CN118027040A - 一种治疗冠状病毒感染的核苷类化合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗冠状病毒感染的核苷类化合物及其用途，所述核苷类化合物为式II所述的化合物或其药学上可接受的盐。所述核苷类化合物具有预防、缓解或治疗冠状病毒感染，或其同源变异病毒的复制或繁殖及其所产生的细胞病变效应的用途。

Description

一种治疗冠状病毒感染的核苷类化合物及其用途
本申请是申请日为2021年9月15日，申请号为202111083730.9，发明名称为“一种治疗病毒感染的核苷类化合物及其用途”的申请的分案申请。
技术领域
本发明属于药物合成领域，涉及药学技术和病毒感染疾病技术领域。具体涉及一种核苷衍生物、其前药和/或其药学上可接受的盐，及其组合物和用途。
背景技术
新冠病毒是一种具有包膜的单链RNA病毒，为β属冠状病毒。与SARS和MERS类似，SARS-CoV-2基因组编码非结构蛋白：3C样蛋白酶(3-chymotrypsin-like protease，3CLpro)、木瓜蛋白酶样蛋白酶(papain-likeprotease，PLpro)、解旋酶(helicase)和RNA依赖RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)；结构蛋白：如棘突糖蛋白(spikeglycoprotein)和附属蛋白(accessory proteins)。新冠病毒的表面棘突糖蛋白与人体细胞表面血管紧张素转换酶(ACE2)受体的结合从而感染人的呼吸道上皮细胞。病毒在进入宿主细胞后解体，将核衣壳和病毒RNA释放到细胞质中，病毒RNA 5ˊ末端开放阅读框(ORF1a/b)将编码多聚蛋白质(pp1a和pp1ab)，它们对病毒复制所需酶的加工、成熟起重要作用。pp1a和pp1ab可被木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)和3C样蛋白酶(3CLpro)裂解，产生非结构蛋白，包括RNA依赖性RNA聚合酶和解螺旋酶等，它们对于新冠病毒的转录和复制的起着关键的作用。目前，冠状病毒识别受体的表面棘突糖蛋白、参与复制及转录过程的重要蛋白3CLpro、PLpro与RdRp是四个十分具有抗病毒药物研发吸引力的靶点。
新型冠状病毒SARS-CoV-2的多个变异毒株近期引起了广泛重视。其中Delta变体，也称为B.1.617.2，被世界卫生组织(WHO)列为“关注的变体”。Delta变异毒株的传染性和致病性增强，其病毒载量是之前原始病毒的1260倍，且可能导致更严重的疾病。尽管全球已接种超过27.6亿剂疫苗，但快速突变的SARS-CoV-2，尤其是Delta变体的疫苗有效性仍然令人担忧。
关于新冠疫苗的研发，12月2日，英国首先批准了辉瑞和BioNTech新冠疫苗的紧急使用权。一方面此款疫苗的普遍使用效果还未得知，另一方严格的低温保存要求对其广泛使用带来了极大的不便。
关于新冠药物研发，目前瑞德西韦是美国FDA唯一批准的新冠用药。瑞德西韦(Remdesivir)是一个腺苷类似物的单磷酸氨甲酯前药，起初为吉利德公司开发的抗埃博拉病毒药物。瑞德西韦作为RdRp抑制剂，在细胞层面表现出了抗新冠病毒的活性，但经临床试验表明，瑞德西韦在人体上并没有显著的降低死亡率。且由于临床使用剂量已接近安全剂量，一些明显的副作用不得不引起关注。
通过申请人前期对瑞德西韦及其前提化合物GS-441524的研究(Li,et al.,J.Med.Chem.2020)，发现GS-441524在小鼠体内的活性测试中产生了优于瑞德西韦的抗病毒作用。化合物GS-441524虽然与瑞德西韦的作用机理类似，但其显示了更好的安全性。因此，申请人已申请了描述化合物GS-441524在预防、缓解和/或治疗SARS-CoV-2的药物的应用专利(申请号或专利号202011000517.2)。
后期通过对GS-441524进行药代动力学分析，发现其生物口服利用度很低，只能以注射液形式使用。因此，寻求GS-441524的可口服的低毒性核苷衍生物或前药研究将具有重大意义。
发明内容
发明概述
本发明的目的是提供具有式I结构的核苷衍生物或其药学可接受的盐。所述式I所示化合物或其药学可接受的盐能有效抑制冠状病毒在细胞内的复制和/或繁殖，尤其是抑制SARS-CoV-2和MHV-A59病毒在细胞内的复制和/或繁殖，其活性高，毒性低，生物利用度高。
本发明的另一目的是提供包含具有式I结构的核苷衍生物、前药和/或其药学上可接受的盐的药物组合物。
本发明的另一目的是提供具有式I结构的核苷衍生物、前药和/或其药学上可接受的盐的用途。
发明详述
为达到上述目的之一，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种核苷衍生物、其前药和/或其药学上可接受的盐。
式I所示化合物或其药学可接受的盐：
其中：
R1选自H、D、氟原子或氯原子；
R2、R3、R4、R5各自独立地选自H、D、卤素原子、R6、R7、OH、-OR6、-OR7、-NH2、-NHR6、-NHR7、-NR7R8、SH、-SR7、-SSR7、SeR7、L型氨基酸酯或D型氨基酸酯；
R6独立地选自-C(＝O)R7、-C(＝O)OR7、-C(＝O)NHR7、-C(＝O)NR7R8、-CH2OC(＝O)OR7、-CH2OC(＝O)NHR7、-CH2OC(＝O)NR7R8、-C(＝O)SR7、-C(＝S)R7、-S(＝O)R7或-S(＝O)2R7；
R7和R8选自取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的C3-C10环烯基、取代或未取代的C3-C10环炔基、取代或未取代的C2-C10烯基、取代或未取代的C2-C10炔基、取代或未取代的C6-C20芳基、取代或未取代的C3-C20杂环基、取代或未取代的C6-C20芳烷基，或其中任意一种的氘代物；
R9选自H或F。
所述取代或未取代的C1-C10烷基可以选自取代或未取代的C1-C5烷基、取代或未取代的C2-C4烷基、取代或未取代的C2-C3烷基。
所述取代或未取代的C3-C10环烷基可以选自取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的C4-C10环烷基、取代或未取代的C4-C8环烷基、取代或未取代的C4-C6环烷基、取代或未取代的C5-C6环烷基。
所述取代或未取代的C3-C10环烯基可以选自取代或未取代的C3-C10环烯基、取代或未取代的C4-C10环烯基、取代或未取代的C4-C8环烯基、取代或未取代的C4-C6环烯基、取代或未取代的C5-C6环烯基。
所述取代或未取代的C3-C10环炔基可以选自取代或未取代的C3-C10环炔基、取代或未取代的C4-C10环炔基、取代或未取代的C4-C8环炔基、取代或未取代的C4-C6环炔基、取代或未取代的C5-C6环炔基。
所述取代或未取代的C6-C20芳基可以选自取代或未取代的C6-C12芳基、取代或未取代的C6-C10芳基。
所述取代或未取代的C3-C20杂环基可以选自取代或未取代的C4-C10杂环基、取代或未取代的C4-C6杂环基、取代或未取代的C4-C5杂环基。
所述取代或未取代的C3-C20杂环基中的杂原子可以为氮原子或氧原子。
所述取代或未取代的C3-C20杂环基中的杂原子数量可以为1个或2个。
所述取代可以包括被甲基、乙基、苯基、吲哚基、吡咯、氨基、卤素原子、巯基或巯甲基取代。
在一些实施例中，所述的化合物或其药学可接受的盐中，所述R2为H、OH或-R6。
在一些实施例中，所述的化合物或其药学可接受的盐中，所述R2为H。
在一些实施例中，所述的化合物或其药学可接受的盐中，所述R2为OH。
在一些实施例中，所述的化合物或其药学可接受的盐中，所述R2为-R6。
在一些实施例中，所述的化合物或其药学可接受的盐中，所述R9为H或F。
在一些实施例中，所述的化合物或其药学可接受的盐，所述R9为H。
在一些实施例中，所述的化合物或其药学可接受的盐中，所述R9为F。
在一些实施例中，所述的化合物或其药学可接受的盐中，所述R3和R4为OH。
在一些实施例中，所述的化合物或其药学可接受的盐中，所述R1为H，F或D。
在一些实施例中，所述的化合物或其药学可接受的盐中，所述R1为H。
在一些实施例中，所述的化合物或其药学可接受的盐中，所述R1为F。
在一些实施例中，所述的化合物或其药学可接受的盐中，所述R1为D。
在一些实施例中，所述的化合物或其药学可接受的盐中，所述R5为-OR6、L型氨基酸酯或D型氨基酸酯。
在一些实施例中，所述的化合物或其药学可接受的盐中，所述R5为-OR6。
在一些实施例中，所述的化合物或其药学可接受的盐中，所述R2为H、OH或-R6；R9为H或F；R3和R4为OH；R1为H，F或D；R5为-OR6、L型氨基酸酯或D型氨基酸酯；R6为-C(＝O)R7。
在一些实施例中，所述式I所示化合物为式II所示化合物：
在一些实施例中，所述的化合物或其药学可接受的盐中，所述R7选自苯基、2-丙基、甲基、乙基、-CH2CF3、1-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2，3-二甲基-2-丁基、3，3-二甲基-2-丁基、辛基、萘基、四氢-2H-吡喃基和1-甲基哌啶基。
在一些实施例中，所述的化合物或其药学可接受的盐中，所述R7选自环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
在一些实施例中，所述式I所示化合物包括选自以下结构中的任一种：
在一些更优选的实施例中，所述式I所示化合物包括选自以下结构中的任一种：
其中，化合物ATV014和ATV006除了具有相比GS-441524和瑞德西韦中间体5，对SARS复制子在HEK293T细胞上和在HEK293T细胞上的抑制率更高，IC50浓度更低，具有更高的活性外，ATV014和ATV006与GS-441524相比，其口服生物利用度显著提高，有更好的口服成药性。另外，化合物ATV014和ATV006均具有良好的抗SARS-CoV及SARS-CoV-2活性，其抗SARS-CoV-2的活性为GS-441524活性的两倍以上，这表明化合物ATV014和ATV006均可有效地抑制病毒以及变异毒株在细胞内的复制和/或繁殖。另外，对于SARS-CoV-2的新型突变株，如SARS-CoV-2突变株B.1、SARS-CoV-2突变株B.1.351和SARS-CoV-2突变株B.1.617.2，本发明所提供的化合物均具有良好的抑制活性，尤其是ATV014，其具有优异的抑制活性，其IC50可低至0.34μM以下，其活性优越GS-441524活性近8倍。
在一些实施例中，所述式I所示化合物不包括以下结构：
在本发明的一些实施例中，所述式I所示化合物包括式I所示化合物的外消旋物、对映异构体、互变异构体、多晶型物、假多晶型物、无定形形式、水合物或溶剂化物。
第二方面，本发明提供一种药物组合物。
一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述化合物或其药学可接受的盐。
所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载体或辅料。
所述药物组合物可以为片剂、丸剂、霜剂、乳剂、软膏剂、混悬剂、冻干剂、胶囊、缓释剂、颗粒剂、冲剂、注射药剂或喷剂。
所述药物组合物还可以包括含中药成分和/或西药成分。
所述西药成分可以包括：阿匹莫德(apilimod)、R 82913(CAS号：126347-69-1)、DS-6930(CAS号：1242328-82-0)、ONO 5334(CAS号：868273-90-9)、磷酸奥司他韦(Oseltamivir phosphate)、汉防己甲素(Hanfangchin A)、氯法齐明(clofazamine)、阿司咪唑(astemizole)、重组人源血管紧缩素转换酶2(rhACE2)或法匹拉韦(Favipiravir)和/或它们的药学上可接受的盐等可以预防、缓解和/或治疗COVID-19感染或其同源变异病毒感染的化合物中的至少一种。
第三方面，本发明提供第一方面所述化合物或其药学可接受的盐和第二方面所述药物组合物的用途。
一种第一方面所述的化合物或其药学可接受的盐或第二方面所述药物组合物在制备用于预防、缓解或治疗冠状病毒感染，或其同源变异病毒的复制或繁殖及其所产生的细胞病变效应的产品中的用途。
一种第一方面所述的化合物或其药学可接受的盐或第二方面所述药物组合物在预防、缓解或治疗冠状病毒感染，或其同源变异病毒的复制或繁殖及其所产生的细胞病变效应的用途。
所述感染包括发热、咳嗽、咽痛、急性呼吸道感染、严重急性呼吸道感染、低氧性呼吸衰竭及急性呼吸窘迫综合征、脓毒症或脓毒性休克。
一种第一方面所述的化合物或其药学可接受的盐或第二方面所述药物组合物在制备用于检测冠状病毒或其同源变异病毒的产品中的用途。
一种第一方面所述的化合物或其药学可接受的盐或第二方面所述药物组合物在检测冠状病毒或其同源变异病毒中的用途。
所述冠状病毒可以包括：MHV-A59、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV，MERS-CoV、SARS-CoV-2、小鼠肝炎病毒、猫传染性腹膜炎病毒、犬冠状病毒、牛冠状病毒、禽传染性支气管炎病毒或猪冠状病毒。
所述SARS-CoV-2包括SARS-CoV-2的突变株或未突变株。
所述SARS-CoV-2的突变株包括SARS-CoV-2突变株B.1、SARS-CoV-2突变株B.1.351(Beta，贝塔)、SARS-CoV-2突变株B.1.617.2(Delta，德尔塔)、SARS-CoV-2突变株C.37(拉姆达：起源于秘鲁的变异毒株)、SARS-CoV-2突变株P.1族谱(起源于巴西的变异毒株)、SARS-CoV-2突变株B.1.525(伊塔：另一个起源于英国的变异毒株)、SARS-CoV-2突变株B.1.427(伊普西隆：起源于加州北部的变异毒株)或SARS-CoV-2突变株B.1.429(伊普西隆：起源于加州北部的变异毒株)。
所述化合物或其药学可接受的盐可以适用于人或动物。
所述动物可以包括牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物、鸟类动物和鱼类动物。
有益效果
相比现有技术，本发明具有以下技术效果：
1)本发明所述式I所示化合物或其药学可接受的盐能有效抑制冠状病毒在细胞内的复制和/或繁殖，尤其是抑制SARS-CoV-2及其突变株，如SARS-CoV-2突变株B.1、SARS-CoV-2突变株B.1.351(Beta，贝塔)和SARS-CoV-2突变株B.1.617.2(Delta，德尔塔)，和MHV-A59病毒在细胞内的复制和/或繁殖，其活性高，毒性低，生物利用度高。
2)所述化合物ATV014和ATV006均具有良好的抗SARS-CoV-2活性，两个化合物抗SARS-CoV-2的活性为GS-441524活性的均在两倍以上，特别是抗SARS-CoV-2德尔塔突变株的活性均为GS-441524活性的三到四倍，其中，ATV014的IC50可低至0.34μM
以下，这表明化合物ATV014和ATV006可以能有效地抑制SARS病毒在细胞内的复制和/或繁殖。
3)所述化合物ATV006和ATV014均具有良好的药代性质，其中ATV006的生物利用度可高达79％(大鼠)，30％(食蟹猴)；ATV014在大鼠中的生物利用度高达49％。
4)本发明所述式I所示化合物或其药学可接受的盐的结构简单、合成容易、有利于生产和分销。
5)本发明所述制备式I所示化合物或其药学可接受的盐的方法操作简单，有利于产业化生产。
术语定义
除非另外说明，否则如本文使用的以下术语和短语意图具有以下含义：
SARS-CoV-2突变株B.1为hCoV-19/CHN/SYSU-IHV/2020毒株，其在GISAID上的Accession ID为:EPI_ISL_444969；是从广州市第八人民医院收治的一名妇女的痰标本中分离出来的。
“本发明所述化合物”意指式I所示化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体、多晶型物、异构体和溶剂合物。同样地，短语“式I所示化合物”意指该式的化合物和其药学上可接受的盐、互变异构体、多晶型物、异构体和溶剂合物。
本发明中，如“化合物I”和“式I所示化合物”的表述，表示的是同一个化合物。
“V/V”表示体积比。IC50表示半抑制浓度。
所述“H”为氢原子，所述“D”为氘原子。所述“卤素原子”表示氟原子(F)、氯原子(Cl)、溴原子(Br)、碘原子(I)、砹原子(At)或钿原子(Ts)。
本发明中“室温”指的是环境温度，温度由大约10℃到大约40℃。在一些实施例中，“室温”指的是温度由大约20℃到大约30℃；在另一些实施例中，“室温”指的是温度由大约25℃到大约30℃；在又一些实施例中，“室温”指的是10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃等。
“烷基”是包含正碳原子、仲碳原子、叔碳原子或环碳原子的烃。例如，烷基可以具有1至10个碳原子(即，C1-C10烷基)、1至8个碳原子(即，C1-C8烷基)或1至6个碳原子(即，C1-C6烷基)。合适的烷基的实例包括但不限于，甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(i-Pr、i-丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、i-丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、n-丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、i-丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、s-丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、t-丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(n-戊基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2，3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3，3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3和辛基(-(CH2)7CH3)。
“烯基”是包含具有至少一个不饱和部位，即碳-碳sp2双键的正碳原子、仲碳原子、叔碳原子或环碳原子的烃。例如，烯基可以具有2至10个碳原子(C2-C10烯基)、2至12个碳原子(C2-C12烯基)或2至6个碳原子(C2-C6烯基)。合适的烯基的实例包括但不限于，乙烯或乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)、环戊烯基(-C5H7)和5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)。
“炔基”是包含具有至少一个不饱和部位，即碳-碳sp三键的正碳原子、仲碳原子、叔碳原子或环碳原子的烃。例如，炔基可以具有2至10个碳原子(C2-C10炔基)、2至12个碳原子(C2-C12炔基)或2至6个碳原子(C2-C6炔基)。合适的炔基的实例包括但不限于，乙炔基(-C＝CH)、炔丙基(-CH2C＝CH)以及类似物。
“芳基”意指通过从母体芳环系统的单个碳原子除去一个氢原子衍生的芳族烃基。例如，芳基可以具有6至20个碳原子、6至14个碳原子或6至10个碳原子。典型的芳基包括但不限于，从苯(例如，苯基)、取代的苯、萘、蒽、联苯等衍生的基团以及类似基团。
“芳基烷基”是指其中键合至碳原子(通常是末端或sp3碳原子)的氢原子中的一个被芳基代替的无环烷基。典型的芳基烷基包括但不限于，苄基、2-苯基乙-1-基、萘基甲基、2-萘基乙-1-基、萘并苄基、2-萘并苯基乙-1-基以及类似物。芳基烷基可以包括7至20个碳原子，例如，烷基部分是I至6个碳原子，且芳基部分是6至14个碳原子。
涉及烷基、芳基、芳基烷基、杂环基、杂芳基、碳环基等的术语“取代的”例如“取代的C1-C10烷基”、“取代的C6-C20芳基”、“取代的芳基烷基”、“取代的C1-C20杂环”和“取代的碳环基”分别意指其中一个或多个氢原子各自独立地被非氢取代基代替的C1-C10烷基、C6-C20芳基、芳基烷基、C1-C20杂环、碳环基。除非另外表明，否则当术语“取代的”与具有能够取代的两个或更多个部分的基团例如芳基烷基结合使用时，取代基可以连接至芳基部分、烷基部分或两者。
如本文使用的术语“前药”是指当被施用至生物体系时由于自发化学反应、酶催化的化学反应、光解和/或代谢化学反应而产生药物，即，活性成分的任何化合物。前药因此是治疗活性化合物的共价改性的类似物或潜在形式。
本文使用的“杂环”或“杂环基”包括作为实例且不限于在以下中描述的那些杂环：Paquette,Leo A.：Principles of Modern Heterocyclic Chemistry(W.A.Benjamin,NewYork,1968)，特别是第1、3、4、6、7和9章：The Chemistry of Heterocyclic Compounds,ASeries of Monographs^(John Wiley&Sons,New York,1950至现在)，特别是第13、14、16、19和28卷和J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566。在本发明的一个具体的实施方案中，“杂环”包括如本文所定义的“碳环”，其中一个或多个(例如1、2、3或4个)碳原子已经被杂原子(例如O、N或S)代替。术语“杂环”或“杂环基”包括饱和环、部分不饱和环和芳族环(即杂芳族环)。取代的杂环基包括，例如，被本文公开的包括羰基的任何取代基取代的杂环。
杂环的实例包括作为实例且不作为限制，吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氢噻吩基、硫氧化的四氢噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、硫杂萘基、吲哚基、吲哚烯基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、吖辛因(氮杂环辛烷)基、三嗪基、6H-1，2，5-噻二嗪基、2H，6H-1，5，2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、咕吨基、酚黄素基、2H-吡咯基、异噻唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、IH-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱基、吩噁嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、二氢吲哚基、异二氢吲哚啉基、奎宁环基、吗啉基、噁唑烷基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、羟吲哚基、苯并噁唑啉基、靛红酰基和双-四氢呋喃基。
“杂芳基”是指在环中具有至少一个杂原子的芳族杂环基。可以在芳族环上包含的合适杂原子的非限制性实例包括氧、硫和氮。杂芳基环的非限制性实例包括在“杂环基”定义中所列的所有那些芳香环，包括吡啶基、吡咯基、噁唑基、引哚基、异吲哚基、嘌呤基、呋喃基、噻吩基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、咔唑基、咪唑基、噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、喹啉基、异喹啉基、哒嗪基、嘧啶基、吡唑基等。
“前药部分”是指，在代谢过程中，全身地、在细胞内，通过水解、酶切割，或通过一些其它过程，从有活性的抑制性化合物分离出的不稳定的官能团(Bundgaard,Hans,Textbook of Drug Design and Development(1991)中的“Design and Application ofProdrugs”，P.Krogsgaard-Larsen和H.Bundgaard,Eds.Harwood Academic Publishers,113-191页)。前药部分可以用于增强溶解度、吸收和亲脂性，以优化药物递送、生物利用度和功效。
前药部分可以包括有活性的代谢物或药物本身。
式I所示化合物或其药学上可接受的盐可以作为不同的多晶型物或假多晶型物存在。本文使用的晶体多晶型现象是指晶体化合物以不同晶体结构存在的能力。晶体多晶型现象可以源自晶体堆积中的差异(堆积多晶型现象)或相同分子的不同构象异构体之间的堆积差异(构象多晶型现象)。本文使用的晶体假多晶型现象是指化合物的水合物或溶剂化物以不同晶体结构存在的能力。本发明的假多晶型物可以由于晶体堆积中的差异(堆积假多晶型现象)或由于相同分子的不同构象异构体之间的堆积差异(构象假多晶型现象)而存在。本发明包含式I-III化合物和它们的药学上可接受的盐的所有多晶型物和假多晶型物。
式I所示化合物或其药学上可接受的盐还可以作为无定形固体存在。本文使用的无定形固体是这样的固体，其中所述固体中的原子的位置不存在长程有序。当晶体大小是2纳米或更小时，该定义也适用。可以使用包括溶剂在内的添加剂，建立本发明的无定形形式。本发明包含式I-III化合物和它们的药学上可接受的盐的所有无定形形式。
本文使用的术语“治疗”，除非另外表明，否则意指逆转、减轻该术语所适用的病症或疾患或这样的病症或疾患的一个或多个症状、抑制所述病症或疾患或其一个或多个症状的进展或防止所述病症或疾患或其一个或多个症状。如本文使用的术语“治疗”是指治疗行为，如“治疗”在上文刚定义的。
本发明所述化合物也包括提及其生理上可接受的盐，实例包括衍生自适当碱的盐，所述碱例如碱金属或碱土金属(例如，Na+、Li+、K+、Ca+2和Mg+2)、铵和NR4 +(其中R如本文所定义)。氮原子或氨基的生理上可接受的盐包括：(a)与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸例如，氢氯酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；(b)与有机酸形成的盐，所述有机酸例如，醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、羟乙磺酸、乳糖酸、鞣酸、棕榈酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸、丙二酸、磺基水杨酸、羟乙酸、2-羟基-3-萘甲酸盐、双羟萘酸盐、水杨酸、硬脂酸、苯二甲酸、苦杏仁酸、乳酸、乙磺酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等；和(c)与元素阴离子形成的盐，所述元素阴离子例如，氯、溴和碘。羟基化合物的生理上可接受的盐包括所述化合物的阴离子与诸如Na+和NR4 +的适当阳离子的组合。
对于治疗用途，本发明化合物的活性成分的盐是生理上可接受的，即它们是源自生理上可接受的酸或碱的盐。但是，也可以将不是生理上可接受的酸或碱的盐用于，例如，制备或纯化生理上可接受的化合物。所有盐，无论是否衍生自生理上可接受的酸或碱，都在本发明的范围内。
由式I所述化合物可以具有手性中心，例如手性碳。式I所述化合物因此包括所有立体异构体的外消旋混合物，包括对映异构体、非对映异构体和阻转异构体。另外，本发明所述化合物包括在任何或所有的不对称的手性原子处富集或拆分的旋光异构体。换句话说，与描述近似的手性中心以手性异构体或外消旋的混合物形式提供。外消旋的和非对映异构体的混合物，以及分离或合成的、基本上不含其对映异构体或非对映异构体配偶体的单独的旋光异构体，都在本发明的范围之内。通过公知技术将外消旋混合物分离为它们的单独的、基本上旋光纯的异构体，所述公知技术例如，分离与旋光活性助剂(例如酸或碱)形成的非对映异构体的盐，之后将其转变回旋光活性物质。在多数情况下，从所需原料的适当的立体异构体开始，通过立体特异性反应，合成所需的旋光异构体。
每当本文描述的化合物被多于一个相同的指定基团(例如，“R”或“R1”)取代时，应当理解，这些基团可相同或不同，即，各个基团被独立选择。
抗新冠病毒的活性检测方法：
本发明的另一方面涉及抗新冠病毒的活性检测方法，包括使用本发明所述化合物处理怀疑含有新冠病毒科的样品的步骤。
本发明所述化合物可用作抗新冠病毒化合物、用作这类化合物的中间体或具有如下所述的其它用途。所述抗新冠病毒化合物会结合到具有对新冠病毒独有的几何形状的表面上或腔中的位置。结合抗新冠病毒的化合物可以不同的可逆程度结合。那些基本上不可逆结合的化合物是用于本发明这种方法的理想候选物。一旦被标记，那些基本上不可逆结合的组合物可以用作检测新冠病毒的探针。因此，本发明涉及检测疑似包含新冠病毒样品中的新冠病毒的方法，其包括以下步骤：用包含与标记物结合的本发明化合物的组合物处理疑似含有新冠病毒的样品；并观察样品对标记物活性的影响。适宜的标记物是诊断学领域公知的，并包括稳定的自由基、荧光团、放射性同位素、酶、化学发光基团和色原。使用官能团(例如羟基、羧基、巯基或氨基)，以常规方式标记本文的化合物。
在本发明上下文中，疑似含有新冠病毒的样品包括天然或人造的材料，例如活生物；组织或细胞培养物；生物样品，例如生物材料样品(血、血清、尿、脑脊液、泪、痰、唾液、组织样品等)；实验室样品；食物、水或空气样品；生物制品样品，例如细胞提取物，特别是合成所需糖蛋白的重组细胞提取物等。典型而言，所述样品将被怀疑包含生产新冠病毒的生物，经常是病原生物，例如新冠病毒科。样品可被包含在任何介质中，包括水和有机溶剂/水混合物。样品包括活生物，例如人和人造的材料，例如细胞培养物。
本发明的处理步骤包括向所述样品中添加本发明的组合物，或它包括向所述样品中添加所述组合物的前体。添加步骤包括上面描述的任意施用方法。
如果需要，通过任何方法，包括直接和间接的检测抗新冠病毒活性的方法，可以观察在施用组合物后的新冠病毒的活性。检测新冠病毒活性的定量的、定性的和半定量方法全部被构思。典型地，应用上述筛选方法之一，然而，也可应用任何其它方法，例如观测活生物的生理性能。
具有抗新冠病毒的活性组合物的筛选：
本发明所述化合物适用于治疗或预防动物或人中的新冠病毒科感染。然而，在筛选能够抑制人新冠病毒科病毒的化合物的过程中，基于细胞的测定应为主要的筛选工具。
通过评价抗病毒活性的任意常规技术，针对具有抗新冠病毒活性的化合物的筛选本发明组合物。在本发明的上下文中，典型地，首先筛选具有抗新冠病毒的活性的组合物，然后筛选表现出抗病毒活性的组合物的体内活性。具有小于约5×10-6M且优选小于约1×10-7M的体外Ki(抑制常数)的组合物优选在体内使用。文献里已经详细描述了有用的体外筛选，这里不再赘述。但是，实施例描述了合适的体外测定。
药物制剂
本发明所述化合物用常规载体和赋形剂配制，它们将按照常规实践进行选择。尽管能够将活性成分单独施用，但是优选将它们制成药物制剂。本发明的制剂，无论是用于兽类还是人类应用，均包含至少一种如上定义的活性成分与用于其的一种或多种可接受的载体，且任选包含其它治疗成分，尤其是如本文公开的那些另外的治疗成分。载体必须是“可接受的”，其含义是与制剂中的其它组分相容，并且在生理上对其接受者而言无害。
制剂包括适合于上述施用途径的那些。可以将制剂便利地制成单位剂型，并且可以通过制药领域众所周知的任意方法制成制剂。技术和制剂一般可以在Remington'sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.,Easton,PA.)中找到。这类方法包括将活性成分与构成一种或多种辅助组分的载体混合的步骤。一般而言，如下制备制剂：通过均匀和紧密混合活性成分与液体载体或细分散固体载体或它们两者，且然后如果需要，使产物成形。
本发明进一步提供了兽用组合物，其包含至少一种如上定义的活性成分与用于此的兽用载体。
兽用载体为用于兽用组合物目的物质并且可以为固体、液体或气态物质，另外其为惰性的或兽药领域中可接受的且与活性成分相容。可以通过口服、肠胃外或通过任意其它所需途径施用这些兽用组合物。
施用途径：
本发明的一种或多种化合物(本文称为活性成分)通过适合于受治疗的病况的任何途径施用。合适的途径包括口服、直肠、鼻、肺、局部(包括口腔和舌下)和胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外)等。应当理解，优选的途径可随着例如接受者的病况而变化。本发明化合物的益处是：它们是口服生物可利用的且可以口服施用。
本发明化合物的代谢产物：
本文所述化合物的体内代谢产物也落在本发明的范围之内，其程度是，这样的产物相对于现有技术是新颖的且非显而易见的。这些产物可产生自，例如，施用的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等，主要是由于酶过程。因此，本发明包括通过以下方法生产的新颖的且非显而易见的化合物，该方法包括，使本发明化合物与哺乳动物接触足够产生其代谢产物的一段时间。此类产物典型如下鉴定：制备放射标记(例如14C或3H)的本发明化合物，将它以可检测的剂量(例如大于约0.5mg/kg)肠胃外地施用给动物，例如大鼠、小鼠、豚鼠、猴或人，允许发生代谢的足够时间(典型地，约30秒到30小时)，并从尿、血或其它生物样品中分离它的转化产物。由于它们被标记，这些产物很容易分离(其它是使用能结合残留在代谢产物中的表位的抗体来分离)。代谢产物的结构以常规方式测定，例如用MS或NMR分析。一般而言，代谢产物的分析以与本领域技术人员公知的常规药物代谢研究相同的方法进行。转化产物，条件是它们不以其它方式在体内被发现，即使它们自身不具有新冠病毒聚合酶抑制活性，也可用于本发明化合物的治疗给药的诊断测定。
用于测定化合物在替代胃肠分泌物中的稳定性的配方和方法是已知的。在本文中将化合物定义为在胃肠道中是稳定的，其中在37℃温育1小时后，少于约50摩尔百分比的受保护基团在肠或胃液的替代物中脱保护。不能仅仅因为化合物对胃肠道是稳定的，就认为它们在体内不会水解。本发明的前药典型地在消化系统中是稳定的，但是它们通常在消化腔、肝脏或其它代谢器官中或在细胞内基本上水解为母体药物。
另外需要指出，所述具有式I结构的化合物、其前药和/或其药学上可接受的盐类药物针对不同患者的特定使用剂量和使用方法决定于诸多因素，包括患者的年龄，体重，性别，自然健康状况，营养状况，药物的活性强度，服用时间，代谢速率，病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。活性成分的有效剂量至少取决于要治疗病症的性质、毒性(不管化合物是预防使用还是抵抗活性病毒感染)、递送的方法和药物制剂，且将通过临床医生使用常规剂量递增研究而决定。可以预期剂量为每天约0.0001到约100mg/kg体重；典型地，每天约0.01到约10mg/kg体重；更典型地，每天约0.01到约5mg/kg体重；最典型地，每天约0.05到约0.5mg/kg体重。例如，对于约70kg体重的成年人来说，每日候选剂量将在1mg到1000mg的范围内，优选为5mg到500mg，且可采取单剂量或多剂量的形式。
上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明中，一些化合物的缩写所表示的化合物结构：
在描述实验细节时，使用了某些缩写和缩略词。尽管它们中的大多数能被本领域技术人员所理解，但下表包含了这些缩写和缩略词的列表。
缩写 含义
ACN 乙腈
DCC 二环己基碳二亚胺
DCM 二氯甲烷
DMAP 4-二甲氨基吡啶
EA 乙酸乙酯
EDMA N,N-二甲基乙胺
MeOH 甲醇
PE 石油醚
rt 室温
TEA 三乙胺
THF 四氢呋喃
TLC 薄层色谱法
附图说明
图1示实施例35中化合物GS-441524，ATV003，ATV004，ATV019，ATV006，以及ATV020对SARS-CoV-2复制子在HEK293T细胞上的抑制效果。其中，横轴为药物浓度，单位为μM；纵轴为抑制率，单位为％。
图2示实施例36中化合物RDV、GS-441524、ATV006、ATV009、ATV010、ATV011、ATV013、ATV014、ATV017、ATV018在Vero-E6细胞中对SARS-CoV-2突变株B.1、SARS-CoV-2突变株B.1.351和SARS-CoV-2突变株B.1.617.2的抑制效果。其中，横轴为药物浓度，单位为μM；纵轴为抑制率，单位为％。
图3示实施例37和38中，ATV006与ATV014在大鼠内，以及ATV006在食蟹猴体内的药时曲线图，其中，横轴为时间，单位为小时，纵轴为血浆中药物浓度，单位为μg/L；A图和B图分别为实施例37中ATV006和ATV014在大鼠体内的药时曲线图；C图为实施例38中ATV006在食蟹猴体内的药时曲线图。
图4示实施例39中ATV006抗小鼠冠状病毒(MHV-A59)体内药效结果，其中，A图为病毒感染后各处理组小鼠体重变化，横轴为时间(单位为天数)，纵轴为小鼠体重(单位为克)；B图为各组小鼠的生存曲线，横轴为时间(单位为天数)，纵轴为生存率(单位为％)；C图为采用荧光定量PCR方法测定病毒感染后72小时小鼠肝脏病毒滴度，横轴为不同药物，纵轴为病毒量的对数函数。
图5示实施例40中，ATV006在小鼠体内抗新冠冠状病毒的药效结果。其中，A图为给药时间与体重测量计划图。B图纵轴为基因拷贝数，横轴为不同实验组，包括对照组，给药组500mg，与给药组250mg。C图纵轴为mRNA水平，横轴为不同实验组，包括对照组，给药组500mg，与给药组250mg。
图6示实施例40中，ATV006在小鼠体内抗新冠冠状病毒的变异毒株(B.1.617.2)的药效结果。其中，A图为给药时间与体重测量计划图。B图纵轴为基因拷贝数，横轴为不同实验组，包括对照组与给药组250mg。C图纵轴为mRNA水平，横轴为不同实验组，包括对照组与给药组250mg。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例以对本发明作进一步的详细说明。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
本发明中，μM表示微摩尔每升；mmol表示毫摩尔；equiv表示当量。
实施例1：(2R,3R,4R,5R)-2-氰基-2-(4-异丁酰胺吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-(甲酸异丁酯)四氢呋喃3,4-双(2-甲酸异丁酯)(化合物ATV001)的合成
取594mg(2mmol)的化合物GS-441524，50mg(0.4mmol,0.2equiv)4-二甲氨基吡啶,804mg(1.2mL,11mmol,5.5equiv)EDMA(N,N-二甲基乙胺)和1.58g(1.66mL,10mmol)异丁酸酐，混合，将得到的混合物与10mL乙腈混合，在40℃下搅拌1小时，旋转蒸发除去有机溶剂，得粗残渣，粗残渣用硅胶色谱进行洗脱(洗脱剂为：甲醇/二氯甲烷(V/V)＝5/95)，得到624mg化合物ATV001(无色粘稠状液体，产率61％)。取所得化合物ATV001检测氢谱、碳谱和高效液相色谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.33(s,1H),8.21(s,1H),7.34(d,J＝4.9Hz,1H),7.06(d,J＝4.9Hz,1H),6.23(d,J＝5.8Hz,1H),5.51(dd,J＝5.8,4.3Hz,1H),4.67(q,J＝4.0Hz,1H),4.41(qd,J＝12.3,3.9Hz,2H),3.19(dt,J＝13.4,6.7Hz,1H),2.74-2.62(m,2H),2.56(dq,J＝14.0,7.0Hz,1H),1.35-1.10(m,24H)。
碳谱：13C NMR(101MHz,CDCl3)δ177.46,176.45,175.76,174.98,151.38,145.87,123.21,118.26,114.91,113.27,106.29,81.60,76.86,71.97,70.54,62.56,36.01,33.85,33.84,33.74,19.13,19.11,18.91,18.85,18.81,18.70,18.67,18.54。
高效液相色谱：流动相为水/乙腈(V/V)＝10/90,流速为0.8mL/min,检测波长为254nm,化合物ATV001的保留时间为3.319min.
实施例2：(2R,3R,4R,5R)-2-(4-乙酰氨基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-(乙酰羟甲基酯)-2-氰基四氢呋喃-3,4-双醋酸酯(化合物ATV002)的合成
取594mg(2mmol)的化合物GS-441524，50mg(0.4mmol,0.2equiv)4-二甲氨基吡啶，804mg(1.2mL,11mmol,5.5equiv)EDMA(N,N-二甲基乙胺)和1.02g(1mL,10.6mmol)乙酸酐，混合，将得到的混合物与10mL乙腈混合，40℃搅拌30分钟；旋转蒸发除去有机溶剂，得粗残渣，粗残渣用硅胶色谱进行洗脱(洗脱剂为：甲醇/二氯甲烷(V/V)＝5/95)，得到518mg化合物ATV002(白色固体，产率56％)。取所得化合物ATV002检测氢谱、碳谱和高效液相色谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.16(s,1H),8.23(s,1H),7.21(d,J＝4.8Hz,1H),7.11(d,J＝4.8Hz,1H),6.25(d,J＝5.9Hz,1H),5.56-5.41(m,1H),4.65(dd,J＝8.5,4.7Hz,1H),4.47(dd,J＝12.3,3.6Hz,1H),4.34(dd,J＝12.3,4.9Hz,1H),2.63(s,3H),2.19(s,3H),2.17(s,3H),2.09(s,3H)。
碳谱：13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.03,170.43,169.84,169.03,151.01,146.16,122.96,117.82,114.85,114.01,103.74,81.00,77.21,71.79,70.60,62.58,26.12,20.76,20.53,20.51。
高效液相色谱：流动相为水/乙腈(V/V)＝10/90,流速为0.8mL/min,检测波长为254nm,化合物ATV002的保留时间为2.162min。
实施例3：(2R,3R,4R,5R)-5-(乙酰羟甲基酯)-2-(4-氨基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-2-氰基四氢呋喃-3,4-双醋酸酯(化合物ATV003)的合成
取594mg(2mmol)的化合物GS-441524，50mg(0.4mmol,0.2equiv)4-二甲氨基吡啶，804mg(1.2mL,11mmol,5.5equiv)EDMA(N,N-二甲基乙胺)和1.02g(1mL,10.6mmol)乙酸酐，混合，将得到的混合物与10mL乙腈混合，40℃搅拌30分钟；旋转蒸发除去有机溶剂，得粗残渣，粗残渣用硅胶色谱进行洗脱(洗脱剂为：甲醇/二氯甲烷(V/V)＝5/95)，得到384mg化合物ATV003(白色固体，产率46％)。取所得化合物ATV003检测氢谱、碳谱和高效液相色谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.94(s,1H),6.92(d,J＝4.6Hz,1H),6.61(d,J＝4.7Hz,1H),6.30(d,J＝5.9Hz,3H),5.61-5.43(m,1H),4.63(dd,J＝8.7,4.9Hz,1H),4.49(dd,J＝12.2,3.7Hz,1H),4.34(dd,J＝12.2,5.1Hz,1H),2.18(s,3H),2.16(s,3H),2.08(s,3H)。
碳谱：13C NMR(101MHz,CDCl3)δ170.55,169.91,169.16,155.54,147.39,121.63,117.23,115.28,112.61,100.23,80.85,77.48,71.90,70.67,62.67,20.77,20.55。
高效液相色谱：流动相为水/乙腈(V/V)＝10/90,流速为0.8mL/min,检测波长为254nm,化合物ATV003的保留时间为2.157min.
实施例4：(2R,3R,4R,5R)-2-(4-氨基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-2-氰基-5-(甲酸异丁酯)四氢呋喃-3,4-双(2-甲酸异丁酯)(化合物ATV004)的合成
取594mg(2mmol)的化合物GS-441524，50mg(0.4mmol,0.2equiv)4-二甲氨基吡啶,804mg(1.2mL,11mmol,5.5equiv)EDMA(N,N-二甲基乙胺)和1.58g(1.66mL,10mmol)异丁酸酐，混合，将得到的混合物与10mL乙腈混合，40℃搅拌1小时，旋转蒸发除去有机溶剂，得粗残渣，粗残渣用硅胶色谱进行洗脱(洗脱剂为：甲醇/二氯甲烷(V/V)＝5/95)，得到410mg化合物ATV004(无色粘稠状液体，产率35％)。取所得化合物ATV004检测氢谱、碳谱和高效液相色谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.89(s,1H),6.86(d,J＝4.7Hz,1H),6.70(d,J＝4.7Hz,1H),6.28(d,J＝5.9Hz,1H),5.53(dd,J＝5.7,4.4Hz,1H),4.65(q,J＝4.1Hz,1H),4.42(qd,J＝12.3,4.1Hz,2H),2.75-2.51(m,3H),1.32-1.10(m,18H)。
碳谱：13C NMR(101MHz,CDCl3)δ176.58,175.85,175.11,155.65,146.56,122.08,117.09,115.34,112.03,101.09,81.50,77.04,71.99,70.63,62.66,33.85,33.82,33.74,18.96,18.82,18.78,18.69,18.67,18.54。
高效液相色谱：流动相为水/乙腈(V/V)＝10/90,流速为0.8mL/min,检测波长为254nm,化合物ATV004的保留时间为2.767min.
实施例5.(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氨基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-6-(羟甲基-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]间二氧杂环戊烷基-4-甲腈(化合物5)的合成
将5.62g的化合物GS-441524溶于30mL丙酮中，再加入11.50mL的2,2-二甲氧基丙烷和1.34mL的98％的硫酸，45℃搅拌半小时，冷却至室温，旋转蒸发除去有机溶剂。用100mL的乙酸乙酯和100mL的饱和碳酸氢钠溶液萃取，重复萃取三次，合并乙酸乙酯层，加入无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠。旋转蒸发除去有机溶剂，经过柱层析分离(洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯(V/V)＝1/2)得到6.20g化合物5(白色固体，产率97％)。取所得化合物5检测氢谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.95(s,1H),7.11(d,J＝4.7Hz,1H),6.69(dd,J＝4.8,2.4Hz,1H),5.77(s,2H),5.42(d,J＝6.6Hz,1H),5.24(dd,J＝6.6,2.4Hz,1H),4.67(q,J＝1.9Hz,1H),3.99(dd,J＝12.5,1.9Hz,1H),3.84(dd,J＝12.5,1.7Hz,1H),1.81(s,3H),1.40(s,3H)。
实施例6：戊基(7-((2R,3R,4R,5R)-2-氰基-3,4-二(((戊氧基)羰基)氧)-5-((((戊氧基)羰基)氧)甲基)四氢呋喃-2-基)吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-4-基)氨基甲酸酯(化合物6)的合成
将化合物GS-441524(50mg,0.17mmol)溶于2.5mL的干燥二氯甲烷中，置换气，使体系充满氩气，随后加入吡啶(80.7mg,1.02mmol)，降温至0℃，逐滴加入氯甲酸正戊酯(107.5mg,0.71mmol)，再自然升到室温搅拌3小时，薄层色谱法监测化合物GS-441524反应完全后，旋转蒸发仪除去有机溶剂，硅胶柱层析(洗脱液为：正己烷/乙酸乙酯,(V/V)＝10:1)，得到71.7mg化合物6(无色液体，产率56％)。取得到的化合物6检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.00(s,1H),8.27(s,1H),7.39(d,J＝4.9Hz,1H),7.17(d,J＝5.0Hz,1H),6.12(d,J＝5.8Hz,1H),5.38(t,J＝5.9Hz,1H),4.69(q,J＝4.6Hz,1H),4.57(dd,J＝12.1,3.4Hz,1H),4.40(dd,J＝12.1,4.7Hz,1H),4.28(t,J＝6.8Hz,2H),4.23-4.07(m,6H),1.85-1.60(m,8H),1.36(ddp,J＝14.4,7.0,3.5Hz,16H),1.02-0.83(m,12H)。
碳谱：13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ154.8,154.0,153.5,151.7,151.5,146.0,122.7,117.7,114.2,114.1,107.0,79.9,77.3(d,J＝24.5Hz),74.6,72.8,69.5,69.2,68.7,66.9,65.1,28.3,28.2,28.1,28.1,27.8,27.7,27.6,27.6,22.2,13.9(d,J＝4.4Hz)。
实施例7：戊基(7-((2R,3R,4S,5R)-2-氰基-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-4-基)氨基甲酸酯(化合物ATV005)的合成
将化合物6(58.3mg,0.078mmol)溶于2mL的四氢呋喃中，加入氢氧化锂(18.7mg,0.78mmol)，随后加入20滴水，室温搅拌反应6小时，薄层色谱法监测化合物6反应完全后，旋转蒸发除去有机溶剂，硅胶柱层析(洗脱液为：3-10％甲醇于二氯甲烷)，得到32.7mgATV005(白色固体，产率82％)。取得到的ATV005检测氢谱、碳谱和高效液相色谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.20(s,1H),7.25(d,J＝4.7Hz,1H),7.15(d,J＝4.8Hz,1H),4.82(d,J＝7.4Hz,2H),4.26(t,J＝6.6Hz,3H),4.15(t,J＝5.5Hz,1H),3.87(dd,J＝12.4,3.1Hz,1H),3.74(dd,J＝12.4,4.4Hz,1H),1.82-1.69(m,2H),1.49-1.36(m,4H),0.95(t,J＝6.9Hz,3H)。
碳谱：13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ153.5,153.2,147.3,127.0,118.6,117.6,114.3,104.6,87.2,81.2,75.6,71.8,67.3,62.7,29.6,29.1,23.4,14.3。
高效液相色谱:流动相为水/乙腈(V/V)＝10/90,流速为0.8mL/min,检测波长为254nm,ATV005的保留时间为2.173min.
实施例8：((3aR,4R,6R,6aR)-6-(4-氨基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-6-氰基-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]间二氧杂环戊-4-基)甲基异丁酸酯(化合物7)的合成
将1.50g的化合物5溶于15ml的二氯甲烷中，再加入0.42mL异丁酸和55.40mg的4-二甲氨基吡啶，搅拌10min后，加入1.02g的二环己基碳二亚胺，室温搅拌24h。经过柱层析分离(洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯(V/V)＝1/1)，得到1.71g化合物7(白色固体，产率94％)。取得到的化合物7检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(400MHz,CDCl3,ZQF-RD01-2)δ(ppm):7.99(s,1H),6.99(d,J＝4.6Hz,1H),6.62(d,J＝4.6Hz,1H),5.72(br,2H),5.49(d,J＝6.8Hz,1H),4.93-4.90(dd,J＝6.8Hz,4.3Hz,1H),4.61-4.58(q,J＝4.4Hz,1H),4.44-4.26(m,2H),2.61-2.50(m,1H),1.77(s,3H),1.42(s,3H),1.17-1.14(q,J＝3.8Hz,6H)。
碳谱：13C NMR(100MHz,CDCl3,ZQF-RD01-2)δ(ppm):176.7,155.2,147.3,123.5,117.2,116.7,115.6,112.6,100.0,83.8,83.0,82.0,81.4,63.1,33.8,26.4,25.6,18.9。
实施例9.((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基异丁酸酯(化合物ATV006)的合成
将1.50g的化合物7溶于3mL质量百分比为37％的盐酸水溶液和15mL的四氢呋喃中，搅拌6小时后，加入碳酸钠调节pH至8，旋转蒸发除去有机溶剂，经过柱层析分离(洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯(V/V)＝1/3)，得到0.66g化合物ATV006(白色固体，产率49％)。取得到的化合物ATV006检测氢谱、碳谱和高效液相色谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.76(s,1H),6.78(s,2H),4.78(d,J＝5.3Hz,1H),4.40-4.24(m,2H),4.24-4.11(m,1H),4.10-4.01(m,1H),2.42(p,J＝7.0Hz,1H),0.99(dd,J＝7.0,4.1Hz,6H)。
碳谱：13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ176.96,155.82,146.92,124.25,116.54,116.29,110.75,101.20,82.04,80.00,74.27,70.68,62.93,33.58,25.00,17.95,17.87。
高效液相色谱：流动相为水/乙腈(V/V)＝10/90,流速为0.8mL/min,检测波长为254nm,化合物ATV006的保留时间为2.036min。
实施例10.((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4二羟基四氢呋喃-2-基)乙酸甲酯(化合物ATV007)的合成
将1.50g的化合物5溶于15ml的二氯甲烷中，再加入0.42mL乙酸和55.40mg的4-二甲氨基吡啶，搅拌10min后，加入1.02g的二环己基碳二亚胺，室温搅拌24h。经过柱层析分离(洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯(V/V)＝1/1)，得到1.78g化合物8(收率为98％)。
将1.50g的化合物8溶于3mL质量百分比为37％的盐酸水溶液和15mL的四氢呋喃中，搅拌6小时后，加入碳酸钠调节pH至8，旋转蒸发除去有机溶剂，经过柱层析分离(洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯(V/V)＝1/3)，得到0.68g化合物ATV007(白色固体，纯度98.7％，收率为51％)。取所得化合物ATV007检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,CD3OD)δ(ppm):7.86(s,1H),6.89(t,J＝5.0Hz,2H),4.87(s,1H),4.43-4.41(dd,J＝12Hz,2.8Hz,1H),4.37-4.34(m,1H),4.30-4.27(m,1H),4.13(t,J＝5.7Hz,1H),2.03(s,3H).
碳谱：13C NMR(150MHz,CD3OD)δ(ppm):171.0,155.8,146.9,124.2,116.6,116.2,110.7,101.1,81.9,80.2,74.1,70.7,63.1,19.3.
实施例11.((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4二羟基四氢呋喃-2-基)丙酸甲酯(化合物ATV008)的合成
将1.50g的化合物5溶于15ml的二氯甲烷中，再加入0.42mL丙酸和55.40mg的4-二甲氨基吡啶，搅拌10min后，加入1.02g的二环己基碳二亚胺，室温搅拌24h。经过柱层析分离(洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯(V/V)＝1/1)，得到1.74g化合物9(收率为99％)。
将1.50g的化合物9溶于3mL质量百分比为37％的盐酸水溶液和15mL的四氢呋喃中，搅拌6小时后，加入碳酸钠调节pH至8，旋转蒸发除去有机溶剂，经过柱层析分离(洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯(V/V)＝1/3)，得到0.68g化合物ATV008(白色固体，纯度98％，收率为48％)。取所得化合物ATV008检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,CD3OD)δ(ppm):7.86(s,1H),6.90-6.88(q,J＝4.5Hz,2H),4.87-4.86(m,1H),4.46-4.43(dd,J＝12Hz,2.8Hz,1H),4.37-4.36(m,1H),4.31-4.28(m,1H),4.15(t,J＝5.8Hz,1H),2.38-2.28(m,2H),1.08(t,J＝7.5Hz,3H).
碳谱：13C NMR(150MHz,CD3OD)δ(ppm):174.3,155.8,146.9,124.2,116.5,116.2,110.7,101.1,82.0,80.1,74.2,70.7,62.9,26.7,7.9.
实施例12.((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4二羟基四氢呋喃-2-基)丁酸甲酯(化合物ATV009)的合成
将1.50g的化合物5溶于15ml的二氯甲烷中，再加入0.42mL正丁酸和55.40mg的4-二甲氨基吡啶，搅拌10min后，加入1.02g的二环己基碳二亚胺，室温搅拌24h。经过柱层析分离(洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯(V/V)＝1/1)，得到1.78g化合物10(收率为98％)。
将1.50g的化合物10溶于3mL质量百分比为37％的盐酸水溶液和15mL的四氢呋喃中，搅拌6小时后，加入碳酸钠调节pH至8，旋转蒸发除去有机溶剂，经过柱层析分离(洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯(V/V)＝1/3)，得到0.76g化合物ATV009(白色固体，纯度97％，收率为56％)。取所得化合物ATV009检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,CD3OD)δ(ppm):7.86(s,1H),6.90-6.88(q,J＝4.5Hz,2H),4.87-4.86(m,1H),4.44-4.42(dd,J＝12Hz,2.8Hz,1H),4.37-4.35(m,1H),4.31-4.28(m,1H),4.14(t,J＝5.8Hz,1H),2.32-2.23(m,2H),1.62-1.56(m,2H),0.91(t,J＝7.4Hz,3H).
碳谱：13C NMR(150MHz,CD3OD)δ(ppm):174.3,155.9,146.9,124.3,116.5,116.2,110.7,101.1,82.0,80.1,74.2,70.7,62.8,35.4,17.9,12.5.
实施例13.((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4二羟基四氢呋喃-2-基)壬酸甲酯(化合物ATV010)的合成
将1.50g的化合物5溶于15ml的二氯甲烷中，再加入0.42mL壬酸和55.40mg的4-二甲氨基吡啶，搅拌10min后，加入1.02g的二环己基碳二亚胺，室温搅拌24h。经过柱层析分离(洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯(V/V)＝1/1)，得到2.07g化合物11(收率为97％)。
将1.50g的化合物11溶于3mL质量百分比为37％的盐酸水溶液和15mL的四氢呋喃中，搅拌6小时后，加入碳酸钠调节pH至8，旋转蒸发除去有机溶剂，经过柱层析分离(洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯(V/V)＝1/3)，得到0.55g化合物ATV010(白色固体，纯度98％，收率为40.3％)。取所得化合物ATV010检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,CD3OD)δ(ppm):7.86(s,1H),6.90-6.88(q,J＝4.5Hz,2H),4.87-4.86(m,1H),4.43-4.41(dd,J＝12Hz,2.8Hz,1H),4.37-4.35(m,1H),4.32-4.29(m,1H),4.14(t,J＝5.8Hz,1H),2.38-2.23(m,2H),1.56-1.53(m,2H),1.29-1.27(m,10H),0.87(t,J＝7.0Hz,3H).
碳谱：13C NMR(150MHz,CD3OD)δ(ppm):173.7,155.9,146.9,124.3,116.5,116.2,110.7,101.1,82.0,74.2,70.7,62.8,33.5,31.5,28.8,28.7,24.6,22.3.
实施例14.((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4二羟基四氢呋喃-2-2-乙基丁酸甲酯(化合物ATV011)的合成
将1.50g的化合物5溶于15ml的二氯甲烷中，再加入0.42mL2-乙基丁酸和55.40mg的4-二甲氨基吡啶，搅拌10min后，加入1.02g的二环己基碳二亚胺，室温搅拌24h。经过柱层析分离(洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯(V/V)＝1/1)，得到1.94g化合物12(收率为99％)。
将1.50g的化合物12溶于3mL质量百分比为37％的盐酸水溶液和15mL的四氢呋喃中，搅拌6小时后，加入碳酸钠调节pH至8，旋转蒸发除去有机溶剂，经过柱层析分离(洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯(V/V)＝1/3)，得到0.70g化合物ATV011(白色固体，纯度98.3％，收率为51.3％)。取所得化合物ATV011，检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,CD3OD)δ(ppm):7.86(s,1H),6.89(s,2H),4.87-4.86(m,1H),4.39-4.43(dd,J＝12Hz,2.8Hz,1H),4.37-4.35(m,1H),4.14(t,J＝5.8Hz,1H),2.38-2.22(m,1H),1.60-1.45(m,4H),0.86-0.82(m,6H).
碳谱：13C NMR(150MHz,CD3OD)δ(ppm):176.1,155.9,146.9,124.3,116.6,116.2,110.7,101.1,81.9,79.9,74.2,70.7,62.8,48.9,24.7,24.6.10.7,10.6.
实施例15.((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4二羟基四氢呋喃-2-环丙烷甲酸甲酯(化合物ATV012)的合成
将1.50g的化合物5溶于15ml的二氯甲烷中，再加入0.42mL环丙甲酸和55.40mg的4-二甲氨基吡啶，搅拌10min后，加入1.02g的二环己基碳二亚胺，室温搅拌24h。经过柱层析分离(洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯(V/V)＝1/1)，得到1.52g化合物13(收率为99％)。
将1.50g的化合物13溶于3mL质量百分比为37％的盐酸水溶液和15mL的四氢呋喃中，搅拌6小时后，加入碳酸钠调节pH至8，旋转蒸发除去有机溶剂，经过柱层析分离(洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯(V/V)＝1/3)，得到0.98g化合物ATV012(白色固体，纯度97％，收率为62％)。取所得化合物ATV012，检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,CD3OD)δ(ppm):7.86(s,1H),6.89(t,J＝4.5Hz,2H),4.87-4.86(m,1H),4.46-4.44(dd,J＝12Hz,2.8Hz,1H),4.36-4.34(m,1H),4.29-4.26(m,1H),4.15(t,J＝5.8Hz,1H),1.64-1.60(m,1H),0.92-0.87(m,4H).
碳谱：13C NMR(150MHz,CD3OD)δ(ppm):174.9,155.9,146.9,124.2,116.6,116.2,110.7,101.1,80.2,80.1,74.2,70.6,63.0,12.1,7.5,7.4.
实施例16.(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)苯甲酸甲酯的合成(化合物ATV013)
根据实施例8和实施例9所述方法，并将异丁酸更换为苯甲酸，合成化合物ATV013共0.21g白色固体,两步总收率为34.9％。取得到的化合物ATV013检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.92(br,2H),7.90(d,J＝7.4Hz,2H),7.86(s,1H),7.68(t,J＝7.4Hz,1H),7.52(t,J＝7.7Hz,2H),6.87(d,J＝4.5Hz,1H),6.81(d,J＝4.5Hz,1H),6.36(d,J＝5.9Hz,1H),5.46(d,J＝5.9Hz,1H),4.79(t,J＝5.3Hz,1H),4.61-4.58(dd,J＝12.2Hz,2.6Hz,1H),4.45-4.42(dd,J＝12.3Hz,4.8Hz,1H),4.39-4.37(m,1H),4.14-4.10(m,1H).
碳谱：13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ(ppm):166.0,156.1,148.4,134.0,129.8,129.7,129.2,123.9,117.4,117.1,110.8,101.3,81.7,79.7,74.5,70.6,63.9.
实施例17.(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基环己烷甲酸酯的合成(化合物ATV014)
根据实施例8和实施例9所述方法，并将异丁酸更换为环己基甲酸，合成化合物ATV014共0.28g白色固体,两步总收率为45.8％。取得到的化合物ATV014检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.92(s,1H),7.86(br,1H),6.92(d,J＝4.5Hz,1H),6.81(d,J＝4.5Hz,1H),6.33(d,J＝5.9Hz,1H),5.38(d,J＝5.9Hz,1H),4.70(t,J＝5.3Hz,1H),4.32-4.29(dd,J＝12.2Hz,2.6Hz,1H),4.24-4.21(m,1H),4.16-4.13(dd,J＝12.3Hz,4.8Hz,1H),3.98-3.95(q,J＝5.9Hz,1H),2.26-2.22(m,1H),1.75-1.72(m,2H),1.64-1.56(m,3H),1.30-1.12(m,5H).
碳谱：13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ(ppm):175.34,156.06,148.4,124.0,117.4,117.0,110.7,101.2,81.7,79.4,74.5,70.6,63.0,42.6,29.0,28.9,25.7,25.2,25.1.
实施例18.(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基环戊烷羧酸酯的合成(化合物ATV015)
根据实施例8和实施例9所述方法，并将异丁酸更换为环戊基甲酸，合成化合物ATV015共0.33g白色固体,两步总收率为56.1％。取得到的化合物ATV015检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,CD3OD)δ(ppm):7.86(s,1H),6.90-6.87(q,J＝4.6Hz,2H),4.85-4.83(m,1H),4.39-4.43(dd,J＝12.1Hz,3.1Hz,1H),4.37-4.35(m,1H),4.14(t,J＝5.7Hz,1H),2.75-2.70(m,1H),1.87-1.80(m,2H),1.75-1.53(m,6H).
碳谱：13C NMR(150MHz,CD3OD)δ(ppm):176.5,155.9,146.9,124.3,116.5,116.2,110.7,101.1,82.0,80.0,74.3,70.7,62.8,43.5,29.5,29.4,25.3.
实施例19.(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)3,3,3-三氟丙酸甲酯的合成(化合物ATV016)
根据实施例8和实施例9所述方法，并将异丁酸更换为三氟丙酸，合成化合物ATV016共0.31g白色固体,两步总收率为50.8％。取得到的化合物ATV016检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,CD3OD)δ(ppm):7.86(s,1H),6.90-6.88(q,J＝4.6Hz,2H),4.89(d,J＝5.3Hz,1H),4.54-4.50(m,1H),4.42-4.38(m,2H),4.15(t,J＝5.7Hz,1H),3.45-3.35(m,2H).
碳谱：13C NMR(150MHz,CD3OD)δ(ppm):164.3(J＝4.0Hz),155.5,146.9,123.8(q,J＝273.6Hz),124.1,116.6,116.2,110.8,101.2,81.7,80.2,74.0,70.6,64.1.
实施例20.(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-3-甲基丁酸-2-基)甲酯的合成(化合物ATV017)
根据实施例8和实施例9所述方法，并将异丁酸更换为异戊酸，合成化合物ATV017共00.27g白色固体,两步总收率为47.2％。取得到的化合物ATV017检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,CD3OD)δ(ppm):7.86(s,1H),6.90-6.88(q,J＝4.6Hz,2H),4.87(d,J＝5.3Hz,1H),4.43-4.40(m,1H),4.39-4.35(m,2H),4.31-4.29(m,1H),4.14(t,J＝5.7Hz,1H),2.18-2.16(m,2H),2.04-1.97(m,1H),0.91-0.90(q,J＝3.2Hz,6H).
碳谱：13C NMR(150MHz,CD3OD)δ(ppm):155.9,146.9,124.3,116.5,116.2,110.7,101.1,82.0,80.0,74.2,70.7,70.6,62.8,62.7,42.6,25.4,21.3,21.2.
实施例21.(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-新戊酸-2-基酯的合成(化合物ATV018)
根据实施例8和实施例9所述方法，并将异丁酸更换为新戊酸，合成化合物ATV018共0.22g白色固体,两步总收率为38.4％。取得到的化合物ATV018检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,CD3OD)δ(ppm):7.86(s,1H),6.89-6.87(q,J＝4.6Hz,2H),4.86(d,J＝5.3Hz,1H),4.39-4.36(m,2H),4.32-4.29(m,1H),4.16(t,J＝5.6Hz,1H),1.15(s,9H).
碳谱：13C NMR(150MHz,CD3OD)δ(ppm):155.9,146.9,124.3,116.6,116.2,110.7,101.1,82.0,79.9,74.2,70.6,63.0,38.5,26.1.
实施例22.((3aR,4R,6R,6aR)-6-(4-氨基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-6-氰基-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]间二氧杂环戊-4-基)甲基(叔丁酯基)-D-缬氨酸酯(化合物7)的合成
将1.80g的化合物5溶于15mL的二氯甲烷中，随后加入1.18g(D)-Boc-缬氨酸，再加入66.48mg 4-二甲氨基吡啶，搅拌10min后，加入1.22g二环己基碳二亚胺，室温搅拌24h。经过柱层析分离(洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯(V/V)＝1/1)，得到2.81g化合物14(白色固体，产率97％)。取得到的化合物14检测氢谱、碳谱和高效液相色谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ7.79(s,1H),6.79(s,2H),5.39(s,1H),4.90(dd,J＝6.5,3.4Hz,1H),4.51(q,J＝4.1Hz,1H),4.29(dd,J＝12.0,3.8Hz,1H),4.24(dd,J＝12.1,5.2Hz,1H),3.77(d,J＝6.0Hz,1H),3.27-3.11(m,1H),1.61(s,4H),1.32(d,J＝2.5Hz,9H),1.24(s,3H),0.73(dd,J＝19.0,6.8Hz,6H)。
碳谱：13C NMR(151MHz,MeOD)δ172.00,156.84,155.83,147.06,123.47,116.84,116.25,115.65,110.76,101.11,84.49,82.89,82.02,81.17,79.18,63.54,59.24,53.42,48.04,47.91,47.90,47.84,47.76,47.62,47.56,47.48,47.33,47.19,33.37,30.06,27.32,25.35,25.14,24.66,24.14,18.14,16.90。
高效液相色谱：流动相为水/乙腈(V/V)＝10/90,流速为0.8mL/min,检测波长为254nm,化合物14的保留时间为3.293min。
实施例23.((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基D-缬氨酸酯(化合物ATV019)。
将2.50g的化合物14溶于3mL质量百分比为37％的盐酸水溶液和15mL的四氢呋喃中，搅拌6小时后，加入碳酸钠调pH至8，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，经过柱层析分离(洗脱剂为：甲醇/乙酸乙酯(V/V)＝1:20)，得到0.99g化合物ATV019(白色固体，产率54％)。取得到的化合物ATV019检测氢谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.76(s,1H),6.80(s,2H),4.79(s,1H),4.42-4.24(m,3H),4.08(d,J＝5.5Hz,1H),3.23(d,J＝11.1Hz,1H),1.90-1.76(m,1H),0.82(d,J＝6.9Hz,3H),0.74(d,J＝6.9Hz,3H)。
实施例24.((3aR,4R,6R,6aR)-6-(4-氨基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-6-氰基-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]间二氧杂环戊-4-基)甲基(叔丁酯基)-L-缬氨酸酯(化合物6)的合成
将1.50g的化合物5溶于15ml的二氯甲烷中，随后加入0.98g(L)-Boc-缬氨酸，再加入55.40mg的4-二甲氨基吡啶，搅拌10min后，加入1.02g的二环己基碳二亚胺，室温搅拌24h。经过柱层析分离(洗脱液为：石油醚/乙酸乙酯(V/V)＝1/1)，得到2.28g化合物15(白色固体，产率95％)。
实施例25：((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基L-缬氨酸酯(化合物ATV020)的合成
将2.28g的化合物15溶于3mL质量百分比为37％的盐酸水溶液和15mL的四氢呋喃中，搅拌6小时，加入碳酸钠调节pH至8，旋转蒸发除去有机溶剂，经过柱层析分离(洗脱剂为：甲醇/乙酸乙酯(V/V)＝1:20)，得到0.85g化合物ATV020(白色固体，产率50％)。取得到的化合物ATV020检测氢谱、碳谱和高效液相色谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ7.76(s,1H),6.80(d,J＝1.6Hz,2H),4.81(d,J＝5.3Hz,1H),4.42-4.26(m,3H),4.04(t,J＝5.8Hz,1H),3.25(d,J＝4.9Hz,1H),1.97-1.84(m,1H),0.83(d,J＝6.9Hz,3H),0.79(d,J＝6.9Hz,3H)。
碳谱：13C NMR(151MHz,MeOD)δ173.76,155.85,146.93,124.12,116.62,116.21,110.86,101.11,81.75,80.16,74.04,70.76,63.66,59.27,31.62,17.75,16.46。
高效液相色谱：流动相为水/乙腈(V/V)＝10/90,流速为0.8mL/min,检测波长为254nm,化合物ATV020的保留时间为2.594min。
实施例26：(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-L-苯丙氨酸甲酯的(化合物ATV021)合成
根据实施例22和实施例23所述方法，并将(D)-Boc-缬氨酸更换为N-Boc-L-苯丙氨酸，合成化合物ATV021共0.1g白色固体，两步总收率为16.9％。取得到的化合物ATV021检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.96(br,1H),7.95(s,1H),7.87(br,1H),7.21-7.13(m,5H),6.93(d,J＝4.5Hz,1H),6.81(d,J＝4.5Hz,1H),6.33(d,J＝6.2Hz,1H),5.36(br,1H),4.70(t,J＝5.0Hz,1H),4.28-4.24(m,2H),4.19-4.16(m,1H),3.88(t,J＝5.5Hz,1H),3.57(t,J＝6.7Hz,1H),2.84-2.73(m,2H),1.85(br,2H).
碳谱：13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ(ppm):174.5,155.4,147.8,137.5,129.0,127.9,126.1,123.4,116.8,116.4,110.1,100.7,81.1,78.9,73.8,70.0,63.1,55.6,40.4.
实施例27：(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-D-苯丙氨酸甲酯的(化合物ATV022)合成
根据实施例22和实施例23所述方法，并将(D)-Boc-缬氨酸更换为N-Boc-D-苯丙氨酸，合成化合物ATV022共0.1g白色固体,两步收率为15.3％。取得到的化合物ATV022检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.92(s,1H),7.85(br,1H),7.25-7.14(m,5H),6.90(d,J＝4.5Hz,1H),6.80(d,J＝4.5Hz,1H),6.33(d,J＝5.9Hz,1H),5.39(d,J＝5.6Hz,1H),4.71(t,J＝5.3Hz,1H),4.25-4.17(m,3H),3.95-3.94(m,1H),3.56(t,J＝6.7Hz,1H),2.86-2.71(m,2H),1.75(br,2H).
碳谱：13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ(ppm):175.2,156.1,148.4,138.2,129.7,128.6,126.8,124.0,117.4,117.1,110.8,101.3,81.7,79.5,74.5,70.7,63.9,56.1.
实施例28：(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-L-异亮氨酸甲酯的(化合物ATV023)合成
根据实施例22和实施例23所述方法，并将(D)-Boc-缬氨酸更换为N-Boc-L-异亮氨酸，合成化合物ATV023共0.06g白色固体,两步收率为10.2％。取得到的化合物ATV023检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.95(br,1H),7.92(s,1H),7.87(br,1H),6.92(d,J＝5.8Hz,1H),6.83(d,J＝5.8Hz,1H),6.35(br,1H),5.40(br,1H),4.73(d,J＝4.6Hz,1H),4.29-4.24(m,3H),3.96(t,J＝5.0Hz,1H),3.18(d,J＝4.2Hz,1H),1.53-1.51(m,1H),1.39-1.32(m,1H),1.11-1.04(m,1H),0.80-0.74(m,6H).
碳谱：13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ(ppm):175.6,156.1,148.4,124.0,117.4,117.0,110.8,101.3,81.6,79.5,74.5,70.7,63.5,59.1,39.1,24.6,16.0,11.8.
实施例29：(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-D-异亮氨酸甲酯的(化合物ATV024)合成
根据实施例22和实施例23所述方法，并将(D)-Boc-缬氨酸更换为N-Boc-D-异亮氨酸，合成化合物ATV024共0.06g白色固体,两步收率为9.1％。取得到的化合物ATV024检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.92(s,1H),7.86(br,2H),6.92(d,J＝5.8Hz,1H),6.83(d,J＝5.8Hz,1H),6.33(d,J＝4.7Hz,1H),5.39(br,1H),4.71(br,1H),4.30-4.19(m,3H),3.97(t,J＝5.1Hz,1H),3.15(d,J＝5.3Hz,1H),1.53-1.50(m,1H),1.39-1.34(m,1H),1.11-1.04(m,1H),0.80-0.75(m,6H).
碳谱：13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ(ppm):175.6,156.1,148.4,124.0,117.4,117.1,110.8,101.3,81.7,79.5,74.5,70.8,63.8,59.1,39.0,24.6,16.1,11.8.
实施例30.((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-5氟吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4二羟基四氢呋喃-2-基)甲基异丁酸酯(化合物ATV025)的合成
取ATV006(1g,2.77mmol)，Selectfluor(1-氯甲基-4-氟-1,4-重氮化二环2.2.2辛烷双(四氟硼酸)盐，1.4g,5.5mmol)和DMAP(0.34g,2.77mmol)，加入20ml乙腈-水(v/v＝9:1)的混合溶剂，室温搅拌24h，TLC监测(流动相为：DCM：MeOH＝10:1)，至ATV006基本反应完全，减压蒸馏去除乙腈，再加入水和乙酸乙酯，搅拌分出有机层，水层用乙酸乙酯萃取两次，合并有机层，合并的有机相依次用饱和碳酸钠溶液，饱和氯化钠溶液洗涤，再用无水硫酸钠干燥，抽滤蒸干，得到黑红色油状物，柱层析(DCM:MeOH＝50:1)分离纯化得到100mg近白色固体，收率为9.5％。取得到的化合物ATV025检测氢谱和碳谱，结果如下：
氢谱：1H NMR(600MHz,CD3OD)δ(ppm):7.79(s,1H),6.65(s,1H),4.79(d,J＝5.0Hz,1H),4.40-4.30(m,3H),4.09(t,J＝5.6Hz,1H),2.59-2.54(m,1H),1.14-1.13(m,6H).
碳谱：13C NMR(150MHz,CD3OD)δ(ppm):176.9,154.5,147.6,144.0,142.3,121.0,115.7,102.7,102.5,97.0,96.9,81.9,79.6,74.5,70.5,62.7,33.7,17.9,17.8.19F NMR(600MHz,CD3OD)δ(ppm):-160.8.
实施例31：((3aR,4R,6R,6aR)-6-(4-氨基-5-碘吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-6-氰基-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]间二氧杂环戊-4-基)甲基异丁酸酯(化合物16)的合成
取化合物7(0.5g，1.2mmol)和N-碘代琥珀酰亚胺(0.28g，1.2mmol)与二氯甲烷(10mL)混合，25℃搅拌，减压除去溶剂，残余物经柱层析(洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚＝1/2(V/V))纯化，得到化合物16(红色固体，350mg，收率53.3％)。
实施例32：((3aR,4R,6R,6aR)-6-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基-5-氘)-6-氰基-2,2-二甲基四氢呋喃[3,4-d][1,3]间二氧杂环戊-4-基)甲基异丁酸酯(化合物17)的合成
在氩气的条件下向含化合物16(200mg,0.38mmol)和碳酸铯(247mg,0.76mmol)的D2O-DMSO-d6(10mL,D2O:DMSO＝1:9(V/V))溶液中加入PdCl2(dppf)2(32mg,0.04mmol)，80℃搅拌反应10小时，冷却至25℃并缓慢倒入水(10mL)中，再用乙酸乙酯(30mL×2)萃取，合并有机相层，用水洗涤合并的有机相层并真空浓缩，得红色油状物，红色油状物通过柱色谱法(洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚＝1/2(V/V))纯化，得到化合物17(淡红色油状，68mg，收率44.7％)。
实施例33：((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基-5-氘)-5-氰基-3,4二羟基四氢呋喃-2-基)甲基异丁酸酯(化合物ATV026)的合成
将化合物17(68mg，0.17mmol)溶解在6mol/L盐酸水溶液(1mL)和四氢呋喃(1.5mL)的混合溶液中，0-5℃搅拌7小时，用Na2CO3将pH调至8，真空除去溶剂，通过硅胶柱色谱法(洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚＝1/1(V/V))纯化残余物，得化合物ATV026(灰白色固体，38mg，收率61.7％)。
实施例34：化合物对SARS-CoV复制子在HEK293T细胞上的抑制效果
在24孔板中接种HEK293T细胞，待细胞生长至40—50％密度时，通过LIPO2000转染SARS复制子质粒250ng，转染6-8h后，弃去细胞上清液，更换新鲜的DMEM培养基，分别加入表1所述各化合物至各化合物的终浓度为50μM、10μM、5μM、2μM、1μM、0.1μM或0.01μM，待转染60h后，弃去细胞上清液，用TRIZOL收取细胞RNA，通过提取总RNA并通过逆转录酶得到cDNA，最后通过荧光定量PCR检测cDNA中内参基因Gapdh和SARS N基因亚基因组来反应SARS复制子中病毒复制情况，计算出不同浓度药物对病毒的抑制效果，并算出药物的IC50，不同化合物对SARS复制子在HEK293T细胞上的抑制效果如表1所示。
表1：化合物对SARS复制子在HEK293T细胞上的抑制效果。
*化合物测试浓度为5μM
结论：由上述实施例27所得实验结果可知：
1)测试化合物在HEK293T细胞中均不同程度抑制SARS-CoV的复制。其中ATV001,ATV002的病毒抑制活性对比母核GS-441524明显下降，而ATV004,ATV009,ATV010,ATV011等化合物的活性得到提高，这表明化合物对病毒的抑制活性并非显而易见，C5位羟基的简单酯单取代对病毒抑制活性有明显提升作用。
实施例35：化合物对SARS-CoV-2复制子在HEK293T细胞上的抑制效果
取化合物GS-441524、ATV001、ATV002、ATV003、ATV004、ATV005、ATV006、ATV007、ATV008、ATV009、ATV010、ATV011、ATV012、ATV013、ATV014、ATV015、ATV016、ATV017、ATV018、ATV019、ATV020、ATV021、ATV022、ATV023、ATV024、ATV025或瑞德西韦中间体5作为待测化合物，分别按以下步骤进行操作：
在24孔板中接种HEK293T细胞，待细胞生长至40-50％密度时，通过LIPO2000(脂质体2000)转染SARS-CoV-2复制子质粒250ng，转染6-8h后，弃去细胞上清液，更换新鲜的DMEM培养基，分别加入待测化合物至终浓度为50μM、10μM、5μM、2μM、1μM、0.1μM或0.01μM，待转染60h后，弃去细胞上清液，用TRIZOL收取细胞RNA，通过提取总RNA并通过逆转录酶得到cDNA，最后通过荧光定量PCR检测cDNA中内参基因Gapdh和SARS-CoV-2N基因亚基因组来反应SARS-CoV-2复制子中病毒复制情况，计算出不同浓度药物对病毒的抑制效果，并算出药物的IC50，结果如表2所示。
表2：化合物对SARS-CoV-2复制子在HEK293T细胞上的抑制效果
结论：测试化合物在HEK293T细胞中均不同程度地抑制SARS-CoV-2的复制。其中ATV006的活性为化合物GS-441524活性的两倍，活性显著提高。不同化合物对SARS-CoV-2复制子在HEK293T细胞上的抑制效果见图1以及表2所示。
实施例36：化合物对Vero-E6细胞中SARS-CoV-2的抑制作用
分别取化合物RDV、GS-441524、ATV006、ATV009、ATV010、ATV011、ATV013、ATV014、ATV017、ATV018作为供试化合物，按如下步骤进行操作：
将Vero-E6细胞接种于48孔板中。当细胞密度约为70-80％时，弃上清液，更换为新鲜的DMEM培养基，然后将每种化合物分别加入培养基中，使化合物的终浓度为50μM、10μM、5μM、2μM、1μM，0.5μM、0.25μM、0.1μM或0.01μM。细胞以0.05的感染复数(MOI)感染三种SARS-CoV-2突变体(B.1、B.1.351和B.1.617.2)。通过定量实时聚合酶链反应评估抗病毒活性(qRT-PCR)定量感染48小时后上清液中的病毒拷贝数。我们计算了不同浓度的受试药物对病毒复制的抑制作用，并计算了它们的IC50值。Vero-E6细胞中不同化合物对SARS-CoV-2的IC50见图2和表3。
表3：不同化合物对Vero-E6细胞中SARS-CoV-2的抑制作用
实施例37：化合物ATV006、ATV014和GS-441524在大鼠体内的代谢
1、各组别给药量及给药方式：
ATV006静注组：每kg小鼠体重静脉注射5mg的ATV006。
ATV006口服组：每kg小鼠体重灌胃25mg的ATV006。
ATV014静注组：每kg小鼠体重静脉注射5mg的ATV014。
ATV014口服组：每kg小鼠体重灌胃25mg的ATV014。
GS-441524静注组：每kg小鼠体重静脉注射5mg的GS-441524。
GS-441524口服组：每kg小鼠体重灌胃25mg的GS-441524。
2、操作：
16只体重为220g～250g的SD大鼠(雄性)，分为4组，分别为ATV006静注组、ATV006口服组，ATV014静注组、ATV014口服组，GS-441524静注组，GS-441524口服组，每组各4只(ATV014每组各3只)，分别按“1、各组别给药量及给药方式”中所述进行给药。颈静脉采血。分别在给药后0.083h(口服组不采)、0.16h(口服组不采)、0.25h、0.5h、1h(静注组不采)、2h、4h、8h、24h、48h的采集血液约0.3mL至肝素管中，于4℃以4000r/min转速离心10min，取上层血浆转移置冰箱冷冻(约﹣20℃)暂时保存至测定。取50μL血浆样品，加入90％甲醇水溶液100μL，旋涡混匀；然后加入甲醇乙腈混合溶液(1:1，V/V)350μL，旋涡混匀；10000rpm离心10min，取上清液经0.22μm滤膜过滤后进样检测；静脉给药后的0.5小时和口服后的4小时内的血样进行10倍稀释后进样检测。采用高效液相色谱(HPLC)/质谱(MS)法测定各样品中的药物浓度。采用Waters UPLC/XEVO TQ-S色谱柱，InertSustain AQ-C18HP柱(3.0mm×50mm,3.0μm,GL)分离分析物。采用DAS(Drug and Statistics)3.0软件计算药代动力学参数。
结果：见表4、表5、表6和图3中A图及B图。
表4：SD大鼠给予ATV006后的药代参数(检测GS-441524，均数±标准差，n＝4)
表5：SD大鼠给予ATV014后的药代参数(检测GS-441524，均数±标准差，n＝3)
表6：SD大鼠给予GS-441524后的药代参数(均数±标准差，n＝4)
结论：
由表4、表5、表6和图3中A图及B图可知，SD大鼠经口灌胃给予ATV006溶液后，口服生物利用度分别为79.59％(以代谢产物GS-441524计算)，ATV014的口服生物利用度为49.08％，GS-441524的口服生物利用度为22.63％，表明ATV006和ATV014与GS-441524相比，其口服生物利用度显著提高，有更好的口服成药性。
实施例38：化合物ATV006在食蟹猴体内的代谢
取3只体重为3-5kg的食蟹猴(3-5岁，雄性)，第一天灌胃单次给药10mg/kg的化合物ATV006,第五天静脉注射单次给药5mg/kg的化合物ATV006。采用一次性注射器刺入颈静脉方式以适当速度采血。分别在给药前0h，给药后即刻(5min)、15min、30min、1h、2h、4h、8h、24h和48h采集血液约1mL/每份，用抗凝剂EDTA-K2处理所采集的血液，在4℃下2000g离心10min，取上层血浆约400μL/每份或最大可能收集量，转移置超低温冰箱冷冻(约﹣65℃)暂时保存至测定。采用LCMS系统和Watson LIMS 7.5SP1的分析方法对所有给药组采集到的血浆样品及对照组给药前和给药后即刻5min样品进行分析。微软Excel 2013WinNonlin 6.3(WNL-01)统计软件计算药代动力学参数。
结果：见表7与图3中C图。
表7.化合物ATV006在食蟹猴体内的代谢数据(灌胃与注射给药)
结论：如表7及图3中C图所示，ATV006在食蟹猴中灌胃给药或静脉注射给药后迅速代谢为活性产物GS-441524，灌胃给药的口服生物利用度为30％(以活性产物GS-441524计算),与NIH OpeData Portal报道的GS-441524在食蟹猴中药代数据(F＝8.3％)相比，口服生物利用度明显提高。
实施例39：化合物ATV006抗小鼠冠状病毒(MHV-A59)体内药效
实验小鼠：SPF级雄性BALB/c小鼠，80只，体重18-22g。
操作：将实验小鼠用MHV-A59感染，并随机分成10组，每组各10只，各组别信息如下：
A组：病毒模型对照组，MHV-A59感染后不给药；
B1组：感染小鼠每天按每kg小鼠体重灌胃50mg化合物ATV006进行给药；
B2组：感染小鼠每天按每kg小鼠体重灌胃20mg化合物ATV006进行给药；
B3组：感染小鼠每天按每kg小鼠体重灌胃10mg化合物ATV006进行给药；
B4组：感染小鼠每天按每kg小鼠体重灌胃5mg化合物ATV006进行给药；
B5组：感染小鼠每天按每kg小鼠体重灌胃2mg化合物ATV006进行给药；
B6组：感染小鼠每天按每kg小鼠体重灌胃20mg瑞德西韦(RD)进行给药；
B7组：感染小鼠每天按每kg小鼠体重灌胃50mg GS-441524进行给药；
C组：未感染病毒的对照组，即取未感染病毒的小鼠不给药作为其他组的对照组；
D组：B1组对应的未感染病毒对照组，即取未感染病毒的小鼠按B1组的给药方式进行给药。
每天监测小鼠的疾病症状，包括体重、临床症状和死亡，持续14天。记录病毒感染后各处理组小鼠体重变化(结果见图4中A图)与生存曲线(结果见图4中B图)。采用荧光定量PCR方法测定病毒感染后72小时小鼠肝脏病毒滴度(结果见图4中C图)。
结论：从图4结果可知，化合物ATV006与GS-441524和瑞德西韦对比具有更好的体外抗小鼠冠状病毒MHV-A59的活性。理由如下：
(1)小鼠感染后，病毒模型对照组(A组)体重出现显著下降，而化合物ATV006治疗组除2mg/kg组外，其他剂量治疗组体重下降幅度均少于病毒模型对照组(A组)和阳性药物GS-441524(50mg/kg)组，动物体重在感染后9天均呈回升趋势，表明药物在体重保护方面有一定积极效果。
(2)小鼠感染4天后，病毒模型对照组(A组)开始出现死亡，截止至感染后第8天，死亡率100％，死亡中位数为5天；而化合物ATV006治疗组(B1-B4组)14天内死亡率0％，表明化合物ATV006在5mg/kg以上剂量下在动物生存方面起到了明显的积极效果。
(3)在2mg/kg化合物ATV006治疗组(B5组)小鼠感染后4天开始出现死亡，截止至感染后第10天，死亡率100％，死亡中位数为6天，与病毒模型对照组(A组)比具有显著性差异(P＝0.0291)。表明化合物ATV006在2mg/kg的超低剂量下在延长动物生存时间方面仍能表现有积极效果。
(4)5mg/kg以上剂量的化合物ATV006(B1-B4组)在病毒感染72h后肝脏中抑制病毒复制效果明显，并呈现剂量依赖性。
实施例40：化合物ATV006在SARS-CoV-2中的小鼠体内疗效
1、化合物ATV006在SARS-CoV-2中的小鼠体内疗效
小鼠：SPF级雄性C57BL/6hACE2人源化小鼠，18只，体重18-22克。
载体溶剂：以载体溶剂的总体积计算，含体积百分比为20％的1,2-丙二醇，体积百分比为5％的solutol(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)和体积百分比为75％的双蒸灭菌水。
在我们的初步研究中，hACE2转基因小鼠鼻内接种SARS-CoV-2(每只小鼠2x105空斑形成单位(PFU)病毒)，在病毒接种前2小时开始(图5中A图)，用载体溶剂(空白对照，灌胃，每天一次)、化合物ATV006(给药量：500mg/kg(用载体溶剂稀释)，灌胃，每天一次)或化合物ATV006(给药量：250mg/kg(用载体溶剂稀释)，灌胃，每天一次)进行处理，并持续到感染后4天。
在感染后第4天(4dpi)，我们通过qPCR评估了小鼠肺组织基因组(N基因)和亚基因组病毒RNA(亚基因组N)的丰度。药物治疗组的病毒基因组和病毒亚基因组的数量显着低于对照组(图5中B图和C图)。
2、化合物ATV006在SARS-CoV-2突变株B.1.617.2中的小鼠体内疗效
小鼠：SPF级雄性C57BL/6K18-hACE2小鼠，6只，体重18-22克。
载体溶剂：以载体溶剂的总体积计算，含体积百分比为20％的1,2-丙二醇，体积百分比为5％的solutol(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)和体积百分比为75％的双蒸灭菌水。
每只小鼠鼻内接种1x 104PFU SARS-CoV-2突变株B.1.617.2病毒，然后在病毒接种前2小时开始用载体溶剂(空白对照，灌胃，每天一次)、化合物ATV006(给药量：250mg/kg(用载体溶剂稀释)，灌胃，每天一次)进行处理(图6中A图)，并持续到感染后3天。
在感染后第3天(3dpi)，我们通过qPCR评估了小鼠肺组织基因组(N基因)和亚基因组病毒RNA(亚基因组N)的丰度。药物治疗组的病毒基因组和病毒亚基因组的数量显着低于对照组(图6中B图和C图)。
结论：我们的结果表明，ATV006的胃内给药可有效抑制SARS-CoV-2以及B.1.617.2B.1.617.2变体的复制。
综上所述：由上述实施例34，35，36，37，38，39及40所得实验结果可知：
(1)所述化合物ATV006具有良好的抗SARS-CoV及SARS-CoV-2活性，其抗SARS-CoV-2的活性为GS-441524活性的两倍，这表明化合物ATV006可有效地抑制病毒在细胞内的复制和/或繁殖。
(2)大鼠和食蟹猴的体内药代实验表明化合物ATV006具有优良的口服药代性质。低剂量化合物ATV006(2mg/kg)对小鼠冠状病毒MHV-A59感染仍具有保护作用，能延长小鼠冠状病毒MHV-A59感染的小鼠的存活时间，中高剂量化合物ATV006(5mg/kg-50mg/kg)对小鼠冠状病毒MHV-A59具有良好的抑制效果，并呈现剂量依赖性。尤其是在两种小鼠模型中的B.1.617.2变体中，数据显示ATV006作为口服抗SARS-CoV-2及其变异毒株的潜力。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。

Claims (8)

1.式II所示化合物或其药学可接受的盐，其特征在于，所述式II所示化合物选自：
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐，所述式II所示化合物包括式II所示化合物的外消旋物、对映异构体、互变异构体或无定形形式。
3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1所述化合物或其药学可接受的盐，和药学上可接受的载体或辅料。
4.一种根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐或权利要求3所述药物组合物在制备用于预防、缓解或治疗冠状病毒感染，或其同源变异病毒的复制或繁殖及其所产生的细胞病变效应的产品中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，所述感染包括发热、咳嗽、咽痛、急性呼吸道感染、严重急性呼吸道感染、低氧性呼吸衰竭及急性呼吸窘迫综合征、脓毒症或脓毒性休克。
6.一种根据权利要求1所述的化合物或其药学可接受的盐或权利要求3所述药物组合物在制备用于以非治疗为目的的检测冠状病毒或其同源变异病毒的产品中的用途。
7.根据权利要求4-6任一项所述的用途，其特征在于，所述冠状病毒包括：MHV-A59、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV，MERS-CoV、
SARS-CoV-2、小鼠肝炎病毒、猫传染性腹膜炎病毒、犬冠状病毒、牛冠状病毒、禽传染性支气管炎病毒或猪冠状病毒，优选地，所述SARS-CoV-2包括SARS-CoV-2的突变株或未突变株；更优选地，所述SARS-CoV-2的突变株包括SARS-CoV-2突变株B.1、SARS-CoV-2突变株B.1.351、SARS-CoV-2突变株B.1.617.2、SARS-CoV-2突变株C.37、SARS-CoV-2突变株P.1族谱、SARS-CoV-2突变株B.1.525、SARS-CoV-2突变株B.1.427或SARS-CoV-2突变株B.1.429。
8.根据权利要求4-6任一项所述的用途，其特征在于，所述化合物或其药学可接受的盐适用于人或动物；和/或所述动物包括牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物、鸟类动物或鱼类动物。
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