CN118048313A - 稳定过表达miRNA-122-5p的PC12细胞株及其应用 - Google Patents
稳定过表达miRNA-122-5p的PC12细胞株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种稳定过表达miRNA‑122‑5p的PC12细胞株及其应用。稳定过表达miRNA‑122‑5p的PC12细胞株的名称为：大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞稳定表达上调miRNA‑122‑5p，保藏编号为：CCTCC NO：C2023156，基因组中含miRNA‑122‑5p mimic质粒，用嘌呤霉素筛选PC12稳转细胞株的筛选浓度为1.5～4μg/ml，本发明制备出的稳定miRNA‑122‑5p表达上调的PC12细胞株，对于深入研究神经退行性疾病（如脑缺血、阿尔茨海默病、帕金森病等）的基础研究甚至临床试验都具有重要意义，同时也为揭示神经退行性疾病的发生机制及探寻其潜在治疗靶点提供了新的策略与途径。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种稳定过表达miRNA-122-5p的PC12细胞株及其应用。
背景技术
神经退行性疾病(neurodegenerative diseases, NDs)是一类与中枢神经系统密切相关的疾病，以特定神经元群的形态异常和功能进展性丧失为主要特征，神经退行性疾病可分为急性神经退行性疾病和慢性神经退行性疾病，前者主要包括脑缺血(cerebralischemia, CI)、脑损伤和癫痫；后者主要包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、亨廷顿病等，目前预防和治疗该疾病的策略有限。神经退行性疾病的发病率逐年上升，是造成人类残疾和死亡的重要原因之一，严重影响患者的生命健康。
微小RNA(microRNAs, miRNA)是一类短链非编码功能基因RNA，其大小为18-24个核苷酸，通过促进mRNA降解和翻译抑制作为基因表达的关键转录后调节剂，参与生理功能和病理过程。miRNA被称为细胞通讯中的微调节剂，可以参与细胞信号传导和微环境重塑，同时在细胞分化，增殖和凋亡等细胞过程中发挥重要作用。已有研究表明，miRNA参与了神经细胞的增殖、分化、迁移和突触形成, 调节神经元的生存、再生和功能恢复等过程。有研究表明，急性缺血性脑卒中发生后 miR-122-5p的表达增高，然而具体作用机制尚不完全清楚。
PC12细胞是嗜铬细胞瘤衍生的细胞系，可以维持分化的神经内分泌表型，是神经元模型研究中常用的细胞系。PC12细胞在神经生长因子的诱导下分化为交感神经样细胞，在形态学、生理生化功能方面与神经元相似，如具有形成生长细胞突起，形成突触样结构以及具有电兴奋性等特性，因此常被用于神经元细胞死亡和神经毒性损伤的研究。
综上，为了深入探索神经系统疾病的发生机制，为寻找神经系统疾病潜在治疗靶点奠定坚实的基础，对PC12细胞进行基因改造是十分必要的。本发明构建的miR-122-5p 过表达的PC12细胞株对于深入研究神经退行性疾病的发生发展及预后，寻找潜在治疗靶点，推进神经退行性疾病的相关研究进展具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种稳定过表达miRNA-122-5p的PC12细胞株及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
构建一种稳定过表达miRNA-122-5p的PC12细胞株，所述细胞株的名称为：大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞稳定表达上调miRNA-122-5p，其保藏编号为：CCTCC NO：C2023156。
优选的，其基因组中含miRNA-122-5p mimic质粒。
设计一种用嘌呤霉素筛选所述稳定过表达miRNA-122-5p的PC12细胞株的方法，所述嘌呤霉素的浓度为1 .5～4μg/ ml。
优选的，所述嘌呤霉素的浓度为2～3.5μg/ ml。
优选的，所述嘌呤霉素的浓度为3.5μg/ ml。
所述的细胞株应用在神经退行性疾病中。
本发明所述的稳定过表达miRNA-122-5p的PC12细胞株，已于2023年11月27日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山（八一路299号）武汉大学中国典型培养物保藏中心，该稳定过表达miRNA-122-5p的PC12细胞株在保藏中心的保藏编号为：CCTCC NO：C2023156。分类命名：大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞稳定表达上调miRNA-122-5p(Rattus norregicus)。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1. 本发明首次制备出在PC12细胞中稳定miRNA-122-5p表达上调的细胞株。
2. 本发明论证用嘌呤霉素筛选稳定过表达miRNA-122-5p的PC12细胞株的最佳筛选浓度为3.5μg/ ml。
3. 本发明制备出的稳定miRNA-122-5p表达上调的PC12细胞株，可作为基础的试验材料和模型细胞株，用于进一步的动物实验乃至临床试验，可用于探索神经系统疾病的发生机制，寻找神经系统疾病潜在治疗靶点开辟新道路，意义重大。
附图说明
图1 GV369 和GV691 载体结构及测序结果图；
图2 pLenti-miR-122-5p测序鉴定图谱（部分序列）
图3 pLenti-hU6-miR-122-5p测序鉴定图谱（部分序列）
图4慢病毒荧光法滴度测定效果图；
图5嘌呤霉素工作浓度筛选效果图；
图6 过表达miR-122-5p慢病毒转染PC12细胞不同条件下的转染结果图；
图7 低表达miR-122-5p慢病毒转染PC12细胞不同条件下的转染结果图；
图8 mimic miR-122-5p稳转PC12细胞株的荧光图；
图9 过表达miR-122-5p慢病毒稳转PC12细胞miR-122-5p的表达情况图；
图10 inhibitor-miR-122-5p稳转PC12细胞株的荧光图；
图11低表达miR-122-5p病毒稳转细胞株miR-122-5p的表达情况图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
1.主要材料
1.1细胞
大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12(pheochromocytoma cell line, PC12)细胞（中国科学院昆明动物研究所，KCB200736YJ）
1.2试剂
RPMI1640培养基(美国Gibico)，胰酶(中国Solarbio)，胎牛血清(中国Biosharp)，Trizol试剂(美国Thermo)，嘌呤霉素（中国Solarbio）All-in-one™microRNA QRT-PCRDetection Kit(QP015)试剂盒(美国Thermo)，由北京擎科生物科技有限公司合成U6Forward primer、microRNANA-122-5p Forward primer。引物序列见表1。慢病毒载体GV369、GV691及pHelper，质粒测序结果来自上海吉凯基因医学科技股份有限公司。
表1 实时荧光定量PCR 的引物序列
2.方法
2.1高/低表达miR-122-5p慢病毒载体的构建
2.1.1慢病毒载体的构建
根据miRBase (http://www.mirbase.org/)数据库，设计扩增大鼠miR-122-5p前体序列的引物及成熟体，引物序列如表2所示。构建高表达慢病毒载体采用GV369，元件顺序为Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin，荧光标记为EGFP，AgeI/NheI为克隆位点，低表达慢病毒载体为GV691，元件顺序为hU6-MCS-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，miR-122-5p反向互补序列为：CAAACACCATTGTCACACTCCA。载体酶切体系见表3，37℃反应3 h后，对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带获得酶切后的线性载体。以大鼠基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增 miR-122-5p 前体序列，扩增反应体系见表4。扩增程序为98℃预变性5min；98℃变性10s，退火55℃10s，延伸55℃ 30s，共计30个循环；延伸72℃ 8min。PCR 产物与载体交换时，在冰水浴中配制反应体系（见表5）。于37℃反应 30 min，随后置于冰水浴中冷却 5 min 后立即转化。将 10 µL交换反应产物加入到 100 µL 感受态细胞中，轻轻混匀后置于冰上30 min。随后，在42℃下进行90 s的热激，再在冰水浴中孵育2 min。加入 500 µL LB 培养基，置于 37℃摇床振荡培养 1 h。取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养 18 h。对阳性单克隆菌落进行PCR鉴定及测序分析。将测序一致的菌液进行扩菌培养和质粒抽提。
表2 引物信息
表3 载体酶切体系
表4 PCR扩增miRNA反应体系
表5 PCR 产物与载体交换反应体系
3.结果
3.1 慢病毒载体构建及质粒鉴定
本研究成功构建了miR-122-5p高/低表达慢病毒载体GV369 和GV691（图1中A、B）。我们将鉴定出的阳性单克隆菌落37℃培养18 h，取适量菌液测序，并与目的基因的反向互补序列进行比对。化学合成目的基因序列图1中C，阳性重组克隆测序比对结果图1中D。比对结果表明，显示序列与设计目的序列保持一致，提示目的基因正确插入GV369载体中。图2：pLenti-miR-122-5p测序鉴定图谱（部分序列）。图3：pLenti-hU6-miR-122测序鉴定图谱（部分序列）。
实施例1
构建和筛选稳定高/低表达miR-122-5p的PC12细胞株
1. 慢病毒的包装与滴度检测
使用pHelper1.0质粒载体、目的质粒载体以及pHelper2.0质粒载体共同转染293T细胞，然后在37℃、5%CO2条件下孵育48 h。随后，收集细胞上清，通过离心浓缩和过滤去除杂质并进行分装，最后对稀释后的病毒进行滴度测定。计算公式：病毒滴度(TU/mL)=表达绿色荧光细胞数/病毒原液量。
2.细胞培养
复苏细胞，在培养皿中使用完全培养基(10%胎牛血清，90%RPMI-1640培养基) 于37℃、5%CO2条件下培养PC12细胞，并根据细胞状态更换培养基，待细胞铺满培养皿的80%区域，可进行传代。
3. PC12细胞嘌呤霉素工作浓度的筛选
将生长状态良好的PC12细胞铺于24孔板，贴壁生长24 h后，每孔中加入0.5 μg/mL梯度浓度的嘌呤霉素，最大浓度为10 μg/mL。培养24 h后观察细胞生长状况，继续培养PC12细胞48 h并于显微镜下观察。将所有能够杀死正常PC12细胞的最低浓度确定为PC12细胞的嘌呤霉素工作浓度。
4. 确定慢病毒转染PC12细胞的最佳转染条件
4.1实验分组
为了确定PC12细胞的最佳转染条件，将实验分组如下表6
表6 实验分组
注：M.完全培养基组； A.转染增强液A组； P.转染增强液P组
4.2 PC12细胞转染
将PC12细胞以2×105个/mL的密度种于96孔板，培养24 h。取出慢病毒置于冰上溶解，取相应体积获得三个滴度，即1×107 TU/mL、5×107 TU/mL、1×108TU/mL，适量加入完培稀释液中。转染试剂按照表7添加至每孔中。转染后24 h后，根据细胞状态改为完全培养基继续培养。
4.3转染效果确定
慢病毒转染PC12细胞72 h后，观察细胞的荧光强度及状态。将转染效果达80%以上、MOI值最小、细胞状态良好的转染条件为最终构建条件。
表7 转染预实验分组和各培养孔添加试剂
注：M.完全培养基组； A.转染增强液A组； P.转染增强液P组
5.高/低表达miR-122-5p稳转PC12细胞株的构建及鉴定
5.1实验分组
将实验分为以下五组：mimic-microRNA-122-5p慢病毒＋HiTransG P 转染液＋完全培养基组(mimic-microRNA-122-5p组)、mimic-microRNA-122 nc慢病毒＋HiTransG P转染液＋完全培养基组(mimic-microRNA-122 nc组)、inhibitor-microRNA-122-5p慢病毒＋HiTransG P 转染液＋完全培养基组(inhibitor-microRNA-122-5p组)、inhibitor-microRNA-122-5p nc慢病毒＋HiTransG P 转染液＋完全培养基组(inhibitor-microRNA-122-5p nc组)和完全培养基组(control组)。
5.2转染实验
将PC12细胞以 4×105个/mL的密度种板，每组设一重复，贴壁生长一天后，依据病毒滴度和MOI计算出每孔需要的病毒体积，加入20 μL25×HitransG P转染增强液和慢病毒。病毒体积计算公式：病毒体积=(MOI×细胞数目)/病毒滴度。转染72 h后，使用荧光显微镜观察转染效率。
5.3构建稳转株
在慢病毒转染PC12细胞72 h后，更换为含3.5μg/mL嘌呤霉素的完全培养基维持培养4-5代，然后收集细胞进行qPCR检测miR-122-5p的表达量。
6.实时荧光定量PCR检测稳转细胞株的miR-122-5p表达量
使用Trizol提取各组PC12细胞中总RNA，按试剂盒说明书操作。通过Light Cycler96测定目的基因和内参U6的表达，并使用2－△△CT法计算miR-122-5p的相对表达量。
7.统计学方法
采用SPSS 25.0软件对数据进行分析，Graph Pad Prism.v6.01绘制数据图表；数据以均数±标准差(x̅±S)表示；两组间平均值比较用t检验P <0.05表示差异具有统计学意义。
3结果
3.1慢病毒的包装及滴度测定
我们进一步对慢病毒进行包装及滴度测定，结果显示，miR-122-5p 高表达慢病毒滴度为4E+8T U/ml，miR-122-5p低表达慢病毒滴度为1E+9 TU/ml（图4）。
3.2嘌呤霉素处理PC12细胞后的死亡情况
在将PC12细胞铺板于24孔板并培养24 h后，我们更换了各培养孔的培养基，使其含有不同嘌呤霉素浓度。在培养24 h后，我们在显微镜下观察到，随着嘌呤霉素浓度的增加，PC12细胞死亡情况愈加明显，当浓度达到4 μg/mL及以上时，基本无细胞存活（图5A）。此外，随着培养时间的延长，即使嘌呤浓度仅为3.5 μg/mL，也无细胞存活（图5B）。
3.3 高/低表达miR-122-5p慢病毒最佳转染条件
将生长状态良好的PC12细胞进行转染，根据不同条件加入相应的转染试剂和慢病毒，并在荧光显微镜下观察细胞转染情况。结果显示，在高表达miR-122-5p慢病毒转染PC12细胞时，当各组的MOI为10时，大多数细胞成功转染，且细胞状态良好，荧光强度较强。与M组和A组相比，P组细胞状态良好，基本无细胞死亡，荧光强度较强。当MOI等于50时，各组被转染的PC12细胞数增多，P组转染效率较好；当MOI等于100时，细胞生长状态较差，出现不少细胞死亡（见图6）。在低表达miR-122-5p慢病毒转染PC12细胞中，当MOI为10时，转染效率较低，荧光强度较弱；当MOI为50时，转染效率达到90%左右，且细胞形态良好，无明显细胞死亡；当MOI为100时，有部分细胞出现死亡（如图7）。基于细胞生长状态良好的前提下使用最少量的慢病毒以及荧光强度较强的转染增强液的选择原则，实验得出当MOI等于10且使用HiTransG P增强液进行过表达miR-122-5p慢病毒转染时转染效果最佳；在MOI等于50加以使用HiTransG P转染液低表达miR-122-5p 慢病毒转染时转染效果最佳。
3.4 高表达miR-122-5p慢病毒稳转PC12细胞株miR-122-5p的表达量
我们将HiTransG P及MOI为10的高表达miR-122-5p的慢病毒对PC12细胞进行转染，连续培养72小时，然后添加3.5 μg/mL嘌呤霉素进行筛选，培养4-5代后获得miR-122-5p稳定高表达的PC12细胞株。荧光显微镜结果显示，在miR-122-5p高表达的PC12细胞株中，大多数细胞成功转染，且细胞生长状态良好，转染效率达到100%(见图8)。通过提取总RNA进行qPCR定量检测，结果显示，与control组相比，mimic-miR-122-5p组的miR-122-5p表达量有显著升高，差异具有统计学意义(P ＜ 0.01)，而nc组的miR-122-5p表达量未发生明显变化(图9)。
3.5 低表达miR-122-5p慢病毒转染PC12细胞株miR-122-5p的表达量
我们在含HiTransG P转染液以及MOI为50的低表达慢病毒，将其加入完全培养基中，与PC12细胞共培养72 h。随后，使用3.5 μg/mL嘌呤霉素筛选获得了稳定低表达PC12细胞株。荧光显微镜结果显示，稳转PC12细胞株生长状态良好，且达到100%的转染效率(图10)。我们进一步对该细胞株提取总RNA进行qPCR分析，结果表明，与Control组比较，低表达组的miR-122-5p表达量有显著降低，差异具有统计学意义(P ＜ 0.01)， 而对照病毒组的miR-122-5p表达量未出现明显变化(图11)。
PC12细胞是嗜铬细胞瘤衍生的细胞系，可以维持分化的神经内分泌表型，是神经元模型研究中常用的细胞系。PC12细胞在神经生长因子的诱导下分化为交感神经样细胞，在形态学、生理生化功能方面与神经元相似，如具有形成生长细胞突起，形成突触样结构以及具有电兴奋性等特性，因此常被用于神经元细胞死亡和神经毒性损伤的研究，缺血性中风后的治疗选择有限，基因治疗已成为一种有前途的选择，慢病毒载体介导基因干预技术的发展为神经退行性疾病治疗带来新希望。本研究成功构建miR-122-5p高/低表达慢病毒载体，并筛选获得稳定高/低表达miR-122-5p的PC12细胞株。经实时荧光定量PCR验证了目的基因的表达，为探究miR-122-5p在神经退行性疾病中具体作用机制奠定实验基础。
尽管已经示出和描述了本发明的较佳实施例，本领域的普通技术人员应当理解不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰仍然视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种稳定过表达miRNA-122-5p的PC12细胞株，其保藏编号为：CCTCC NO：C2023156。
2.根据权利要求1所述的稳定过表达miRNA-122-5p的PC12细胞株，其特征在于，其基因组中含miRNA-122-5p mimic质粒。
3.一种用嘌呤霉素筛选权利要求1所述稳定过表达miRNA-122-5p的PC12细胞株的方法，其特征在于，所述嘌呤霉素的浓度为1 .5～4μg/ ml。
4.根据权利要求3所述用嘌呤霉素筛选权利要求1所述稳定过表达miRNA-122-5p的PC12细胞株的方法，其特征在于，所述嘌呤霉素的浓度为2～3.5μg/ ml。
5.根据权利要求4所述用嘌呤霉素筛选权利要求1所述稳定过表达miRNA-122-5p的PC12细胞株的方法，其特征在于，所述嘌呤霉素的浓度为3.5μg/ ml。
6.根据权利要求1所述的细胞株在神经退行性疾病中的应用。
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| CN202410303609.XA CN118048313A (zh) | 2024-03-18 | 2024-03-18 | 稳定过表达miRNA-122-5p的PC12细胞株及其应用 |
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