CN118027116A - 一种铜绿假单胞菌o11血清型o-抗原三糖及其合成方法 - Google Patents

一种铜绿假单胞菌o11血清型o-抗原三糖及其合成方法 Download PDF

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CN118027116A CN202410174662.4A CN202410174662A CN118027116A CN 118027116 A CN118027116 A CN 118027116A CN 202410174662 A CN202410174662 A CN 202410174662A CN 118027116 A CN118027116 A CN 118027116A
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高健
王悦
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Abstract

本发明属于化学合成技术领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌O11血清型O‑抗原三糖及其合成方法。铜绿假单胞菌O11血清型O‑抗原三糖，具有如式I所示的结构：本发明通过单糖砌块之间化学方法偶联合成铜绿假单胞菌O11血清型的O‑抗原三糖，合成砌块包括利用L‑岩藻糖胺、D‑岩藻糖胺和D‑葡萄糖砌块，各单糖砌块之间通过1,2‑顺式或1,2‑反式糖苷键连接。首先，单糖砌块之间通过位置选择性与立体选择性糖苷化偶联组装三糖骨架，随后通过官能团修饰和保护基脱除等步骤得到目标三糖。同时，三糖的还原端连接臂末端组装有自由氨基，为下一步的缀合免疫原性载体做准备。

Description

一种铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原三糖及其合成方法
技术领域
本发明属于化学合成技术领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原三糖及其合成方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种革兰氏阴性杆菌，菌体细长且长短不一，呈球杆状或线状，单极端生有鞭毛，无芽孢。该菌具有较强的环境适应性，广泛存在于自然界、人体皮肤、呼吸道、消化道等，是临床最常见的条件性致病菌之一(J.Mol.Biol.,2015,427,3628.；Infect.Epidemiol.Med.,2016,2,25.)。铜绿假单胞菌的流行病学特征突出表现在以下两个方面(Pharmacotherapy,2005,25,1353.；J.Crit.Care.,2008,23,18.)：
第一：院内感染尤其是肺部感染的发病率不断增加。其引起的肺部感染通常与机械通气有关，导致了约20％的呼吸机相关性肺炎(VAP)，VAP是影响最高的院内感染之一，在重症监护室内最常见，通常需要长期护理和治疗，且死亡率较高。
第二：对常用抗菌药物的耐药率居高不下。由于铜绿假单胞菌外膜渗透率低，其对多种抗生素具有天然耐药性，此外，该菌极易通过获得外源性耐药基因产生新的耐药表型。
脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作为铜绿假单胞菌重要的毒力因子之一，主要由脂质A、核心寡糖和O-抗原三部分组成。脂质A和核心寡糖是LPS结构的相对保守部分，O-抗原寡糖具有结构多样性，可用来区分铜绿假单胞菌的各种血清型，并且具有一定的免疫原性，可作为研发相关疫苗的理想靶标抗原(World J.Microb.Biot.,2007,23,1541.)。根据O-抗原结构，铜绿假单胞菌可分为20种血清型，其中一个重要血清型O11的O-抗原寡糖由[→3)-α-L-N-乙酰氨基岩藻糖-(1→3)-β-D-N-乙酰氨基岩藻糖-(1→2)-β-D-葡萄糖-(1→]n三糖重复片段组成。由O11血清型导致的感染约占铜绿假单胞菌总感染的23％，高居第二位(Diagn.Micr.Infec.Dis.,2007,58,393.；Eur.J.Biochem.,1980,106,643.)。
从天然菌体中提取O-抗原寡糖的纯化步骤较为繁琐复杂，产品结构难以精准控制，同时有被热源性物质污染的风险，给后续糖疫苗的研发带来不便。利用化学合成方法制备的寡糖抗原，可避免上述情况的发生。此外，结构均一的合成寡糖抗原便于后续抗原结构的优化和构效关系研究，有利于质量更加可控、疗效更佳的新型半合成或全合成糖缀合物疫苗研发。糖类化合物具有结构复杂性和多样性，其化学合成难度较高。在铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原三糖的合成中，稀有寡糖模块的高效制备、糖苷键的位置选择性与立体选择性构建、特定位置官能团的引入与修饰等均是其化学合成的难点。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原三糖及其合成方法。本发明通过单糖砌块之间化学方法偶联合成铜绿假单胞菌O11血清型的O-抗原三糖，合成砌块包括利用L-岩藻糖胺、D-岩藻糖胺和D-葡萄糖砌块，各单糖砌块之间通过1,2-顺式或1,2-反式糖苷键连接。首先，单糖砌块之间通过位置选择性与立体选择性糖苷化偶联组装三糖骨架，随后通过官能团修饰和保护基脱除等步骤得到目标三糖。同时，三糖的还原端连接臂末端组装有自由氨基，为下一步的缀合免疫原性载体做准备。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
第一方面，本发明提供了一种铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原三糖，具有如式I所示的结构：
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原三糖的合成方法，包括以下步骤：
S1、化合物7和化合物10在二氯甲烷和乙腈混合溶剂中，以N-碘代丁二酰亚胺和三氟甲磺酸三甲基硅酯为活化剂反应生成化合物11；
S2、化合物11在二氯甲烷和水的混合溶液中，利用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌将对甲氧基苄基进行脱除得到化合物12；
S3、化合物12和化合物3在二氯甲烷和乙醚的混合溶剂中，以N-碘代丁二酰亚胺和三氟甲磺酸三甲基硅酯为活化剂，糖苷化反应生成化合物13；
S4、在1,3-丙二硫醇和三乙胺的作用下，将化合物13中的叠氮基还原成氨基，随后利用吡啶和醋酸酐将生成的氨基进行乙酰化得到化合物14；
S5、化合物14溶解于二氯甲烷溶液，向其中加入锌粉和醋酸，将三氯乙氧羰酰基脱除后，将生成中间体溶解于吡啶中，加入醋酸酐生成乙酰氨基，再经氢氧化钯催化的氢解反应脱除其中的2-萘甲基、苄基和苄氧羰基等保护基，得到具有如式I结构所示的铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原三糖。
优选的，步骤S1中，二氯甲烷：乙腈为5:1～15:1(v/v)，反应温度为-60～-20℃，反应时间为10～40min；
步骤S2中，反应温度为室温，反应时间为2～4h；
步骤S3中，二氯甲烷：乙醚为1:5～5:1(v/v)，反应温度为-40～0℃，反应时间为20～60min；
步骤S4中，将化合物13中的叠氮基还原成氨基的反应温度为室温，反应时间为2～6h；乙酰化的温度为室温，反应时间为0.5～3.0h；
步骤S5中，三氯乙氧羰酰基脱除的反应温度为室温，反应时间为2～4h；生成乙酰基的反应温度为室温，反应时间为0.5～3.0h；氢解反应的温度为室温，时间为36～60h。
优选的，还包括化合物3的合成方法，包括以下步骤：
S6、化合物1与二丁基氧化锡加入至甲苯中，加热回流1～3h，冷却后四丁基溴化铵和2-(溴甲基)萘在55～65℃下反应3～5h，得到化合物2；
S7、0℃条件下，化合物2与氢化钠和溴化苄溶解于DMF中反应2～4h，反应过程中自然升至室温，得到化合物3。
优选的，还包括化合物7的合成方法，包括以下步骤：
S8、化合物4与二丁基氧化锡加入至甲苯加热回流，反应混合物冷却至室温并减压旋干后溶于DMF中，加入氟化铯、4-甲氧基苄氯和四丁基溴化铵反应，得到化合物5；
S9、化合物5与氢化钠和溴化苄溶解于DMF中进行反应，得到化合物6；
S10、化合物6溶于吡啶和水的混合溶液与三乙胺和1,3-丙二硫醇反应，反应得到的中间体溶于四氢呋喃和水的混合溶液中与碳酸氢钠和氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯反应，得到化合物7。
进一步优选的，步骤S8中，加热回流时间为6～10h；加入氟化铯、4-甲氧基苄氯和四丁基溴化铵反应时反应温度由0℃自然升至室温，反应时间为8～16h；
步骤S9中，反应温度由0℃自然升至室温，反应时间为2～4h；
步骤S10中，与三乙胺和1,3-丙二硫醇反应时反应温度为室温，反应时间为3～5h；碳酸氢钠和氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯反应时反应温度为室温，反应时间为5～7h。
优选的，还包括化合物10的合成方法，包括以下步骤：
S11、二氯甲烷为溶剂，三氟甲磺酸三甲基硅酯为活化剂，化合物8和N-苄基-N-甲酸苄酯-3-氨基丙醇进行立体糖苷化反应得化合物9；
S12、将化合物9溶于甲醇和二氯甲烷的混合溶剂中，利用甲醇钠脱除乙酰基得到化合物10。
进一步优选的，步骤S11中，立体糖苷化反应的反应温度为-10～10℃，时间为5～30min；
步骤S12中，脱除乙酰基时反应温度为室温，反应时间为4～6h。
第三方面，本发明提供了一种糖缀合物，使用如第一方面所述的铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原三糖制备获得。
第四方面，本发明提供了如第一方面所述的铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原三糖和/或如第三方面所述的糖缀合物在制备抗铜绿假单胞菌疫苗或治疗铜绿假单胞菌感染药物中的应用。
上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：
1、本发明提出了一种结构新颖的铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原寡糖的化学合成方法，通过对稀有寡糖砌块的合成、糖苷键的位置选择性与立体选择性构建、特定官能团的位置选择性修饰以及脱除保护基等步骤成功完成了一种结构新颖的铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原三糖的化学合成。
2、本发明合成的铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原三糖的还原端位置组装有氨基连接臂，可以和免疫原性载体(如蛋白质)缀合以制备糖缀合物疫苗，对于预防和治疗铜绿假单胞菌感染具有重要意义。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为化合物3(L-岩藻糖胺砌块)的合成路线；
图2为化合物7(D-岩藻糖胺砌块)的合成路线；
图3为化合物10(D-葡萄糖砌块)的合成路线；
图4为式I化合物(即铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原三糖)的合成路线。
具体实施方式
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
本发明所有试验材料如无特殊说明均为市售购买产品。本发明的产率计算方法为“产物(mol)/反应底物(mol)*100％”。本发明中化合物结构鉴定的方法为核磁共振图谱的测定(安捷伦，600MHz)。
实施例1
化合物3(L-岩藻糖胺砌块)的合成：
如图1所示，以化合物1(对甲苯硫基-2-叠氮-2-脱氧-β-L-岩藻糖苷)为起始原料，甲苯为溶剂，C3-OH选择性用2-萘甲基保护得化合物2。随后，以无水DMF为溶剂，冰水浴条件下，化合物2与氢化钠和溴化苄反应，得化合物3。
具体实验操作和步骤：
化合物2：在氮气保护条件下，将化合物1(0.89g，3.02mmol)、二丁基氧化锡(1.13g，4.52mmol)和分子筛加入至甲苯(20.00mL)中，110℃加热回流2小时后，将反应体系冷却至室温，依次加入四丁基溴化铵(1.46g，4.52mmol)和2-(溴甲基)萘(1.00g，4.52mmol)，加热至60℃，搅拌4小时。TLC检测发现原料反应完全，过滤除去分子筛，将滤液减压蒸馏旋干，所得粗产物经硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝13:1)得到无色透明浆状化合物2(1.05g，80％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.89-7.78(m,4H),7.54-7.46(m,5H),7.16-7.12(m,2H),4.87(d,J＝12.0Hz,1H),4.84(d,J＝11.4Hz,1H),4.29(d,J＝10.2Hz,1H),3.78(t,J＝2.4Hz,1H),3.56(t,J＝9.6Hz,1H),3.50(q,J＝6.6Hz,1H),3.44(dd,J＝3.0Hz,9.6Hz,1H),2.34(s,3H),2.14(d,1H),1.36(d,J＝6.6Hz,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:138.5,134.4,133.9,133.2,133.1,129.7,128.5,127.9,127.7,127.5,127.0,126.3,126.2,125.7,86.1,81.3,74.4,72.0,68.1,60.8,21.2,16.8.
化合物3：在氮气保护条件下，将化合物2(1.00g，2.30mmol)溶解于干燥的DMF(15.00mL)，0℃条件下，加入60％氢化钠(0.14g，3.45mmol)，搅拌15分钟后加入溴化苄(0.41mL，3.45mmol)，反应自然升至室温，搅拌3小时，TLC检测发现原料点消失。冰水浴下，向体系中滴加适量冰水淬灭反应，用乙酸乙酯稀释，随后用饱和食盐水洗涤3次，有机相用无水硫酸钠干燥后减压旋干，经硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝20:1)得到无色透明浆状化合物3(1.05g，87％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.90-7.83(m,4H),7.56-7.49(m,5H),7.37-7.30(m,5H),7.10-7.06(m,2H),4.98(d,J＝11.4Hz,1H),4.92-4.87(m,2H),4.66(d,J＝11.4Hz,1H),4.35(d,J＝9.6Hz,1H),3.86(t,J＝9.6Hz,1H),3.62(d,J＝2.4Hz,1H),3.51-3.45(m,2H),2.34(s,3H),1.30(d,J＝6.6Hz,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:138.4,137.9,135.0,133.3,133.2,133.0,129.6,128.3,128.16,128.12,127.9,127.7,127.4,126.6,126.2,126.0,125.7,86.4,82.7,75.3,74.7,74.6,72.5,61.4,21.1,17.3.
如图2所示，以化合物4(对甲苯硫基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-岩藻糖苷)为起始原料，首先对其C3-OH进行位置选择性保护，得到化合物5。其次，以无水DMF为溶剂，冰水浴条件下，化合物5与氢化钠和溴化苄反应，得化合物6。将化合物6的叠氮基团进行还原后在四氢呋喃和水的混合溶液中，自由氨基用三氯乙氧羰酰基保护得化合物7。
具体实验操作和步骤：
化合物5：在装有Dean-Stark装置的反应瓶中，将化合物4(1.10g，3.73mmol)和二丁基氧化锡(1.39g，5.59mmol)在干燥的甲苯(50.00mL)中，加热回流8小时，将反应混合物冷却至室温，减压旋干，真空下室温抽1小时。在氮气保护下，反应混合物溶于干燥的DMF(20.00mL)中，冰水浴条件下加入氟化铯(0.85g，5.59mmol)、4-甲氧基苄氯(0.76mL，5.59mmol)、四丁基溴化铵(1.80g，5.59mmol)，自然升至室温并过夜反应，TLC检测发现原料点消失。用乙酸乙酯稀释，用氯化钠溶液洗涤3次，用无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝12:1)得到透明浆状化合物5(1.36g，88％)。
化合物6：在氮气保护条件下，将化合物5(1.20g，2.89mmol)溶解于干燥的DMF(15.00mL),0℃条件下，加入60％氢化钠(0.17g，4.34mmol)搅拌，15分钟后向其中加入溴化苄(0.51mL，4.34mmol)，自然升至室温，搅拌3小时，TLC检测发现原料点消失。冰水浴下，向体系中滴加适量冰水淬灭反应，用乙酸乙酯稀释，随后用饱和食盐水洗涤3次。有机相用无水硫酸钠干燥后减压旋干，经硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝20:1)得到白色粉末状化合物6(1.30g，89％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.38-7.27(m,9H),7.12-7.08(d,J＝7.8Hz,2H),6.94-6.90(m,2H),5.52(d,J＝5.4Hz,1H),4.95(d,J＝11.4Hz,1H),4.72(d,J＝11.4Hz,1H),4.69(d,J＝10.8Hz,1H),4.60(d,J＝11.4Hz,1H),4.40-4.36(dd,J＝5.4Hz,10.8Hz,1H),4.36-4.32(q,J＝6.6Hz,1H),3.83(s,3H),3.78-3.75(dd,J＝3.0Hz,10.8Hz,1H),3.69(d,J＝1.8Hz,1H),2.32(s,3H),1.16(d,J＝6.0Hz,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:159.5,138.2,137.6,132.3,130.1,129.8,129.66,129.62,128.3,128.2,127.7,114.0,88.0,79.3,76.2,75.0,72.3,67.7,60.3,55.3,21.1,16.6.
化合物7：将化合物6(1.30g，2.57mmol)溶于吡啶和水的混合溶液(10.00mL，v:v＝4:1)中，室温下依次加入三乙胺(3.58mL，25.73mmol)和1,3-丙二硫醇(3.87mL，38.60mmol)，搅拌4小时，TLC检测原料反应完全。将反应体系减压蒸干，所得粗产物经硅胶柱分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝40:1)，得到白色泡沫状固体化合物(1.17g，95％)。将得到的中间体(1.17g，2.44mmol)溶于四氢呋喃和水的混合溶液(12.00mL，v:v＝3:1)中，冰水浴下加入碳酸氢钠(2.05g，24.42mmol)，15分钟后滴加氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯(0.34mL，2.44mmol)，反应自然升至室温。搅拌6小时后，TLC检测发现原料点消失，向反应体系中加入二氯甲烷稀释,然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝20:1)得到白色粉末状固体7(1.44g，90％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.41-7.26(m,9H),7.11-7.06(d,J＝7.8Hz,2H),6.95-6.90(d,J＝9.0Hz,2H),5.66-5.59(d,J＝4.8Hz,1H),5.02-4.95(m,2H),4.78(d,J＝12.0Hz,1H),4.73-4.61(m,4H),4.48(d,J＝12.0Hz,1H),4.31(q,J＝6.0Hz,1H),3.83(s,3H),3.75(bs,1H),3.58-3.48(dd,1H),2.31(s,3H),1.27-1.20(d,J＝6.6Hz,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:159.5,154.0,138.3,137.5,132.0,130.4,129.8,129.6,129.4,128.3,128.2,127.7,114.1,95.5,89.9,77.4,75.2,74.7,74.6,71.3,68.3,55.3,51.3,21.1,16.8.
化合物10(D-葡萄糖砌块)的合成：
如图3所示，二氯甲烷为溶剂，三氟甲磺酸三甲基硅酯为活化剂，0℃条件下，化合物8和N-苄基-N-甲酸苄酯-3-氨基丙醇进行立体糖苷化反应得化合物9。将化合物9溶于甲醇和二氯甲烷的混合溶剂中，利用甲醇钠脱除乙酰基得D-葡萄糖衍生物砌块10。
具体实验操作和步骤：
化合物9：在氮气保护条件下，三氯乙酰亚胺酯供体(Tetrahedron Asymmetry,2011,22,1390.)化合物8(1.30g，2.04mmol)、N-苄基-N-甲酸苄酯-3-氨基丙醇(0.61g，2.04mmol)、分子筛，用干燥二氯甲烷溶解，室温干燥半小时，0℃条件下，向其中加入TMSOTf(37.0μL，0.20mmol)。20分钟后，TLC检测反应结束，向反应体系内滴加适量的三乙胺淬灭，抽滤除去分子筛，减压旋干得粗产物，经硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝7:1)得到无色透明浆状化合物9(1.37g，87％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.38-7.26(m,17H),7.25-7.20(m,5H),7.19-7.14(m,3H),5.21-5.12(m,2H),4.97(dd,J＝8.4Hz,9.0Hz,1H),4.80-4.76(m,2H),4.65(d,J＝11.4Hz,1H),4.60-4.48(m,4H),4.47-4.38(m,1H),4.29(d,J＝7.2Hz,1H),3.92-3.79(m,1H),3.75-3.57(m,4H),3.49-3.21(m,4H),1.88-1.70(m,5H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:169.4,156.6,138.1,138.0,137.89,137.85,136.8,136.6,128.5,128.4,128.3,127.9,127.89,127.82,127.81,127.7,127.6,127.5,127.28,127.21,100.8,82.8,77.9,75.0,74.9,73.4,73.0,68.6,67.1,66.8,50.9,44.5,28.4,20.7.
化合物10：将化合物9(1.30g，1.68mmol)溶解于二氯甲烷与甲醇的混合溶液(14.00mL，v:v＝1:1)中，滴加0.50M甲醇钠的甲醇溶液，调节至pH＝9，室温下搅拌5小时。TLC检测原料点完全消失。向体系中加入适量酸性树脂中和至pH＝7，过滤除去酸性树脂，减压旋干得粗品，粗品经硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)得到无色透明浆状化合物10(1.09g，89％)。
如图4所示，化合物7和化合物10在二氯甲烷和乙腈混合溶剂中，以N-碘代丁二酰亚胺(NIS)和TMSOTf为活化剂，-40℃条件下，反应生成β-(1→2)连接的二糖化合物11。化合物11在二氯甲烷和水的混合溶液中，利用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)将对甲氧基苄基进行脱除得到二糖受体化合物12。化合物12与化合物3在二氯甲烷和乙醚的混合溶剂中，以NIS和TMSOTf为活化剂，在-20℃条件下，糖苷化反应生成α-(1→3)连接的全保护三糖化合物13。在1,3-丙二硫醇和三乙胺的作用下，将化物合13中的叠氮基还原成氨基，随后利用吡啶和醋酸酐将生成的氨基进行乙酰化得到化合物14，纯化后将化合物14溶解于二氯甲烷溶液，向其中加入锌粉和醋酸，将三氯乙氧羰酰基脱除并对生成的氨基进行乙酰化。最后，经氢氧化钯催化的氢解反应脱除其中的2-萘甲基，所有的苄基和苄氧羰基得到组装有氨基连接臂的铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原目标三糖化合物(即式I所示化合物)。
具体实验操作和步骤：
化合物11：在氮气保护条件下，作为供体的化合物7(0.79g，1.20mmol)、作为受体的化合物10(0.80g，1.09mmol)和分子筛置于圆底烧瓶中，加入无水二氯甲烷和乙腈(14.00mL，v:v＝9:1)充分溶解，搅拌干燥1.5小时。将体系降温至-40℃，依次加入NIS(0.30g，1.32mmol)和TMSOTf(0.02mL，0.12mmol)，继续搅拌20分钟，TLC检测到受体反应完全。向反应体系内滴加适量的三乙胺淬灭，抽滤除去分子筛，加入二氯甲烷稀释，依次用饱和硫代硫酸钠溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥有机相后减压蒸干，所得的粗产物用硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)得到白色泡沫状化合物11(1.20g，87％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.43-7.26(m,18H),7.25-7.14(m,12H),7.09-7.05(m,2H),6.88-6.84(m,2H),5.20-5.11(m,2H),5.03-4.79(m,5H),4.71(d,J＝10.8Hz,1H),4.68-4.42(m,8H),4.42-4.28(m,3H),3.98-3.81(m,2H),3.81-3.78(s,3H),3.70-3.59(m,3H),4.56(t,J＝9.6Hz,1H),3.54-3.29(m,6H),3.29-3.08(m,2H),1.91-1.70(m,2H),1.06(d,J＝3.6Hz,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:159.3,156.7,153.8,138.9,138.5,138.2,138.0,137.9,136.9,136.7,130.2,129.3,128.58,128.54,128.46,128.40,128.38,128.36,128.14,128.13,128.0,127.9,127.83,127.81,127.6,127.5,127.48,127.44,127.2127.1,127.0,113.8,102.7,100.0,95.8,84.4,81.5,77.9,75.4,74.98,74.92,74.5,74.1,73.4,71.6,70.3,68.8,67.2,67.1,56.0,55.3,50.9,44.8,28.8,17.2.
化合物12：将化合物11(0.70g，0.56mmol)溶解在二氯甲烷和水的混合溶液(9.00mL，v:v＝5:1)中，随后加入DDQ(0.19g，0.83mmol)，室温下充分搅拌，3小时后TLC检测原料反应完全。向反应体系中加入二氯甲烷稀释，依次用饱和硫代硫酸钠溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏旋干，得到粗品。硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)粗产物，得到白色泡沫状化合物12(0.50g，79％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.38-7.26(m,19H),7.25-7.16(m,8H),7.19-7.14(d,J＝7.2Hz,1H),7.11-7.07(m,2H),5.36-5.11(m,3H),4.91(d,J＝11.4Hz,1H),4.85-4.81(m,1H),4.74-4.67(m,4H),4.66-4.47(m,5H),4.41-4.27(m,3H),3.93-3.72(m,2H),3.70-3.59(m,4H),3.58-3.32(m,5H),3.32-3.13(m,3H),2.65(s,1H),1.91-1.72(m,2H),1.12(s,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:156.7,154.7,138.5,138.2,138.1,138.09,138.03,137.7,136.9,136.7,128.57,128.55,128.44,128.41,128.40,128.1,128.05,128.01,127.9,127.87,127.83,127.81,127.6,127.3,127.2,102.2,100.7,95.6,84.3,80.8,78.6,78.1,75.7,75.3,74.8,74.6,74.3,73.5,71.6,70.7,68.6,67.1,57.6,50.8,43.7,28.7,17.0.
化合物13：在氮气保护条件下，作为供体的化合物3(0.25g，0.47mmol)、作为受体的化合物12(0.45g，0.39mmol)和分子筛置于圆底烧瓶中，加入无水二氯甲烷和乙醚(16.00mL,v:v＝1:1)充分溶解，搅拌干燥1.5小时。将体系降温至-20℃，依次加入NIS(0.12g，0.52mmol)和TMSOTf(8.6μL，47.35μmol)，继续搅拌40分钟，TLC检测到受体反应完全。向反应体系内滴加适量的三乙胺淬灭，抽滤除去分子筛，加入二氯甲烷稀释，依次用饱和硫代硫酸钠溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥有机相后减压蒸干，所得粗产物用硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)得到白色泡沫状固体化合物13(0.51g，84％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.86-7.72(m,4H),7.51-7.45(m,3H),7.44-7.26(m,25H),7.25-7.17(m,8H),7.10(m,2H),5.30-5.13(m,3H),5.02-4.84(m,5H),4.83-4.47(m,12H),4.37-4.26(m,2H),4.17(d,J＝12.6Hz,1H),3.94 -3.83(m,1H),3.80(dd,J＝3.0Hz,10.8Hz,1H),3.76-3.71(m,2H),3.70-3.59(m,3H),3.57(t,J＝9.6Hz,1H),3.55-3.20(m,8H),3.16-2.97(d,J＝5.4Hz,1H),1.95-1.69(m,2H),1.16-1.02(m,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:156.7,154.0,138.8,138.2,138.1,138.0,137.8,136.9,136.8,135.1,133.3,133.0,128.6,128.5,128.46,128.42,128.39,128.32,128.2,128.15,128.12,127.97,127.93,127.85,127.82,127.7,127.6,127.5,127.3,127.08,127.03,126.5,126.2,126.1,125.6,102.7,99.9,99.7,95.7,84.3,81.3,80.2,78.0,77.6,76.1,75.5,75.3,75.0,74.9,74.6,74.3,73.5,72.4,70.3,68.7,67.2,67.1,59.9,56.5,51.0,44.8,28.7,17.3,16.8.
化合物14：将化合物13(80.0mg，51.9μmol)溶于吡啶和水的混合溶液(2.0mL，v:v＝4:1)中，室温下依次加入三乙胺(72.1μL，519.0μmol)和1,3-丙二硫醇(78.0μL，778.4μmol)，搅拌4小时，TLC检测原料反应完全。将反应体系减压旋干，真空干燥得到粗产物。用吡啶(1.5mL)溶解粗产物，加入醋酸酐(100.0μL)，室温下反应1小时，TLC检测反应完全。将反应体系减压蒸馏旋干，所得粗产物经硅胶柱分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝60:1)得到白色泡沫状化合物14(67.0mg，83％)。
式I所示化合物：将化合物14(44.0mg，28.2μmol)溶解于二氯甲烷溶液中，向其中加入锌粉(37.0mg，565.0μmol)和醋酸(16.2μL，282.5μmol)，搅拌反应3小时，TLC检测反应完全后，将锌粉过滤并减压旋干，真空干燥得到粗产物。用吡啶(1.5mL)溶解粗产物，加入醋酸酐(100.0μL)，室温下反应1小时，TLC检测反应完全。将反应体系减压蒸馏旋干，所得粗产物经硅胶柱分离纯化(二氯甲烷:甲醇＝30:1)得到白色泡沫状化合物(32.0mg)。将白色泡沫状化合物(15.0mg)溶解于甲醇和水的混合溶液(6.0mL，v:v＝5:1)中，滴加3滴冰醋酸，加入氢氧化钯(10.0mg)，反应体系在50psi的氢气条件下搅拌48小时，经质谱检测，反应完全。过滤除去不溶物，减压蒸馏除去溶剂，将所得粗产物在G-15葡聚糖凝胶柱中纯化，以水为流动相，浓缩得到无色透明固体化合物，即式I所示化合物(5.0mg，68％)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:5.01(d,J＝4.2Hz,1H),4.76(d,J＝8.4Hz 1H),4.55(d,J＝7.8Hz,1H),4.15-4.08(m,3H),4.00-3.95(m,2H),3.94-3.90(dd,J＝2.4Hz,12.6Hz,1H),3.86-3.75(m,5H),3.74-3.70(dd,J＝6.0Hz,12.6Hz,1H),3.54(t,J＝9.0Hz,1H),3.49-3.42(m,2H),3.36(t,J＝9.0Hz,1H),3.25-3.21(m,2H),2.06(s,3H),2.02(s,3H),2.02-1.96(m,2H),1.28(d,J＝6.6Hz,3H),1.24(d,J＝6.6Hz,3H).
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原三糖，其特征在于，具有如式I所示的结构：
2.一种如权利要求1所述的铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原三糖的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、化合物7和化合物10在二氯甲烷和乙腈混合溶剂中，以N-碘代丁二酰亚胺和三氟甲磺酸三甲基硅酯为活化剂反应生成化合物11；
S2、化合物11在二氯甲烷和水的混合溶液中，利用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌将对甲氧基苄基进行脱除得到化合物12；
S3、化合物12和化合物3在二氯甲烷和乙醚的混合溶剂中，以N-碘代丁二酰亚胺和三氟甲磺酸三甲基硅酯为活化剂，糖苷化反应生成化合物13；
S4、在1,3-丙二硫醇和三乙胺的作用下，将化合物13中的叠氮基还原成氨基，随后利用吡啶和醋酸酐将生成的氨基进行乙酰化得到化合物14；
S5、化合物14溶解于二氯甲烷溶液，向其中加入锌粉和醋酸，将三氯乙氧羰酰基脱除后，将生成中间体溶解于吡啶中，加入醋酸酐生成乙酰基，再经氢氧化钯催化的氢解反应脱除其中的2-萘甲基、苄基和苄氧羰基等保护基，得到具有如式I所示结构的铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原三糖。
3.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，二氯甲烷：乙腈为5:1～15:1(v/v)，反应温度为-60～-20℃，反应时间为10～40min；
步骤S2中，反应温度为室温，反应时间为2～4h；
步骤S3中，二氯甲烷：乙醚为1:5～5:1(v/v)，反应温度为-40～0℃，反应时间为20～60min；
步骤S4中，将化合物13中的叠氮基还原成氨基的反应温度为室温，反应时间为2～6h；乙酰化的温度为室温，反应时间为0.5～3.0h；
步骤S5中，三氯乙氧羰酰基脱除的反应温度为室温，反应时间为2～4h；生成乙酰基的反应温度为室温，反应时间为0.5～3.0h；氢解反应的温度为室温，时间为36～60h。
4.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，还包括化合物3的合成方法，包括以下步骤：
S6、化合物1与二丁基氧化锡加入至甲苯中，加热回流1～3h，冷却后四丁基溴化铵和2-(溴甲基)萘在55～65℃下反应3～5h，得到化合物2；
S7、0℃条件下，化合物2与氢化钠和溴化苄溶解于DMF中反应2～4h，反应过程中自然升至室温，得到化合物3。
5.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，还包括化合物7的合成方法，包括以下步骤：
S8、化合物4与二丁基氧化锡加入至甲苯加热回流，反应混合物冷却至室温并减压旋干后溶于DMF中，加入氟化铯、4-甲氧基苄氯和四丁基溴化铵反应，得到化合物5；
S9、化合物5与氢化钠和溴化苄溶解于DMF中进行反应，得到化合物6；
S10、化合物6溶于吡啶和水的混合溶液与三乙胺和1,3-丙二硫醇反应，反应得到的中间体溶于四氢呋喃和水的混合溶液中与碳酸氢钠和氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯反应，得到化合物7。
6.如权利要求5所述的合成方法，其特征在于，步骤S8中，加热回流时间为6～10h；加入氟化铯、4-甲氧基苄氯和四丁基溴化铵反应时反应温度由0℃自然升至室温，反应时间为8～16h；
步骤S9中，反应温度由0℃自然升至室温，反应时间为2～4h；
步骤S10中，与三乙胺和1,3-丙二硫醇反应时反应温度为室温，反应时间为3～5h；碳酸氢钠和氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯反应时反应温度为室温，反应时间为5～7h。
7.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，还包括化合物10的合成方法，包括以下步骤：
S11、二氯甲烷为溶剂，三氟甲磺酸三甲基硅酯为活化剂，化合物8和N-苄基-N-甲酸苄酯-3-氨基丙醇进行立体糖苷化反应得化合物9；
S12、将化合物9溶于甲醇和二氯甲烷的混合溶剂中，利用甲醇钠脱除乙酰基得到化合物10。
8.如权利要求7所述的合成方法，其特征在于，步骤S11中，立体糖苷化反应的反应温度为-10～10℃，时间为5～30min；
步骤S12中，脱除乙酰基时反应温度为室温，反应时间为4～6h。
9.一种糖缀合物，其特征在于，使用如权利要求1所述的铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原三糖制备获得。
10.如权利要求1所述的铜绿假单胞菌O11血清型O-抗原三糖和/或如权利要求9所述的糖缀合物在制备抗铜绿假单胞菌疫苗或治疗铜绿假单胞菌感染药物中的应用。
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