 섭취해야하는 필수 영양소이다. 비타민 D의 종류에는 여러 가지가 있으나, 이 중에서도 식물성 비타민 D라고 불리는 에르고칼시페롤(ergocalciferol, 비타민 D2)과 동물성 비타민 D라고 불리는 콜레칼시페롤(cholecalciferol, 비타민 D3)이 가장 생리활성이 높다. 에르고칼시페롤과 콜레칼시페롤은 각각 버섯 등에 다량 함유되어 있는 에르고스테롤(ergosterol)과 우유, 치즈 등에 다량 함유되어 있는 7-데하이드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol, 7-DHC)로부터 자외선 조사에 의해 합성이 된다(표재성 등, 2020).

종래 대한민국 공개특허 제2004-0073459호에는 미백, 피부의 색소침착의 예방, 개선 및 치료에 유효한 에르고스테롤 유도체 및 이것을 함유하는 조성물이 게시되어 있다. 대한민국 공개특허 제2019-0059394호에는 영지버섯추출물, 분획물 또는 에르고스테롤을 함유하는 TRPM8 발현 증가 효과가 우수한 피부 쿨링용 화장료 조성물이 게시되어 있다. 또한 대한민국 공개특허 제1998-0028477호에는 콜레칼시페롤을 유효성분으로 포함하는 피부각화 방지 및 주름 완화용 화장료 조성물이 게시되어 있다. 대한민국 공개특허 제2001-0002281호에는 7-데하이드로콜레스테롤을 고분자 수지에 흡착함으로 안정화시켜 피부노화 등을 개선하기 위한 화장료 조성물이 게시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제2019-0142655호에는 7-데하이드로콜레스테롤, 콜레스테롤 및 스테아린산이 히알루론산-세라마이드 엔피 복합체의 내상에 봉입된 나노에멀젼을 함유하는 화장료 조성물 및 그의 제조방법이 게시되어 있다.

본 발명자들은 비타민 D를 화장품의 유효한 활성성분으로서 효과적으로 이용하기 위하여 연구해 왔으며, 7-데하이드로콜레스테롤에 다양한 천연소재를 혼합하고 자외선을 조사하여 그 활성을 평가하였다. 그 결과 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물에 7-데하이드로콜레스테롤을 첨가하여 제조한 복합물을 자외선에 노출시키는 경우, 피부유래 각질세포주를 이용한 실험 모델에서 자외선에 의해 유발된 피부 산화적 스트레스 및 염증반응을 억제하고, 피부 각질세포에서 냉감각 수용체 발현 유도 효과가 크게 증진됨을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물과 7-데하이드로콜레스테롤의 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물과 7-데하이드로콜레스테롤의 복합물을 유효성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~10 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 복합물은 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합물과 7-데하이드로콜레스테롤을 혼합한 후, 추출하여 제조되는 것으로서, 상기 추출 전 또는 추출 후에 자외선 조사(照射) 처리하여 제조되는 것임을 특징으로 한다.

이때, 상기 꽃송이버섯 및 주름버섯이 각각 1~10:1~10의 중량비율로 혼합되고, 상기 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃이 각각 1~3:1~3의 중량비율로 혼합되며, 상기 꽃송이버섯 및 주름버섯의 혼합물과 상기 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합물은 각각 5~10:1의 중량비율로 혼합되어 추출 제조되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 복합물은 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합물 99.0~99.999중량%, 7-데하이드로콜레스테롤 0.001~1.0중량%의 비율로 혼합되어 제조되는 것이 바람직하다.

상기 자외선 조사 처리는 자외선 B(290~320nm)를 방출하는 램프(8~25W)를 점등하여 8시간 이상, 더욱 바람직하게는 8~10시간 조사하는 것으로 이루어진다.

상기 복합물은 에르고스테롤, 에르고칼시페롤 및 콜레칼시페롤을 함유하는 것임을 특징으로 한다.

상기 복합물은 자외선에 의해 증가하는 피부 산화적 스트레스와 염증반응 억제효과 및 피부온도 감소효과를 나타내므로 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 항산화용, 항염증용, 피부진정용, 광노화 억제용 및 피부 쿨링용으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물과 7-데하이드로콜레스테롤의 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 천연 추출물을 함유하여 안전하며, 그 상승작용에 의하여 자외선 유발 피부 산화적 스트레스 및 염증반응을 억제하고, 피부온도를 감소시키는 효능을 나타낸다. 그러므로 광노화 억제용 및 피부진정용 제품에 적용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 발명의 내용을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명은 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물에 7-데하이드로콜레스테롤을 혼합하여 복합물로서 제조하여 사용하는 경우 자외선에 의해 증가하는 피부 산화적 스트레스와 염증반응 억제효능 증진 및 피부 온도 감소 효과 상승하여 더욱 우수해진다는 것을 이용한 것이다.

버섯에는 비타민 D의 전구체인 에르고스테롤(ergosterol)의 함량이 많아 비타민 D 강화 소재로서 최적의 조건을 갖춘 식품이다. 꽃송이버섯(Sparassis crispa)은 우리나라의 여름에서 가을까지 침엽수 등 죽은 나무에서 나는 대표적인 식용버섯이다. 자실체는 전체가 오글오글한 꽃잎 모양의 덩어리로 나는데, 뿌리 모양의 대가 반복해서 가지가 나누어져 꼭대기가 편평하게 되고 가장자리가 물결 모양을 형성한다. 흰색부터 크림색이지만 오래되면 황토색이 된다. 크기는 직경 10~30cm, 높이 10~20cm이다. 식용과 유용물질 추출 대상 균류로서 경제적인 가치가 높다(국립생물자원관). 특히 꽃송이버섯은 β-1,3-D-glucan과 함께 다양한 폴리페놀 화합물도 많이 함유하고 있어 면역활성 및 항암효과와 함께 항균, 항염증, 항산화에 유효한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(나창수 등, 2016). 본 발명에서는 꽃송이버섯의 자실체 및 균사체가 사용될 수 있다.

주름버섯(Psalliota campestris)은 우리나라의 여름에서 가을에 걸쳐 주로 부식질이 많은 나지에 군생한다. 갓은 지름 35~105mm로 반구형 내지 편평형이다. 갓의 표면은 백색 또는 암황색~황갈색이고 평활하거나 섬유상 인피가 있다. 조직은 백색이나 상처가 나면 적색으로 변한다. 주름살은 떨어진 형으로 빽빽하며 초기에는 백색이나 분홍색을 띠다가 자갈색~흑갈색을 띤다. 대는 백색이나 상처가 나면 갈색으로 변하며 위쪽에 막질의 흰 턱받이가 있다(국립생물자원관). 폴리페놀을 함유하고 있고 우수한 항산화 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다(Marco E et al, 2002). 본 발명에서는 주름버섯의 자실체 및 균사체가 사용될 수 있다.

둥근잎나팔꽃(Ipomoea purpurea)은 밭 주변에 흔히 자라는 한해살이풀이다. 줄기는 덩굴성이며, 길이 1~3m, 밑을 향하는 털이 있다. 잎자루는 가늘며, 길이 8~15cm이다. 잎은 어긋나며, 넓은 난형으로 길이 6~10cm, 폭 5~8cm, 끝은 뾰족하고 밑부분은 심장형이며, 가장자리는 밋밋하다. 꽃은 7~10월에 피고 잎겨드랑이에서 나온 꽃대 끝에 1~5개가 모여 달린다. 꽃잎은 깔때기 모양이며, 지름 5~10cm, 청색 또는 자주색을 띤다. 열매는 편평한 구형이며, 지름 1cm쯤이다. 관상용으로 식재한다(국립생물자원관). 본 발명에서는 둥근잎나팔꽃의 전초, 꽃, 잎, 줄기, 뿌리 및 씨앗이 사용될 수 있다.

복사나무(Prunus persica)는 장미목 장미과에 속하는 관속식물로 우리나라 전역에서 널리 재배된다. 밭에 과수로 널리 식재하는 낙엽 활엽 작은큰키나무로 꽃은 4~5월 피는데 흰색 또는 연한 분홍색이며, 묵은 가지의 잎겨드랑이에 1~2개씩 달린다. 꽃줄기는 짧고 털이 없다. 꽃받침잎은 5개, 타원형, 털이 있다. 꽃잎은 5개, 긴 타원형, 끝은 둥글다. 수술은 30~40개다. 씨방에 털이 있다. 복사, 복사나무, 복성아나무라고도 부른다. 중국 원산이며, 우리나라 전역에서 널리 재배된다(국립생물자원관). 특히 복사나무꽃은 자외선에 의한 피부 부종과 홍반을 완화하고, DNA 손상과 피부암을 억제하는 효능이 보고된 바 있다(Heo MY et al, 2001; Kim YH et al, 2001). 본 발명에서는 꽃이 사용된다.

비타민 D는 적절한 태양광선에 노출됨으로서 피부에서 생성되거나, 식이를 통해 에르고칼시페롤과 콜레칼시페롤의 형태로 섭취된다. 이후 간과 신장에서 두 번의 수산화를 거침으로서 생리적으로 활성을 갖는 비타민 D 대사산물로 전환된다. 비타민 D 최종대사산물인 칼시트리올(Calcitriol, 1,25[OH]2 비타민 D)은 활성 호르몬으로 작용하여, 체내에서 세포 증식과 분화의 조절작용, 면역기능 조절작용, 항암작용 등을 나타낸다고 알려져 있다. 특히 피부에서 피부장벽을 유지 및 강화하고 면역반응을 증가시키며, 아토피 피부염 등과 같은 알레르기 질환과 발진, 두드러기 등과 같은 피부질환에도 작용하는 것으로 보고된 바 있다(정수호, 2008; 박양, 2013; 정재우 및 강혜련, 2016). 상기 언급한 비타민 D의 다양한 효능과 안전성을 고려하였을 때 앞으로 주요한 피부 기능 개선용 화장품 원료로서의 개발 가능성이 높다.

본 발명에 따르면 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물과 7-데하이드로콜레스테롤의 복합물을 유효성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~10 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 복합물은 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합물과 7-데하이드로콜레스테롤을 혼합한 후, 추출하여 제조되는 것으로서, 상기 추출 전 또는 추출 후에 자외선 조사(照射) 처리하여 제조되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 복합물은 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물을 먼저 제조한 후, 7-데하이드로콜레스테롤과 혼합하고 자외선 조사(照射) 처리하여 제조될 수도 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 다음과 같은 방법에 의하여 상기 복합물을 제조한다. 먼저, 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃을 혼합하여 혼합물을 제조한다.

이때, 상기 꽃송이버섯과 주름버섯이 각각 1~10:1~10의 중량비율로 혼합되어 추출되는 것이 바람직하며, 특히 10:1의 중량비율로 혼합되어 추출되는 경우에 에르고스테롤의 함량이 가장 높게 나타나므로 더욱 바람직하다.

상기 둥근잎나팔꽃과 복사나무꽃은 각각 1~3:1~3의 중량비율로 혼합되어 추출되는 것이 바람직하며, 특히 3:1의 비율로 혼합되어 추출되는 경우에, 피부 항산화 및 항염증 효능이 가장 우수하므로 더욱 바람직하다.

또한, 상기 꽃송이버섯 및 주름버섯의 혼합물과 상기 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합물은 각각 5~10:1의 중량비율로, 더욱 바람직하게는 10:1의 중량비율로 혼합되어 추출 제조된다.

이후 이와 같이 제조된 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합물에 7-데하이드로콜레스테롤을 혼합한다. 이때, 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합물 99.0~99.999중량%, 7-데하이드로콜레스테롤 0.001~1중량%의 비율로 이루어진다.

상기 혼합물을 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 디메치콘, 미네랄오일, 사이클로메치콘, 옥틸도데칸올, 세틸에칠헥사노에이트, 트리레칠헥사노인, 이소프로필미리스테이트 및 식물성 오일로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매를 가한 후 통상의 추출방법으로 추출하고 여과, 농축하여 본 발명의 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물과 7-데하이드로콜레스테롤의 복합물을 제조한다.

이때, 상기 추출 전에 또는 추출 후에 특정한 자외선을 조사 처리하는 경우에 에르고칼시페롤과 콜레칼시페롤의 함량이 증가하고, 더욱 우수한 피부 항산화, 항염증 및 피부온도 감소 효과를 나타내므로 더욱 바람직하다.

이때, 상기 자외선 조사 처리는 자외선 B(290~320nm)를 방출하는 램프(8~25W)를 점등하여 8시간 이상, 더욱 바람직하게는 8~10시간 조사하는 것으로 이루어진다. 상기 자외선 조사 처리에 의하여 복합물에서 비타민 D류의 함량 증가에 따른 활성성분 간의 상승효과를 확인할 수 있었다.

상기 방법에 의하여 제조된 복합물은 에르고스테롤, 에르고칼시페롤, 7-데하이드로콜레스테롤 및 콜레칼시페롤을 함유하고 있었다(시험예 5). 또한 인체피부 유래 각질세포의 생존률에 영향을 미치지 않았으며(시험예 6), 각질세포 내에서 자외선에 의한 활성산소종의 생성 증가를 억제하였고(시험예 7), 항산화 효소인 SOD 1(superoxide dismutase 1)의 발현을 증가시켰다(시험예 8). 뿐만 아니라 자외선에 의해 증가하는 피부 염증유발 인자, IL-1β (interleukin-1β) 및 TNFα(tumor necrosis factor α)의 발현을 억제하였다(시험예 9 및 10). 시원한 감각과 피부 온도를 조절하는 냉 수용체인 TRPM 8(transient receptor potential melastatin 8 channel)의 발현도 증가시켰다(시험예 11). 그러므로 상기 복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 자외선에 의해 증가된 산화적 스트레스와 염증반응을 억제하고 피부온도 감소 작용을 나타냄으로서, 피부 항산화용, 항염증용, 피부진정용, 광노화 억제용 및 피부 쿨링용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물과 7-데하이드로콜레스테롤의 복합물은 유효성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~10 중량% 함유될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 그 예로는 화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 여성청결제, 팩, 바디 로션, 바디 오일, 바디 젤, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스 등을 들 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발병의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

제조예 1: 꽃송이버섯 추출물의 제조

건조된 꽃송이버섯을 20 mesh 로 여과하여 미세분말화하고 추출용매로서 에탄올을 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 50~60℃로 가열하여 24시간 동안 추출하였다.

위의 방법으로 추출한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이 드라이어(B-290, BUCHI사)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 180℃, 흡입기(Aspirator) 효율 100%(35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 25%(7.5㎖/분), 노즐클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter):30㎜(357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 추출물을 제조하였다.

제조예 2: 주름버섯 추출물의 제조

건조된 주름버섯을 20 mesh 로 여과하여 미세분말화하고 추출용매로서 에탄올을 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 50~60℃로 가열하여 24시간 동안 추출하였다. 이후 상기 제조예 1의 방법으로 침전, 여과, 농축 및 건조하여 추출물을 제조하였다.

제조예 3 ~ 7: 꽃송이버섯 및 주름버섯 혼합추출물의 제조

건조된 꽃송이버섯 및 주름버섯을 총 혼합중량을 동일하게 하여 중량비를 하기 표 1과 같이 조절하였다. 이후 상기 제조예 1의 방법으로 침전, 여과, 농축 및 건조하여 꽃송이버섯 및 주름버섯 혼합추출물을 제조하였다.

중량비	꽃송이버섯	주름버섯
제조예 3	1	1
제조예 4	1	5
제조예 5	1	10
제조예 6	5	1
제조예 7	10	1

시험예 1: 제조예 1 ~ 7 의 에르고스테롤 함량 분석

제조예 1 ~ 7을 대상으로 에르고스테롤 함량을 분석하기 위해 HPLC 장비를 이용하여 표 2와 같이 분석하였다. 에르고스테롤 표준품(Sigma, USA)을 100 ng/ml ~ 500 μg/ml 농도로 준비하여 분석하고 이에 대한 표준곡선을 그린 후 그 식에 대비하여 제조예의 에르고스테롤 함량을 구하였으며 그 결과를 하기의 표 3에 나타내었다.

Column	Phenomenex Luna Gemini NX-C18 (250 x 4.6mm, 5um)
Mobile phase	(A) Acetonitlie 75% (B) Methanol 25% Isocratic
Run time	30 min
Flow rate	1.0 ml/min
Detection	UV 280 nm
Column temperature	Ambient
Injection volume	10 μl
Retention time	9.975 min

	에르고스테롤 함량 (μg/ml)
제조예 1	231
제조예 2	46
제조예 3	169
제조예 4	142
제조예 5	128
제조예 6	248
제조예 7	263

상기 표 3의 결과에서 보는 바와 같이, 꽃송이버섯, 주름버섯 추출물 및 이들의 혼합추출물에 대한 에르고스테롤 함량을 비교해본 결과, 이들 각각을 추출한 것 보다 이들을 혼합하여 추출하였을 때 더 많은 에르고스테롤을 확인할 수 있었으며, 특히 제조예 7에서 가장 다량의 에르고스테롤이 함유되어 있음을 확인할 수 있었다.

제조예 8: 둥근잎나팔꽃 추출물의 제조

건조된 둥근잎나팔꽃 전초에 추출용매로서 에탄올을 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 50~60℃로 가열하여 24시간 동안 추출하였다. 이후 상기 제조예 1의 방법으로 침전, 여과, 농축 및 건조하여 추출물을 제조하였다.

제조예 9: 복사나무꽃 추출물의 제조

건조된 복사나무 꽃에 추출용매로서 에탄올을 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 50~60℃로 가열하여 24시간 동안 추출하였다. 이후 상기 제조예 1의 방법으로 침전, 여과, 농축 및 건조하여 추출물을 제조하였다.

제조예 10 ~ 14: 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물의 제조

건조된 둥근잎나팔꽃 및 복사나무 꽃의 총 혼합중량을 동일하게 하여 중량비를 하기 표 4와 같이 조절하였다. 이후 상기 제조예 1의 방법으로 침전, 여과, 농축 및 건조하여 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물을 제조하였다.

중량비	둥근잎나팔꽃	복사나무꽃
제조예 10	1	1
제조예 11	1	2
제조예 12	1	3
제조예 13	2	1
제조예 14	3	1

시험예 2: 제조예 8 ~ 14 의 세포 내 활성산소종 생성 억제 활성 측정

인간 각질세포주인 HaCaT은 10% FBS(fetal bovine serum), 100 unit/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin이 첨가된 DMEM 배지에 배양하였다. HaCaT을 96 well plate에 3×10⁴cells/well의 세포 농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였고, 이후 365 nm 파장의 UV lamp를 이용하여 60 mJ/cm²으로 자외선을 조사하고 제조예 8 ~ 14를 24시간 동안 0.1% 및 1%로 처리하였다. 배지를 제거한 후 PBS(phosphate buffered saline)을 이용하여 2회 세척하고 상온에서 50 μM의 DCF-DA(2',7'-dichlorodihydofluorescein diacetate)용액을 처리한 후 형광분석기(molecular devices)를 이용하여 형광강도의 변화를 측정하였다(excitation 485 nm, emission 530 nm). 활성산소종 생성율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

활성산소종 생성율(%) = 대조군(자외선 비조사군) 또는 시료첨가군의 형광 강도/대조군(자외선 조사군)의 형광 강도 × 100

시료	활성산소종 생성율 (%)
시료	0.1%	1.0%
대조군 (자외선 조사 X)	18
대조군 (자외선 조사 O)	100
제조예 8	79	68
제조예 9	86	74
제조예 10	71	55
제조예 11	74	56
제조예 12	75	62
제조예 13	67	48
제조예 14	61	40

상기 표 5의 결과에서 보는 바와 같이, 둥근잎나팔꽃 또는 복사나무꽃 추출물의 제조예 8 ~ 9 보다 이들의 혼합추출물인 제조예 10 ~ 14에서 우수한 활성산소종 생성억제 효능을 나타내었다. 특히 제조예 14가 가장 우수한 억제 효능을 나타내었다.

시험예 3: 제조예 8 ~ 14 의 IL-1β 생성 억제 효능 확인

염증매개인자인 IL-1β(interleukin 1β)의 생성 억제 효능을 확인하기 위해 HaCaT 세포를 24 well plate에 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 365 nm 파장의 UV lamp를 이용하여 60 mJ/cm²으로 조사하고, 상기 제조예에서 제조한 추출물을 시료농도가 0.1 또는 1.0% 가 되도록 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이후에 배양된 세포의 배지를 수거하여 IL-1β Human ELISA kit(R&D Systems, USA)를 사용하여 IL-1β의 양을 측정하였다.

그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

구분	IL-1β(pg/ml)
구분	0.1%	1.0%
대조군 (UVB 조사 X)	3.4
대조군 (UVB 조사 O)	30.9
제조예 8	27.6	22.4
제조예 9	29.3	24.1
제조예 10	25.1	18.9
제조예 11	25.3	19.1
제조예 12	26.7	21.6
제조예 13	23.2	19.0
제조예 14	22.1	17.2

상기 표 6의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명 제조예의 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물을 각각의 추출물과 비교해 볼 때, 인간 각질세포주에서 자외선에 의해 유도된 염증매개인자인 IL-1β의 생성 증가를 효과적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 특히 제조예 14에서 가장 우수한 활성을 나타내었다.

제조예 15: 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물의 제조

상기 시험예 1에서 가장 높은 에르고스테롤 함량을 나타내었던 제조예 7과 동일하게 건조된 꽃송이버섯 및 주름버섯을 각각 10:1의 중량비로 혼합하였다. 시험예 2와 3에서 가장 우수한 활성산소종 및 IL-1β 생성 억제 효능을 나타낸 제조예 14와 동일하게 건조된 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃을 각각 3:1의 중량비로 혼합하고 상기 꽃송이버섯 및 주름버섯 혼합물에 첨가하였다. 중량비는 꽃송이버섯 및 주름버섯 혼합물과 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합물을 10:1로 하였다. 이들 혼합물에 추출용매로서 에탄올을 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 50~60℃로 가열하여 24시간 동안 추출하였다. 이후 상기 제조예 1의 방법으로 침전, 여과, 농축 및 건조하여 혼합추출물을 제조하였다.

시험예 4: 최적 자외선 조사 조건 확인

상기 제조예 7의 제조방법에 명시된 중량비대로 건조된 꽃송이버섯과 주름버섯을 10:1의 비율로 혼합하고 20 mesh 로 여과하여 미세분말화하였다. 또한 7-데하이드로콜레스테롤을 함께 준비하였다. 이들 각각의 시료를 높이 5~10 mm로 얇고 고르게 분포시키고 자외선 B(290~320nm)를 방출하는 램프(8~25W)를 5~10 cm 의 높이에서 점등하여 각각 1시간, 2시간, 4시간 및 8시간 이상 동안 노출시켰다.

상기 자외선 조사한 꽃송이버섯 및 주름버섯 혼합물에는 추출용매로서 에탄올을 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 50~60℃로 가열하여 24시간 동안 추출하였다. 이후 상기 제조예 1의 방법으로 침전, 여과, 농축 및 건조하여 추출물을 제조하였다. 자외선 조사한 7-데하이드로콜레스테롤은 100배 중량의 에탄올에 용해하였다.

상기 자외선 조사한 꽃송이버섯 및 주름버섯 혼합추출물을 대상으로 에르고칼시페롤 함량을 분석하고, 상기 자외선 조사한 7-데하이드로콜레스테롤 용액을 대상으로 콜레칼시페롤의 함량을 분석하기 위해 HPLC 장비를 이용하여 상기 표 2와 같이 분석하였다. 에르고칼시페롤의 머무름 시간(retention time)은 9.125분이었으며, 콜레칼시페롤은 9.308분이었다. 에르고칼시페롤 및 콜레칼시페롤 표준품을 각각 100 ng/ml ~ 500 μg/ml 농도로 준비하여 분석하고 이에 대한 표준곡선을 그린 후 그 식에 대비하여 이들의 함량을 구하였으며 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

	꽃송이버섯 및 주름버섯 혼합추출물	7-데하이드로콜레스테롤용액
	에르고칼시페롤 (μg/ml)	콜레칼시페롤 (μg/ml)
1시간	1.3	34
2시간	1.5	42
4시간	2.0	64
8시간 이상	2.5	93

상기 표 7의 결과에서 보는 바와 같이, 꽃송이버섯 및 주름버섯 혼합물, 또는 7-데하이드로콜레스테롤을 자외선에 8시간 이상 노출한 후 추출할 경우 에르고칼시페롤 또는 콜레칼시페롤의 함량이 가장 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

제조예 16 ~ 20: 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물과 7-데하이드로콜레스테롤의 복합물의 제조

상기 제조예 15에 7-데하이드로콜레스테롤을 각각 중량비 0.001%(제조예 16), 0.01%(제조예 17), 0.1%(제조예 18), 0.5%(제조예 19) 및 1%(제조예 20) 첨가하여 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물과 7-데하이드로콜레스테롤의 복합물을 제조하였다.

실시예 1 ~ 5: 자외선 처리된, 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물과 7-데하이드로콜레스테롤의 복합물 제조

상기 제조예 15의 제조방법에 명시된 중량비대로 건조된 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃을 혼합한 후 20 mesh 로 여과하여 미세분말화하였다. 이후 7-데하이드로콜레스테롤을 각각 중량비 0.001%(실시예 1), 0.01%(실시예 2), 0.1%(실시예 3), 0.5%(실시예 4) 및 1%(실시예 5) 첨가하여 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합물과 7-데하이드로콜레스테롤의 혼합물을 제조하였다. 자외선 B(290~320nm)를 방출하는 램프(8~25W)를 5~10cm의 높이에서 점등하여 각각 8시간 동안 노출시킨 후 추출용매로서 에탄올을 10배 중량을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80℃~100℃로 가열하여 2 시간 동안 추출하였다. 이후 상기 제조예 1의 방법으로 침전, 여과, 농축 및 건조하여 복합물을 제조하였다.

시험예 5: 제조예 15 ~ 20 및 실시예 1 ~ 5의 에르고스테롤, 에르고칼시페롤, 7-데하이드로콜레스테롤 및 콜레칼시페롤 함량 분석

제조예 15 ~ 20 및 실시예 1 ~ 5를 대상으로 에르고스테롤, 에르고칼시페롤, 7-데하이드로콜레스테롤 및 콜레칼시페롤의 함량을 분석하기 위해 HPLC 장비를 이용하여 표 2와 같이 분석하였다. 에르고스테롤의 머무름 시간(retention time)은 9.975분이었으며, 에르고칼시페롤은 9.125분이었다. 7-데하이드로콜레스테롤의 머무름 시간은 10.152분이었으며, 콜레칼시페롤은 9.308분이었다. 각각의 표준품을 1 ~ 1000 ppm 농도로 준비하여 분석하고 이에 대한 표준곡선을 그린 후 그 식에 대비하여 이들 성분의 함량을 구하였으며 그 결과를 하기의 표 8에 나타내었다. 분석이 되지 않은 경우 n.d로 표시하였다.

	함량 (μg/ml)
	에르고스테롤	에르고칼시페롤	7-데하이드로콜레스테롤	콜레칼시페롤
제조예 15	248	n.d	n.d	n.d
제조예 16	243	n.d	10	n.d
제조예 17	251	n.d	100	n.d
제조예 18	247	n.d	1,000	n.d
제조예 19	252	n.d	5,000	n.d
제조예 20	249	n.d	10,000	n.d
실시예 1	223	21	8	1
실시예 2	220	24	87	9
실시예 3	224	23	913	82
실시예 4	221	24	4,514	476
실시예 5	226	22	8,793	988

상기 표 8의 결과에서 보는 바와 같이, 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합물과 7-데하이드로콜레스테롤과의 혼합물에 자외선을 처리하여 제조된 실시예 1 ~ 5의 복합물의 경우, 자외선을 조사하지 않은 제조예 15 ~ 20의 복합물과 비교해 볼 때, 에르고스테롤 및 7-데하이드로콜레스테롤이 각각 에르고칼시페롤과 콜레칼시페롤로 전환되고 결과적으로 이들 성분의 함량이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 6: 세포 독성 여부 확인

세포 독성 여부를 확인하기 위해 인간 각질세포주인 HaCaT를 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 배양하였으며 96 well plate에 3×10⁴cells/well의 세포 농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 상기 제조예 7, 14 ~ 20과 실시예 1 ~ 5를 농도가 0.1% 또는 1.0% 가 되도록 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 희석하여 제조한 희석용액을 처리하여 24시간 배양하였다. 또한 자외선 조사 조건에서의 세포독성 여부를 확인하기 위해 365nm 파장의 UV lamp를 이용하여 60 mJ/cm²으로 자외선을 조사하고, 상기 시료를 농도가 0.1 또는 1.0%가 되도록 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumboromide, Sigma, USA)용액을 각 well에 100 μl 씩 첨가한 후 (3 mg/ml) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150 μl의 DMSO를 첨가한 후, 30분간 shaking하여 생성된 formazan을 녹여 multimicroplate reader(Molecular device Spectra max190)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 9에 나타내었다.

세포생존율(%) = 시료첨가군의 흡광도 / 대조군의 흡광도 × 100

	세포생존율(%)
	자외선 조사 X		자외선 조사 O
시료명	0.1%	1.0%	0.1%	1.0%
대조군	100		100
제조예 7	100	98	101	101
제조예 14	101	100	100	99
제조예 15	99	99	98	99
제조예 16	98	100	102	100
제조예 17	103	100	99	97
제조예 18	102	100	98	99
제조예 19	100	98	101	97
제조예 20	99	98	99	97
실시예 1	102	101	99	97
실시예 2	100	99	100	102
실시예 3	101	100	99	100
실시예 4	99	98	100	98
실시예 5	100	98	99	99

상기 표 9의 결과에서 보는 바와 같이, 모든 시료가 HaCaT에 처리하였을 때 자외선 조사 유무와 상관없이 95% 이상의 세포생존율을 나타냄에 따라 인간 피부 유래 각질세포주의 세포 독성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.

시험예 7: 활성산소종 생성 억제 활성 측정

제조예 7, 14 ~ 20 및 실시예 1 ~ 5의 세포 내 활성산소종 생성억제 효능을 측정하기 위해, 시험예 2의 방법대로 인간 각질세포주 HaCaT에 자외선을 조사한 후 이들 시료를 24시간 동안 0.1% 및 1%로 처리한 후 DCF-DA를 이용하여 형광 강도의 변화를 측정하였다. 측정값을 대상으로 활성산소종 생성율을 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 10에 나타내었다. 비교예로서 7-데하이드로콜레스테롤만을 함유한 시료를 사용하였으며, 실시예 5의 7-데하이드로콜레스테롤 농도와 동일하게 1%로 제조하여 본 시험에 사용하였다.

시료	활성산소종 생성율 (%)
시료	0.1%	1.0%
대조군 (자외선 조사 X)	16
대조군 (자외선 조사 O)	100
제조예 7	60	41
제조예 14	58	41
제조예 15	53	34
제조예 16	46	31
제조예 17	44	29
제조예 18	43	28
제조예 19	41	27
제조예 20	40	26
비교예 1	43	29
실시예 1	35	22
실시예 2	33	21
실시예 3	33	20
실시예 4	31	18
실시예 5	29	17

상기 표 10의 결과에서 보는 바와 같이, 꽃송이버섯과 주름버섯 혼합추출물인 제조예 7, 둥근잎나팔꽃과 복사나무꽃의 혼합추출물인 제조예 14와 비교하여 이들을 모두 혼합하여 추출한 제조예 15가 자외선 조사한 HaCaT의 활성산소종 생성을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 이들 혼합추출물에 7-데하이드로콜레스테롤을 첨가하여 제조할 경우(제조예 16 ~ 20) 더 우수한 생성 억제 효능을 나타내었다. 또한 제조예 16 ~ 20 및 비교예 1과 비교하여 볼 때, 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물에 7-데하이드로콜레스테롤을 첨가하고 자외선을 조사하여 제조된 실시예 1 ~ 5의 복합물에서 더욱 우수한 활성산소종 생성억제 효능을 나타내어, 복합물로의 제조 및 자외선 조사에 따른 상승효과를 확인할 수 있었다.

시험예 8: SOD 1(superoxide dismutase 1) 발현 증가 효능 확인

항산화 관련 효소인 SOD1의 발현 증가에 미치는 영향을 확인하기 위해 HaCaT을 6 well plate에 8×10⁵cells/well의 세포 농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 365 nm 파장의 UV lamp를 이용하여 60 mJ/cm²으로 자외선을 조사하고 상기 제조예 7, 14 ~ 20 및 실시예 1 ~ 5를 농도가 0.1% 또는 1.0% 가 되도록 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 희석하여 처리하고 24시간 배양하였다. 비교예로서 7-데하이드로콜레스테롤만을 함유한 시료를 사용하였으며, 실시예 5의 7-데하이드로콜레스테롤 농도와 동일하게 1%로 제조하여 본 시험에 사용하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)을 통해 SOD1의 발현 증가율을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 β-actin을 사용하였으며, 각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 11에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 10분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 70℃ 15분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25 units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인했다. SOD 1 발현 증가율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 표 12에 나타내었다.

SOD 1 발현증가율(%) =(시료첨가군의 SOD 1 발현양/ 대조군(자외선 비조사)의 SOD 1 발현양) × 100

프라이머 이름	염기서열
SOD1	Forward : GGGAGATGGCCCAACTACTG
SOD1	Reverse : CCAGTTGACATCGAACCGTT
β-actin	Forward : GGATTCCTATGTGGGCGACGA
β-actin	Reverse : CGCTCGGTGAGGATCTTCATG
TRPM8	Forward : GAAGGAATGACACTCTGGAC
TRPM8	Reverse : GCCATTGTCCACGAGCAGC

시료	SOD1 발현 증가율 (%)
시료	0.1%	1.0%
대조군 (자외선 조사 X)	157
대조군 (자외선 조사 O)	100
제조예 7	107	112
제조예 14	109	115
제조예 15	115	121
제조예 16	121	128
제조예 17	123	129
제조예 18	124	131
제조예 19	126	133
제조예 20	129	134
비교예 1	123	130
실시예 1	135	144
실시예 2	136	145
실시예 3	137	147
실시예 4	140	150
실시예 5	142	152

상기 표 12의 결과에서 보는 바와 같이, 자외선을 조사한 HaCaT 세포에 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃을 혼합추출하여 제조한 제조예 15를 처리했을 때보다 이들 혼합추출물에 7-데하이드로콜레스테롤을 첨가하여 제조한 제조예 16 ~ 20을 처리했을 때 더 우수한 SOD1 발현 증가 효능을 나타내었다. 또한 7-데하이드로콜레스테롤을 첨가한 후 자외선을 조사하여 제조한 실시예 1 ~ 5의 복합물을 처리하였을 때 제조예 16 ~ 20 및 비교예 1과 비교하여 그 효능이 더욱 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 9: IL-1β 생성 억제 효능 확인

제조예 7, 14 ~ 20 및 실시예 1 ~ 5의 IL-1β의 생성 억제 효능을 확인하기 위해 시험예 3의 방법대로 인간 각질세포주 HaCaT에 자외선을 조사한 후 이들 시료를 24시간 동안 0.1% 및 1%로 처리하였다. 이후 배지를 수거하고 IL-1β Human ELISA kit를 사용하여 IL-1β의 양을 측정하였다.

그 결과를 하기 표 13에 나타내었다. 비교예로서 7-데하이드로콜레스테롤만을 함유한 시료를 사용하였으며, 실시예 5의 7-데하이드로콜레스테롤 농도와 동일하게 1%로 제조하여 본 시험에 사용하였다.

시료	IL-1β(pg/ml)
시료	0.1%	1.0%
대조군 (자외선 조사 X)	3.1
대조군 (자외선 조사 O)	32.0
제조예 7	25.3	20.6
제조예 14	24.8	19.7
제조예 15	23.0	17.5
제조예 16	19.9	14.2
제조예 17	19.7	14.1
제조예 18	19.1	13.6
제조예 19	18.5	12.8
제조예 20	17.6	12.0
비교예 1	19.5	13.9
실시예 1	15.2	11.0
실시예 2	14.8	10.5
실시예 3	14.0	10.1
실시예 4	13.2	9.2
실시예 5	12.0	8.4

상기 표 13의 결과에서 보는 바와 같이, 자외선을 조사한 HaCaT 세포에 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃을 혼합추출하여 제조한 제조예 15를 처리했을 때보다 이들 혼합추출물에 7-데하이드로콜레스테롤을 첨가하여 제조한 제조예 16 ~ 20을 처리했을 때 더 우수한 IL-1β 생성 억제 효능을 나타내었다. 또한 7-데하이드로콜레스테롤을 첨가한 후 자외선을 조사하여 제조한 실시예 1 ~ 5의 복합물을 처리하였을 때 제조예 16 ~ 20 및 비교예 1과 비교하여 그 효능이 더욱 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 즉 7-데하이드로콜레스테롤 복합물로의 제조 및 자외선 조사에 따른 상승효과를 확인할 수 있었다.

시험예 10: TNF-α 생성 억제 효능 확인

염증매개인자인 TNF-α(tumor necrosis factor α)의 생성 억제 효능을 확인해보기 위해 시험예 3의 방법대로 인간 각질세포주 HaCaT에 자외선을 조사한 후 제조예 7, 14 ~ 10 및 실시예 1 ~ 5를 0.1% 및 1%의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 이후 배지를 수거하고 TNF-α Human ELISA kit(R&D Systems, USA)를 사용하여 TNF-α의 양을 측정하였다.

그 결과를 하기 표 14에 나타내었다. 비교예로서 7-데하이드로콜레스테롤만을 함유한 시료를 사용하였으며, 실시예 5의 7-데하이드로콜레스테롤 농도와 동일하게 1%로 제조하여 본 시험에 사용하였다.

시료	TNF-α(pg/ml)
시료	0.1%	1.0%
대조군 (자외선 조사 X)	2.8
대조군 (자외선 조사 O)	28.5
제조예 7	26.4	24.5
제조예 14	25.3	24.0
제조예 15	22.0	20.7
제조예 16	19.5	17.2
제조예 17	19.1	16.8
제조예 18	18.7	15.3
제조예 19	18.4	14.8
제조예 20	17.6	14.1
비교예 1	18.8	15.2
실시예 1	14.9	11.4
실시예 2	14.6	11.0
실시예 3	14.0	10.6
실시예 4	13.7	9.4
실시예 5	13.1	8.7

상기 표 14의 결과에서 보는 바와 같이, 자외선을 조사한 HaCaT 세포에 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃을 혼합추출하여 제조한 제조예 15를 처리했을 때보다 이들 혼합추출물에 7-데하이드로콜레스테롤을 첨가하여 제조한 제조예 16 ~ 20을 처리했을 때 더 우수한 TNF-α 생성 억제 효능을 나타내었다. 또한 제조예 16 ~ 20 및 비교예 1과 비교하여 볼 때, 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물에 7-데하이드로콜레스테롤을 첨가하고 자외선을 조사하여 제조된 실시예 1 ~ 5의 복합물에서 더욱 우수한 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 11: TRPM 8(Transient receptor potential melastatin 8) 발현 증가 효능 확인

온도에 따라 발현되는 단백질 중 저온 범위에서 반응하는 cold receptor인 TRPM 8의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 시험예 7의 방법대로 인간 각질세포주 HaCaT에 제조예 7, 14 ~ 20 및 실시예 1 ~ 5를 0.1% 및 1%의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 비교예로서 7-데하이드로콜레스테롤만을 함유한 시료를 사용하였으며, 실시예 5의 7-데하이드로콜레스테롤 농도와 동일하게 1%로 제조하여 본 시험에 사용하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR을 통해 TRPM8의 발현 증가율을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 β-actin을 사용하였으며, 각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 10에 나타냈다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔에서 전기영동 하였고, Gel Documentation system을 이용하여 발현양을 확인했다.

그 결과를 하기 표 15에 나타내었다.

시료	TRPM 8 발현 증가율(%)
시료	0.1%	1.0%
대조군	100
제조예 7	103	109
제조예 14	105	112
제조예 15	109	120
제조예 16	113	129
제조예 17	115	130
제조예 18	116	133
제조예 19	120	134
제조예 20	123	139
비교예 1	116	132
실시예 1	134	148
실시예 2	136	150
실시예 3	137	151
실시예 4	140	156
실시예 5	144	159

상기 표 15의 결과에서 보는 바와 같이, HaCaT 세포에 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃을 혼합추출하여 제조한 제조예 15의 시료를 처리했을 때보다, 이들 혼합추출물에 7-데하이드로콜레스테롤을 첨가하여 제조한 제조예 16 ~ 20의 시료를 처리했을 때 더 우수한 TRPM8 발현 증가 효능을 나타내었다. 또한 제조예 16 ~ 20 및 비교예 1과 비교하여 볼 때, 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물에 7-데하이드로콜레스테롤을 첨가하고 자외선을 조사한 실시예 1 ~ 5의 복합물에서 더욱 우수한 TRPM8 발현 증가 효능을 나타내어, 복합물로의 제조 및 자외선 조사에 따른 상승효과를 확인할 수 있었다.

Claims

꽃송이버섯 및 주름버섯이 각각 5~10:1의 중량비율로 혼합되고, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃이 각각 2~3:1의 중량비율로 혼합되며, 상기 꽃송이버섯 및 주름버섯의 혼합물과 상기 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합물은 각각 5~10:1의 중량비율로 혼합되어 이루어지는 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합물과 7-데하이드로콜레스테롤을 혼합한 후, 추출하여 제조되는 것으로서, 상기 추출 전 또는 추출 후에 자외선 조사 처리하여 제조되는 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합추출물과 7-데하이드로콜레스테롤의 복합물을 유효성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~10 중량% 함유하는 화장료 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 복합물은 꽃송이버섯, 주름버섯, 둥근잎나팔꽃 및 복사나무꽃 혼합물 99.0~99.999중량%, 7-데하이드로콜레스테롤 0.001~1.0중량%의 비율로 혼합되어 제조되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 자외선 조사 처리는 자외선 B(290~320nm)를 방출하는 램프(8~25W)를 점등하여 8시간 이상 조사하는 것으로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 복합물은 에르고스테롤, 에르고칼시페롤 및 콜레칼시페롤을 함유하는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 자외선에 의해 증가하는 피부 산화적 스트레스와 염증반응을 억제하는 효능을 갖는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부온도 감소 효능을 갖는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.