CN118006839A - 一种鹅腺病毒4型的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鹅腺病毒4型的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒，属于生物技术与诊断检测技术领域。所述引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物，所述试剂盒包括所述引物。采用本发明的试剂盒，仅需将待检样品使用一对特异性引物进行PCR扩增后即可快速实现鹅腺病毒4型的定量检测，检测结果可直接通过电脑软件读出，简化实验步骤、节约检测时间。当前尚未见基于SYBR GreenⅠ检测鹅腺病毒4型的实时荧光定量PCR检测方法的研究报道，本发明属于国内外首创，可填补相关研究领域空白，为新发鹅腺病毒4型感染的诊断提供依据，对保障水禽养殖业的发展起到重要作用，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术与诊断检测技术领域，更具体地，涉及一种鹅腺病毒4型的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒。
背景技术
鹅腺病毒(Goose adenovirus)于1967年由Csontos等首次从匈牙利鹅群中发现(Csontos，1967)，随后该病毒在匈牙利及其周边地区蔓延。Zsa等从匈牙利某2-4周龄发病雏鹅的肝脏和肠道中分离到7株GoAdV，并根据其限制性内切酶切割模式将其分为三种基因型(GoAdV-1、GoAdV-2和GoAdV-3)(Zsa，1984)。Kajan等对20世纪70年代自匈牙利某死亡雏鹅中分离的鹅腺病毒P29株进行全基因组序列测定，并根据病毒全基因组特征将其命名为鹅腺病毒4型(GoAdV-4)，国际病分类委员会将该毒株归类为腺病毒科、禽腺病毒属的鹅腺病毒A种(http://ictv.global/report/adenoviridae)。
2022年4月，本申请的发明人团队于国内首次从病死雏鹅中分离获得GoAdV-4，同时通过分子生物学手段获取了国内第一株GoAdV-4的全基因组序列(CH-FJZZ-202201株，登录号：OR842729)。GoAdV-4感感染鹅的发病死亡率高达10％～30％不等，感染宿主和日龄有不断扩大趋势，给我国养鹅业造成了较大威胁。因此建立一种准确、快速、灵敏的检测方法对其进行流行动态监测，保障养鹅业健康发展迫在眉睫。
目前对GoAdV-4的检测方法主要有传统的病毒分离、电镜观察等。传统方法对病毒样本浓度与纯度要求均较高且步骤繁琐成本高昂，不适用于临床大样本的检测与监测。目前，国内外尚未见特异性检测该病毒的分子生物学方法的报道，本发明可填补该领域空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鹅腺病毒4型的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种鹅腺病毒4型的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测引物，包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物。
本发明根据本团队上传至美国国家生物技术信息中心(National Center ofBiotechnology Information，NCBI)数据库的国内唯一1株鹅腺病毒4型(CH-FJZZ-202201株，登录号：OR842729)及国内外其它型腺病毒Hexon基因序列信息，经比对分析，设计特异性检测鹅腺病毒4型的引物(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)，建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法，可对鹅腺病毒4型感染快速鉴别诊断，节省了时间和成本，提高了准确性。
进一步地，本发明提供一种鹅腺病毒4型的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测试剂盒，包含上述的引物。
进一步地，所述试剂盒的扩增反应体系为Premix Ex TaqTM 10μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，模板2μL，补充灭菌去离子水至终体积20μL。
优选地，所述上游引物、下游引物的浓度均为10μmol/L。
进一步地，所述试剂盒的扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环。
一种采用本发明所述的引物的鹅腺病毒4型的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：提取待测样本基因组
S2：PCR反应
其中，扩增反应体系为：Premix Ex TaqTM 10μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，模板2μL，剩余为灭菌去离子水，反应体系的总体积为20μL；
扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环；
S3：结果判定
若待测样本核酸浓度高于检测下限6.4×102拷贝/μL时，则判定为鹅腺病毒4型阳性，反之则为阴性。
本发明首次建立了特异性检测GoAdV-4的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒。采用本发明的试剂盒，仅需将待检样品使用一对特异性引物进行PCR扩增后即可快速实现鹅腺病毒4型的定量检测，检测结果可直接通过电脑软件读出，简化实验步骤、节约检测时间。该检测试剂盒非常适用于临床大量样本的检测与监测。当前尚未见基于SYBR GreenⅠ检测鹅腺病毒4型的实时荧光定量PCR检测方法的研究报道，本发明为新发鹅腺病毒4型感染的诊断提供依据，对保障水禽养殖业的发展起到重要作用，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR扩增动力曲线。
注：1～8分别为质粒含量为6.4×107-6.4×100copies/μL标准品的扩增动力学曲线。
图2为实时荧光定量PCR标准曲线。
图3为实时荧光定量PCR的特异性扩增曲线。
注：GoAdV-4：鹅腺病毒4型；对照：禽腺病毒4型(FAdV-4)，鸭腺病毒3型(DAdV-3)，减蛋综合征病毒(EDSV)，鹅圆环病毒(GoCV)，鹅星状病毒(GoAstV)，小鹅瘟病毒(GPV)，灭菌去离子水(ddH2O)。
图4为实时荧光定量PCR的特异性溶解曲线。
注：GoAdV-4：鹅腺病毒4型；对照：禽腺病毒4型(FAdV-4)，鸭腺病毒3型(DAdV-3)，减蛋综合征病毒(EDSV)，鹅圆环病毒(GoCV)，鹅星状病毒(GoAstV)，小鹅瘟病毒(GPV)，灭菌去离子水(ddH2O)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料；所用的设备，如无特殊说明，均为常规实验设备，所涉及的溶液无特殊说明均为水溶液。
菌株毒株
试验用鹅腺病毒4型(GoAdV-4CH-FJZZ-202201株)、禽腺病毒4型(FAdV-4)，鸭腺病毒3型(DAdV-3)，减蛋综合征病毒(EDSV)，鹅圆环病毒(GoCV)，鹅星状病毒(GoAstV)，小鹅瘟病毒(GPV)和灭菌去离子水(ddH2O)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病研究室保存。24份鹅源组织病料来自2021年～2023年国内某鹅场送检的临床样品。
主要试剂
Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(Code No.RR420A)、pMD18-T载体和DL2000 DNA Marker均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；EasyPure Viral DNA/RNAKit(Code No.ER201)、pEASY-T1 Simple Cloning Kit(Code No.CT111)和2×EasyTaq PCRSuperMix(Code No.AS111)均购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒(CodeNo.Gel Extraction Kit D2500)和质粒小量提取试剂盒I(Code No.Plasmid Mini KitID6943)均购自Omega Bio-Tek公司；荧光定量八排管(PCR-0208-C)购自爱思进(Axygen)公司；其他常规化学试剂和耗材，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
实施例1
一种鹅腺病毒4型的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测引物及检测方法
1、引物设计
根据NCBI数据库的鹅腺病毒4型CH-FJZZ-202201株(登录号：OR842729)Hexon基因序列的特异性保守区域，利用Lasergene DNAStar进行核苷序列分析比对，利用引物设计软件Oligo 7.0设计引物，序列如下：
上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2、病毒核酸的提取及cDNA的制备
试验用鹅腺病毒4型CH-FJZZ-202201株按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit试剂盒的方法提取相应的病毒核酸，-80℃冻存备用。
3、阳性标准品的构建
利用Oligo 7引物设计软件设计引物，上游引物GoAdV-4-F：5＇-TGTCTTTAGTAATGATGGGTAT-3＇(SEQ ID NO:3)，GoAdV-4-R：5＇-CCTCATTAAACACTACGGAT-3＇(SEQ ID NO:4)，预期扩增片段大小为650bp；构建标准阳性质粒pMD18-Hexon，载体pMD18-T为TAKARA公司产品。阳性质粒经分光光度计(A260)测得质粒浓度为235.7ng/μL，通过计算获得标准阳性质粒的拷贝数为6.4×1010拷贝数/μL，-20℃保存。
4、SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR最佳反应条件
按照Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书配制20μL的实时荧光定量PCR反应体系，在不同退火温度(52，54，56，58，60，62和64℃)、引物浓度(1.25，2.5，5.0，10和20μmol/L)，对反应条件进行优化。
经优化，最佳反应体系(20μL)如下：Premix Ex TaqTM 10μL、上/下游引物(各10μmol/L)0.4μL、模板2μL，补充灭菌去离子水至终体积20μL。最佳反应条件为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环。
实施例2
SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线的建立及其敏感性
质粒含量为6.4×107，6.4×106，6.4×105，6.4×104，6.4×103，6.4×102，6.4×101和6.4×100拷贝/μL的标准品按优化后的条件进行扩增，获得扩增动力学曲线(图1)。从图1可以看出，本发明建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为6.4×102拷贝/μL。
以每个浓度标准品模板中拷贝数的常用对数(lgQ)为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为纵坐标，获得基于SYBR GreenⅠ检测GoAdV-4实时荧光定量PCR标准曲线(见图2)的线性方程为y＝－3.12X+39.70，其相关系数为0.9926，扩增效率为98％，表明建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系。
实施例3
特异性试验
用优化后的实时荧光定量PCR最佳反应条件分别对水禽其他常见病原，如FAdV-4、DAdV-3、EDSV、GoCV、GoAstV、GPV和ddH2O进行实时荧光定量PCR检测。用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取相应病毒的核酸，RNA经反转录后，按照Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)试剂盒说明书用优化后的反应条件进行检测，评价建立的实时荧光定量PCR方法的特异性。
从扩增曲线(图3)可见，建立的实时荧光定量PCR方法仅对GoAdV-4检测出现阳性扩增信号，对其他水禽常见病原(如FAdV-4、DAdV-3、EDSV、GoCV、GoAstV、GPV和ddH2O)均未见阳性扩增荧光信号。
从熔解曲线(图4)可见，在Tm＝(82.50±0.25)℃出现单一的特异性峰，无引物二聚体及非特异性产物。对其他水禽常见病原(如FAdV-4、DAdV-3、EDSV、GoCV、GoAstV、GPV和ddH2O)，均未检测到荧光信号，表明建立的实时荧光定量PCR方法特异性强。
实施例4
重复性试验
用优化后的实时荧光定量PCR最佳反应条件分别对质粒含量为6.4×105，6.4×104，6.4×103和6.4×102拷贝/μL的标准品进行检测，每种质粒含量重复3次，计算组内(intra-group)变异系数。分别将上述不同质粒含量的标准品分装后置于-20℃保存，每隔7d取出，用建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，共检测3次，计算组间(inter-group)变异系数。
实时荧光定量RT-PCR检测标准阳性样品的组内变异系数(CV)为0.88-2.12％，组间变异系数(CV)0.75-2.40％，结果见表1，表明建立的方法重复性好。
表1实时荧光定量PCR的组内和组间变异系数
实施例5
临床应用
对临床收集的24份鹅源病料进行GoAdV-4感染的检测，将相关病料按照常规方法研磨处理后用Easy Pure Viral DNA/RNA Kit提取相应的核酸，按照Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书用优化后的反应条件，进行实时荧光定量PCR检测；获得的Ct值以本发明建立的标准曲线线性方程进行计算拷贝数，当病毒核酸浓度低于检测下限6.4×102拷贝/μL时，判断检测结果为阴性。同时对这24份病料利用PCR引物(SEQ IDNO:3/4)进行常规PCR检测，对阳性样品送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，计算上述检测方法之间的符合率。结果获得阳性样品3份，阳性样品序列测定分析发现，其均为鹅腺病毒4型；常规PCR方法与本发明方法阳性率均为12.5％(3/24)，两者符合率为100％。
表2临床样品检测结果
Claims (6)
1.一种鹅腺病毒4型的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于，所述引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物。
2.一种鹅腺病毒4型的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的PCR检测引物。
3.根据权利要求2所述的一种鹅腺病毒4型的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增反应体系为SYBR® Premix Ex Taq™ 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，模板2 μL，补充灭菌去离子水至终体积20 μL。
4.根据权利要求3所述的一种鹅腺病毒4型的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物的浓度均为10 μmol/L。
5.根据权利要求2所述的一种鹅腺病毒4型的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。
6.一种采用权利要求1所述的引物的鹅腺病毒4型的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：提取待测样本基因组
S2：PCR反应
其中，扩增反应体系为：SYBR® Premix Ex Taq™ 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，模板2 μL，剩余为灭菌去离子水，反应体系的总体积为20 μL；
扩增反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40个循环；
S3：结果判定
若待测样本核酸浓度高于检测下限6.4×102拷贝/μL时，则判定为鹅腺病毒4型阳性，反之则为阴性。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202311825719.4A CN118006839A (zh) | 2023-12-26 | 2023-12-26 | 一种鹅腺病毒4型的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒 |
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2023
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